Practicas Microbiologia.2015ok Casa

DETERMINACIN DE MATERIA ORGNICA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTN DE AREQUIPA

FACULTAD DE INGENIERA DE PROCESOS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA QUMICA

GUA DE PRCTICA

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

AUTORES:

Dr. Ing. Ral Omar Gallegos Jara

Ing. Marcia Juana Quequezana Bedregal

Ing. Karina Moran Medina

AREQUIPA PER

2015PROLOGO

El Campo de la Microbiologa en toda su magnitud es indispensable para el desarrollo de las ciencias de la salud humana y animal, para el desarrollo de la agricultura y para el ilimitado campo de los bioprocesos.

Los microorganismos han demostrado ser un enorme potencial para la elaboracin de infinidad de productos tiles al hombre, en la generacin de procesos productivos con menor contaminacin del medio ambiente y con consumos de energa muchos menores.

Los microorganismos son objetos de manipulaciones genticas para que puedan producir sustancias diversas de gran necesidad. Estos microorganismos pueden generar Enzimas que a su vez son empleados como biocatalizadores para los nuevos bioprocesos.

El conocimiento de la microbiologa se hace imperioso para su aplicacin a diversas disciplinas del saber humano. La presente Gua de Prctica se ha desarrollado con el objeto de poner al interesado en el conocimiento sistematizado sobre las tcnicas bsicas del manejo de Microorganismos en laboratorio para estudiantes de Ingeniera Qumica.

Los Autores

NDICE

PROLOGO

NDICEPgs.RECOMENDACIONES GENERALES4

PRCTICA 1: BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA5PRCTICA 2:MICROSCOPIA; OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS IN VIVO, COLORACION VITAL10PRCTICA 3:PREPARACIN DE UN FROTIS BACTERIANO: COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL10

PRCTICA 4:COLORACIONES ESPECIALES: TINCION Y MORFOLOGIA DE HONGOS20PRCTICA 5:EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO, ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIN 30PRCTICA 6:PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO 35PRCTICA 7:SIEMBRA DE MICROORGANISMOS47PRCTICA 8:CARACTERSTICAS CULTURALES: MORFOLOGA DE COLONIAS58PRCTICA 9:CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO63PRCTICA 10:CONTEO DIRECTO DE CLULAS MICROBIANAS67PRCTICA 11:AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MTODO DE DILUCIN EN PLACA49PRCTICA 12:AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL RHIZOBIUM74PRCTICA 13:ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS CONTAMINADAS77

FRMULA Y PREPARACIN DE REACTIVOS USADOS EN LAS DIFERENTES PRCTICAS 80BIBLIOGRAFA83

Recomendaciones Generales1. La hora de entrada tendr 10 minutos de tolerancia, despus de este tiempo, no se permitir al acceso al laboratorio

2. Al entrar al laboratorio, el alumno deber ponerse la bata y abotonarla completamente, slo podr quitrsela al salir de ste.

3. Las mesas debern estar siempre limpias y desocupadas, las mochilas debern ser colocadas en los cajones de las mesas de trabajo.

4. No comer ni fumar en el laboratorio, no introducirse ningn objeto a la boca.

5. Recogerse el pelo para efectuar el trabajo de laboratorio.

6. Limpiar y desinfectar el rea de trabajo antes y despus de usarla.

7. No pasear entre las mesas del laboratorio, el trabajo deber efectuarse sentado y en su equipo de trabajo.

8. Hablar slo lo necesario con los compaeros.

9. Das antes de iniciar la prctica lea cuidadosamente que es lo que se va a realizar, si no entiende pregunte al profesor.

10. Si hay necesidad de llevar material biolgico para la realizacin de la prctica, es necesario conseguirlo de lo contrario la prctica se suspender para todo el equipo.

11. El asa utilizada para el cultivo de microorganismos deber esterilizarse en la flama del mechero, antes y despus de su uso.

12. Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra.

13. En caso de derramar material que contenga microorganismos, cbralo con fenol o benzal y deje actuar diez minutos y de aviso al profesor.

14. Todo el material que se va a incubar o desechar, debe colocarse en el sitio indicado por el profesor.

15. Etiquete todo el material que va a incubar con los siguientes datos: equipo, grupo, fecha, nombre del material e iniciales del nombre del alumno.

16. Despus de la incubacin es necesario la esterilizacin del material para eliminar microorganismos que pudieran hacernos dao a nuestra salud.

17. Lvese las manos con agua y jabn antes de salir del laboratorio.

18. Es obligacin de cada equipo entregar todo el material limpio.

I. OBJETIVOS

Aprender las normas bsicas de bioseguridad en el laboratorio Identificar peligros y riesgos existentes en el laboratorio.

Valorar la importancia de la bioseguridad en el laboratorio

Identificar cada una de las partes del microscopio ptico, conocer su funcin y el cuidado de cada uno de ellas.

Dominar el mecanismo de iluminacin, la observacin de una muestra con todos los objetivos.II. MARCO TEORICO

2.1 BIOSEGURIDAD

La bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas de sentido comn que tienen la finalidad de proteger la salud, la integridad fsica, la seguridad de las personas en un ambiente determinado, frente a diferentes riesgos biolgicos fsicos, psicolgicos y mecnicos.

2.1.1 PRINCIPIOS BASICOS DE LA BIOSEGURIDAD

Universalidad: se deben seguir las normas de bioseguridad rutinariamente en todas las situaciones que puedan dar origen a accidentes, estando o no previsto el contacto con sangre o cualquier otro fluido corporal. Estas precauciones deben ser seguidas en todo momento mientras se est dentro del laboratorioPrecauciones estndar: comprende las medidas a tomar para evitar la contaminacin de una persona, evitando la exposicin directa a sangre y otros fluidos orgnicos potencialmente contaminantes, por ejemplo mediante el uso de barreras, es decir mediante la utilizacin de materiales adecuados que se interpongan al contacto de los mismos. La utilizacin de barreras por ejemplo guantes no evitan los accidentes de exposicin a estos fluidos, pero disminuyen las consecuencias de dicho accidente 2.1.2 PRECAUCIONES ESTANDAR

Barreras de proteccin

Lavado de manos

Desinfeccin y esterilizacin.

Manejo de objetos punzo cortantes.

Manejo y eliminacin de desechos

Ventilacin e iluminacin adecuadas

Limpieza y desinfeccin de ambientes2.1.3 VAS DE CONTAMINACIN

1. La boca Comer, beber y fumar en el laboratorio. Realizar transferencias con pipetas sin utilizar ningn tipo de proteccin.2. La piel Cortaduras o rasguos. Transferencia indirecta de microorganismos a travs de los dedos o utensilios contaminados (lpices, bolgrafos, etc.).3. Los ojos Salpicaduras de materiales infecciosos. Transferencia indirecta de microorganismos a travs de los dedos contaminados.4. Los pulmones Inhalacin de microorganismos transportados por el aire (aerosoles).2.1.4 BARRERAS DE PROTECCION

Lavado de manos (antes y despus)

Guantes

Mascarilla o barbijo

Mandil

Gorro

2.1.5 NORMAS DE BIOSEGURIDAD

Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y otros objetos personales en el lugar que se les indique para tal fin. Llevar puesto el mandil de laboratorio en todo momento, que debe permanecer completamente cerrado. Limpiar y descontaminar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar la sesin prctica. Lavar las manos con agua y jabn: antes de realizar las actividades programadas antes de salir del laboratorio despus de usar materiales contaminantes. Recoger el cabello largo. Evitar desplazamientos innecesarios, movimientos bruscos. Hablar slo lo indispensable. No comer, beber, fumar. Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de iniciar las actividades indicadas en la prctica. Si usted tiene alguna duda, dirjase al profesor. Usar mascarillas para casos indicados2.2 MICROSCOPIA

El microscopio permite la observacin de estructuras muy pequeas que no pueden ser vistas a simple vista. El poder de resolucin de un microscopio est en relacin inversa a la longitud de onda de la luz usada.

2.2.1.- PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

1. Parte mecnica:

Pie

Columna (pilar, charnela y brazo)

Tubo: Revlver

Tornillo macromtrico o sistema de movimiento rpido

Tornillo micromtrico o sistema de movimiento lento

Platina: Pinzas sujetadoras de lminas y mandos coaxiales Subplatina: Pieza que asciende y desciende condensador, anillo porta filtros, diafragma iris y soporte para el espejo

2. Parte ptica del Microscopio:

Oculares: lentes situados donde va del ojo del observador

Objetivos: lentes situados en el lado de la muestra

Los objetivos traen impresas las siguientes caractersticas:

Magnificacin: Ej. x 25 Apertura numrica (A.N.): Ej. 0,45 Cualidades de la lente: Ej. Plan cuando se refiere a un objetivo Planacromtico Longitud del tubo: Ej. 160 mm

Correccin de espesor de laminilla Ej. 0,17 mm

Aparato de iluminacin. comprende: Espejo, Condensador, Diafragma

2.2.2.- USO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

1. El M.O. debe agarrarse siempre del brazo, nunca del tubo o platina porque deteriora el tornillo micromtrico.

2. Disponer el M.O. en una mesa horizontal y a una altura conveniente para observar sin fatiga Verificar que los oculares estn limpios y en posicin correcta.

3. Cuando se observe preparaciones fijas, puede inclinar el tubo del M.O. para una mejor comodidad si se trata de Microscopios que no posean el sistema inclinado. Si se observan preparaciones frescas oin vivo debe mantenerse la platina horizontal.

4. Verificar que los objetivos en el revlver estn en orden progresivo de aumento.

5. Coloque el objetivo de menor aumento en el eje ptico girando el revlver hasta que haga clik.

6. Suba el condensador hasta que la lente superior este muy cerca de la platina y abra el diafragma totalmente.

7. Si el Microscopio tiene luz incorporada, encender el interruptor y si tiene espejo orientarlo hacia la ventana mejor iluminada o al fluorescente ms cercano.8. Observe por el ocular la iluminacin del campo y trate de lograr la mxima luminosidad moviendo el espejo; luego, si es necesario baje ligeramente el condensador.9. Colocar en la platina el preparado a estudiar, cuidando que la laminilla cubreobjetos quede hacia arriba, la etiqueta hacia la derecha del observador y que el preparado se encuentre entre el condensador y el objetivo; es decir, atravesado por los rayos de luz. Este desplazamiento se logra utilizando los mandos coaxiales.10. Para iniciar la observacin, emplee siempre el objetivo de menor aumento (panormico 10X) y procure que la distancia objeto-objetivo sea la mnima (5 mm.), esto se logra bajando el tubo con el tomillo macromtrico y observando por un lado del Microscopio el descenso del mismo. Luego, observe por el ocular y simultneamente suba al tubo con el tomillo macromtrico hasta enfocar el elemento en estudio, de inmediato utilice el tomillo micromtrico para dar nitidez a la imagen. Finalmente recorra la lmina con la ayuda de los mandos coaxiales para su observacin integral, siempre utilizando el tomillo micromtrico para no perder la nitidez.Cuando se trate de Microscopios en donde la platina asciende al utilizar el tomillo macromtrico, la distancia objeto-objetivo debe ser de 1 a 1,5 cm.

11. Regular el diafragma iris hasta obtener las mejores condiciones de contraste.

12. El elemento que desee observar a mas aumento coloque en el centro del campo y cambie de objetivo girando el sistema de revlver, teniendo cuidado de girar el objetivo del siguiente aumento (45X) y NO el de inmersin. Ponga ntida la imagen nicamente con el tomillo micromtrico.Es importante tener en cuenta que para cambiar de un aumento a otro no debe manipularse con el tomillo macromtrico porque corre el riesgo de romper la lmina o la lente frontal del objetivo.

13. Para observar las estructuras con objetivo de inmersin, coloque el elemento seleccionado en el centro del campo y gire un poco el objetivo, de manera tal, que quede libre ste sector de lmina para que pueda colocarse una gota de aceite de inmersin. Luego, contine girando el revlver hasta que el objetivo de inmersin (100X) contacte con la gota y encaje en el eje ptico; finalmente, observe por el ocular y aclare la imagen solamente con el tomillo micromtrico.

Una vez terminada la observacin limpie el objetivo de inmersin y la lmina con el campo ligeramente humedecido con alcohol isoproplico o metanol.

2.2.3.-AUMENTOS DEL MICROSCOPIO Y CLCULO APROXIMADO DE DIMENSIONES CELULARES

1. Para calcular el aumento del Microscopio, multiplique el aumento del objetivo por el del ocular.

Ej.:Objetivo 40X y Ocular 10X

40 x 10 = 400 aumentos

2. Para el clculo aproximado de dimensiones celulares, se debe conocer el dimetro del campo microscpico que vara de acuerdo al objetivo que se usa.

Dimetro del campo microscpico

OcularObjetivoDimetro del campo en micras

10X10X1500

10X45X400

10X100X150

Ejemplo:Si observamos una clula epitelial al Microscopio con objetivo 10X y ocular 10X, y si sta ocupa la tercera parte del campo microscpico, concluiremos que la clula mide aproximadamente 500 micras; es decir, la tercera parte de 1500.

2.2.4.- CUIDADOS DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

1. El Microscopio debe tomarse por el brazo, nunca por el tubo la platina, porque a la larga deteriora el tomillo micromtrico.

2. Los objetivos y oculares constituyen la parte ms delicada del Microscopio, por lo que debe tenerse sumo cuidado en su uso. As, el enfoque debe hacerse suavemente, evitando que la lente frontal del objetivo roce el cubre objetos. Por ninguna razn debe desmontarse los objetivos.El objetivo de inmersin no debe usarse en seco y debe quedar escrupulosamente limpio despus de su uso, para lo cual use el campo ligeramente humedecido con alcohol isoproplico o metanol.

3. Al finalizar la observacin microscpica, coloque el objetivo de menor aumento en el eje ptico dejando un espacio de 2 cm. entre ste y la lentilla del condensador, luego apague la luz.

III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Proceda a enfocar una muestra, con objetivo 4X, 10 X, 40 X y 100X.Observe las diferencias en el campo ptico y el acercamiento.

IV. CUESTIONARIO

1. Realice un dibujo del microscopio y seale sus partes?

2. A qu se denomina campo ptico?

3. Por qu decimos que nuestro microscopio tiene sistema parafocal.

4. Qu es el poder de resolucin 5. qu entiende por bioseguridad

6. Identifique 3 situaciones de peligro y 3 de riesgo en el laboratorio.

7. qu barreras de proteccin debe tener en cuenta antes de empezar a trabajar.

8. Cmo promovera la cultura de bioseguridad.

I. OBJETIVOS

1) Conocer la morfologa de organismos unicelulares.

2) Conocer los distintos mtodos de observacin de microorganismos in vivo.

II. OBSERVACIN IN VIVO DE ORGANISMOS UNICELULARESIndicaciones:

1. Ilumine correctamente su Microscopio, cuidando que la platina est en posicin horizontal.2. Coloque la lmina porta objetos en su Microscopio.

3. Ponga una gota del agua estancada en el centro de la lmina de manera que la luz del Microscopio la atraviese.

4. Proceda a enfocar con menor aumento y observar que tiene exceso de iluminacin y poca visin de la muestra corrija ste defecto bajando el condensador y cerrando un poco el diafragma iris.

5. Observar elementos fijos, con pocos movimientos y veloces que tienen caractersticas especiales y un fondo de partculas de tierra y cristales grises y oscuros. Pueden distinguirse:

Algas, como la espirogira, de color amarillento verdoso a manera de pequeas escaleras en cuyo interior se observan los cloroplastos.

Diatomeas, de diferentes formas y tamaos, se las distingue porque son brillantes, amarillentas, poco mviles; van desde la forma de un barril pequeo hasta cigarros o prismas.

Parameccium, de gran movilidad, atraviesan raudamente el campo de observacin. Son protozoarios que tienen forma ovoide, de zapatilla y se caracterizan por presentar su cuerpo rodeado de cilios. En su interior observar el ncleo y vacuolas.

Tambin puede observarse a la stilonichia, ms pequea que el Parameccium y con un pelo o cerda en un extremo.

Algunas veces se visualiza a la Euglena Viridis, caracterizada por presentar un flagelo largo (Protozoario flagelado).

La ameba, difcil de visualizar por su transparencia, presenta pocos movimientos y se desplaza lentamente emitiendo pseudpodos en la superficie de su cuerpo.

Tambin puede encontrar Vorticelas, tienen forma de cliz, con un pedicelo largo y delgado, generalmente viven en colonias. La superficie del cliz est rodeada de cilios.

6. Luego, coloque una gota de colorante vital (rojo neutro o azul de metileno) en su preparado y observe nuevamente los organismos unicelulares.

7. Haga un dibujo de lo observado y coloque los nombres correspondientes.

Grafique la Observacin y Resultados

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III. EXAMEN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS

1. Examen en Fresco

Es la forma ms simple de realizar la preparacin de un espcimen para su examen microscpico.

Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos.

Hay 2 tipos de tcnicas:

a. Preparacin en fresco simple entre porta y cubre.

Consiste en colocar una gota de lquido con los microorganismos sobre un porta objetos y luego cubrirla con un cubreobjetos.

b. Gota pendiente

Consiste en colocar una gota de lquido con microorganismos en un cubreobjetos y cubrirlo con un portaobjetos (de forma invertida) con una excavacin central (portaobjetos excavados). Se debe sellar la preparacin con vaselina alrededor de la excavacin.

La ventaja de esta preparacin es que no se seca y puede ser observada durante un tiempo ms largo.2. Coloraciones Vitales Son los montajes de materia viva teidos. Suelen utilizarse para ello, determinados colorantes (azul de metileno, rojo neutro) a muy baja concentraciones (1/1000, 1/10000). Su objetivo es facilitar la observacin, mediante el colorante de la morfologa y la estructura bacteriana, pero sin provocar alteraciones celulares ni destruir la bacteria.

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

EXAMEN DE MICROORGANISMOS VIVOS

Este examen permite observar microorganismos vivos, se realiza con la finalidad de observar caracteres de movilidad, morfologa, agrupacin, observacin de huevos y quistes de parsitos.

EXAMEN EN FRESCO

Material

Microscopio

Lminas cubreobjetos

Lminas portaobjetos

Agua destilada

Asas de Kolle

Grmenes varios

Muestras fermentadas

Cultivo de microorganismos

Metodologa

Si la muestra proviene de un lquido, con un asa de kolle se coloca una gota de lquido sobre un portaobjeto, sobre el que se coloca un cubreobjeto.

Si la muestra proviene de un cultivo slido, se deposita primero una gota de suero fisiolgico sobre el portaobjetos, para luego con la ayuda del asa de kolle realizar una suspensin y colocar un cubreobjetos.

Observar al microscopio con objetivo 40X.


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COLORACIONES VITALESEstos tipos de exmenes pueden considerarse como preparaciones en fresco o como tcnicas intermedias entre stas y las preparaciones fijadas y coloreadas. Son montajes de materia viva teidas.

Material. Microscopio, Lminas portaobjetos, a examinar, Cubreobjetos, Solucin de azul de metileno (1/1000), Asas de platino, Grmenes diferentes

Procedimiento

Sobre el portaobjeto colocar una gota de colorante azul de metileno (l/l000). Colocar una gota de la muestra a examinar y con ayuda de una asa de kolle mezclar. Seguir el procedimiento (muestra liquida o slida). Observar al microscopio con el objetivo de 40X.


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V. CUESTIONARIO

Qu ventajas y desventajas ofrece una preparacin en fresco?

Qu ventaja presenta una preparacin gota pendiente?

Realice un dibujo del microscopio y seale sus partes?

I. OBJETIVOS

. Observar clulas muertas en frotis seco y teidas con diferentes procedimientos de coloracin.

II. MARCO TEORICO

Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeos y su protoplasto posee un ndice de refraccin cercano al agua, se requiere generalmente tinciones biolgicas para visualizarlos adecuadamente o demostrar el detalle de sus estructuras internas.

Los colorantes estn constituidos en su mayora por el anillo bencnico, y difieren uno de otro en cuanto al nmero y disposicin de estos anillos y a la sustitucin de los tomos de hidrgeno por otras molculas. Algunos de los grupos cromforos ms comunes hallados en los colorantes son: C=C, C=O, C=S, C=N, N=N, N=O, NO2.

La intensidad de coloracin de colorante es proporcional al nmero de radicales cromforos del compuesto.

2.1.- COLORACIONES DIFERENCIALES

PARED CELULAR

El espesor oscila generalmente entre 0.150 m y 0.500 m de espesor, pudiendo incluso alcanzar 0.8 m (Lactobacillus). Las paredes de las clulas jvenes son ms delgadas que las clulas de cultivo antiguo.

GRAMPOSITIVAS. La pared celular de las Grampositivas est constituida principalmente por cadenas de peptidoglucano, a menudo unidas por puentes peptdicos.

Sin embargo estas clulas contienen tambin una gran cantidad de cidos teicocos, polmeros de glicerol y ribitol unidos por grupos fosfato y aminocidos como D-alanina o azcares como la glucosa estn unidos a los grupos glicerol y ribitol.

GRAMNEGATIVAS. Presentan 3 capas de envoltura distintas, dispuestas de manera laxa, estas incluyen la membrana externa (ME), con voluta, arrugada con surcos u ondulante, que contiene el antgeno o somtico conocido como lipopolisacrido LPS, una capa densa intermedia, y la membrana plasmtica interna. Un espesor de 0.0075 m.

2.2.- PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS

Este tipo de preparaciones son las ms frecuentes, tanto las obtenidas directamente a partir de muestras clnicas como las obtenidas a partir de desarrollo de cultivos.

Los pasos a seguir para la realizacin de una preparacin fijada y coloreada son:

a. Confeccin del Frotis. Puede prepararse a partir de productos lquidos o slidos.

Producto lquido. Para preparar un frotis, se coloca sobre un portaobjetos de vidrio limpio y seco, una gota del material a estudiar y se extiende con ayuda del asa de platino.

Cultivo en medio slido. puede prepararse una suspensin del material en una gota de solucin salina colocada previamente en el portaobjetos, extendindola con ayuda del asa de platino.

b. Secado. Se dejar secar el frotis a temperatura ambiente.

c. Fijacin. La fijacin tiene como objeto la inmovilizacin de las estructuras del material a estudiar en un estado lo ms prximo posible al estado vivo. Consiste en una muerte rpida de los microorganismos, debida a la coagulacin de las albminas protoplsmicas. Existe un gran nmero de fijadores, tanto en forma simple (etanol, cido pcrico). Las formas ms habituales de fijacin son: por el calor y alcohol en fro.

d. Coloracin. Es el proceso de coloracin de los microorganismos.

e. Lavado. Eliminacin del exceso de colorante.

f. Secado. Se secar la preparacin al aire.

CLASIFICACIN DE LAS COLORACIONES

La clasificacin de los colorantes es algo confusa, pero est basada en los cromforos presentes.

a. Segn su estructura qumica. Pueden clasificarse como cido o Bsico, trmino que no ndica sus reacciones de pH en solucin, sino, si una parte de la molcula es aninica o catinica.

Los colorantes bsicos, tien estructuras de naturaleza cida, como la cromatina nuclear de las clulas. Ej: Cristal violeta, Violeta de Genciana, Verde de Malaquita. Safranina.

Los colorantes cidos, reaccionan con sustancias bsicas, tales como estructuras citoplsmaticas, y como colorante de contraste. Ej: cido pcrico.

Los colorantes neutros, cuando se asocia un colorante cido con uno bsico. Ej: Wright, Giemsa, Hematoxilina - Eosina.

Los colorantes indiferentes, suelen ser insolubles en agua y solubles en alcohol. Ej: Sudn III.

CLASIFICACIN DE LAS TINCIONES

a. Tinciones Simples. Son las que utilizan un solo colorante y permiten conocer la morfologa y tipo de agrupacin bacteriana. ejplo. Tincin azul de metileno, Tincin fucsina.b. Tinciones Diferenciales. Utilizan ms de un colorante y sirven para poner de manifiesto las caractersticas de afinidad de los microorganismos por ciertos colorantes como; Tincin Gram, Tincin cido-alcohol resistente.

c. Tinciones Estructurales. Utilizan ms de un colorante y sirven para poner de manifiesto estructuras bacterianas. como; Tincin de flagelos, Tincin de esporas, Tincin de cpsulas, Tincin de corpsculos metacromticos

III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

3.1. PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS

Preparacin del Frotis

Flamee el asa para siembra hasta que se ponga al rojo vivo. Sostenga el asa inmediatamente arriba de la porcin azul de la flama. Ponga el asa tan cerca de la posicin vertical como sea posible. Djela enfriar (cuente hasta 20).

Tome una porcin de la muestra que se va examinar, colocando el asa en posicin plana en la superficie del lquido.

Coloque el asa sobre el portaobjeto y aplnese ligeramente en el centro de ste (el portaobjeto deber estar numerado).

Sosteniendo todava el asa aplanada sobre el portaobjeto muvala trazando una espiral del centro a la periferia. Debe dejar cierto espacio entre la muestra y cada uno de los 4 lados del portaobjetos.

Flamee de nuevo el asa hasta que est al rojo vivo para destruir cualesquiera bacterias que se encuentren en ella.Fijacin Confirme que el frotis se ha secado completamente al aire libre.

Pase el portaobjeto tres veces a travs de la llama del mechero de Bunsen, con la muestra hacia arriba.

Djelo enfriar antes de aplicar la tincin.

3.2. TINCIONES SIMPLESMaterial. Microscopio, Lminas portaobjetos, Azul de metileno (solucin acuosa al 1%), Safranina (solucin acuosa 1%), Asas de platino, Grmenes diferentes, Aceite de inmersin, Xilol

TINCIN DE AZUL DE METILENO

Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorcin del colorante por los diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las esporas absorben el colorante con dificultad son as fcilmente diferenciables.

Procedimiento

Tome una lmina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un frotis.

Con l esa tome una pequea porcin del cultivo en medio slido y disuelva en la gota de agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua). Los frtices que se obtengan no deben ser ni muy gruesos m muy finos.

Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la fijacin del frotis.

Cubrir la preparacin con el colorante (2 o 3 gotas) y se deja actuar de unos 5 minutos.

Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso de colorante.

Secar al aire, a temperatura ambiente.

Observar al microscopio con lente de inmersin. (100X) y con aceite de inmersin.Grafique la Observacin y Resultados

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TINCIN DE SAFRANINA

Las bacterias aparecen de color rojo.

Procedimiento

Tome una lmina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un frotis.

Con el asa tome una pequea porcin del cultivo en medio slido y disuelva en la gota de agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua). Los frtices que se obtengan no deben ser ni muy gruesos ni muy finos.

Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la fijacin del frotis.

Cubrir la preparacin con el colorante de safranina (2 3 gotas) y se deja actuar de unos 5 minutos.

Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso de colorante.

Secar al aire, a temperatura ambiente.

Observar al microscopio con lente de inmersin. (100X) y con aceite de inmersin.


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3.3. COLORACIONES DIFERENCIALES

Material. Microscopio, Lminas portaobjetos, Set para la coloracin de Gram, Asas de platino, Grmenes diferentes, Aceite de inmersin, Xilol

TINCIN GRAM

El cristal violeta acta como un colorante primario, que se une a la pared celular bacteriana luego de un tratamiento con una solucin dbil de iodo (Mordiente). Algunas bacterias debido a su naturaleza qumica de sus paredes celulares, poseen la capacidad de retener el cristal violeta, an luego del tratamiento con un decolorante orgnico, tal como una mezcla de alcohol y acetona. Tales bacterias se denominan Grampositivas.

Las bacterias Gramnegativas debido a su mayor contenido lipdico en su pared celular, pierden la coloracin primaria del cristal violeta cuando son tratadas con el decolorante. El colorante secundario o de contraste utilizado es la safranina. Las bacterias Gramnegativas que han perdido el cristal violeta, aparecen rojas o rosadas vistas al microscopio, habiendo fijado la safranina como contracolor a sus paredes celulares.

Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorcin del colorante por los diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las esporas absorben el colorante con dificultad son as fcilmente diferenciables.

Reactivos

Solucin de Cristal Violeta(Cristal violeta= 1.0 g, Alcohol 95= 20 ml, Agua destilada csp=100 ml)

Solucin de Lugol (Yodo en cristales, 1.0 g, Yoduro de potasio= 2.0 g, Agua destilada=100 ml)

Decolorante (Acetona= 50 ml, Etanol= 50 ml) Etanol comercial Safranina ( Safranina=0.25 g, Alcohol 95= 10 ml, Agua destilada csp=100 ml)

Procedimiento

Coloque una asada de caldo nutritivo que contiene una mezcla de bacterias Grampositivas y Gramnegativas sobre una lmina portaobjeto limpia.

Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la fijacin del frotis, con la finalidad de que el material no sea arrastrado durante el proceso de tincin.

Colocar el preparado sobre un soporte de tincin y cubrir la superficie con solucin de cristal violeta por 1 minuto. Lavar bien con agua de cao.

Cubrir el preparado con Iodo de Gram durante 1 minuto. Lavar con agua.

Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el ndice y baar la superficie con unas gotas del decolorante acetona-alcohol hasta no arrastrar ms colorante violeta. Se requiere unos 10 segundos ms o menos. Tambin puede utilizar etanol comercial como decolorante , en este caso dar ms tiempo aproximadamente 1 minuto. Cubrir la superficie con la safranina durante 1 minuto. Lavar con agua de cao.

Secar al aire, a temperatura ambiente. Observar al microscopio con lente de inmersin. (100X) y con aceite de inmersin.Grafique la Observacin y Resultados

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IV. CUESTIONARIO

1. Qu es un colorante y cules son sus propiedades?

2. Por qu se le llama a un colorante cido o bsico?

3. A qu se debe la afinidad que tiene un colorante por la bacteria?

4. De qu manera influye el pH en la coloracin?

5. Por qu es necesario utiliza mtodos de tincin para visualizar a las bacterias?

6. Escriba la estructura del azul de metileno y safranina

7. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de bacilos

8. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de espirales

9. Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos grampositivos y explique la funcin que cumple cada uno de ellos.

10. Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos gramnegativos y explique la funcin que cumple cada uno de ellos.

11. Explique el fundamento de la coloracin de Gram y esquematice.

12. A qu se denomina mordiente y mencione tres ejemplos?

13. Mencione tres razones por las que un microorganismo grampositivo se observa gramnegativo.

14. Dibuje la estructura del colorante cristal violeta

15. Mencione tres microorganismos (gnero) que sean cocos grampositivos, bacilos, grampositivos, cocos gramnegativo y bacilos gramnegativos.

I. OBJETIVOS

Distinguir las caractersticas macroscpicas y las estructuras microscpicas de los Aspergillus, Penicilium y Rhizopus Conocer mediante las caractersticas macroscpicas y microscpicas las especies de Aspergillus, Penicilium y Rhizopus

Conocer la aplicacin de los gneros Aspergillus, Penicilium y Rhizopus en la industria.

II. MARCO TERICO

1. ASPERGILLUS

A. CARACTERISTICAS MICROBIOLOGICAS

Caractersticas morfolgicas del hongo: tamao y forma de las cabezas conidiales, Morfologa de los conidiforos, filides y metulas, y en la presencia de clulas de Hulle y de esclerocios. En la siguiente figura se muestra las principales estructuras morfolgicas del gnero Aspergillus:

B. ETIOPATOGENIA

Se origina por hongos omnipresentes y oportunista que vive como saprofitos en el suelo, vegetales en descomposicin, cualquier tipo de materia orgnica como pintura fresca, alimentos enlatados abiertos, ropa vieja, recipientes con agua sin usar, reactivos qumicos, paredes de refrigeradores, sistemas de ventilacin, cuartos de hospital, lentes de contacto blancos, en las capas altas de la atmosfera.

Las especies que actan como patgenos son termotolerantes. Tras la exposicin a grandes cantidades de conidios, penetran por inhalacin o se instalan de manera saprofitica en una cavidad pulmonar de cualquier origen, como cavernas por TBC.

C. APLICACIONES INDUSTRIALES

En la produccin de enzimas que se emplean en la industria molinera y panadera:

ALFA y BETA-AMILASA.

El nombre de diastasas corresponde a un sinnimo de las amilasas, aunque se usa Principalmente para designar la alfa-amilasa, que se extrae de cereales.

Origen de alfa-amilasa'. Fngico (Aspergillus oryzae), de cereales y del pncreas.

En la produccin de enzimas que se aplican en la industria de alimentos azucarados.

INVERTASA O SACARASA.

Origen y accin'. La hidrlisis de la sacarosa en glucosa y fructosa (azcar invertido) puede ser realizada por dos enzimas: la betafructosidasa, que acta sobre el extremo fructosa de la molcula de sacarosa, y la alfa-glucosidasa, que la ataca por el extremo de la glucosa. Actualmente, se entiende generalmente por "invertasa" la beta-fructosidasa, que es producida por levaduras (Sacaromyces cerevisiae, Candida), mientras que la alfa-glucosidasa constituye preferentemente las invertasas intestinales y de hongos (Aspergillus oryzae).Rango de pH: 4-6.

La aplicacin de enzimas en los detergentes

Las enzimas optimizan la eficiencia de los detergentes, a la vez que permiten el trabajo de limpieza a bajas temperaturas y perodos ms cortos de lavado.

Las enzimas usadas en los detergentes de lavado de ropa actan sobre los materiales que constituyen las manchas, facilitando la remocin de estos materiales y de forma ms efectiva que los detergentes convencionales.

Lipasas: Las lipasas deben mezclarse con los lpidos para romperlos por hidrlisis, pero las lipasas son solubles en agua y los lpidos son insolubles en agua. Por lo tanto, la hidrlisis slo ocurre en la interfase entre la gota lipdica y la fase acuosa, lo que causa que la reaccin sea relativamente lenta e inefectiva. Se busca desarrollar lipasas que permitan la remocin de manchas de grasas a bajas temperaturas de lavado. Una combinacin de bsqueda y manipulacin gentica ha conducido a la introduccin reciente de lipasas en los jabones en polvo. Un ejemplo es la lipasa Hamicola , que se logr producir en Aspergillus otyzae y que se conoce como "Lipolasa".

Preparativos de celulasas comerciales y aplicaciones en procesos extractivos Extraccin de aceite. El uso de algunos preparados celulolticos en el proceso de extraccin ha tenido un efecto positivo sobre el rendimiento de la extractabilidad del aceite. El efecto de un preparado enzimtico producido por Aspergillus fumigatus fue evaluado sobre la extraccin del aceite de soya. En condiciones ptimas, el contenido de aceite de soya extrable (24.9 % en base seca) y el porcentaje de recuperacin del aceite de soya (99 %).El efecto de una enzima cruda obtenida de Aspergillus fumigatus, con actividad mixta principalmente celulasa, hemicelulasa, quitinasa, xilanasa, pectinasa y proteasa; sobre el rendimiento en la extraccin de aceite a partir de las semillas de ajonjol, de cacahuate y de girasol. Los niveles de porcentaje de aceite extrado fueron de 51.4 a 56.7 % para el aceite de ajonjol, de 51.0 a 53.2 % en el caso del aceite de cacahuate y de 55.3 a 57.1 %Extraccin de colorantes. La extraccin de colorantes es otra aplicacin atribuida a algunos preparados enzimticos.

Extraccin de antioxidantes con preparados enzimticos con actividades mixtasmixtas

El preparado enzimtico comercial Grindamyl pectinasa, con actividad mixta principalmente pectinasa, pero ambin celulasa y hemicelulasa, producido por Aspergillus niger, no slo fue efectivo al aumentar la extraccin de los fenoles debido a la degradacin de los polisacridos (celulosa,.hemicelulosa y pectina) que constituyen la pared celular de la cascara de uva, sino que mejor tambin la actividad antioxidante de los extractos fenlicos

2. PENICILLIUM

Las especies de Penicillium son reconocidas por su denso cepillar como las estructuras del espora-cojinete.

Los conidiforos son simples o ramificados y son terminados por los racimos de fales en forma de botella.

Las esporas (conidios) se producen en cadenas secas de las extremidades de los fialides, con la espora ms joven en la base de la cadena, y son casi siempre verdes.

La ramificacin es una caracterstica importante para identificar especie del penicillium. Algunos son no ramificado y llevan simplemente un racimo.de fialides en la tapa del estpite. Otros pueden tener un racimo de ramas, cada cojinete un racimo de fialides. Un tercer tipo tiene ramas el llevar de una segunda pedido de ramas, llevando alternadamente un racimo de fialides. Estos tres tipos de sistemas del cojinete de la espora (penicilli) se llaman monoverticillate, biverticillate y terverticillate respectivamente.

Colonias de crecimiento rpido, vellosas, aterciopeladas, verdosas con una corona radial ancha y blanca, a 25 C (no crecen o crecen pobremente a 37 C) (Figura 66). Puede haber gotas de exudado sobre la superficie de la colonia. Reverso habitualmente amarillento o cremoso. Esporulacin abundante. Olor aromtico, especiado o afrutado (a manzanao a pina).

ECOLOGIA

El Penicillium es gnero grande y difcil encontrado casi por todas partes, y generalmente el gnero ms abundante de hongos en suelos. La ocurrencia comn de la especie del Penicillium en alimento es un problema particular. Unas ciertas especies producen las toxinas y pueden hacer el alimento no comestible o an peligroso. Es una buena prctica desechar los alimentos que demuestran el desarrollo de cualquier moho.

Se le encuentra en el polvo domstico, en los edificios hmedos y mohosos donde deteriora diferentes materiales de construccin, entre los que resaltan el papel de decoracin (crece bien en la cola empleada para su adhesin a las paredes). No muestra una notable variacin estacional. Las mximas concentraciones de conidios en el aire se alcanzan en invierno y primavera (mayores en las reas urbanas que en las rurales).

APLICACIONES DEL PENICILLLIUM

Por otra parte unas ciertas especies de Penicillium son beneficiosas a los seres humanos. Los quesos tales como Roquefort, Brie, camembert, Stilton, etc. se maduran con la especie de Penicillium y son absolutamente seguros de comer.

La cepa de Penicillium notatum aislada por A. Fleming produca 2 mg de penicilina por cada litro de cultivo, posteriormente se encontr que otros Penicillium eran mejores productores de penicilina y se eligi a Penicillium chrysogenum como cepa sper productora de este antibitico. Finalmente, la seleccin de sucesivos mutantes sper productores y la mejora en las tcnicas de fermentacin realizadas por la industria biotecnolgica han hecho que actualmente se obtengan 20 g/L de penicilina Se le emplea en la produccin de algunos alcaloides como la roquefortina C, meleagrina y chrisogina.

Incluye las siguientes especies:

Penicillium bilaiae

Penicillium camemberti, que es usado para producir los quesos camembert y brie. Penicillium candida, dem. Penicillium glaucum, que es usado para producir queso gorgonzola. Penicillium marneffei, que desarrolla una micosis sistmica emergente que afecta a roedores y humanos, especialmente a personas inmunodeprimidas, conocida como penicilioisis Penicillium notatum, que es usado para producir la penicilina. Penicillium purpurogenum Penicillium roqueforti, que es usado para producir los quesos roquefort, danish blue y recientemente tambin gorgonzola III. PROCEDIMENTO A. MATERIAL Asa de kolle KOH al O% Mechero Azul de lactofenol Lminas portaobjetos Lminas cubreobjetos MicroscopioB. MATERIAL BIOLOGICO Cultivo de Aspergillus flavus Cultivo de Aspergillus niger Cultivo de Aspergillus fumigatus Cultivo de PenicilliumC. REACTIVOSC.l. Hidrxido de potasio al 10%

KOH10 g

Agua destilada100 mlC.2. Azul de lactofenol.

Fenol20 g

cido lctico20 g

Glicerol40 mlAgua destilada20 mlDisolver los componentes antes mencionados y despus se agrega el colorante.

Se puede emplear cualquiera de los siguientes:

Azul de algodn0.05g

Azul de metileno0.05 gAzul de cotton de Perrier0.05 g1. EXAMEN DIRECTO CON KOH 10%

Se realiza a partir del esputo, membranas expectoradas o fragmentos de tejido que se obtienen por broncospia.

Se encuentran filamentos hialinos, largos, sinuosos y ramificados de 3 a 4 de dimetro. En los aspergilomas puede observarse masas de filamentos con sus cabezas aspergilares. Se puede trabajar a partir del cultivo, con la finalidad de observar sus estructuras que permitan identificar el gnero.

Colocar una gota de KOH al 10% en un portaobjeto y mezclar con una pequea cantidad del material a examinar (micelio areo proveniente del cultivo).

Colocar un cubre objeto (18 x 18 mm) sobre la gota.

El hidrxido de potasio acta disolviendo la queratina e intensificando el contraste de las estructuras fngicas con otros materiales presentes en este preparado microscpico.

Examinar microscpicamente en busca de hifas u otras estructuras nicticas.

2. CULTIVOS

Se realiza en los medios habituales sin cicloheximida, Agar Sabauraud. Las colonias crecen con rapidez, son de color blanco y por la produccin de esporas se tornan de diferentes colores. La superficie es aterciopelada o pulvurulenta. Estos hongos se diferencian por el aspecto y pigmentacin de la colonia.

2.1. AGAR SABOURAUD

A. FUNDAMENTO

Es un medio recomendado para el aislamiento de hongos, particularmente a aquellos asociados a infecciones dermatolgicas. Su bajo pH inhibe el desarrollo de muchas bacterias contaminantes que pueden estar presentes en la muestra.

B. COMPOSICION

C. PREPARACION

IV. RESULTADOSA. ASPEGILLUS NIGER

Caracteres MacroscpicosCaracteres Microscpicos

B. ASPERGILLUS FUMIGATUS


C. ASPEGILLUS FLAVUS


D. PENICILLIUM


3. RHYZOPUSLas especies del Rhizopus son hongos filamentosos cosmopolitas encontrados en suelo, fruta que se decae y las heces del vehculo, animales, y el viejo pan. En ciertas especies del Rhizopus son causas ocasionales del zygomycosis (phycomycosis). Pueden causar infecciones serias (y a menudo fatales) en seres humanos y animales debido a su tarifa de crecimiento rpida. En ciertas especies son patgeno de la planta, y uno, oligosporus del Rhizopus, se utiliza en la produccin del tempeh, un alimento fermentado derivado de las sojas.

Las especies del Rhizopus producen las esporas de dos diversas maneras. Los sporangiospores son el interior producido a pinhead-como la estructura, el esporangio, y son gentico idnticos a su padre, los zygospores se producen despus de que dos mycelia se fundan durante la reproduccin sexual, y dan lugar a las colonias que pueden ser gentico diferentes de sus padres.

EL GNERO MUCORSe caracteriza por no formar estolones ni rizoides. Por estos motivos, sus especies invaden lentamente los medios de cultivo.

EL GNERO RHYZOPUS

Posee estolones y rizoides, razn por la cual invaden rpidamente los medios de cultivo. En este Gnero los esporangiforos nacen en los nudos de los estolones, o sea sobre los rizoides.

EL GENERO ABSIDIA

Los esporangiforos derivan internodalmente de segmentos de hifas entre rizoides. APLICACIONES INDUSTRIALES

Importancia econmica, sntesis de productos industriales: produccin de cidos lctico, ctrico, succnico, oxlico, etc. Y alimentos populares orientales: su-fu y tem-pe

Mucor racemosus: Se presenta en dos formas segn el medio en que se desarrolle. Una forma tpica o filamentosa, en medios slidos y otra forma atpica o levaduriforme que por lo general aparece en los medios lquidos y que es aprovechada en la industria para obtener etanol por fermentacin de mostos azucarados, en cambio, la forma tpica se usa para obtener enzimas (amilasas).

Mucor rouxil: Hidroliza el almidn posteriormente y posteriormente fermenta los azcares formados en la hidrlisis anterior produciendo etanol en forma lenta, por lo cual es conveniente sembrar una levadura a las 24 horas de desarrollo de Mucor para facilitar la fermentacin alcohlica. Esto es en sntesis lo que se conoce con el nombre de proceso amilo. La forma tpica se emplea para la fabricacin de amilasas.

Rhyzopus nigricans: Es un hongo de bajo poder amiloltico, puede hidrolizar el almidn y producir etanol, pero en menor proporcin que otras especies, por lo cual no se lo aplica en la industria de fermentacin alcohlica, en cambio, en los ltimos aos se

A. CULTIVOS

Se realiza el cultivo en Agar Sabauraud. Se deja a temperatura ambiente.

Las colonias sospechosas son aquellas que producen colonias de muy rpido crecimiento, son vellosas o algodonosas y empujan la tapa de la placa petri.

Inicialmente son blancas pero cambian a gris, marrn o negro con la madurez a medida que se forman esporas. B. OBSERVARa. RHYZOPUS


b. MUCOR


c. ABSIDIA


V. CUESTIONARIO1. Dibuje e indique las partes del Aspergyllus?2. Mencione las enfermedades producidas por el gnero Aspergillus?3. Mencione 4 diferencias entre cada especie de Aspergillus (Macroscpicas y microscpicas) ? Dibuje.4. Cmo diferencia el gnero Aspergillus del Penicilium?5. Indique Ud. 4 aplicaciones del Aspergillus?6. Indique Ud. 4 aplicaciones del Penicillium?7. Qu es una enzima?8. Dibuje e indique las partes del Penicillium?9. Mencione Ud. Cules son las caractersticas macroscpicas del Penicillium?10. Cul es la estructura bsica de la Penicilina?11. Cules son los hongos que pertenecen a los Zygomycetes?

12. Cmo sospecha Ud. Que el hongo que ha desarrollado en su placa de cultivo se trata de un Zygomycete?

13. Dibuje e indique las partes de los Zygomycetes?

14. Indique Ud. Cules son las diferencias que permiten identificar un Mucor, Rhyzpopus y una Absidia?15. Qu enfermedades producen estos hongos?16. Mencione Ud. 5 aplicaciones Industriales de estos hongos?

I. OBJETIVOS1) Dar a conocer al estudiante las tcnicas para el acondicionamiento y esterilizacin de materiales y equipos ms empleados en un laboratorio de microbiologa industrial.

2) Ejecutar con habilidad y destreza el acondicionamiento de materiales para el anlisis microbiolgico.

3) Justificar la importancia de los mtodos de esterilizacin para el control microbiolgico de los alimentos.

II. MARCO TERICO

El acondicionamiento de los materiales as como la esterilizacin de los mismos es el primer paso en el control microbiolgico de los alimentos, pues de l depender el xito del anlisis.

2.1.- METODOS DE ESTERILIZACION POR CALOREl calor acta desnaturalizando y coagulando las protenas.

2.1.1.- ESTERILIZACIN POR CALOR SECO

Se requiere temperaturas elevadas y un periodo ms prolongado de calentamiento que la esterilizacin con vapor. Su uso est limitado primariamente a la esterilizacin de material de vidrio y aquellas sustancias que sean impermeables al vapor.

El mecanismo por el cual los organismos son destruidos se basa en los efectos letales del calor seco debido a la desecacin en general, lesin por oxidacin y efectos txicos de los niveles de electrlitos.

En ausencia de agua, disminuye el nmero de grupos polares de la cadena peptdica y se requiere ms energa para abrir las molculas, de all la aparente mayor estabilidad del organismo.

Se emplea el horno o estufa de esterilizacin, en la que se aplica una temperatura de 160-170C durante 1 hora.

a) Flameo o Llama Directa. Consiste en exponer los materiales a esterilizar (asas y agujas de kolhe, esptulas, pinzas, tijeras, etc.) al contacto de la llama de un mechero para eliminar rpidamente los microorganismos del entorno; Ejemplo: mechero de Bunsen.

b) Aire Caliente. Para ello se utiliza un horno bacteriolgico u horno Pasteur, donde se esteriliza el material a temperaturas de 170-180C por 2 horas. Es generalmente empleado para esterilizar material de vidrio.

2.1.2ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO

Se usa el vapor, tanto porque las bacterias se mueren ms rpidamente cuando se encuentran hmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas partes del recipiente de esterilizacin, el vapor debe conservarse a una presin de 1000g/cm3 sobre la presin atmosfrica para obtener una temperatura de 121C. Se produce tambin rupturas de cadena nica en el ADN, y la prdida de la viabilidad de las clulas expuestas a calor leve puede correlacionarse con la introduccin de estas rupturas. La lesin de ADN parece ser enzimtica, como resultado de activacin o liberacin de una nucleasa.

El calor produce tambin una prdida de la integridad funcional de la membrana y filtracin de pequeas molculas y material absorbente de 260 nm. Este material es de origen ribosmico y aparentemente es resultado de la degradacin de los ribosomas por ribonucleasas activadas por el tratamiento con calor. Existe tambin degradacin del ARN ribosmico y la prdida de viabilidad de las clulas expuestas a temperaturas elevadas.

a) Por Ebullicin. Se coloca el material a esterilizar en agua hirviendo (100C) por 15-35 minutos.

b) Vapor de agua sin Presin. Se coloca el material a esterilizar a la accin del vapor de agua y a temperatura no mayor de 100C; para ello puede hacer uso del autoclave con la espita abierta. Se utiliza para materiales termolbiles como es el caso de algunos medios de cultivo.

c) Vapor de agua con Presin. Se realiza en un autoclave a 15 libras de presin y 121C por 15-20 minutos. Se emplea para esterilizar medios de cultivo y todos aquellos materiales que no pueden esterilizarse por calor seco. Se puede usar; autoclave, pasteurizacin o tindalizacin.c.1) Autoclave: es un equipo construido en acero inoxidable, de forma cilndrica, paredes resistentes, puede ser horizontal o vertical; consta de:

Caldera de material resistente, fondo cncavo cubierta de una camisa metlica cilndrica.

Dispositivos para la instalacin de la fuente calorfica (gas, electricidad o vapor de agua).

Orificios superiores para purga de gases de combustin.

Tapa con vlvula de seguridad, espita, manmetro.

Canastilla para colocar el material a esterilizar.

2.2ESTERILIZACIN POR FILTRACIN

Consiste en hacer pasar las sustancias lquidas o gaseosas a esterilizar a travs de membranas porosas que retienen a los microorganismos; sirve para la esterilizacin de sustancias termolbiles. El material filtrante puede ser de porcelana, tierras de infusorios, acetato de celulosa, etc.2.3 ESTERILIZACIN POR RADIACIN ULTRAVIOLETA

Poseen efectos letales y mutagnicos en las bacterias presentando su mayor efectividad como agente bactericida en la regin espectral de alrededor de los 260 nm. de longitud de onda, ste mtodo presenta muchas dificultades tcnicas.

III. MATERIALES Y EQUIPO

Material de vidrio: pipetas, palcas Petri Erlenmeyer, tubos de ensayo

Papel craff, algodn, gasa, tijeras

Mechero de Bunsen

Horno Pasteur de aire caliente

Autoclave


4.1 PREPARACIN DE MATERIAL A ESTERILIZAR

a) Preparacin de tubos matraces

Los tubos, matraces y frascos antes de su esterilizacin deben llevar sus tapones de algodn respectivamente, los cuales deben cerrar suavemente no muy flojos ni apretados, ni largos ni cortos, preparados segn el mtodo siguiente:

De acuerdo al tapn a confeccionar se toma el pedazo convenientemente de algodn de fibra, extendida, rectangular

Practicar un dobles de 1/3 a lo largo de la fibra.

Enrollar de un extremo, presionando sobre si mismo hasta completar toda la longitud.

Rotar con los dedos el trozo confeccionado aplastando para drsele la forma de cono truncado, con el dimetro a la medida del recipiente a taponar, el tapn debe entrar en el recipiente hasta la mitad, y el otro medio quedar fuera. Se pueden preparar los tapones envueltos en gasa para evitar el hilachamiento.Tubos de Ensayo

Formar un paquete de tubos de ensayo taponados, empaquetarlos con papel kraft y amarrarlos, en su defecto se le envuelve con papel slo la zona de las bocas.

Frascos y Matraces

Los frascos y matraces se taponan con algodn, se cubre con papel kraft y se amarra con hilo pabilo.

Colocar el nombre del medio de cultivo

Rotular la fecha de preparacin.

b) Preparacin para proteger las pipetas

En el extremo de succin de cada pipeta introducir una porcin de algodn con auxilio de una aguja o puntero delgado, evitando que quede muy ajustado.

Cortar tiras largas de papel kraft de unos 3 cm. de ancho, y colocar uno de sus extremos, en una de las puntas del papel envolver la punta de la pipeta en forma oblicua y envolver toda la longitud de la pipeta girndose en espiral en forma ajustada y en la parte terminal de la boquilla se remata con una torsin para protegerla y se rompe el resto de papel sobrante. Anotar con un lpiz la medida de la pipeta y la fecha de su esterilizacin.c) Preparacin de las placas Petri Cortar papel kraft tamao adecuado para cubrir ntegramente las placas petri completas.

Con la parte brillante del papel hacia fuera se envuelve la placa ponindose esta en el centro, se envuelve la placa tomndose dos extremos opuestos del papel, dndose una vuelta alrededor de ella, los otros dos extremos del papel se doblan en tringulos, rematndose con un fuerte dobles hacia el dorso de la placa, dndosele una apariencia de paquete de regalo.

4.2 ESTERILIZACIN CON CALOR SECOEl procedimiento de esterilizacin por aire caliente slo se puede emplear con utensilios de vidrio o metal.

a) Procedimiento para la esterilizacin en horno

Ponga el termostato a l75C y encienda el horno.

Si hay un ventilador verifique que est funcionando.

Vigile el termmetro. Cuando la temperatura llegue a l75C. sgase calentando durante 60 minutos ms.

Apague el horno. Espere a que la temperatura descienda hasta 60C. Abra la puerta del horno.

El papel empleado para envolver deber de haber tomado un color marrn oscuro, si el color del papel es amarillo plido indicar que el horno no se ha calentado bastante. Si el papel se ha ennegrecido indicar que el horno se ha calentado demasiado.

4.3 ESTERILIZACIN CON CALOR HMEDOa) Procedimiento para la esterilizacin con autoclave

Llene con agua el fondo de la autoclave (hasta el soporte de la canasta). Cercirese que el agua no toque la canasta. Elimine el exceso de agua abriendo la espita del drenaje.

Introduzca en la autoclave la canasta con los materiales que se van a esterilizar, se pueden aadir indicadores de la esterilizacin, como ciertas piezas de papel especial que ennegrecen al lograrse la temperatura adecuada.

Cierre la tapa de la autoclave, cerciorndose de que la arandela de goma se encuentra en su surco. Atornille a niveles iguales los sujetadores de la tapa, con firmeza pero sin apretarlo demasiado. Abrir la vlvula de salida del aire.

Inicie el calentamiento de la autoclave. Vigile la salida de aire hasta que aparezca un chorro de vapor. Aguarde 3- 4 minutos hasta que el chorro de vapor sea uniforme y continuo, esto indicar que todo el aire ha sido expulsado de la autoclave.

Cierre a continuacin la vlvula de salida del aire. Apritense los sujetadores de la tapa del autoclave y reduzca la temperatura ligeramente. Cuando se obtenga la temperatura adecuada 120C se deber regular el calor para conservarla. Y esperar por 15 minutos.

Reduzca completamente el calor tan pronto como se cumpla el tiempo requerido.

Cuando la temperatura descienda a menos de 80C abra la vlvula de salida de aire para igualar las presione dentro y fuera del autoclave.

Deje enfriar la autoclave y a continuacin retire cuidadosamente la canasta con los utensilios estriles.

VI. CUESTIONARIO

1. Qu mtodo de esterilizacin utiliz en la prctica, cite algunos ejemplos?2. Cree usted que es importante acondicionar y esterilizar los materiales antes del control microbiolgico, por qu?

3. Cite en forma ordenada cada uno de los pasos a seguir para poner en funcionamiento el autoclave.

4. Compare la resistencia al calor de las clulas vegetativas con esporas bacterianas. Y explique a que se debe tal diferencia.5. Cite usted tipos de filtros empleados en el proceso de esterilizacin.

I. OBJETIVOSa. Identificar las diferentes condiciones de un medio de cultivo para que pueda llevarse a cabo un crecimiento microbiano.

b. Describir los medios de cultivo ms empleados en bacteriologa.

c. Conocer las aplicaciones y utilidades de los medios de cultivo ms corrientes.

d. Saber manejar el material que se emplea en la elaboracin de cualquier medio de cultivo.

II. MARCO TEORICO2.1REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

El medio proporciona los elementos necesarios para el crecimiento microbiano. De acuerdo con esto, siempre se requerir una fuente de energa y una fuente no energtica como son las sales, factores de crecimiento, etc., que sin proporcionar energa son necesarias para su desarrollo.

2.1.1.- REQUERIMIENTOS ENERGTICOS DE LOS MICROORGANISMOS

A. FUENTES DE CARBONO

En la mayor parte de los casos, la fuente de carbono corresponde a azcares en forma de mono o disacridos, como glucosa, lactosa, maltosas etc., e incluso hay microorganismos que pueden utilizar azcares ms complejas para obtener energa., como es el caso del almidn.

Existen tambin bacterias capaces de utilizar el gas carbnico CO2 hecho que es caracterstico de las bacterias fotosintetizantes y quimiolittrofas.

Otros microorganismos pueden crecer a expensas del metano, benceno e, incluso hidrocarburos como fuente de energa: Ejemplo: Cladosporium.Por ltimo, existen especies como Pseudomonas que pueden utilizar como fuente de energa un gran nmero de componentes hidrocarbonados diferentes.

B. FUENTE DE NITROGENO

Pueden presentarse como protenas completas, que sera el caso de la gelatina o incluso protenas an ms complejas, como es el caso de los extractos de carne, sales de amonio, o como peptonas etc.

Es frecuente encontrar peptonas como fuente de nitrgeno que corresponden a pptidos o polipptidos dependiendo de su complejidad pero en cualquier caso son tambin protenas que estn parcialmente hidrolizadas, aunque no se las deba considerar como tal.

El bio-Thione, es una denominacin comercial correspondiente a una peptona ppsica de carne.La casena en forma de peptona tripsica de casena se usa para estudiar la formacin de indol por parte de la bacteria debido al alto contenido de triptfano que posee este tipo de peptona. Tambin es utilizada para estudiar la reduccin de los nitratos e incluso para el cultivo de algunos protozoos.

La peptona papanica de soja, es una fuente de nitrgeno especialmente para hongos y ciertos grmenes como Neisserias.

Otra fuente de nitrgeno serian: nitratos, nitrgeno orgnico, amoniaco, sales de amonio, aminocidos, etc.

2.1.2. REQUERIMIENTOS NO ENERGTICOS DE LOS MICROROGANISMOSA. FUENTE DE AZUFRE

Todos los microorganismos que utilizan en su metabolismo azufre lo hacen mayoritariamente en forma de sulfatos, a veces en forma de tiosulfatos y en otras ocasiones lo pueden obtener a partir de algn aminocido, ejemplo: metionina, cisterna, tiamina, etc.

Ejemplo de medios de cultivo: TSI, LIA, SIM, SS.B. FUENTE DE FSFORO

En general, las bacterias que utilizan el fsforo lo suelen hacer en forma de fosfato.C. IONES METLICOS

Son utilizados por las bacterias bajo la forma de iones a concentraciones muy bajas. Por ej: el Sodio, el Potasio, Magnesio, Hierro, etc.

Tambin se encuentra otro tipo de iones metlicos Cobalto, Molibdeno.

Estos iones son esenciales para el crecimiento microbiano y dependiendo de su concentracin pueden inhibir el crecimiento de otros, como el caso del sodio que a concentraciones altas inhibe el crecimiento de un tipo de microorganismo y facilita el crecimiento de otros.

Agar Manitol Salado, contiene 7.5% ClNa permite el crecimiento de Staphylococous.

Agar Streptococus KF contiene 6.5% ClNa permite el crecimiento del Enterococus.D. FACTORES DE CRECIMIENTO

Existen bacterias que an con los medios antes descritos no crecen o, si lo hacen, es muy lentamente. A este tipo de bacterias les hace falta adems una serie de componentes definidos que no son capaces de fabricar por s solas.

A este tipo de componentes se denomina factores de crecimiento y van a corresponder a algn tipo de aminocido de bacterias muy exigentes o incluso vitaminas, bases pricas o pirimidinicas, etc.

Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos:

Agar sangre enriquecido con metionina, cido glutmico y cido nicotinico para el crecimiento de Xanthomonas.

El Agar Chocolate permite el desarrollo de colonias hmedas, lisas y grises del Haemophylus influenzae. Este medio contiene hematina (factor X) y est enriquecido con otros cofactores, como el NAD (factor V), que permite el desarrollo de este microorganismo.

Agar Sangre enriquecido con Glicerol - papa (Bordet Gengou) para crecimiento de Bordetella pertusis. Se observa colonias en gotas de mercurio brillantes es fcil de apreciar.

Agar sangre enriquecido con nitrgeno suplementario y vitaminas del complejo B para el crecimiento del Flavobacterium.E. FACTORES INHIBIDORES

Son componentes que van a impedir el crecimiento de algn tipo de microorganismo por bloqueo de sus procesos metablicos.

Los antibiticos son agentes inhibidores o destructores de la propia bacteria.

La azida sdica inhibe el crecimiento de los Gramnegativos.

Algunos colorantes: Eosina Azul de metileno impide el crecimiento bacteriano de los Grampositivos.

Cristal Violeta impide el crecimiento de los Grampositivos.

Las sustancias inhibidoras son muy tiles para la identificacin y tipificacin de pruebas bioqumicas de las bacterias.

Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos:

Agar Mac Conkey: Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de las bacterias Gramnegativas.

El medio EMB contiene Eosina y azul de metileno que son colorantes de anilina y van a inhibir el crecimiento de los microorganismos Grarnpositivos, permitiendo el crecimiento de todas las Enterobacterias.

Agar Salmonella Shigella contiene una alta concentracin de sales biliares y citrato de sodio, inhibe a todas las bacterias Grampositivas y a muchas Gramnegativas incluyendo las coliformes.2.3.- CONDICIONES QUE HA DE CUMPLIR UN MEDIO DE CULTIVO

Para que un microorganismo crezca en un medio de cultivo es necesario: Una composicin de nutrientes adecuada a las necesidades de ese microorganismo.

Unas condiciones fsico-qumicas apropiadas. De acuerdo con ello, habra que considerar:

A. TEMPERATURA PTIMA

Los microorganismos, pueden clasificarse en una de las cinco categoras siguientes en funcin de los rangos de temperatura de crecimiento.

Los psicrfilos crecen bien a 0C y tienen una temperatura ptima o inferior, la mxima es de 20C. Se aslan del rtico y Antrtico. Pueden crecer a 0C, aunque su temperatura ptima sea 20 a 30C y la mxima de casi 35C. Las bacterias y los hongos responsables de la putrefaccin de alimentos refrigerados.

Los Mesfilos, crecen a una temperatura ptima de 20 a 45C, siendo la mnima de 15 a 20C y la mxima de casi 45C. La mayora de los microorganismos pertenecen a esta categora. Las bacterias patgenas para el hombre suelen crecer a una temperatura ptima de 37C.

Los termfilos, pueden crecer a una temperatura de 55C o superiores. La temperatura mnima es normalmente de 45C y la ptima es de 55 a 65C. Microorganismos que crecen en fardos de heno, tuberas de agua caliente, aguas termales.

Los Hipertermfilos, temperatura ptima de entre 80C y casi 113C, no crecen por debajo de 55C. Microorganismos aislados en zonas calientes del suelo marino.

RANGOS DE TEMPERATURA PARA EL CRECIMIENTO MICROBIANOMicroorganismoTemperaturas cardinales (C)

MnimaptimaMxima

Bacillus psichrophilus

Microcococcus cryophilus

Pseudomona fluorescens

Staphylococcus aureus

Enterococcus faecalis

Escherichia coli

Neisseria gonorrhoeae

Thermoplasma acidophilum

Bacillus stearthermophilus

Sulfolobus acidocaldarius

Pyrococcus abyssi

Pyrodictium occultum

Pvrolobus fumarii

Candida scotti

Saccharomyces cerevisiae

Mucor pusillus-10

-4

4

6.5

0

10

30

45

30

60

67

82

90

0

1-3

21-2323-24

10

25-30

30-37

37

37

35-36

59

60-65

80

96

105

106

4-15

28

45-5028-30

24

40

46

44

45

38

62

75

85

102

110

113

15

40

50-58

B. GRADO DE HUMEDAD

Va a corresponder a la cantidad de agua que va a necesitar la bacteria para su crecimiento.

En general, cualquier medio slido o lquido requiere cierta proporcin de agua.

En medios sin agua es muy difcil el crecimiento bacteriano: de ah que la liofilizacin y cualquier mtodo de deshidratacin, sea un buen medio de conservacin.C. pH

Cada especie tiene un rango definido de pH para su crecimiento y un pH ptimo de crecimiento.

Los acidfilos tienen un valor de pH ptimo de crecimiento entre 0 y 5.5.

Los neutrfilos, entre 5.5 y 8.0

Los alcalfilos prefieren un rango de pH entre 8.5 y 11.5

La mayora de las bacterias y protozoos son neutrfilos.

La mayora de hongos prefieren medios ligeramente cidos, con valores de pH de 4 a 6.

Variaciones intensas en el pH pueden daar a los microorganismos alterando la membrana plasmtica o inhibiendo la actividad de las enzimas y las protenas transportadoras.

El pH ptimo en la mayora de los casos es cercano a la neutralidad.

Los tiobacilos pueden crecer mejor a pH muy cido, a pH prximo a 0.

Los bacilos ureasa positivo tal como Proteus crece a pH cercano a 8.

El Vibrio Cholerae crece bien a pH 9.

En un medio de cultivo pueden aparecer variaciones de pH como consecuencia de los metabolitos que se producen por la degradacin de los nutrientes por parte de las bacterias. Es tpico que en la fermentacin glucdica se produzca acidificacin del medio o en la degradacin proteica utilizando la bacteria sales amnicas como fuente de energa se alcalinice el medio.

Siempre es necesario tamponar el medio de cultivo, al menos al comienzo para mantener el pH dentro de los lmites fisiolgicos.

EFECTOS DEL PH EN EL CRECIMIENTO MICROBIANOMicroorganismoLmite inferiorpH ptimoLmite superior

Picrophilus oshimae

Thiobacillus thiooxidans

Sulfolobus acidocaldarius

Lactobacillus acidophilus

Staphylococcus aureus

Proteus vulgaris

Escherichia coli

Clostridium sporogenes

Pseudomonas aeuriginosa

Nitrosomonas

Bacillus pasteurii

Bacillus alcalophilus0

0.5

1.0

4.0-4.6

4.2

4.4

4.4

5.5-5.8

5.6

7.0-7.6

8.5

8.50.7

2.0-3.5

2.5

5.8-6.6

7.0-7.5

6.0-7.0

6.0-7.0

6.0-7.6

6.6-7.0

8.0-8.8

SD

10.6SD

6.0

4.0

6.8

9.3

8.4

9.0

8.5-9.0

8.0

9.4

SD

11.5

D. PRESIN OSMTICA

Se suele trabajar en condiciones de isotonia (300 miliosmoles) aunque existen muchas bacterias que pueden crecer a concentraciones algo superiores.

Las bacterias pueden mantenerse vivas y crecer en medios muy acuosos e hipotnicos; este hecho es debido a su pared rgida que permite que el agua no penetre en la bacteria y sta se rompa.

En las bacterias halfilas, su crecimiento so produce especialmente a concentraciones muy altas de cloruro sdico; Ej: Staphylococus.

Como la concentracin osmtica de un hbitat tiene efectos tan marcados sobre los microorganismos, es de gran utilidad expresar cuantitativamente el grado de disponibilidad del agua. Se emplea la actividad de agua (aw).

Actividad del AguaAmbienteMicroorganismo

1.00 (agua pura)

0.95

0.90

0.85

0.80

0.75

0.70

0.60Sangre

Pan

Jamn

Salami

Conservas

Lagos salados

Pescado salado

Cereales, dulces

Chocolate

Leche deshidratadaMayora de Gramnegativos

no halfilos

Bacilos Grampositivos, Basidiomycetes

Cocos, Bacillus, Fusarium, Mucor, Rhizopus

Staphylococus, Saccharomyces

Penicillum

Halobacterium, Aspergillus

Actinospora

Aspergillus

Saccharomyces

Xeromyces

E. CONCENTRACION DE OXGENO

Un organismo que puede crecer en presencia de oxgeno atmosfrico es AEROBIO, mientras que otro puede crecer en su ausencia, es ANAEROBIO.

Los ANAEROBIOS FACULTATIVOS no precisan de Oxigeno para crecer, pero lo hacen mejor en su presencia.

Los ANAEROBIOS AEROTOLERANTES como Enterococcus faecalis pueden crecer bien tanto en su presencia como en su ausencia.

Por el contrario los ANAEROBIOS ESTRICTOS U OBLIGADOS, ejemplo: Bacteroides. Fusobacterium, Clostridium, no toleran en absoluto el oxigeno y mueren en su presencia.

Los anaerobios tolerantes y los estrictos no pueden producir energa mediante la respiracin aerobia y deben utilizar vas de fermentacin o respiracin anaerobia para este objetivo.

Finalmente existen unos pocos microorganismos como el Campylobacter, que son MICROAEROFILOS que son daados por el nivel de oxigeno atmosfrico 20% precisando para su crecimiento niveles del 2 al 10% de Oxgeno.

2.3.- PRINCIPALES TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

Existen muchos tipos distintos de medios de cultivo, as como diferentes clasificaciones. De acuerdo con esto y segn criterios se podran dividir en:

2.3.1.-MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU PROPORCIN EN AGUA

A. MEDIOS SLIDOS

Corresponden a aquellos medios donde la proporcin en agar est siempre por encima del 15%.

La importancia, de los medios slidos es muy grande, pues permite el aislamiento, purificacin y visualizacin del crecimiento en colonias, as como su posible identificacin a travs de medios especficos y diferenciales de caracteres, slidos elaboracin de antibiogramas, etc.

Ejemplo de medios de cultivo:

Agar Mac Conkey, permite el crecimiento de microorganismos Gramnegativos.

Agar EMB, permite el crecimiento de coliformes.

Agar Chapman, permite el crecimiento de Staphylococcus.

Agar Sabouraud, permite el crecimiento de hongos.

Agar Nutritivo, permite el estudio de la morfologa de las colonias.

B. MEDIOS LQUIDOS

Tambin denominados caldos, no contienen agar. Son de gran utilidad para la realizacin de recuentos bacteriolgicos por turbidimetra, especialmente til en levaduras, para la realizacin de inculos, para obtener metabolitos primarios o secundarios, de los microorganismos como: antibiticos, cidos lcticos, etc.

Ejemplo de medios de cultivo:

Caldo MRVP, para investigar la ruta utilizada en la degradacin de glucosa.

Caldo Peptona, para investigar la produccin de Indol.

Caldo Lactosado, para investigar la formacin de cido y gas

Caldo BHI, permite el crecimiento de microorganismos considerados difciles de cultivar.

C. MEDIOS SEMISLIDOS

Son medios intermedios entre los lquidos y los slidos; su proporcin en agar suele ser inferior al 5% pero siempre presentan una cierta cantidad que le proporcione consistencia semislida. Son tiles para algunas pruebas bioqumicas:

Agar SIM, estudiar movilidad, produccin de H2S, Indol.

Agar MIO, estudiar movilidad, produccin de Indol y Ornitina.

2.3.2.- MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU USO O UTILIZACIN

A. MEDIOS PARA AISLAMIENTO

Son medios con la particularidad de poder obtener a partir de ellos colonias aisladas. Estos, segn sea su composicin, se pueden a su vez dividir en:

A.1. MEDIOS ENRIQUECIDOS

Son medios a los cuales, como su nombre indica, se les aade adems de los componentes bsicos, uno o varios elementos, como por ejemplo casena soja, triptfano, etc., que facilitan el crecimiento de algn tipo de microorganismo generalmente exigentes, lo que nos permite aislar el microorganismo que buscamos.A.2. MEDIOS SELECTIVOS

Son medios en cuya composicin presentan componentes que impiden el crecimiento de algn tipo bacteriano.

Medio Salmonella Shigella, contiene en su composicin sales biliares, citrato de sodio y el verde brillante que inhibe a la flora Grampositiva y los hacen con el grupo coliforme.

A.3. MEDIOS DIFERENCIALES

Corresponden a aquellos medios que presentan las mismas propiedades que los medios selectivos, es decir, tienen componentes que inhiben el crecimiento de algunas bacterias y, lo que es ms caracterstico de este medio, presentan sustancias que al ser utilizadas, o no, por las bacterias que van a crecer en dicho medio, dan una informacin suplementaria y especfica, es decir, diferencial; por ejemplo:

El medio Levine (EMB) este medio presenta en su composicin eosina y azul de metileno que inhiben el crecimiento de los Grampositivos y algunas Gramnegativas, facilitando el crecimiento de la enterobacterias, que segn utilicen o no la lactosa darn lugar a una coloracin caracterstica para cada tipo de microorganismo.

Los medios diferenciales suelen ser tambin selectivos y se usan con fines de aislamiento e identificacin.

Agar TSI, que permite investigar si un microorganismo es capaz de utilizar la Glucosa, Lactosa y Sacarosa, adems si puede producir H2S.

Agar LIA, permite investigar si un microorganismo descarboxila o desamina el aminocido Lisina.

Agar Citrato de Simmons, investiga si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como nica fuente de carbono.

B. MEDIOS PARA CRECIMIENTO EN GENERAL

Son medios ya sea en forma lquida o slida que sirven para el cultivo de la mayor parte de las bacterias. Su composicin va a corresponder a una fuente de carbono, una fuente de nitrgeno, sales y agua. Dentro de los medios generales ms empleados tendramos el caldo comn, que est compuesto por extracto de carne, peptona, glucosa, cloruro de sdico y agua.C. MEDIOS DE MANTENIMIENTO DE CEPAS

Son medios que suelen tener los nutrientes necesarios para mantener a las cepas vivas durante perodos de tiempo relativamente largos mantenindose tales medios generalmente a temperaturas lo suficientemente bajas en cada caso como para impedir su crecimiento. Ejemplo, leche descremada que congelada se utiliza a menudo para mantener cepas durante meses.

2.3.3.- MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU COMPOSICIN

A. MEDIOS NATURALES

B. MEDIOS SEMISINTTICOS

C. MEDIOS SINTTICOS

D. MEDIOS COMPLEJOS

2.3.4.- MEDIOS DE CULTIVO SEGUN SU PRESENTACIN

A. MEDIOS DESHIDRATADOS O LIOFILIZADOS

B. MEDIOS YA PREPARADOS

C. MEDIOS SLIDOS EN PLACA PETRI

D. MEDIOS SLIDOS EN TUBO

D.1. Con Agar Inclinado

D.2. Con Agar Semi-Inclinado o Pico de Flauta

E. MEDIOS LQUIDOS EN TUBO

III. MATERIALES Y REACTIVOS

d. MATERIAL REQUERIDO Matraces 250 ml, 100 ml. 50 ml Probetas de 50ml, 100 ml. Baguetas. Balanza. Esptula. Agua destilada. Placas Petri .Tubos de ensayo.e. MEDIOS DE CULTIVO

Agar nutritivo. Agar TSI. Agar Citrato de Simmons. Agar Mac Conkey

Agar Sabouraud. Agar LIA . Agar Manitol salado.


4.1. PREPARACIN

Para la preparacin de medios de cultivo se usa agua destilada.

El medio de cultivo a preparar debe ser pesado, segn la cantidad que est indicada en la etiqueta del medio de cultivo.

Agregar el medio de cultivo en el matraz, y aadir la mitad del volumen de agua que se requiere, agitar suficientemente para conseguir una suspensin homognea, despus incorporar el agua restante, aprovechando esta adicin para desprender e incorporar al conjunto las partculas del medio de cultivo que hubieran quedado adheridas a la pared interna del recipiente.

Los medios nutritivos que contienen agar deben ser calentados para conseguir su disolucin.

Para reconocer que se ha alcanzado una disolucin completa, al agitar no debe adherirse el medio a la pared interna del recipiente; la solucin es viscosa y resbala libremente.

Tapar el matraz con el tapn de algodn, envolver con papel Kraft y pabilos.4.2. ESTERILIZACION

Se esterilizar el medio de cultivo, ya disuelto en el autoclave en caso de ser necesario.

El tiempo es de 15 minutos a 121C.

4.3. REPARTICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Debe verterse el medio de cultivo a una temperatura de 45-55C.

Previamente hay que remover el medio de cultivo hacindolo oscilar en sentido circular su recipiente para garantizar la homogeneidad del medio.

Los tubos llenos con medios de cultivo esterilizado, todava lquido, se colocan en la posicin deseada:

Pico y Fondo o Pico de flauta o semi inclinado

Pico o inclinado

Fondo

El medio de cultivo se deja solidificar en la posicin lograda.

Repartir:

En Placas (aproximadamente 16 a 20 ml) los siguientes medios de cultivo:

Agar nutritivo

Agar Mac Conkey Agar EMB Agar Sabouraud En Tubos: la posicin de pico y fondo (aproximadamente 4 ml)

Agar TSI Agar LIA En Tubos: la posicin de pico (aproximadamente 2 a 3 ml)

Agar Citrato de Simmons En tubos: la posicin de Fondo (aproximadamente 3 ml)

Agar SIM 4.4. ALMACENAMIENTO

Los medios de cultivo deshidratados debern conservarse en lugar seco, protegidos contra la luz, a una temperatura de 15C a 30C, y en envases bien cerrados.

Los medios de cultivo preparados, listos para su uso, tienen un slo tiempo limitado de conservacin. Cuando no se indique otra cosa y bajo condiciones adecuadas de conservacin es de varios meses. Se recomienda temperatura de 4 8C.

Las placas Petri, preparadas con el medio de cultivo, debern pre encintarse con cinta adhesiva su borde lateral, para impedir fugas entre el cuerpo de la placa y la tapa.

4.5. COMPOSICION Y PREPARACIN DE CADA UNO DE LOS MEDIOS UTILIZADOS

AGAR NUTRITIVO

Composicin

Peptona, 17.0 g. Extracto de carne, 3.0 g. Cloruro de sodio, 5.0 g

Agar Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 mPreparacin________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Descripcin del Medio

Requerimiento Energtico

Fuente de carbono: ________________________

Fuente de nitrgeno: _______________________

Requerimiento no Energtico

Fuente de azufre: _________________________

Fuente de fsforo: ________________________

Iones metlicos: __________________________

Factores de crecimiento: ____________________

Factores de arranque: ______________________

Factores inhibidores: ______________________

Segn su proporcin en agua

_________________________________________________________

Segn su uso o utilizacin

_________________________________________________________

Segn la composicin

_________________________________________________________

Segn su presentacin

_________________________________________________________

AGAR MAC CONKEY

Composicin

Peptona de casena17.0 g. Rojo neutro0.03 g. Peptona de carne 3.0 g.

Cristal violeta 0.001 g. Lactosa 10.0 g. Sales biliares1.5 g. Cloruro de sodio 5.0 g

Agar Agar 12.5 g. Agua destilada1000 ml.

Preparacin

________________________________________________________________________________________________________________________________________________






Fuente de azufre: _________________________

Fuente de fsforo: ________________________

Iones metlicos: __________________________



Factores inhibidores: _______________________


_________________________________________________________


_________________________________________________________

Segn la composicin

_________________________________________________________

Segn su presentacin

_________________________________________________________

AGAR TSI

Composicin

Extracto de carne, citrato de amonio, 0.2 g. Extracto de levadura, 3.0 g. , peptona de sacarosa,

Tiosulfato de sodio, 0.3 g. Peptona, 20.0 g. Rojo de fenol, 24 mg., sacarosa,

Cloruro de sodio, 5.0 g. Lactosa, 10.0 g. Agar Agar, 12 g. Glucosa, 1.0 g

Agua destilada, 1000 ml

Preparacin

________________________________________________________________________________________________________________________________________________






Fuente de azufre: ________________________

Fuente de fsforo: _______________________

Iones metlicos: _________________________

Factores de crecimiento: ___________________

Factores de arranque: _____________________

Factores inhibidores: _____________________


_________________________________________________________


_________________________________________________________

Segn la composicin

_________________________________________________________

Segn su presentacin

_________________________________________________________

MEDIO EMB.

Composicin

Fosfato dipotsico, 1.0 g. , 5.0 g. Sulfato de magnesio, 0.2 g, peptona, azul de metileno, lactosa, sacarosa, caseina, Agar Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 ml

Preparacin

________________________________________________________________________________________________________________________________________________






Fuente de azufre: _________________________

Fuente de fsforo: ________________________

Iones metlicos: __________________________



Factores inhibidores: ______________________

Segn su proporcin en agua ___________________________________________

Segn su uso o utilizacin ___________________________________________

Segn la composicin _____________________________________________

Segn su presentacin. _____________________________________________

CALDO LURIA BERTANI (LB)

Composicin

Extracto de levadura,.. g. ,

Cloruro de sodio.. g.

Triptonag

Agua destilada. ml

Preparacin

________________________________________________________________________________________________________________________________________________






Fuente de azufre: ________________________

Fuente de fsforo: _______________________

Iones metlicos: _________________________

Factores de crecimiento: ___________________

Factores de arranque: _____________________

Factores inhibidores: _____________________


_________________________________________________________


_________________________________________________________

Segn la composicin

_________________________________________________________

Segn su presentacin

_________________________________________________________V. CUESTIONARIO

1. Defina Ud. los siguientes trminos y mencione 1 ejemplo de microorganismo: Aerobios obligados, Anaerobio facultativo, Anaerobio aerotolerante, Anaerobio estricto, Microaerofilo.

2. Cules son las condiciones que debe reunir un medio de cultivo?

3. Cual es al funcin del agar-agar en los medios de cultivo?

4. Por qu es difcil para los microorganismos crecer en medios con valores bajos de aw?

5. A qu se denomina medio sinttico o definido? De 3 ejemplos.

6. Qu es un medio complejo?. De 3 ejemplos.

7. Qu es un medio selectivo?. De 3 ejemplos.

8. Qu es un medio diferencial?. De 3 ejemplos.

9. Realice una grfica donde se coloquen los rangos de temperatura para el crec

Practicas Microbiologia.2015ok Casa

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