BIO 368

ANALISIS INSTRUMENTAL

Métodos cromatográficos II

CROMATOGRAFIA DE ADSORBCION

Fase fija: sólidoFase móvil: líquido

Algunos materiales sólidos tienen la capacidad de retener (adsorber)moléculas en su superficie por fuerzas de atracción débiles no iónicas(van der Waals, puentes de H) y con distinta fuerza de interacción.

Al pasar la fase móvil, estas diferencias de atracción llevan a una separación de los analitos.

Grupos funcionales como hidroxilos y grupos aromáticos incrementanla interacción. Sólo los grupos específicos interactúan con el adsorbente.

Típicos adsorbentes: Sílice (posee grupos silanol Si-OH), carbón, alúmina.

EJEMPLOS DE CROMATOGRAFIA DE ADSORBCION

Cromatografía con hidroxilapatita: cristales de fosfato de calcio. Útiles para separación de proteínas y ácidos nucleicos. Como fasemóvil se utiliza amortiguador fosfato a distintas concentraciones.

Cromatografía de interacción hidrofóbica: Utilizada en lapurificación de proteínas basado en la presencia de grupos hidrofóbicosen la superficie de la proteína que son expuestos al colocar la proteínaen una solución salina concentrada. Como fase estacionaria se usan grupos alkilo o fenilo unidos a una matriz de sílice o agarosa. La eluciónse logra con gradientes de concentración decreciente de sal.

Separación de una mezcla de proteínaspor cromatografía de interacciónhidrofóbica usando distintas fasesestacionarias.

Se eluye con un gradiente descendentede sulfato de amonio en amortiguadorfosfato.

CROMATOGRAFIA DE PARTICION

Basada en diferente coeficiente de distribución Kd de los analitos de la mezcla por la fase fija y móvil.

Fase fija: líquida, adsorbida o unida covalentemente a un soporte sólido.

Fase móvil: líquida o gaseosa

TIPOS DE CROMATOGRAFIA DE PARTICION

Cromatografía líquida de fase normal:

La fase estacionaria es polar (p. ej. alkilaminas unidas a sílice), y la fase móvil es relativamente no polar (p. ej. acetato de etilo). Se eluyecon gradiente de polaridad creciente. El analito menos polar eluye primero. Utilizada en especial para separar analitos poco solubles en agua.

Cromatografía líquida en fase reversa:

La fase estacionaria es no polar y la fase móvil relativamente polar. Lamás común utiliza grupos alkil o aril silanos: butil (C4), octil (C8), fenil silanos unidos a sílice. La fase móvil utiliza soluciones acuosas,metanol, acetonitrilo (CH3CN) (o mezclas). La fase fija es inerte y sóloson posibles interacciones hidrofóbicas con los analitos. Los analitos polares eluyen primero. HPLC de fase reversa es una forma muy usadade cromatografía (flexibilidad y alta resolución).

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

Se basa en la atracción entre partículas de cargas opuestas. Altacapacidad y poder de resolución. Muy utilizada en la separaciónde proteínas, péptidos y aminoácidos.

Resinas de intercambio catiónico: la fase fija (sólida) posee cargas negativas y atrae partículas con carga positiva.

Resinas de intercambio aniónico: la fase fija (sólida) posee cargas positivas y atrae partículas de carga negativa.

Etapas del proceso de intercambio iónico: (fase móvil líquida) - Difusión del ión de la fase móvil a la superficie del intercambiador. - Difusión del ión por la estructura de la matriz al sitio de intercambio. - Intercambio de iones en el sitio de intercambio. - Difusión del ión intercambiado a la superficie. - Desorbción y difusión a la fase móvil.

EJEMPLOS DE RESINAS DE INTERCAMBIO

USO DE UNA RESINA DE INTERCAMBIO CATIONICO

ALGUNAS CARACTERISTICAS DE LA CROMATOGRAFIADE INTERCAMBIO IONICO

Capacidad de intercambio: número de miliequivalentes de iones intercambiables por unidad de volumen o peso de resina.

Elección de intercambiador: dependerá de la estabilidad de los analitos (proteínas).

Elución: Para que se una el analito a la resina, el pH debe estar al menos1 unidad por encima o debajo del pI. Se usan amortiguadores cuya forma cargada sea igual a la de la resina: (catiónicos, p. ej. Tris con intercambiadores aniónicos y acetato o fosfato con catiónicos); si los iones del amortiguador tienen carga opuesta a la resina, participan en el proceso de intercambio y producen variaciones locales de pH. La elución se realiza en general por gradiente (de pH, o de preferencia, fuerza iónica).

A: DEAE celulosa (intercambio aniónico)B: SP (sulfopropil) Sepharose (intercambio catiónico)C: Q-Sepharose (amina cuaternaria) (intercambio aniónico)

CROMATOENFOQUE

Se utiliza una resina de intercambio aniónico (con carga +). Se pre-equilibra la columna con un amortiguador a pH alto (p. ej. 9) y se lalava con un amortiguador anfotérico (con capacidad tamponante en un rango de pH, p. ej. 9 a 6) ajustado a pH 6.

El cromatoenfoque utiliza la capacidad amortiguadora del amortiguadoranfotérico y de los grupos cargados de la resina para generar ungradiente de pH. El eluido de la columna va a ser inicialmente de pH 9 e irá descendiendo a medida que se lava con el amortiguador a pH 6. Al agregar una proteína a la columna avanzará por el gradiente hastaalcanzar el pH que corresponde a su pI; allí se focaliza y eluye a esepH.

pH altopH bajo

pH alto

pH bajo

ex