Purificación de proteínas

Fase III

Utilizar los métodos cromatográficos apropiados considerando las propiedades de la proteína de interés:

A) pI, B) Peso molecular,C) Unión a ligantes como sustratos,

hormonas, compuestos que simulan a un metabolito, etc.

La fase III...

Se purifica a la proteína tomando en cuenta su afinidad específica por un ligando como:

a) su cofactor, b) un anticuerpo o c) un ión metálico.

Cromatografía de afinidad

pI es el pH al cual la carga neta de la proteína es cero.

A bajos pH hay más cargas positivas en el ambiente entonces la proteína incrementa su carácter catiónico.

De manera opuesta ocurre a pH por arriba del pI.

Carga

Cerca de su pI las proteínas son menos solubles

La carga neta de una proteína es positiva a valores de pH < pI, y se une fuertemente a una resina con cargas negativas o intercambiador catiónico.

Efecto de la fuerza iónica en la solubilidad de la proteína

FASE III

Cromatografía basada en la separación de las moléculas debida a su carga eléctrica

Intercambio iónico

Cambio en la carga eléctrica de la proteína

Cambio en la carga eléctrica de la solución de elución

Elución de las proteínas de la columna de intercambio iónico

MacroPrep High S Biorad

>gi|119920080|ref|XP_001251829.1| PREDICTED: similar to L-lactate dehydrogenase A chain (LDH-A) (LDH muscle subunit) (LDH-M) [Bos taurus]

MATLKDQLIQNLLKEEHVPQNKITIVGVGAVGMACAISILMKDLADEVALVDVMEDILKGEMMDLQHGSLFLRTPKIVSGKDYNVTANSRLVIITAGARQQEGESRLNLVQRNVNIFKFIIPNIVKYSPNCKLLVVSNPVDILTYVAWKISGFPKNRVIGSGCNLDSARFRYLMGERLGVHPLSCHGWILGEHGDSSVPVWSGVNVAGVSLKNLHPELGTDADKEQWKAVHKQVVDSAYEVIKLKGYTSWAIGLSVADLAESIMKNLRRVHPISTMIKGLYGIKEDVFLSVPCILGQNGISDVVKVTLTHEEEACLKKSADTLWGIQKELQF

Full length LDH

10 20 30 40 50 60 MATLKDQLIQ NLLKEEHVPQ NKITIVGVGA VGMACAISIL MKDLADEVAL VDVMEDILKG

70 80 90 100 110 120 EMMDLQHGSL FLRTPKIVSG KDYNVTANSR LVIITAGARQ QEGESRLNLV QRNVNIFKFI

130 140 150 160 170 180 IPNIVKYSPN CKLLVVSNPV DILTYVAWKI SGFPKNRVIG SGCNLDSARF RYLMGERLGV

190 200 210 220 230 240 HPLSCHGWIL GEHGDSSVPV WSGVNVAGVS LKNLHPELGT DADKEQWKAV HKQVVDSAYE

250 260 270 280 290 300 VIKLKGYTSW AIGLSVADLA ESIMKNLRRV HPISTMIKGL YGIKEDVFLS VPCILGQNGI

310 320 330 SDVVKVTLTH EEEACLKKSA DTLWGIQKEL QF

Theoretical pI/Mw: 7.64 / 36582.62

Compute pI/MwTheoretical pI/Mw (average) for the user-entered sequence:

http://www.expasy.ch/cgi-bin/pi_tool

Amortiguador de fosfatos pH= 7.0 Si la LDH tiene un pI=7.64, entonces está

ligeramente cargada positivamente a pH 7.0. Tipo de resina que se necesita: Una que

tenga carga negativa (un intercambiador de tipo catiónico).

Hay otras LDH que van de 6.55 hasta 8.6 entonces si bajamos el pH del amortiguador hasta 4.0-6.0 todas estarían cargadas positivamente.

LDH músculo isoforma músculo Bos taurus similar a LDH A

Ir construyendo su tabla de purificación...

Preparación de la columna