Guia de Laboratorio Microbiologia Ambiental

Escuela de Ciencias Agrcolas, Pecuarias y del Medio Ambiente Gua de laboratorio Microbiologa Ambiental

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GUIA PRACTICA DE LABORATORIO MICROBIOLOGA AMBIENTAL 358010 JORGE ALEJANDRO RODRIGUEZ PALACIOS DIRECTOR DE CURSO 1-2015


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Los estudiantes deben consultar por su cuenta propia y basados en las referencias y bibliografa entregada en el curso la informacin necesaria para las siguientes prcticas. El tutor prctico guiar y despejar las dudas a los estudiantes en el laboratorio e igualmente al final de la sesin de laboratorios realizar una evaluacin compuesta por 3 quices los cuales sern la calificacin correspondiente a la actividad experimentacin 2 actividad 4 del curso. PRACTICA 1- TEORA BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO TEORA PRACTICA No.1 BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO Los laboratorios de microbiologa estn regidos por normas de seguridad e higiene que deben cumplirse a cabalidad para garantizar la proteccin contra infecciones de los estudiantes u otro personal que labora en estas instalaciones, as como garantizar la calidad de las tcnicas y la confiabilidad de los resultados. 1.1. Las siguientes medidas son de obligado cumplimiento en cualquier rea del laboratorio: 1.1.1. El acceso al laboratorio estar limitado al personal autorizado. 1.1.2. El personal del laboratorio debe implicarse en el cumplimiento de las normas de seguridad. 1.1.3. Todas las reas estarn debidamente marcadas con la seal de riesgo biolgico y su nivel de contencin. 1.1.4. Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas para mantener la adecuada contencin biolgica. 1.1.5. Todas las superficies de trabajo se limpiarn y desinfectarn diariamente y siempre que se produzca un derrame. 1.1.6. Los residuos y muestras peligrosas que van a ser incinerados fuera del laboratorio deben ser transportados en contenedores cerrados, resistentes e impermeables siguiendo las normas especficas para cada tipo de residuo. 1.1.7. El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado y no es aconsejable utilizar los pasillos como almacn. Siempre debe quedar un espacio libre no inferior a 120 cm para poder evacuar el laboratorio en caso de emergencia. 1.1.8. El transporte de las muestras dentro o entre laboratorios se realizar de tal manera que, en caso de cada, no se produzcan salpicaduras. Lo recomendable es hacerlo en cajas hermticas o neveras transportables. Estas cajas o neveras debern ser rgidas y resistentes a los golpes, contar con materiales absorbentes en su interior y de fcil desinfeccin. Se etiquetarn o identificarn de forma oportuna y no podrn ser utilizadas para otros fines. Bajo ningn concepto se deben transportar las muestras a mano. 1.1.9. La ropa protectora, fcilmente ajustable y confortable, as como guantes, gafas, etc.; debe estar disponible en todo momento. La ropa protectora de las reas con nivel de contencin 3 (batas) nunca debe ser usada fuera del rea de trabajo y si se quita debe de ser desechada automticamente en una bolsa de material contaminado. Jams debe volver a ser usada.


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1.1.10. Todo el personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto de la piel con materiales potencialmente infecciosos. Con este fin deben usarse guantes cuando se manipulen muestras o cultivos que contengan posibles patgenos. Los guantes siempre sern desechados antes de salir del rea de trabajo. Jams se saldr de la misma con los guantes puestos, ni con ellos se coger el telfono, se tocarn las hojas de examen, maniguetas de las puertas, etc. 1.1.11. Tras quitarse los guantes, se realizar un lavado de manos. 1.1.12. Se usarn gafas protectoras y mascarillas faciales si existe riesgo de salpicaduras y/o aerosoles. 1.1.13. Se pondr extremo cuidado en minimizar el riesgo de auto-inoculacin y de generacin de aerosoles. 1.1.14. Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente al Supervisor y al Jefe del Laboratorio y hacerse constar por escrito. 1.1.15. Est rigurosamente prohibido pipetear con la boca. Se realizar pipeteo automtico con material adecuado y cada trabajador ser instruido para manejarlo debidamente. 1.1.16. En la zona de trabajo no debe colocarse material de escritorio ni libros ya que el papel contaminado es de muy difcil esterilizacin. 1.1.17. No debern usarse lentes de contacto. 1.1.18. El personal con el cabello largo debe llevarlo recogido. 1.1.19. Comer, beber, fumar y aplicarse cosmticos esta formalmente prohibido en el rea de trabajo del laboratorio, as como el almacenamiento de comida o bebida. 1.1.20. El personal debe lavarse las manos frecuentemente durante las actividades rutinarias, tras acabar la jornada laboral y siempre antes de abandonar el laboratorio (almorzar). Se usar un jabn antisptico y el secado se realizar con papel. 1.1.21. Las heridas y cortes en las manos, si se han producido en el Laboratorio, sern comunicados al responsable de la Seccin correspondiente, as como al Supervisor de Bioseguridad que lo registrar haciendo constar todas las circunstancias. Las heridas y cortes deben ser convenientemente vendados y despus es imprescindible ponerse guantes. 1.2. Clasificacin de los microorganismos infecciosos por grupo de riesgo 1.2.1. Grupo de riesgo 1 (riego individual o poblacional escaso o nulo) 1.2.2. Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales 1.2.3. Grupo de riesgo 2 (riego individual moderado, riesgo poblacional bajo) 1.2.4. Agentes patgenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entraar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la poblacin, el ganado o el medio ambiente. La exposicin en el laboratorio puede provocar una infeccin grave, pero existen medidas preventivas y teraputicas eficaces y el riesgo de propagacin es limitado. 1.2.5. Grupo de riesgo 3 (riego individual elevado, riesgo poblacional bajo) 1.2.6. Agentes patgenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves, pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro. Existen medidas preventivas y teraputicas


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eficaces. 1.2.7. Grupo de riesgo 4 (riesgo individual y poblacional elevado) Agentes patgenos que suele provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se transmiten fcilmente de un individuo a otro, dicta o indirectamente. Normalmente no existen medidas preventivas y teraputicas eficaces. Tipos de laboratorios: Nivel de bioseguridad 1 Laboratorio bsico Nivel de bioseguridad 2 Laboratorio bsico Nivel de bioseguridad 3 Laboratorio de contencin Nivel de bioseguridad 4 Laboratorio de contencin mxima 1.3. Cdigo de prcticas en laboratorios bsicos 1.3.1. Acceso: el smbolo y signo internacional de peligro biolgico (Figura 1) debe colocarse en las puertas de loa locales donde se manipulen microorganismos del grupo de riesgo 2 o superior. 1.3.2. Proteccin personal: se debe usar todo el tiempo batas o uniformes especiales para el trabajo en el laboratorio. Usar guantes protectores apropiados con materiales potencialmente infecciosos. 1.3.3. Procedimientos: es estrictamente prohibido pipetear con la boca. Colocarse material y/o etiquetas en la boca. Se mantendr un registro de accidente e incidentes que ocurren en el laboratorio. Se elaborar y seguir un procedimiento escrito para la limpieza de todos los derrames. Los lquidos contaminados debern descontaminarse antes de ser descartados. 1.3.4. Zona de trabajo del laboratorio: se mantendr ordenado, limpio y libre de materiales no relacionados con el trabajo. Las superficies de trabajo deben permanecer descontaminadas. Las ventanas que puedan abrirse deben estar equipadas de rejillas para evitar el ingreso de artrpodos. 1.3.5. Diseo e instalaciones del laboratorio: inicialmente se debe prestar especial atencin a los problemas que puedan causar problemas en la bioseguridad, Entre ellos estn: la formacin de aerosoles, el trabajo con grandes cantidades o altas concentraciones de microorganismos, el exceso de personal o material, la infestacin por roedores o artrpodos, la entrada de personas no autorizadas y el circuito de trabajo. 1.4. Normas de trabajo en el laboratorio de microbiologa 1.4.1. Desinfectar el rea de trabajo 1.4.2. Prender el mechero antes de comenzar a trabajar 1.4.3. Al utilizar el asa bacteriolgica, debe calentarse en toda su extensin el alambre a la llama del mechero hasta que se ponga roja. Este proceso debe hacerse antes y despus del uso. 1.4.4. Durante las siembras, el tubo debe mantenerse en la mano izquierda y el tapn en la mano derecha sostenido entre el dedo meique y la palma de la mano, cerca de la llama del mechero, con esta misma mano debe cogerse el asa entre el


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dedo ndice y el pulgar. El correcto manejo de los tubos evitara contaminaciones cruzadas en los cultivos. 1.4.5. Flamear la boca de los tubos despus de quitarles el tapn y antes de volverlo a colocar para evitar la formacin de aerosoles o la contaminacin del contenido del tubo. 1.4.6. Destapar las cajas de petri manteniendo la base y la tapa simultneamente en la mano izquierda, abriendo la caja parcialmente y cerca de la llama del mechero. 1.4.7. Los escobillones o baja lenguas deben quemarse en la llama del mechero, se deja enfriar y se descarta. 1.4.8. Todo el material que se use en microbiologa de estar estril. 1.4.9. El material se debe marcar con cinta de enmascarar antes de llevarlo a la incubadora. Las cajas de Petri se marcan en el borde de la base para evitar que tapen las superficies de los cultivos. FIGURA 1. Seal de advertencia de peligro biolgico para las puertas del laboratorio.


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REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS BENSON, HAROLD J. Microbiological applications: Laboratory Manual in General Microbiology. McGraw Hill. U.S.A. 1998. COLLINS, C. H. and M LYNE, PATRICIA. Traduccin del ingles por Jos Mara Tarazona Vilas. Mtodos microbiolgicos. Editorial ACRIBIA, S. A. ZARAGOZA (Espaa). 1989. OMS Organizacin Mundial de la Salud. Manual de bioseguridad en el laboratorio. Ginebra. 2005.


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IMPORTANTE: LOS ESTUDIANTES DEBEN LEER Y CUMPLIR LAS NORMAS DE LABORATORIO, EL INCUMPLIMIENTO DE LAS MISMAS ACARREAR LA SANCIN DE LA NOTA PRCTICA. PRACTICA 1.1 Los estudiantes debern leer las siguientes preguntas y tener claro los conocimientos tericos de las msmas, en la sesin de laboratorio el tutor prctico realizar una evaluacin sobre el tema, dichas preguntas y sus respuestas deben ser entregadas al tutor de la prctica junto con el informe final de laboratorio. PRCTICA No. 1 DE RECONOCIMIENTO DEL LABORATORIO Y MATERIALES DE MICROBIOLOGIA 1. Qu caractersticas debe reunir el vidrio utilizado para la fabricacin del material de cristalera para los laboratorios y por qu? 2. Explique brevemente las ventajas y desventajas del uso de materiales de vidrio y de plstico, respectivamente, en los laboratorios de microbiologa. 3. Describa, ilustre y clasifique los siguientes materiales, indicando el uso que se les da en el laboratorio de microbiologa (Sea breve, se le sugiere elaborar un cuadro): a) Portaobjetos b) Cubreobjetos c) Cajas de Petri d) Pipetas graduadas (terminales y no terminales) e) Pipetas Pasteur f) Tubos de ensayo (tipos) g) Matraces (tipos) h) Probetas (tipos) i) Tubos de Durham j) Asas de inoculacin (tipos) k) Mecheros (tipos) l) Estufas bacteriolgicas (tipos) m) Bao bacteriolgico n) Horno Pasteur o) Autoclave p) Jarra de anaerobiosis q) Centrfuga r) Nefelmetro de Mac Farland s) Membranas Millipore t) Cuenta colonias 4. Ilustre un Microscopio ptico de campo claro con los nombres de todas sus partes. 5. Enliste detalladamente todas las medidas que se requiere tomar en cuenta para el manejo correcto y cuidados del microscopio compuesto. 6. Enliste detalladamente todos los pasos que se requiere seguir para enfocar imgenes en un microscopio compuesto.


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7. Defina los siguientes trminos en microscopa: Lmite de resolucin, poder de resolucin y poder de amplificacin, indicando la frmula mediante la que se calculan cada uno. 8. Mencione los tipos de microscopio electrnico que existen actualmente y cules son las diferencias y ventajas que usted considera ms importantes entre estos y el microscopio ptico cuando se trabaja en un laboratorio de microbiologa. 9. Cul es la utilidad del asa recta y redonda? 10. Qu se entiende por resiembra o pase bacteriano? PRACTICA 2 MTODOS DE SIEMBRA PARTE A La inoculacin de medios de cultivo para la recuperacin, mantenimiento y/o aislamiento de microorganismos, es un procedimiento fundamental e importante. Debe tenerse cuidado con las tcnicas de siembra microbiana para evitar en lo posible la contaminacin por otros microorganismos diferentes al deseado. MATERIALES 1. Muestra contaminada con microorganismos (Pueden utilizar las muestras de la practica 3 experimentacin 1 en caso que el laboratorio CEAD, UDR, CERES, no cuente con microorganismos para la prctica.) 2. Agua peptonada al 0,1% estril 3. Agar nutritivo en caja de Petri 4. Asa redonda 5. Gradilla 6. Mechero 7. Incubadora 8. Vinipel 9. Marcador de vidrio PROCEDIMIENTO 1. Desinfectar el rea de trabajo, prender el mechero y preparar el material de trabajo. 2. Coger parte de la muestra y colocarla en el tubo de ensayo que contiene el agua peptonada. Homogenizar. 3. Dejar 20 30 minutos en incubacin los tubos. 4. Realizar un diagrama de aislamiento de colonias, en un circulo de papel (8 cm) para ponerlo debajo de la caja de Petri (Figura 1) 5. Finalizado el tiempo de incubacin tomar el asa redonda y esterilizarla por calor hasta que est est roja, dejar enfriar cerca al mechero. 6. Abrir el tubo con la muestra y tomar una asada. 7. Cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla. Teniendo cuidado de que el asa no toque nada y de no pasarla por encima del mechero, pero siempre estar cerca de este 8. Abrir la caja de Petri y seguir el esquema para el aislamiento. 9. Terminado la siembra, marcar las cajas en el borde de la base de la caja y envolverla en papel vinipel.


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10. Colocar el tubo y la caja a incubar a 37C. La caja debe estar boca abajo siempre. 11. Desinfectar el rea de trabajo, apagar el mechero y entregar el material Figura 1. Tcnica de aislamiento de colonias

Este procedimiento se denomina aislamiento de bacterias, debido a que las bacterias presentes en una muestra se distribuyen sobre la superficie de un agar, y cada clula se reproduce independientemente hasta formar un conglomerado de bacterias observables a simple vista (colonia bacteriana). De esta manera es posible observar sobre la superficie del medio, colonias de diferentes caractersticas en cuanto a forma, superficie, borde, forma, color, aspecto y elevacin, lo que indica microscpicamente presencia de diferentes tipos microbianos en la muestra. As se puede estudiar e identificar independientemente cada especie. METODOS DE SIEMBRA PARTE B Los microorganismos tambin pueden ser cultivados en distintos titpos de medios de cultivo tanto lquidos como slidos, en esta parte los estudiantes debern hacer una siemra del microorganismo en medio lquido. Materiales 1. Muestra contaminada con microorganismos (Pueden utilizar las muestras de la practica 3 experimentacin 1 en caso que el laboratorio CEAD, UDR, CERES, no cuente con microorganismos para la prctica.) 2. Agua peptonada al 0,1% estril(frascos con 90 ml)


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3. caldo nutritivo en tubo de ensayo (9ml) 4.Agar nutritivo semislido o tioglicolato en tubo de ensayo 5. Agar nutritivo slido en tubo de ensayo 6. pipeta de vidrio de 1ml 7. Asa redonda 8. Gradilla 9. Mechero 10. Incubadora 11. Vinipel 12. Marcador de vidrio Procedimiento 1. Desinfectar el rea de trabajo, prender el mechero y preparar el material de trabajo. 2. Coger parte de la muestra y colocarla en el frasco que contiene el agua peptonada. Homogenizar. 3. Dejar 20 30 minutos en incubacin . 4. tomar 1 ml de la suspensin y transferirla en el tubo que contiene el medio de cultivo. 5. incubar a 37 por 24 horas, observar el tipo de crecimiento, a continuacin un ejemplo.

6. anotar los resultados obtenidos. Siembra en medio semislido. De la misma suspensin inicial tomar con un asa recta e introducirla en dicha suspensin, posteriormente siembre por puncin en el medio semislido como indica a continuacin la figura.


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Siembra en medio slido con superficie inclinada Tomar con asa recta de la misma suspensin inicial (muestra) y proceder a realizar la misma accin anterior, incubar y observar el crecimiento, a continuacin se ilustra un ejemplo.

Patrones de crecimiento en medios slidos

Anotar el crecimiento que obtuvo con su microorganismo. Siembra de Hongos


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Los hongos son microorganismos eucariticos con condiciones de crecimiento especiales e inters ambiental, pueden ser utilizados a nivel de industria. Materiales

1. Cajas de Petri con agar PDA

2. Agujas de diseccin, jeringas de insulina o asa recta.

3. Hongos de cualquier gnero con crecimiento no mayor a 15 das antes de la

prctica ( en caja de Petri)

Procedimiento 1. Tome con la aguja de diseccin o asa un cuadro de la colonia fngica de no

ms de 5 mm de dimetro, intente tomar de los extremos de la colonia,

cuidadosamente coloque el cuadro en la caja de Petri con agar PDA en el

centro de la misma, incubar a 25.

NOTA: PARA LA SEGUNDA FASE DEL LABORATORIO EL MICROORGANISMO SER UTILIZADO PARA LA REALIZACIN DE LMINAS Y OBSERVACIN DE ESTRUCTURAS BAJO EL MICROSCPIO. PRACTICA 3 TECNICAS DE TINCIN MATERIALES 1. Lminas 2. Laminillas 3. Agua destilada estril 4. Asas bacteriolgicas redonda y asa recta 5. Mechero 6. Azul de metileno 7. Cristal violeta 8. Lugol 9. Alcohol cetona 10. Fucsina bsica o safranina 11. Tinta china 12. Microscopio ptico 13. Colonias aisladas de bacterias para observacin de bacterias 14. Guantes de ltex PROCEDIMIENTO 1. Coloracin simple a. En una lmina portaobjetos limpia, colocar una gota del agua destilada estril (trabajo con


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muestra slida) o una gota del cultivo bacteriano (trabajo con muestra liquida) sobre la misma y con ayuda del asa redonda estril extender la gota de suspensin a un rea no superior a dos centmetros cuadrados. b. Dejar que la preparacin se seque al aire. Fijar con calor, pasando tres veces seguidas a travs de la llama del mechero. c. Dejar enfriar la lmina. Lo anterior se conoce como la realizacin de un frotis y se hace para coloraciones donde la muestra debe ser fijada y luego si iniciar las coloraciones respectivas. d. Colocar la preparacin sobre una rejilla encima del vertedero. e. Cubrir la suspensin con algn colorante dado por el profesor, as: i. Cristal violeta: 1 minuto ii. Azul de metileno: 5 minutos iii. Fucsina: 1 minuto f. Terminado el tiempo de coloracin segn el colorante empleado, eliminar el colorante lavando con agua suavemente. g. Dejar secar y colocar la preparacin en la platina del microscopio y observar con el objetivo de menor aumento inicialmente hasta llegar al objetivo de 100X


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2. Coloracin compuesta a. Realizar un frotis de la muestra seleccionada b. Colocar en la rejilla para coloracin y cubrir el frotis con cristal violeta esperando que transcurra 1 minuto. Lavar con agua el colorante. c. El segundo colorante es el lugol, el cual se deja por 1 minuto sobre el frotis


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d. Realizar la decoloracin con la mezcla alcohol-acetona, por 25 segundos. Lavar inmediatamente con agua. e. Finalmente adicionar el colorante de contraste, fucsina o safranina, por 30 segundos. Lavar con agua. f. Escurrir el exceso de agua, dejar secar y montar al microscopio para hacer las observaciones respectivas. Figura 2. Tincin de Gram

Distintas morfologas observadas al microscopio


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NOTA: ANOTAR LAS MORFOLOGAS OBSERVADAS POSTERIORES A LA COLORACIN, SI ES POSIBLE TOMAR FOTOS. PRACTICA 4 OBSERVACIN MICROSCPICA DE HONGOS La clula fngica es similar a cualquier organismo eucarionte, aunque existen diferencias subcelulares entre la clula de un hongo inferior a la de uno superior. Cuando se estudian los hongos se pueden observan dos grandes grupos: los algodonosos, que se conocen con el nombre de mohos y otros que forman colonias hmedas y se conocen como levaduras. MATERIALES 1. Cultivo de hongos 2. Lminas portaobjetos 3. Laminillas 4. Azul de lactofenol


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5. Microscpio PROCEDIMIENTO Colocar en el centro de la lmina portaobjeto una gota de azul de lactofenol, luego tomar con el asa micolgica previamente esteril parte del hongo y resuspenderlo en la gota del colorante. Colocar luego una laminilla encima de esta preparacin y esperar 3 minutos. Finalizado este tiempo montar al microscpio y observar en 10X y 40X. Dibujar las siguientes caractersticas en el cuadro que corresponda. Hifa septada Hifa Cenoctica Artrocionidios Conidios PRACTICA 5 CONTROL DEL CRECIMIENTO BACTERIANO Los factores fsicos y qumicos tienen un efecto notable sobre la vida de los microorganismos en su medio ambiente natural. Algunos estimulan su desarrollo en tanto que otros lo retardan o lo impiden. El conocimiento del efecto de esos parmetros medio ambientales no solo permiti estudiar los microorganismos bajo condiciones controladas de laboratorio para favorecer su crecimiento sino que posibilit aprender la forma de controlarlos. MATERIALES Cultivo de un microorganismo Gram - positivo Cultivo de un microorganismo Gram - negativo. Medio de cultivo nutritivo en cajas de Petri con diferentes pHs. Medio de cultivo nutritivo en cajas de Petri con diferentes concentraciones de NaCl.


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Medio de cultivo nutritivo en cajas de Petri Caldo nutritivo Pipetas estriles de 1 y 2 mL Estufa Vaso de precipitado de 500 mL Incubadora PROCEDIMIENTO 1. ACCIN DE LA TEMPERATURA Suspender una colonia del microorganismo seleccionado en el caldo nutritivo y dejarlo por media hora para un desarrollo de los microorganismos en el medio de cultivo. Luego tomar 0.1 mL del medio y sembrarlo sobre el medio slido del agar nutritivo. Llevar el caldo nutritivo donde se inoculo el microorganismo a la estufa y ponerlo a ebullicin por el tiempo dado por el profesor y sembrar como al inicio. Llevar las dos cajas de Petri e incubarlas a 37oC. 2. ACCION DEL pH Dividir la base de las cajas en dos cuadrantes con el marcador de vidrio y con el asa redonda sembrar por estras en un cuadrante el microorganismo Gram-negativo y en el otro el Grampositivo. Realizar este procedimiento con todas los medios de diferentes pH. 3. ACCIN DE LA PRESIN OSMTICA Dividir la base de las cajas en dos cuadrantes con el marcador de vidrio y con el asa redonda sembrar por estras en un cuadrante el microorganismo Gram-negativo y en el otro el Grampositivo. 4. ACCIN DE LA LUZ ULTRAVIOLETA Dividir la base de las cajas en dos cuadrantes con el marcador de vidrio y con el asa redonda sembrar por estras en un cuadrante el microorganismo Gram-negativo y en el otro el Grampositivo. Seguidamente tapar la mitad de la caja con papel de aluminio y colocar sobre la otra parte de la caja la luz ultravioleta por 5 y/o 10 minutos, tapar la caja y llevar a incubar. PRACTICA 6 RECUENTO DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS-UFC. Microorganismo aerobio mesfilo son todas las bacterias, levaduras y hongos capaces de desarrollarse en condiciones de aerobiosis a 30C. Es un parmetro que sirve para estimar la flora total, pero sin especificar tipos de microorganismos. Es uno de los indicadores ms tiles del estado microbiolgico de un alimento, agua, suelo entre otros. Tiene un valor limitado como indicador de la presencia de patgenos o sus toxinas. Altos recuentos microbianos se consideran poco aconsejables para la mayor parte de los alimentos. MATERIALES 1. 2 cajas de Petri estriles 2. 4 tubos de ensayo con agua peptonada al 0.1% estriles 3. 4 Pipetas de 1 mL o una pipeta automtica (100 1000 L)


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4. 1 frasco de dilucin con 90 mL de agua peptonada al 0.1% 5. 50 mL de agar nutritivo previamente preparado y atemperado a 45 - 48C 6. Marcador de vidrio 7. Incubadora a 35C 8. Contador de colonias 9. Balanza PROCEDIMIENTO 1. Hacer diluciones de la muestra lquida de acuerdo al tipo de producto. Si es una muestra contaminada deben realizarse diluciones altas En muestras procesadas se hacen diluciones bajas 2. Sembrar en profundidad por duplicado 1 mL de cada una de las diluciones seleccionadas 3. Adicionar de 15 20 mL del agar nutritivo a la temperatura adecuada 4. Mezclar inmediatamente el inculo con el medio, con movimientos circulares de la placa a favor y en contra de las manecillas del reloj, como en ngulo recto. Debe evitarse que el medio impregne la tapa. 5. Dejar solidificar, adicionar una capa sellante de 5 mL sobre la caja y dejar solidificar nuevamente. 6. Una vez solidificado el agar, se vierten las placas e introducen en la incubadora (35C durante 72 horas) .7. Sacar de la incubadora y realizar el recuento 8. Lectura: se deben contar las cajas cuyo nmero de colonias est comprendido entre 30 y 300 UFC. Es conveniente ir marcando las colonias para evitar volver a contarlas. Hallar la media. El nmero contado se multiplica por el factor de dilucin y los resultados se expresarn en unidades formadoras de colonia (UFC) por mL o g, dependiendo del tipo de alimento de partida. 9. Siempre se informan dos nmeros enteros y el resto en exponente. PRACTICA 7 APLICACIONES DE MICROBIOLOGA AMBIENTAL. La microbiologa enfocada en la parte ambiental ha permitido diagnosticar e implementar nuevas alternativas para el desarrollo agrcola, en el mbito de la ingeniera ambiental y la industria. Con los conocimientos adquiridos en el curso y teniendo un conocimiento bsico de la microbiologa, los estudiantes realizaran las siguientes pruebas que actualmente se utilizan a nivel mundial y especficamente en el pas. CONTROL DE CALIDAD EN ABONOS ORGNICOS Y SUELOS POR NMERO MS PROBABLE (NMP)


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Materiales 1. Fracsos con solucin salina 0.85% o agua peptonada al 0.1% (90 ml)

2. Tubos tapa rosca con 9 ml de solucin salina o agua peptonada al 0.1%

3. 15 tubos tapa rosca con 9 ml de caldo de cultivo LBT (Lauryl Tryptose

Broth)

4. 15 campanas durham para observar produccin de gas (dentro de los

tubos de LBT)

5. 15 tubos trapa rosca con 9 ml de caldo de cultivo LMX (FLUOROCULT)

para cultivo de E. coli

6. Reactivo de kovacs

7. Lampara U.V

8. Pipetas de vidrio de 1 ml

9. Muestra de abono orgnico (los estudiantes debern llevar la muestra,

puede ser abono orgnico comercial, lombricompost, humus etc)

Procedimiento 1. Pesar 10 gramos de la muestra, mezclarla con los 90 ml de solucin salina o

agua peptonada.

2. Realizar diluciones seriadas hasta 10-3.

3. Marcar los tubos de LBT y LMX en 3 series de 5, es decir 5 tubos marcados

como 10-1, 5 tubos marcados como 10-2, 5 tubos marcados como 10-3.

4. A partir de las diluciones sembrar 1 ml de cada dilucin en los tubos con los

dos medios.recuerden que por cada dilucin deben inocular 5 tubos de medio.

5. Incubar a 37 por 24 horas

6. Realizar la lectura, la cual se realiza contando el nmero de tubos positivos,

para el caso de coliformes fecales (LBT) se presenta turbidez y presencia de

gas en las campanas durham, sino se presentan los dos fenmenos se

tomarn como negativos)

7. Por ejemplo en la dilucin 10-1 se presentaron 3 tubos positivos, en la dilucin

10-2 1 tubo positivo, en la dilucin 10-3 0 tubos positivos, obtenindose una

combinacin de 310, con ese nmero se dirigen a la tabla de Numero mas

probable segn la EPA-1680 2006.

Deteccin de Pseudomonas en suelos

Numerosos Microorganismos son utilizados como indicadores de

contaminacin en suelos o como posibles agentes en la mitigacin de

derrames de petrleo u otros compuestos derivados del petrleo, tal es el

caso de derrames petroleros, accidentes etc.


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Un microorganismo utilizado en biorremediacin de suelos pertenece al

gnero Pseudomonas.

Materiales

1. Frascos con 90 ml de solucin salina al 0.85% o agua peptonada al 0.1%

2. Tubos tapa rosca para diluciones con 9 ml de solucin salina al 0.85% o

agua peptonada al 0.1%

3. Cajas de Petri con agar King b o cetrimide

4. Rastrillos de vidrio

5. Pipetas de vidrio de 1 ml

6. Suelo procedente del algn sitio de derrame de petrleo o que estp

impactado por derivados del petrleo (suelos de cultivos donde se ha

fumigado) o cualquier suelo.

7. Lampara de luz UV

Procedimiento 1. Pesar 10 g de la muestra y mezclarlos con los 90 ml de solucin diluyente,

agitar bien y realizar diluciones seriadas hasta 10-6.

2. Sembrar 0.1 ml de las diluciones 102, 10-4, 106 en superficie por duplicado,

proceder a hacer siembra masiva con los rastrillos cuidando que no se

rompa el agar, incubar a 30 grados por 4 das.

3. Posterior a la incubacin con ayuda de la lmpara observar las colonias

con fluorescencia o pigmentacin azul verdosa, realizar el recuento de la

dilucin que contenga entre 30 y 300 colonias.

4. Realizar los clculos de la siguiente manera, por ejemplo, en la dilucin 10-

6 se contaron 48 colonias, ese valor se multiplica por el factor de dilucin,

por el factor de correccin as:

48(numero de colonias contadas x106(factor de dilucin) x10(factor de correccin,

es un nmero constante)=48x108UFC/g (UFC hace referencia a unidades

formadoras de colonia)

INDICADORES DE CONTAMINACION DE AGUAS POTABLES

Los indicadores de contaminacin son utilizados para medir el grado de

contaminacin o afectacin de cuerpos de agua, agua de consumo etc, en

Colombia para el caso de aguas potables la normatividad exige un valor de

0 unidades formadoras de colonia en 100 ml de agua muestreada para el

caso de coliformes totales como indicador.

Para esta prueba si el laboratorio de su CEAD, UDR, CERES no tiene los

elementos necesarios para realizarla, debern consultar cual es la


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normativa vigente y qu otros indicadores (microorganismos) se utilizan en

el mbito de contaminacin de aguas.

Materiales

1. Equipo de filtracin por membrana (equipo millipore de plstico)

2. Membrana de nitrocelulosa de 0.45 micrometros para filtacion.

3. Jeringa (para hacer vaco)

4. Cajas de Petri con agar Cromocult para coliformes.

Procedimiento 1. Tomar 100 ml de agua de la llave, la cual se inocular con una asada

de cultivo de E. coli, agitar muy bien.

2. Colocar la muestra en la parte superior de la campana de filtracin y

con la ayuda de la jeringa realizar el vaco para permitir el paso del

agua de un lado al otro.

3. Con unas pinzas estriles retirar la membrana y colocarla sobre el agar

cromocult, la parte de la cuadrcula debe ir mirando hacia arriba.

4. Incubar por 24 horas a 37 c y observar el nmero de colonias con las

caractersticas tpicas de E. coli y coliformes totales (consultar la

coloracin en este medio, se encuentra por internet)

NOTA: SI NO CUENTAN CON LOS MATERIALES DEBEN CONSULTAR LA NORMATIVIDAD Y CMO SE INFORMAN LOS RESULTADOS, DEBEN REALIZAR LOS DIBUJOS CORRESPONDIENTES A LA ACTIVIDAD. EL INFORME DE LABORATORIO SER ENTREGADO AL TUTOR PRCTICO, EL TUTOR PRCTICO REALIZAR LA EVALUACIN CORRESPONDIENTE A LA PRCTICA, L SER EL ENCARGADO DE EVALUAR Y ENTREGAR LOS PUNTOS CORRESPONDIENTES A LA ACTIVIDAD AL DIRECTOR DEL CURSO. Muchos xtitos!!!!

Guia de Laboratorio Microbiologia Ambiental

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