PRÁCTICAS DE

MICROBIOLOGÍA GENERAL

2º de Grado de Biología

Almudena Fernández Villadangos

PRÁCTICA 5: BIOENSAYO (análisis de resultados).

1. Medir el diámetro de cada halo (mm).2. Hacer recta patrón representando diámetro de halo (abcisas; eje X) frente a log10 de la concentración de antibiótico (ordenadas; eje Y).3. Estimar la concentración de la solución problema de penicilina G de forma gráfica o matemáticamente

PRÁCTICA 6: ANTIBIOGRAMA (análisis de resultados).

1.Medir el diámetro de cada halo (mm):>15 mm microorganismo sensible<13 mm microorganismo resistente

Bacitracina (Gram+)Ampicilina (Gram + y algunas Gram -) Kanamicina (Gram + y -)

E. coli (Gram -)B. subtilis (Gram +)

Entre 13-15 mm: zona de incertidumbre (resultado no definitivo)

RESULTADOS EN COMÚN! DISCUSIÓN!

PRÁCTICA 6: ANTIBIOGRAMA (análisis de resultados).

El tamaño del halo puede estar influido por:(i)el medio de cultivo: composición; temperatura de incubación. (ii)la estabilidad del antibiótico; (iii)La difusión del antibiótico en medio: grosor; % agar; volumen de antibiótico; tamaño molecular.(iv)Microorganismo: cantidad de inóculo microbiano; sensibilidad al antibiótico.

PRÁCTICA 7: TITULACIÓN DE FAGOS (análisis de resultados).

1. Identificar los halos de lisis.2. ¿Cómo ha sido la siembra? Homogénea, heterogénea,…

3. Elegir las placas de cultivo que tengan entre 30-200 halos para el análisis y contamos los halos.

4. Calcular los títulos de la solución problema del fago λ:

Título viral (UFP/ml)

promedio del número de placas de lisis (UFP)

0.1 mlx dilución=

5. Resultados en común y discusión:¿Dónde hay más halos en LE392 + o -?

PRÁCTICA 8: PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Objetivos: - Comprender el fundamento de las pruebas bioquímicas.- Entender su utilidad.- Visualizar los distintos resultados.- Interpretar los resultados.- Identificar microorganismos con pruebas miniaturizadas.

Pruebas bioquímicas: -Se utilizan para la identificación, principalmente, de enterobacterias (Gram -; de interés clínico) viendo una serie de pruebas fenotípicas y genotípicas y comprobando con las ya clasificadas.- En las reacciones bioquímicas se detectará la existencia de una enzima en concreto o una vía metabólica.

Pruebas IMViC: Indol, RMVP, agar Citrato de Simmons.

INDOLFundamento: detección de actividad triptofanasa (triptófano como funte de C o N)Crecemos el microorganismo en estudio en un medio líquido “caldo Indol” (medio con peptonas y triptófano al 1%).

Triptofanasa: Trp piruvato + amoniaco + indol

El indol se pondrá de manifiesto por la acción del reactivo de Kovacs [alcohol isoamílico, para-dimetilamino-benzaldehido (PDAB) y ácido clorhídrico].

Realización de la práctica:Añadir 6-8 gotas de reactivo de Kovacs para detectar la presencia de indol en el medio.

Positiva: un producto coloreado (rosindol) se manifiesta como un anillo rojo en la superficie del caldo.

Pruebas IMViC: Indol, RMVP, agar Citrato de Simmons.

RMVP (rojo de metilo y Voges-Proskauer)Fundamento: detección de fermentaciones.Crecemos el microorganismo en estudio en un medio líquido diferencial “caldo RMVP” (favorece los procesos fermentativos a partir de la glucosa; peptonas, glucosa, fosfato a pH7).

Prueba Rojo de metilo:Detecta la realización de una fermentación ácido mixta (acidos: fórmico, acético, láctico y butírico); mediante la detección de ácidos.

Prueba Voges-Proskauer:Detecta la realizacion de una fermentación butiliendiólica o butilenglicólica; mediante la detección de la producción de acetoína (intermediario de la fermentación butiliendiólica o butilenglicólica).

La reacción positiva en una de estas pruebas implicará negatividad en la otra reacción para el mismo microorganismo.

Pruebas IMViC: Indol, RMVP, agar Citrato de Simmons.

Realización de la práctica: RMAñadir 5-7 gotas de rojo de metilo (indicador de pH) para detectar el cambio de pH del medio.

Positiva: el medio cambia de color a rojo.[Mediante el rojo de metilo se detectará la producción de ácidos (fermentación ácido mixta) que bajan el pH hasta 4]

RMVP (rojo de metilo y Voges-Proskauer)

Realización de la práctica: VPAñadir 8-10 gotas de KOH 40% (para subir el pH) y 5 gotas de α-naftol 5%.Agitar suavemente.

Positiva: el medio cambia de color a rosa-rojizo.(en alcalinidad y con oxígeno la acetoina se oxida a acetilo, el cual con α-naftol se observa con un tono rosa-rojizo)

Pruebas IMViC: Indol, RMVP, agar Citrato de Simmons.

CITRATOFundamento: detección de actividad citrato permeasa (capacidad de introducir el citrato al interior de la célula) y saber si utiliza citrato como fuente de carbono:

Citrato CO2 + AcetilCoA + NH4

Creceremos el microorganismo en estudio en un medio “agar citrato Simmons” (medio con citrato como única fuente de carbono, azul de bromotimol y fosfato amónico pH6.8).

Realización de la práctica:Realizar una siembra en estría que cubra toda la placa a partir del eppendorf con E. coli o E. aerogenes.Crecer 30ºC 24 horas.

Positiva: crecimiento y cambio de color a azul (se introduce el citrato en las células y se alcaliniza el medio: NH4).

Negativo: no crecimiento y no cambio de color (verdoso).

Prueba de la CATALASA:

Fundamento: detección de actividad catalasa.

catalasa: H2O2 H2O + O2

Realización de la práctica:Forma I:1.Coger 30 μl del eppendorf con E. coli o E. aerogenes y añadirlos en un porta.2.Añadir una gota de agua oxigenada.

Forma II:1.Añadir 6-8 gotas de agua oxigenada sobre la placa petri donde se encuentra el miroorganismo Proteus mirabilis.

Positiva: salen burbujas (liberación de oxígeno).

Prueba API20E:

Fundamento: Es un sistema rápido de identificación de bacterias que consta de una serie de análisis bioquímicos equivalentes a los indicados anteriormente y muchos otros que se realizan de forma miniaturizada en cada uno de los pocillos de la tira de API.

Sistema rápido, eficaz, permite hacer diferentes pruebas bioquímicas a la vez.

Hay diferentes tipos de tiras API, por lo que necesitamos saber de antemano si el microorganismo a identificar es Gram + o -, y su grupo bacteriano.

Prueba API20E:

Fundamento: El sistema API20E es específico para enterobacterias (gram-): con 20 microtubos o pocillos con sustratos deshidratados para 20 pruebas bioquímicas y E de Enterobacterias.

El resultado genera un número (API Profile Index) de 7-9 dígitos que se incorpora a una base de datos que nos dará una identificación microbiológica.

Number 1044552 --- Escherichia coli

Prueba API20E:

Realización de la práctica:1.Resuspender en 5ml de NaCl 0.9% una colonia de 2-3 mm: asa de siembra y mechero.2.Rellenar los pocillos de la base del envase con agua sin que rebose (mantener humedad).3.Rellenar con la suspensión microbiana todos los pocillos de izquierda a derecha, hasta la cúpula, sin que aparezcan burbujas.4.Rellenar con la suspensión microbiana la cúpula de las pruebas CIT, VP y GEL.5.Rellenar con aceite mineral las cúpulas de las pruebas ADH, 2DC, ODC, H2S y URE (condiciones anaerobias).6.Cerrar, rotular e incubar a 37ºC 24 horas.

Material:-Tubo 10ml.- Asa de siembra.-Solución salina.-Placa con colonias aisladas: E. coli, E. aerogenes o P. mirabilis.-Agua milli Q.-Aceite mineral.