BIO 368

ANALISIS INSTRUMENTAL

Métodos cromatográficos III

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA (TLC)

La separación puede estar basada en adsorción, partición, intercambioiónico o una combinación de ellos.

La fase fija es un sólido adherido a una superficie sólida plana (vidrio,plástico, lámina de aluminio). La fase móvil es un líquido que asciendepor la fase fija por capilaridad.

El movimiento de los analitos se expresa por el "factor de retardo" Rf distancia recorrida por el analito

Rf = -----------------------------------

distancia recorrida por el solvente

Después de terminada la cromatografía, se detecta la ubicación de los analitos en la placa por adsorción UV o tinción con un colorante adecuado (si no son coloreados).

CROMATOGRAFIA EN PAPEL

Se utiliza una matriz como soporte (celulosa de papel filtro) impregnadacon la fase fija, que puede ser un líquido polar o apolar.

El desarrollo del cromatograma puede hacerse en forma ascendente (lamás usada) o descendente. La fase móvil líquida se desplaza por capilaridad arrastrando a los analitos.

El análisis (revelado, identificación y cuantificación de las manchas) essimilar al de la cromatografía en capa fina.

Su capacidad de resolución es inferior a la TLC, pero su costo es muchomenor.

CROMATOGRAFIA DE FILTRACION MOLECULAR

Utiliza la propiedad de diversas sustancias porosas para actuar como"cedazos moleculares".

Principios básicos: una columna conteniendo partículas porosas (fasefija, habitualmente un gel) se equilibra con una fase móvil que contienela mezcla de moléculas a ser separadas. Aquellas más grandes quelos poros del gel son excluidas, pasan por fuera del gel y eluyenprimero; las de menor tamaño se distribuyen entre la fase móvildentro y fuera del gel, avanzan a menor velocidad y eluyen después.

Así, las partículas de la mezcla se separan de acuerdo a su tamaño(más exactamente, de su radio de Stokes), eluyendo primero lasde mayor tamaño. La matriz (fase fija) debe ser totalmente inerte.

ALGUNAS DEFINICIONES:

Vt : volumen total de la columna.

Vx : volumen ocupado por las partículas del gel

Vo : volumen ocupado por el solvente que rodea a las partículas,

también llamado "volumen vacío" (~ 35 % de Vt).

Vt = Vx + Vo

Ve : volumen de elución de cada soluto.

Kd (coeficiente de distribución) = (Ve- Vo)/ Vx

Este coeficiente varía entre 0 (moléculas totalmente excluidas, Ve =Vo)

y 1 (moléculas que tienen total acceso a la fase móvil interna, Ve = Vt ).

SIGNIFICADO DE LOS SIMBOLOS

Cadenas de dextrano(residuos de glucosaunidos por enlacesα (1→6)) entrecruzadasmediante epiclorohidrina

La agarosa es un polisacárido lineal (peso molecular ~ 12 000) constituido por unidades de agarobiosa (disacárido de galactosa y 3,6 anhidro galactosa).

Gel obtenido al entrecruzarcovalentemente alil dextrano conN,N’ metilen bis acrilamida

APLICACIONES

Purificación de biomoléculas, en especial proteínas

Determinación de la masa molecular de proteínas globulares (hayuna relación bastante aproximada entre el volumen de elución y el logaritmo de la masa molecular). Permite estimar la masa molecularde la proteína nativa.

Eliminación de sales de soluciones con moléculas de alto peso molecular (proteínas).

Unión de ligandos a macromoléculas, utilizando un ligando marcado(radioactivo) se puede separar el ligando libre del complejo con lamacromolécula.

RELACION ENTRE EL COEFICIENTE DE DISTRIBUCION Y EL LOGARITMO DEL PESO MOLECULAR DE UN CONJUNTO DE PROTEINAS

CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD

No se basa en diferencias en las propiedades físicas de los analitos, sinoen interacciones biológicas altamente específicas.En teoría, podría llevar a la purificación total de una proteína a partirde un extracto crudo.No sólo se utiliza para purificar enzimas (su aplicación original), sino también receptores, inmunoglobulinas, ácidos nucleicos, etc.

Requiere que la molécula que va a ser aislada sea capaz de unirsereversiblemente a un ligando específico, unido a una matriz insoluble.Se une así en forma selectiva la molécula con afinidad para el ligando. El resto puede ser eluido en el lavado, y finalmente la molécula de interés es eluida desplazándola del ligando.

COMPONENTES DE LA CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD

Matriz: debe poseer grupos químicos que permitan ligarla al "brazo".Debe tener una capacidad mínima de interacciones inespecíficas ybuenas propiedades de flujo. Se utilizan partículas de agarosa, dextrano,poliacrilamida, celulosa, etc., que sean esféricas, uniformes y rígidas.

Brazo: es opcional; permite separar el ligando de la matriz y así facilitarla unión de la macromolécula. Debe poseer grupos funcionales reactivosen ambos extremos, que permitan su unión química tanto a la matriz como al ligando.

Ligando: debe poseer un grupo químicamente reactivo que permitaunirlo al brazo.

matriz--brazo--ligando

Si la cromatografía de afinidad presenta tantas ventajas, ¿por quéno se la usa más comúnmente en la purificación de macromoléculas?

CROMATOGRAFIA DE PSEUDO-AFINIDAD

También llamada "cromatografía de ligando-colorante".

- Hay sustancias que por sus propiedades de polaridad y geometría sepueden unir a proteínas con alta especificidad sin tener una estructurasimilar a un ligando natural, mediante interacciones iónicas e hidrofóbicas.

- Variedad de colorantes textiles. Más utilizado: Cibacron Blue. Disponibles a bajo costo.

- Inmovilización a matrices diversas: polisacáridos (dextrano, agarosa,celulosa).

- La elución se logra por gradientes de sal o elución por afinidad.

Estructura del Azul de Cibacron F3GA.

La porción antraquinona (A) se parece a la estructura de ciertos sustratos:su estructura tridimensional se parece a los nucleótidos y combina gruposiónicos e hidrofóbicos que facilitan interacciones.

CROMATOGRAFIA GAS-LIQUIDO

Fase fija: líquido (de muy baja tensión de vapor) adsorbido a unamatriz sólida inerte. Son compuestos orgánicos de alto punto de fusióntales como polietilenglicoles.

Fase móvil: gases inertes tales como nitrógeno, helio y argón.

Es un tipo de cromatografía de partición en que la separación se lograpor diferencias en la volatilidad de los analitos. Muy usada en la separación de compuestos de baja polaridad, como lípidos.La columna (en general larga, 1-3 m, y delgada) se mantiene en unaestufa para facilitar la volatilidad de los analitos. También se utilizancolumnas capilares de < 1 mm de diámetro y hasta 100 m de largo, de alta resolución (muchos platos teóricos).

CROMATOGRAFIA GAS-LIQUIDO

CROMATOGRAFIA MONOLITICA

Emplea un nuevo tipo de empaque: sólido poroso de una pieza,denominado “monolito” (una piedra). Se caracterizan por poseer unamayor velocidad de flujo y mejor capacidad de resolución.

Al sintetizar estas resinas, se puede controlar la porosidad del material,y con ello los espacios vacíos. Se utilizan polímeros inorgánicos (sílice)y orgánicos (estireno-divinilbenceno). Unido a detectores de espectrometría de masas, se alcanzan sensibilidades de hasta menos de10-18 moles (attomoles).

Ha sido usado con éxito en la separación de proteínas, péptidos,oligonucleótidos y otros analitos.Están siendo aplicados con éxito encromatografía de afinidad.

UPLC: Ultra performance liquid chromatographyMayor rapidez y resolución en la separación de analitos

Se empacan las columnas con partículas de silice esféricas y de tamaño uniforme muy pequeñas (<2 µm).

Consecuencias: mejor resolución y mayor resistencia al paso de líquido, requiriendo muy altas presiones (hasta 15 000 psi).

Ejemplo: una mezcla de acetaminofen y cafeína en un HPLC requiere7 min para separarlos. En un UPLC, se obtiene mejor separación en sólo1 minuto.