Comparación de dos procesos cromatográficos

para la purificación de lactoferrina

a partir de suero de queso

Proceso de elaboración del queso

Proceso de elaboración del queso

Generación de una de gran cantidad suero lácteo (relación 9:1 con respecto al queso) el cual generalmente se elimina como efluente, constituyendo un problema potencial de contaminación.

Demanda bioquímica de Oxigeno del suero es de 50,000 ppm, recuperación de nutrientes del suero podría reducir hasta en un 95% de dicho valor.

Lactoferrina

Glicoproteína de 80 kDa que posee la capacidad de unir y transportar el hierro a través de la sangre.

Además, presenta otras funciones como: • Actividad bactericida.• Antioxidante.• InmunomodulatoriaTodas muy útiles en la industria farmacéutica y alimentaria.

Lactoferrina recombinante humana

LactoferrinaLas principales fuentes comerciales de Lf son el suero de queso y la leche descremada, ambas de origen bovino.

Para el 2003, se estimó una producción mundial de 73 toneladas de Lf; Nueva Zelanda es el principal productor, mientras que Asia y Europa la consumen como suplemento alimenticio o como antimicrobiano en cosméticos y pastas de dientes.

Recientemente la FDA aprobó el uso de lactoferrina en canales de carne para el control del crecimiento microbiano.

Cromatografías utilizadasCromatografía de

intercambio iónico

La cual se basa en las diferencias en signo y magnitud de la carga eléctrica neta de las proteínas a un valor de pH determinado. La afinidad de cada proteína a los grupos cargados de la matriz esta influenciada por el pH y por la concentración de iones en solución (concentración salina) que compiten con la proteína en la interacción con la matriz.

Cromatografía de afinidad por metales inmovilizados

• Permite la separación de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando metálico

Cromatografías utilizadas

Materiales1. Los ensayos de inmunodetección se realizaron con :Anti-Lf bovina producida en cabra Anti IgG de cabra ligada a peroxidasa producida en conejo.

2. Para la Cromatografía de Intercambio Iónico se usara una matriz cromatográfica de Sulfopropil-Sefarosa.

3. Para la Cromatográfica por Afinidad de Metales Inmovilizados se usara una matriz de Sefarosa-IDA.

4. El suero se obtuvo de la elaboración de queso fresco por el método tradicional.

Purificación de la lactoferrinaCromatografía de intercambio iónico (IEC) en un equipo ÄKTA Purifier

• Se utilizó una matriz de Sulfopropil-Sefarosa empacada en una columna XK16 a un volumen de cama (VC) de 10 mL.

• La matriz se equilibró con 5 VC de pBS 10 mM, pH 6.7 (Solución A).

• El suero (200-1600 mg de proteína total), se aplicó a la columna y se promovió la adsorción de sus proteínas en presencia de la solución A, misma que se utilizó como fase móvil y solución de lavado.

• Las proteínas débilmente unidas se eliminaron con solución A con NaCl 0.1 M.

• La elución se promovió desarrollando un gradiente de 0.1–1 M de NaCl. • La columna se regeneró con 5 VC de NaCl 1 M, 2 VC de NaOH 1 M y 10 VC

de agua Milli Q.

Purificación de la lactoferrina

Cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC)

• Para la purificación de Lf por IMAC se utilizaron 10 mL de VC de Sefarosa-IDACu++.

• La matriz se equilibró con 5 VC de Tris-Ac. Acético 0.05M, NaCl 0.5M, pH 5 (Solución B).

• Las proteínas del suero (20-80 mg) se aplicaron a la columna, se promovió la adsorción con solución B y la elución fue con la misma solución a distinto pH (4 y 3).

• La matriz se regeneró con 5 VC de Guanidina 4M, 5 VC de EDTA 10 mM y 10 VC de agua MilliQ.

Purificación de la lactoferrina

En ambos casos la proteína se estimó por el método de Bradford utilizando una curva estándar de albúmina de suero bovino (BSA).

La caracterización de las fracciones cromatográficas de IEC e IMAC se realizo por electroforesis SDS-PAGE en geles de poliacrilamida al 10% tiñendo con plata y por inmunodetección con anti-lactoferrina bovina con Western Blot con el sistema avidina-peroxidasa.

Resultados y discusión

Resultados cromatografía de intercambio iónico

• La adsorción de proteínas se promovió en presencia de PBS pH 6.7 (pico 1).

• Las proteínas que no se unieron de manera específica fueron desprendidas con NaCl 0.1 M (pico 2).

• Posteriormente se eluyó con un gradiente de 0.1-1 M de NaCl (picos 3 y 4).

Figura 1.A: Cromatograma de purificación por intercambio iónico

Resultados y discusión Podemos ver la electroforesis del pico

4 en el que se obtuvo la Lf (carril 2) y la confirmación por inmunodetección con anti-lactoferrina (carril 3).

Se muestra la migración electroforética del pico 4 (carril 2) al aplicar 400 mg de proteína de suero de queso. Se observa una banda de 80 kDa correspondiente a la masa molecular de la Lf bovina.

No se observa contaminación con alguna otra proteína.

La inmunodetección con antilactoferrina bovina (carril 3), confirmo la presencia de la proteína. Figura 1.A: Electroforesis de

cromatografía de intercambio iónico

Resultados y discusiónResultados cromatografía de afinidad por metales inmovilizados

En la imagen se observa un cromatograma típico obtenido por IMAC para la purificación de Lf. En el cromatograma se observan 3 picos. Lavado (Solución B solución, Tris Ac. Acético, pH 5) Elución con solución B a pH 4 Elución con solución B a pH 3.

La matriz aceptó desde 20 a 50 mg de proteínas de suero saturándose con 40mg.

La velocidad máxima de la fase móvil fue de 1 mL/min.

La capacidad de la matriz fue de 0.1 mg de proteína /mL de matriz, obteniéndose un máximo de 0.08 mg de proteína en un proceso de 4 h.

Figura 2.A: Cromatografía de purificación por afinidad por metales inmovilizados

Resultados y discusiónCarriles de la electroforesis:

1. Estándares de masa molecular

2. Suero de queso

3. Fracción de lavado (pico1)

4. Fracción de elución a pH 4 (pico 2)

5. Fracción de elución a pH 3.

La Lf no pudo obtenerse pura en este tipo de cromatografía.

En el carril 4 se observa una banda de 80 kDa correspondiente a la Lf y otras bandas (contaminantes).

Debido a esta contaminación, fue necesario acoplar una columna de Sefarosa-Heparina a IMAC, con el fin de aplicarle la elución a pH 4 y obtener la Lf pura añadiendo 4 h más al proceso.

Figura 2.B: Electroforesis de cromatografía de afinidad por metales inmovilizados.

Conclusión

Cuadro 1 : Resumen de los aspectos más relevantes de la comparación de ambos procesos cromatográficos.

ConclusiónComo puede observarse la cromatografía de intercambio

iónico requiere de la mitad del tiempo de proceso (4 h) para obtener de 18 a 20 veces más lactoferrina que la cromatografía de afinidad por metales inmovilizados.

En este último proceso debe además, acoplarse una cromatografía de afinidad por heparina para obtener la lactoferrina pura, ya que, como se observó en los patrones electroforéticos de la figura 2, la Lactoferrina obtenida por IMAC se encuentra contaminada con albúmina e inmunoglobulinas.

La matriz de intercambio iónico acepta mayores flujos de la fase móvil sin comprimirse (5 mL/min) y acepta una mayor cantidad de proteínas sin saturarse.

Por lo tanto la IEC es un proceso mas optimo que la IMAC para la purificación de lactoferrina.

Bibliografía• Elaboración de queso:

http://www.poncelet.es/enciclopedia-del-queso/elaboracion.html

• Lactoferrina: http://www.naturafoundation.es/monografie/Lactoferrina.html

• Cromatografías: http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/cromatografia.htm

• Método de Bradford: http://bioquibi.webs.ull.es/practicas/3.pdf