CROMATOGRAFÍA

(parte I)

Graciela Escandar

Conceptos generales Clasificación La elución en cromatografía en columna Resolución

Sistemas cromatográficos (reparto, adsorción, intercambio iónico y exclusión molecular)

Cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) Cromatografía de gases

TEMAS A DESARROLLAR

Origen

A principios del siglo XX, el botánico ruso Tswett separó pigmentos vegetales pasando soluciones de estos pigmentos por una columna de vidrio empaquetada con CaCO3. Las especies separadas aparecían como bandas de colores, lo que dio origen al nombre del método

chroma = color graphé = escribir

Fase móvil (líquida o gaseosa): contiene los componentes a separar y fluye a través de la fase estacionaria

Fase estacionaria (líquida o sólida): a través de la cual fluye la fase móvil y donde quedan momentáneamente retenidos los componentes de la muestra

Un sistema cromatográfico consta de dos fases

Cromatografía: técnica separativa donde

los componentes de una muestra se

distribuyen entre dos fases (FM y FE), como

consecuencia de su diferente afinidad hacia

dichas fases. La separación se basa en las

distintas velocidades de migración de los

analitos, determinadas por el tiempo que

permanecen en cada fase

Definición

líquida

sólida

resina i.i.

gel poroso

otras

líquida

sólida

L-L y L-FL partición L-L

intercambio iónicoInter. Iónico

G-L y G-FL

exclusión

G-S

tamizado

L-S

adsorción

partición G-L

adsorción

afinidad reacción específica

Líquida(cromatografía líquida)

Gaseosa(cromatografía gaseosa)

Fluido supercrítico (cromatografía de fluidos supercríticos)

FM FE Método InteracciónClasificación

Clasificación

De acuerdo a la disposición física de la FE

Planar

papel

capa delgada

Columna

B Detector

B

At0

BA

BA

Muestra

Cromatografía en columna: elución

A + B

t2t1 t4t3

FM FM FM FM

Análisis cualitativo y cuantitativo

Objetivo de la cromatografía

resolver los componentes de una muestra

Cromatograma con picos no resueltos

Mejora por aumento en la separación de bandas

Mejora por disminución del ancho de bandas

1t

t2

B A

3t

B A

Distribución de A y B dentro de la columna

Distancia de migración (L)

Con

cent

raci

ón (

CE)

El ensanchamiento de cada banda se produce a una velocidad menor que su desplazamiento → se logran separaciones exitosas

Teorías del proceso cromatográfico

Teoría de los platos: concepto de N y H (similitud con columna de destilación fraccionada). Explica la forma gaussiana de las bandas pero no su ensanchamiento durante el proceso cromatográfico.

Teoría cinética: La columna opera en situación de no-equilibrio. Nuevo concepto de N y H

La teoría del proceso cromatográfico debe explicar las variables que influyen en la velocidad de migración de los analitos y en el ensanchamiento de las bandas

SE

ÑA

L D

ET

EC

TO

RtR

TIEMPO

tR

Cromatograma

compuesto no retenido por FE

analito

tM

CE

CM

Cromatografía líquida Cromatografía de adsorción

Isotermas de reparto y adsorción

CM

mda/mte

masa adsorbida/masa adsorbente

Factor de separación (factor de selectividad)

Factor de retención(factor de capacidad)

= kB

kA

k = nE

nM

Constante de reparto

K =CE

CM

Constantes termodinámicas

Mide la distribución del analito entre FE y FM

Describe la velocidad de migración del analito en la columna

Mide la selectividad de la columna de un analito respecto a otro

Relación entre las constantes termodinámicas y el tiempo de retención

velocidad lineal del soluto v = L/tR

velocidad lineal de la FM u = L/tM

velocidad relativa del analito dentro de la columna

v/u = L/tR

L/tM

La velocidad relativa también se puede definir a partir de la fracción molar del soluto en la FM

v/u = nM

nM + nE

=1

1 + nE/nM

v/u = tM/tR

=1 + k

1

Igualando los segundos miembros de ambas expresiones

tM

tR 1 + k

1= tR = tM (1 + k)

tR = tM (1 + K VE/VM)

tR - tM

tM

k =

v/u = tM/tR =1 + k

1v/u

velocidad relativa

Relación entre las constantes termodinámicas y el tiempo de retención

señ

al d

etec

tor

tiempo

W= 4

punto de inflexión

Ancho de banda

Parámetros relacionados con el ancho de banda

N y H

N = 16 (tR/W)2

N = L/H

Eficiencia

N = 16 (tR / W)2

DemostraciónH = 2/L

LtR

= LtR

= 2 2

2 2

LtR

= HLtR

= 2

2

HWL16tR

= 2

2

LtR

HW

= 162

N

recordando que: W = 4= W/4

N = 16 (tR / W)2

Ecuaciones relacionadas con la eficiencia

H = A + B/ + C

Relacionan la altura de plato teórico con los procesos dispersivos que ocurren dentro de la columna (A, B y C) y la velocidad de la fase móvil

difusión en remolino

difusión longitudinal

Ecuación de van Deemter

H = A + B/ + CE + CM

Otra ecuación

resistencia a la transferencia de masa

2

1

2

Difusión en remolino

A = 2 dp

33

1

constante de empaque

diámetro medio de partículas

B = 2 DM

Dir

ecci

ón

de

FM

Difusión longitudinal

factor de obstrucción

coeficiente difusión del analito en FM

FMFE

FMFE

dirección de elución

Resistencia a la transferencia de masa

Desde y hacia la FE: CE

t1

t2

FE líquida

FE sólida

E2

2fEDk)(1

qkdC+

=

2d

Ek)(1

k2tC

+=

Resistencia a la transferencia de masa

Dentro de la FM: CM

soporte soporte

M

2c

2p

MD

)d,,f(dC

=

Resistencia a la transferencia de masa

H

H = A + B/ + CE + CM

H mínimo

óptimo

AB/

CE

CM

Ecuación de van Deemter

Tiempo

Señ

al d

el d

etec

tor

0

1

tr

WA WB

Resolución

2tr(WA + WB)

R =

kBR =

1+kB

4

N

Optimización de la columna

aumentar la separación entre bandas (tR)

Modificar variables termodinámicas (K, k y ) modificando FM, FE y temperatura

disminuir el ancho de bandas

Modificar variables que permiten ↓H y ↑N (ecuación tipo van Deemter)