CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS

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1 CURSO DE CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS HPLC

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CURSO

DE

CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS

HPLC

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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS HPLC

1.- INTRODUCCIÓN

La cromatografía se utiliza para separar los diferentes analitos de interés a partir de mezclas con otros analitos que interfieren. Los métodos cromatográficos se pueden dividir en dos principales categorías: cromatografía de gases (GC) y cromatografía de líquidos de alto desempeño (HPLC). La cromatografía de líquidos de alto desempeño (HPLC) es una técnica de separación muy usual para semivolátiles y no volátiles o para analitos que se descompongan por calentamiento. El éxito de la separación de cromatografía de líquidos requiere que los analitos de interés sean solubles en el disolvente seleccionado como fase móvil. Debido a que los disolventes se trabajan a alta presión, la técnica originalmente se le llamó cromatografía de alta presión, pero ahora se le refiere como cromatografía de líquidos de alto desempeño, (High Performance Liquid Chromatography). Todos los procesos alcanzan una separación por el paso de una fase móvil sobre una fase estacionaria. Los constituyentes de una mezcla son separados debidos a sus diferentes coeficientes de partición entre la fase móvil y la fase estacionaria teniendo así diferentes tiempos de

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retención. Los compuestos que interaccionan fuertemente con la fase estacionaria eluyen lentamente (tiempo de retención grande), los compuestos que permanecen en la fase móvil o que su interacción con la fase estacionaria es débil, eluyen rápidamente (tiempo de retención corto).

2.0 DEFINICIONES

2.1 Tiempo de retención total ( tR1 o tR2 ) es el tiempo, que es necesario para que el componente de una muestra migre desde la entrada de la columna (inyección de la muestra) al final de la columna(detector). Tiempo muerto t0 (tiempo sin adsorción) es el tiempo requerido por un compuesto inerte para que migre de la entrada de la columna al final de la columna sin ninguna interacción por la fase estacionaria. 2.2 Tiempo de retención neto o corregido (t´R1 o t´R2) es la diferencia entre el tiempo de retención total y el tiempo muerto t0 . Que es el tiempo que permanece el analito en la fase estacionaria. t´R1 = tR1 – t0 t´R2 = tR2 - t0 2.3 Factor de capacidad k´es una medida de la separación de la muestra en el cromatograma. Este es específico para una sustancia dada, k´ depende de la fase estacionaria, la fase móvil, la temperatura, características del empaque, etc. k1´= tR1 – t0 = tR1 k1´= tR1 – t0 = tR1 t0 t0 t0 t0

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2.4 Retención relativa , también conocido como

factor de separación , es la relación entre dos factores de capacidad, colocándose en denominador el compuesto de referencia. = k´2

k´1 2.5 Velocidad lineal del disolvente µ (cm/seg). La velocidad lineal es independiente de la sección transversal de la columna y proporcional a la caída de presión de la columna. La velocidad lineal puede ser calculada por medio del tiempo muerto, en donde L es la longitud de la columna en cm y t0 es el tiempo de retención de un compuesto no retenido. U = L t0 2.6 Número de platos teóricos n caracteriza la calidad del empaque de una columna y su transferencia de masa, números grandes de n significa que se pueden separar mezclas complejas de analitos. N = 16 ( tR1 / w ) 2 = 5.54 (tR1 / w1 )

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2.7 Altura equivalente de un plato teórico h (HETP), es la longitud (o altura) de un plato teórico, cuando una columna tiene un número grande de platos teóricos, h , la altura deberá ser muy pequeña. El valor de h es un criterio para la calidad de una columna, el valor de h depende del tamaño de partícula, velocidad de flujo y de la fase móvil. h = L / n

3.0 CLASIFICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS

3.1 En HPLC fase Normal, donde la fase estacionaria es de elevada polaridad tal como el trietilenglicol colocada sobre partículas de sílice o alúmina, y la fase móvil de menor polaridad que la fase estacionaria (columna polar, fase móvil no polar). En HPLC fase Reversa, se refiere a que la fase móvil es relativamente polar y la fase estacionaria no polar (columna no polar, fase móvil polar). La fase estacionaria con frecuencia se trata de un hidrocarburo y la fase móvil puede ser como por ejemplo el agua, el metanol o el acetonitrilo. La fase Reversa de HPLC es la técnica seleccionada para analizar residuos y analitos orgánicos no volátiles. En cromatografía en fase normal, el componente menos polar se eluye primero, debido a que relativamente

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es el más soluble en la fase móvil y un aumento de la polaridad de la fase móvil aumenta el tiempo de elución. En cromatografía fase reversa: Las partículas sólidas de partículas no tratadas son polares y no son muy usuales para separar compuestos no polares, por la poca afinidad que se tiene. Para resolver este problema la superficie reactiva (polar) se le somete a un proceso químico para cambiar ésta superficie a no polar, teniéndose así diversas superficies no polares (fase reversa). Los rellenos de fase enlazada se clasifican como de fase inversa cuando el recubrimiento unido químicamente tiene un carácter no polar, y de fase normal cuando el recubrimiento contiene grupos funcionales polares. Por lo general, el grupo R del siloxano en estos recubrimientos es una cadena C8 (n-octilo) o una cadena C18 (n-octadecilo). En estas preparaciones, los grupos de hidrocarburo de cadena larga se alinean el uno junto al otro y en perpendicular a la superficie de la partícula, dando una estructura semejante a una brocha o un cepillo. Las cadenas más largas originan rellenos o empaques que proporcionan una mayor retención. Además, una mayor longitud de la cadena permite una mayor cantidad de muestra. En la mayoría de las aplicaciones de la cromatografía en fase inversa (o reversa) , la elución se lleve a cabo con una fase móvil de elevada polaridad como es el caso de

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una solución acuosa conteniendo concentraciones diversas de disolventes como el metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano. Se debe procurar que el pH sea menor de, aproximadamente a 7,5 porque si no puede tener lugar la hidrólisis del siloxano, lo que originaría la degradación o destrucción del empaque. Con empaques de fase enlazada en fase normal, R en la estructura del siloxano es un grupo funcional polar como es el caso de los grupos ciano ( -C2H4CN ), diol ( _C3H6OCH2CHOHCH2OH), amino (-C3H6NH2 ) Y Los Dimetilamino ( -C3H6n(CH3)2. 4.0 COMPONENTES BÁSICOS DE UN

CROMATOGRAFO DE LÍQUIDOS 4.1 Componentes de HPLC Los componentes fundamentales de un cromatógrafo de líquidos de alta resolución son comúnmente los siguientes: • Bomba • Inyector/Automuestreador • Columna • Detector • Recipientes de disolventes • Disolventes • Desgasificador • Filtro (frit)

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• Precolumna • Válvula de drenado • Sistema de datos/Integrador • Todas estas partes pueden presentar problemas y requieren diagnosticarlos. 4.1.1 Un aparato de HPLC se equipa con uno o más recipientes de vidrio para contener los disolventes a utilizar como fase móvil. El desgasificador que puede consistir en un difusor de un gas inerte como helio que arrastra los gases disueltos como el aire. Estos sistemas pueden tener un dispositivo ( filtro) para la eliminación de partículas sólidas en suspensión de los disolventes. Por otro lado, conviene que todos los disolventes que se vayan a utilizar, sean filtrados a vacío a través de una membrana de 0.45 micras. 4.1.2 Disolventes El rango de disolventes que pueden ser usados en cromatografía de líquidos es muy amplio. El agua y las disoluciones acuosas buffer (reguladora) son de uso común, así como los disolventes no acuosos de baja viscosidad. Los disolventes no acuosos poseen diferentes polaridades (ver tabla).

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Tabla 1.- Disolventes grado cromatografía de líquidos en orden de índice de polaridad.

Disolvente Polaridad Disolvente polaridad

Pentano 0.0 Metil terbutil éter 2.5

Heptano 0.1 o-Xileno 2.5

Hexano 0.1 Benceno 2.7

Eter petróleo 0.1 Clorobenceno 2.7

Isooctano 0.1 o-Diclorobenceno 2.7

Ciclohexano 0.2 Eter etílico 2.8

Hexadecano 0.5 Cloruro de metileno 3.1

Tricloroetileno 1.0 Dicloro etileno 3.5

Tetracloruro de carbono 1.6 Isopropanol 3.9

Tolueno 2.4 2- butanol 4.0

Disolvente Polaridad Disolvente Polaridad

Alcohol isobutílico 4.0 Metanol 5.1

Tetrahidrofurano 4.0 Piridina 5.3

Cloroformo 4.1 Carbonato de dietilo

5.5

Metil isobutil cetona 4.2 2- Metoxi etanol 5.5

Acetato de etilo 4.4 Acetonitrilo 5.8

Metil n-propil cetona 4.5 Propilen carbonato 6.1

Metil etil cetona 4.7 Dimetil formamida 6.4

2- Etoxietanol 5.0 Dimetil acetamida 6.5

Fenetilamina 5.0 Dimetil sulfóxido 7.2

Acetona 5.1 Agua 10.2

4.1.3 Filtros Los disolventes que se usen en cromatografía de líquidos, deben de estar libres de partículas y de aire disuelto, para ello se deben filtrar y desgasificar, de lo contrario pueden causar problemas. Las partículas pueden bloquear el

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empaque de la columna y el aire disuelto puede formar burbujas en el sistema que provocan ruido en el detector. Para eliminar las partículas es necesario filtrar haciendo pasar el disolvente a través de una membrana de 20 micras, colocada en un sistema filtrante Millipore accionada con vacío. Para desgasificar se introduce al reservorio del disolvente un tubing con un filtro de metal sinterizado mediante el cual se le burbujea helio, con un flujo pequeño (5 -10 psi). Otra opción para desgasificar los disolventes consiste en colocar el reservorio dentro de un baño de ultrasonido durante 10 – 15 min. La muestra puede ser también un problema, para asegurarse que no tenga partículas, deberá ser filtrada mediante una membrana de 0.45 micras utilizando una jeringa que en su extremo tenga colocado un filtro con esta membrana (swinny). 4.1.4 Bombas La bomba es una de las partes más importantes de un cromatógrafo de líquidos. Para obtener las mejores separaciones, la columna deberá empacarse con partículas muy pequeñas, pero como se puede observar que esto afecta grandemente a la presión requerida. Esto significa que entre menor sea el tamaño de partícula mayor será la presión desarrollada por la bomba.

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Se utilizan tres tipos de bombas: bombas recíprocas, bombas de jeringa o de desplazamiento y bombas neumáticas o de presión constante. Las bombas recíprocas, son las que se usan en su mayoría, consisten, en una pequeña cámara en la que el disolvente es impedido por el movimiento de vaivén de un pistón accionado por un motor. Dos válvulas con cierre de bola, que se abren y cierran alternativamente, controlan el flujo del disolvente hacia dentro y hacia fuera de un cilindro.

4.1.5 Inyectores

El inyector de un HPLC comúnmente consiste de una válvula de inyector y un loop de muestra. La muestra se disuelve en la fase móvil antes de ser inyectada en el loop de la muestra. La muestra se carga con una jeringa y se inyecta en el loop a través de la válvula de inyección. Con un giro al rotor de la válvula, se cierra la válvula y se abre el loop para inyectar la muestra en la corriente de la fase móvil. Los volúmenes del loop pueden ser desde 10 µl hasta 500 µl. Las inyecciones pueden ser automatizadas.

4.1.6 Precolumnas En muchas ocasiones, para aumentar la vida de la columna analítica, se coloca por delante una precolumna que elimina la materia en suspensión y los contaminantes de los disolventes. La composición del empaque de la precolumna debe de ser semejante al de la columna

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analítica; sin embargo, el tamaño de partícula es por lo común mayor para minimizar la caída de presión. Las columnas pueden bloquearse con partículas que se van reteniendo sobre la superficie del empaque al paso de la disolución de las muestras inyectadas o de la propia fase móvil (disolvente) provocando un aumento en la presión de trabajo, para minimizar este problema se tienen 2 formas de protección de la columna. Una forma es utilizar una precolumna (o guarda columna) y la otra es instalar un filtro en línea entre el inyector y la columna. La precolumna consiste en una sección corta de columna, alrededor de 5 cm de longitud, empacada con el mismo material que la columna e instalada inmediatamente antes de la columna. Esta columna actúa como un filtro, sí ésta, empieza a bloquearse (la presión aumentará, para mantener la misma velocidad de flujo, de ser necesario la precolumna puede ser removida, limpiarla y reempacarla. Las precolumnas eliminan materia en suspensión y componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la fase estacionaria. Las precolumnas deberán ser de composición similar a la columna analítica, ayudando al buen funcionamiento de la columna analítica, reemplazando la precolumna cuando se contamine.

4.1.7 Columnas Las columnas para cromatografía de líquidos se construyen de acero inoxidable, con una resistencia de

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presión de hasta 10000 psi. Estas son de una longitud de 10 a 30 cm de longitud, con un diámetro interno de 4 a 10 mm, tamaño de partícula del empaque de 5 a 10 micras. Normalmente los números de platos se pueden situar en 100 000 platos/ metro. Las columnas son rectas, de 10 a 30 cm de longitud, que de acuerdo a necesidades es posible hacer extensiones mediante acoples y así tener longitudes más largas. Las columnas normalmente no requieren control de temperatura trabajando a temperatura ambiente, sin embargo la aplicación de temperatura puede mejorar los cromatogramas. De manera común las columnas son de 25 cm de longitud, 4.6 mm de diámetro, y tamaño de partícula de 5 micras y con un número de platos de 10,000 platos. Generalmente las columnas se trabajan en condiciones isotérmicas, a temperatura ambiente. Los instrumentos modernos tienen control de temperatura, desde la ambiente a 100 o 150 o C. El empaque de la columna consiste en micropartículas de 3 a 10 micras de diámetro, de silica , que están recubiertas con películas de sustancias orgánicas unidas fisicamente o químicamente a la superficie.

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4.1.7 Detectores Los detectores en cromatografía de líquidos son de dos tipos básicos. Los detectores basados en una propiedad de la disolución, responden a una propiedad de la fase móvil, tal como el índice de refracción, la constante dieléctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos. Por otro lado se tienen los detectores basados en una propiedad del soluto, que responden a alguna propiedad del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, o intensidad de difusión, que no son propias de la fase móvil. 4.1.8.1 Detectores de absorbancia Los métodos HPLC requieren del uso de detectores, de tal forma que un flujo de la columna pasa a través de una celda montada el extremo final de la columna. Un haz de radiación ultravioleta pasa a través del flujo de la celda en el detector. A medida que los compuestos eluyen de la columna, pasan a través de la celda y absorben la radiación, resultando en una energía medible.

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5.0 CROMATOGRAFÍA 5.1 Inyección de muestra A menudo, el factor limitante en la precisión de las medidas en cromatografía de líquidos es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna. El problema se agrava por el ensanchamiento de banda que acompaña a la sobrecarga de las columnas. Por ello, los volúmenes que se emplean deben de ser pequeños, de unas cuantas décimas de microlitro hasta tal vez 500 microlitros. Además, se ha de poder introducir la muestra sin despresurizar el sistema. Normalmente los volúmenes con que se trabaja van de 5 a 50 microlitros ( μL). Una forma de inyectar consiste en introducir la jeringa (que debe de ser de punta roma) al inyector del cromatógrafo de líquidos, que tiene instalado un “loop” o rizo, en el cual se descarga la muestra, para posteriormente se accione el dispositivo de “inyectar muestra”. Este tipo de inyector permite que la muestra se introduzca sin interrumpir el flujo de la fase móvil. Con estos loops o rizos se puede introducir la muestra hasta presiones de 7000 psi (libras por pulgada cuadrada), con una precisión de unas décimas de por ciento. Nunca se debe de utilizar una microjeringa propia para cromatografía de gases, ya que estas jeringas pueden rayar las superficies del inyector y provocar fugas.

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El loop es un tubing de acero inoxidable en forma de rizo o aro. Estos loops o rizos son intercambiables de acuerdo al volumen en microlitros con el que se quiere trabajar. Es decir que el volumen de muestra se determina por el tamaño del loop, lo común es de 10, 20 o 50 μL. 5.1.1 Cromatografía fase normal y fase reversa. Se distinguen dos tipos de cromatografía de reparto: fase normal y fase inversa o reversa. En la fase normal, la fase estacionaria es polar (grupos ciano, amino, diol) y la fase móvil no polar (hexano). En la fase inversa o reversa, la fase estacionaria es no polar y la fase móvil es polar (agua, metanol, acetonitrilo). En fase normal, el componente menos polar es el que eluye primero y en la fase inversa o reversa el componente más polar es el primero en eluir. 5.1.2 Fases móviles ( Eluyentes) Las fases estacionarias en base a la silica son compatibles con todos los disolventes orgánicos dentro del rango de pH mencionado. Es recomendable utilizar disolventes de la más alta pureza (grado HPLC). Además de que todas las disoluciones preparadas se deben de filtrar a través de un membrana de 0.5 micras antes de utilizarse en el sistema de HPLC.

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El uso de disolventes HPLC no puros provocan adsorción irreversibles de impurezas sobre la entrada de la columna. Estas impurezas bloquean los sitios de adsorción, cambian la selectividad de la columna y provocan que haya división de picos. En gradiente de elución, las impurezas causan los llamados picos “fantasmas”. Los picos fantasmas pueden aparecer siempre en la misma posición en el cromatograma. Generalmente estos picos son causados por las impurezas de los disolventes o aditivos. Por la que es recomendable correr un gradiente sin inyección al iniciar cada método para eliminar los picos fantasmas. Para impedir la adsorción irreversible en la entrada de la columna, es recomendable utilizar una precolumna. Al utilizar la precolumna aumenta notablemente la vida media. Como alternativa de precolumna es instalar un filtro en línea. Estos filtros retienen sólidos del eluyente pero no impiden la adsorción irreversible de impurezas orgánicas. ilRestricte17 July 2008Month ##, 200X Page 10 5.1.3 Fase estacionaria reversa La fase móvil es polar y consiste de disoluciones acuosas conteniendo concentraciones diversas de metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano. El pH no debe de ser mayor que 7.5 porque esto generaría la hidrólisis del siloxano y la destrucción del empaque de la columna.

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Si – OH + Cl Si R3 Si – O – Si R3

En donde R puede ser radicales metilo o C8 H17 o C18 H37 (metilo, octilo o octadecilo). Los eluyentes se clasifican en orden creciente de polaridades de la siguiente forma: Hidrocarburos; éteres; ésteres; cetonas; aldehídos; amidas; aminas; alcoholes; y agua. La polaridad de la fase estacionaria deberá ser bastante similar a la de los analitos y para la elución se utiliza una fase móvil de polaridad considerablemente distinta. El tiempo de elución puede ser modificado con la polaridad del eluyente, los factores de selectividad pueden controlarse variando la naturaleza de la fase móvil o la fase estacionaria. El eluyente puede estar formado por una mezcla de disolventes, tales como metanol (49%) con agua (51%), proporciones que en su momento pueden cambiarse. 5.1.4 Gradiente de elución Si la composición del disolvente se mantiene constante a través de toda la corrida analítica, se tiene un proceso llamado elución isocrática. Sí la composición del disolvente se cambia de alguna forma (pH, fuerza reguladora, mezcla con otros disolventes), entonces se

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tendrá un proceso llamado elución por gradiente . El gradiente de elución es muy usual cuando se tienen mezclas de analitos con diversas características. Las características del disolvente se cambian progresivamente, que a su vez cambian el comportamiento de los analitos. Sí se realiza apropiadamente, mezclas complicadas en su separación pueden ser separadas eficientemente. Generalmente para realizar este tipo de mezclas se requiere de una segunda bomba, sin embargo es posible con una sola bomba pero con una válvula de control y una cámara mezcladora. 6.0 SELECCIÓN DE COLUMNAS DE HPLC 6.1 Parámetros de selección de columna Fase estacionaria Tamaño de poro Tamaño de partícula Longitud Diámetro interno 6.1.1 Selección de la fase Para esta selección se debe considerar el tipo de analitos de interés y el pH.

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•Las fases C18 y C8 son las mejores para iniciar el desarrollo de métodos con muestras típicas. •Tener en cuenta que el pH juega un papel crítico en la separación y puede ser agresivo para la columna; buscar la columna adecuada. •Elegir la fase estacionaria más adecuada para la muestra en particular. Usar fases especiales como la SB-Aq para muestras polares, difíciles de retener para disminuir los tiempos de desarrollo. •Buscar la columna que nos dé resultados con el mínimo de problemas C18 ofrece la mayor retención, puede ser más de lo deseado para algunas muestras; recomendada para analitos moderadamente polares. C8 tiene menor retención que C18, pero su selectividad es parecida en la mayoría de los casos; recomendada para analitos polares, moderadamente polares y no polares. Fenil tiene una retención significativamente menor para compuestos no polares, pero retiene los compuestos polares, por lo que reduce el tiempo de análisis para mezclas de compuestos polares y no polares. CN es la de menor retención, muestra cambios en la selectividad, buena para reducir los tiempos de análisis de los compuestos que tardan en eluir lo cual evita el uso de gradientes. Buena para separaciones de compuestos polares y moderadamente polares. E- July 17 July 2008Month ##, 200X Page 3

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6.1.2 Selección del Tamaño de Poro Tamaño de las moléculas que serán analizadas. • Las moléculas pequeñas (PM menor a 2000) pueden distribuirse fácilmente en poros de 80-120Å • Las moléculas mas grandes (PM mayores a 2000)por ej. proteínas y péptidos, requieren un tamaño de poro mayor 300 Å

E-Semi17 July 2008Month ##, 200X Page 4 6.1.2.1 Selección del tamaño de poro de la columna. •Las moléculas deben entrar al poro para interactuar con la fase. •La moléculas deben entrar y salir del poro libremente

para maximizar la eficiencia. 5

• El tamaño de la molécula en disolución determina el tamaño de poro de la columna. • Un pico estrecho indica acceso libre a los poros. /Presentation TitleAgilent Restrictedonth ##, 200X Page 6 6.1.3 Tamaño de partícula Para análisis convencionales de moléculas grandes y pequeñas, el tamaño de partícula más usado es de 5 micras. Mientras más pequeño sea el tamaño de partícula, mayor es la eficiencia y la resolución. Tamaños de partícula disponibles (en micras): 1.8, 3, 3.5, 5, 10. E-SeminarGroup/Presentation Titl17 July##, 200X Page 7 6.1.4 Selección de longitud de la columna •El tiempo de análisis es proporcional a la longitud de la columna.

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•Columnas de 250mm tienen tiempos de corrida más largos •Preferir columnas cortas de tamaño de partícula pequeño para disminuir el tiempo de análisis. E-Semin arGr17 July 2008Month ##, 200X Page 8 6.1.4.1 Disminución del tiempo de análisis… Disminuir la longitud de columna y disminución del tamaño de partícula: •disminución proporcional en el tiempo de análisis (tiemp~long, L) •disminución proporcional en el uso de disolventes (~L) •disminución de N, platos~ L y así N mantiene la resolución, R. Agilent Restricted17 July 2008Month ##, 200X Page 9 6.1.5 Selección del diámetro interno •El diámetro interno define cuánto del analito se puede inyectar en la columna. •Las columnas de i.d. pequeño, incrementan la sensibilidad, por lo que son muy usadas en técnicas como LC/MSD •Mientras menor sea el i.d., requiere de menor cantidad de disolvente E-

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7.0 DESARROLLOS DE MÉTODOS

7.1 pH – Un parámetro importante

•La retención de los compuestos ionizables es fuertemente influenciada por el pH. •Los compuestos ionizables (ácidos y bases) pueden ser analitos o compuestos de matriz. •Un control preciso del pH mejora la reproducibilidad del método. •El intervalo de pH de 1 – 12 provee la máxima flexibilidad para el desarrollo de métodos pH 2.5, pH 6.5, pH 8, pH 11.5.… 2A/Presentation Title17 July 2008Month ##, 200X Page 18 7.1.1 pH medio •Los compuestos de interés son inestables a bajos pH •Se mejora la solubilidad de los analitos a pH medios. •Incrementar la retención de los compuestos básicos. •Puede existir una mejor selectividad en el intervalo de pH de 3 a 8.E-SeminarGroup/Presentation TitleAgilent Restricte17 July 2008Month ##, 200X Page 20 7.1.2 pH alto •Los compuestos de interés pueden no ser solubles a pH bajos. •Los compuestos de interés pueden no ser estables a pH bajos. •Obtener un incremento en la retención de compuestos básicos analizándolos en su forma no cargada. •Mejorar la selectividad.

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E-Se 8.0 CUIDADOS GENERALES PARA COLUMNAS DE HPLC La silica es el soporte ideal para las columnas HPLC . Esta ofrece una gran estabilidad mecánica, excelentes propiedades fisicoquímicas, un amplio rango de enlaces químicos y es compatible con un amplio rango de disolventes químicos. Los siguientes puntos son importantes: 8.1 Estabilidad con el pH En general, las columnas de HPLC son estables dentro de un rango de pH de 2 a 8. 8.2 Estabilidad mecánica Las fases estacionarias basadas en la silica, mecánicamente son muy estables. Las columnas pueden utilizarse hasta 6000 psi sin tener problemas. Sin embargo se deben evitar “golpes o shocks” de presión sobre las columnas. Los golpes de presión en las columnas provocan canalizaciones en la columna, lo cuál resulta en divisiones de picos en los cromatogramas.

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8.3 Fases móviles ( Eluyentes) Las fases estacionarias en base a la silica son compatibles con todos los disolventes orgánicos dentro del rango de pH mencionado. Es recomendable utilizar disolventes de la más alta pureza (grado HPLC). Además de que todas las disoluciones preparadas se deben de filtrar a través de un membrana de 0.5 micras antes de utilizarse en el sistema de HPLC. El uso de disolventes HPLC no puros provocan adsorción irreversibles de impurezas sobre la entrada de la columna. Estas impurezas bloquean los sitios de adsorción, cambian la selectividad de la columna y provocan que haya división de picos. En gradiente de elución, las impurezas causan los llamados picos “fantasmas”. Los picos fantasmas pueden aparecer siempre en la misma posición en el cromatograma. Generalmente estos picos son causados por las impurezas de los disolventes o aditivos. Por la que es recomendable correr un gradiente sin inyección al iniciar cada método para eliminar los picos fantasmas. Para impedir la adsorción irreversible en la entrada de la columna, es recomendable utilizar una precolumna. Al utilizar la precolumna aumenta notablemente la vida media. Como alternativa de precolumna es instalar un filtro en línea. Estos filtros retienen sólidos del eluyente pero no impiden la adsorción irreversible de impurezas orgánicas.

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8.4 Regeneración de columnas La adsorción irreversible provocada por impurezas que puede causar cambios en la selectividad o división de picos. Frecuentemente estas columnas “sucias” pueden ser regeneradas con los siguientes procedimientos: 8.4.1 Columnas fase reversa Empaques tales como C18, C8, C4, C1, C30, CN o fases de fenilos.

- Fluir la columna con 20 volúmenes* (de columna) de agua.

- Fluir la columna con 20 volúmenes (de columna) de acetonitrilo.

- Fluir la columna con 5 volúmenes (de columna) de isopropanol.

- Fluir la columna con 20 volúmenes (de columna) de heptano.

- Fluir la columna con 5 volúmenes (de columna) de isopropanol.

- Fluir la columna con 20 volúmenes (de columna) de acetonitrilo.

8.4.2 Columnas fase normal Empaques tales como Silica, Diol, Nitro, y fases amino.

- Fluir la columna con 20 volúmenes (de columna) de heptano.

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- Fluir la columna con 5 volúmenes (de columna) de isopropanol.

- Fluir la columna con 20 volúmenes (de columna) de acetonitrilo.

- Fluir la columna con 20 volúmenes (de columna) de agua.

- Fluir la columna con 20 volúmenes (de columna) de acetonitrilo.

- Fluir la columna con 5 volúmenes (de columna) de isopropanol.

- Fluir la columna con 20 volúmenes (de columna) de heptano.

* V= Πr2 h 9.0 PROBLEMAS y SOLUCIONES EN LOS SISTEMAS DE HPLC.2008Mon Tipos de problemas en columna 9.1 Línea base 9.2 Presión 9.3 Forma de pico 9.4 Retención 9.5 Resolución R

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9.1.1 Variaciones de la línea base

- Posible causa: Burbujas de aire atrapado en la celda del detector debido a una mala desgasificación de los disolventes de la fase móvil.

- Solución: Asegúrese de que todas las fases móviles estén debidamente desgasificadas.

9.1.1.1 Presión con fluctuaciones.

- Posible causa: Burbujas en la bomba. - Solución: Desgasifique el disolvente; Burbujee el

disolvente con helio. - Posible causa: Fuga en la válvula check o sellos. - Solución: Reemplace o limpie las válvulas check;

reemplace sellos de la bomba. 9.1.2 Línea base con mucho ruido

- Posible causa: Aire atrapado en la celda del detector o en la bomba.

- Solución: Enjuague el sistema y purgue la bomba de HPLC. Utilice disolventes desgasificados adecuadamente para mantener constante la velocidad de flujo de la fase móvil del sistema.

- Posible causa : problema de la lámpara del detector o celda de flujo sucia.

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- Solución: Reemplace la lámpara UV (cada una tiene un tiempo de vida de 2000h aprox.); limpie y fluya la celda.

- Posible causa: Falla en el mezclado del disolvente, en gradiente o isocrático.

- Solución: Use un equipo apropiado de mezclado; compruebe la precisión de proporciones de disolventes adicionando un compuesto que absorba al UV y monitoreando la lectura en el detector.

- Posible causa: ocasionales “spikes” de interferencias eléctricas.

- Solución: Usar estabilizador de voltaje para el sistema. - Posible causa: Contaminación acumulada. - Solución: Fluya la columna con un disolvente fuerte;

limpie las muestras; utilice disolvente grado HPLC. - Posible causa: “spikes” por burbujas en el detector. - Solución : Desgasifique el gas.

9.1.3 Spikes

- Posible causa: Burbujas en fase móvil. - Solución: Desgasifique la fase móvil; Use restrictor de

presión a la salida del detector; Asegúrese que todas la conexiones estén apretadas.

- Posible causa: Columna almacenada sin tapones. - Solución: Almacene la columna con sus tapones

apretados; fluya la columna invertida con metanol desgasificado.

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9.2.1 Presión alta • Posibles causas: Frit de la columna tapado Empaque tapado Contaminación de la columna Columna incorrecta, por error (d.i. menor) • Soluciones: • Verificar la presión con y sin columna, muchos de esto problemas pueden ser causados por obstrucciones en el sistema. • Lavar la columna: – Elimina la contaminación de columna y desbloquea el empaque – Compuestos de alto peso molecular o adsorbidos –Precipitados de la muestra o del buffer • Voltear la columna – Desbloquea el frit • Cambio de frit – Elimina el frit tapado E-SeminarGroup/Presentation Ti200X Page 33 9.2.2 Lavado de la columna: Use al menos 26 ml de cada disolvente para columnas analíticas (4.6 mm)

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Purgar la columna con disolventes más fuertes que la fase móvil. Opciones de disolventes para columnas de fase reversa (en orden de incremento de fuerza): 1. Fase móvil sin las sales del buffer 2. 100% Metanol 3. 100% Acetonitrilo 4. 75% Acetonitrilo: 25 % Isopropanol 5. 100% Isopropanol 6. 100% Cloruro de metileno* 7. 100% Hexano* *Después de usar hexano o cloruro de metileno la columna debe ser purgada con Isopropanol antes de regresar a la fase reversa. 34 9.2.3 Lavado de la columna: Opciones de disolvente para la fase normal (En orden de incremento de fuerza) • Use al menos 50 ml de cada disolvente 1. 50% Metanol: 50 % Cloroformo 2. 100% Acetato de etilo • Es posible usar pequeñas cantidades de ácido, para eliminar compuestos fuertemente retenidos, la reequilibración es muy larga. • Es más fácil comenzar con columnas ciano y diol que con

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columnas de sílica cuando se va a comenzar a usar LC de fase normal. E-SeminarGroup/Presentation Tit17 July 2008Month ##, 200X Page 35 9.2.4 Prevención de la presión alta: Instalar accesorios en línea: Fase móvil filtrada Pre-Columna Inyector Filtro Guarda Columna: Columna Analítica Detector Tanto el filtro como el guarda-columna actúan sobre la muestra, mientras que la pre-columna lo hace sobre la fase móvil. • Proteger la columna - Pre columnas - Filtros en línea • Preparación de la muestra • Purga apropiada de la columna • Filtrar los buffers • Cambiar frecuentemente los buffers y el agua (cada 1–2 días max.)

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• Usar frascos ámbar o forrados con papel aluminio para minimizar la exposición a la luz de las fases acuosas. E-SeminarGroup/Presentation Title Agilent Restricte17 July 2008Month ##, 200X PaPage 37 9.3.1 Forma de Pico: • Picos divididos • Coleo • Ensanchamiento • Baja eficiencia Muchos problemas de la forma de pico, son una combinación de problemas, esto es, ensanchamiento con coleo o coleo con incremento en el tiempo de retención. E-SAgilent Restrict17 July 2008Month ##, 200X Page 38 9.3.1.1 Picos divididos Pueden ser causados por: • Contaminación de la columna • Frit parcialmente obstruido • Volúmen muerto en la columna • Efectos del solvente de inyección • Columna contaminada Lavar la columna con 100 % ACN. La respuesta mejora notablemente después de lavar la columna con 100 % ACN. E-SAgilent Restricte17 July 2008Month ##, 200X Page 40 • Picos divididos Efectos del disolvente de inyección

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La forma del pico mejora completamente si se utiliza como disolvente de la muestra, a la fase móvil. a) Disolvente de inyección 100 % Acetonitrilo b) Disolv. de inyección, Fase móvil. /Presentation Title Agilent Restrict17 July 2008Month ##, 200X Page 41 • 9.3.1.2 Coleo del pico Posible causa: “interacciones secundarias” • El coleo se elimina agregando un modificador a la fase móvil. Reduciendo el pH de la fase móvil, se reducen las interacciones con los silanoles que causan el coleo. E-SAgilent Restricte17 July 2008Month ##, 200X Page 43 • Coleo del pico: Posible causa: contaminación en la columna Solución: invertir la columna y lavarla con un volumen de alcohol isopropílico. • Ensanchamiento: Posible causa: Volúmen muerto en la columna • Multiples cambios en la forma del pico pueden ser causados por el mismo problema. Un caso, cuando el elevado pH disuelve a la sílica y forma un volumen en la columna. El no ajustar el pH de la fase móvil, ocasiona disolución de la sílica.

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Solución: invertir la columna y lavarla con un volumen de alcohol isopropílico. •9.4.1 Cambios en la retención: Posible causa: Cambios en la fase móvil • Variación del modificador de la fase móvil. •Solución: Corregir la fase móvil, resuelve el problema. •Posible causa: Cambios en las condiciones, pueden causar cambios en la retención. •Solución: Restaurar las condiciones iniciales. •Posible causa: Aire atrapado en la bomba debido a gases disueltos en fase móvil. •Solución: Purgar el flujo de la fase móvil, para eliminar burbujas de aire. •Prevención: asegúrese de que la fase móvil sea apropiadamente desgasificada, ya sea burbujeando helio o por sonificación.

9.4.1.1 Aumento del tiempo de retención.

- Posible causa: Disminución de velocidad de flujo.

- Solución: Comprobar velocidad de flujo en la bomba, comprobar fugas en los sellos y en el sistema.

- Posible causa: Composición variable de la fase móvil

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- Solución: Cubra las reservas de disolvente; asegúrese de que el sistema desarrolla la composición correcta.

- Posible causa: Pérdida de fase enlazada - Solución: Usar fase móvil con pH entre 2 y 8.

9.4.1.2 Disminución de tiempos de retención.

- Posible causa: Sitios activos en el empaque de la columna. - Solución: Use modificador de fase móvil, (compuestos básicos), o aumentar la fuerza del buffer; utilizar columnas con mayor desactivación (end capping).

- Posible causa: Columna sobrecargada con muestra. - Solución: disminuya la cantidad de muestra o utilice

columna con diámetro mayor. - Posible causa: Aumento de velocidad de flujo. - Solución: Comprobar la velocidad de flujo en la

bomba. - Posible causa: Pérdida de fase estacionaria enlazada o

sílica base. - Solución: Usar fase móvil con pH entre 2 y 8. - Posible causa: Variación de la temperatura de

columna. - Solución: Equilibre la temperatura de columna o

aíslela; asegúrese que la temperatura del laboratorio sea constante.

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9.5.1 Pérdida de resolución

- Posible causa: Obstrucción de la columna de HPLC o del Guarda columna por partículas.

- Solución: Seguir las indicaciones de la presión alta. - Prevención: Filtrar todo antes de que se introduzcan

las fases móviles en el sistema de HPLC. 9.6 Sensibilidad baja -Posible causa: Bloqueo en las líneas del automuestreador.

- Solución: Compruebe el flujo y limpie cualquier obstrucción.

- Posible causa: Atenuación demasiado alta. - Solución: Reducir la atenuación del detector. - Posible causa: El loop del inyector no se esta llenando. - Solución: Sobrellene el loop con muestra. - Posible causa: No se esta inyectando suficiente

muestra. - Solución: Aumente la cantidad de muestra inyectada. - Posible causa: Los picos se salen del rango del

detector. - Solución: Diluya o concentre la muestra para que los

picos estén dentro del rango lineal del detector. - Posible causa: Pérdida de muestra durante su

preparación. - Solución: Utilice estándar interno durante su

preparación; optimice el método de preparación de

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muestra.

9.6.1 Fuga en la columna o conexiones.

- Posible causa: Conexiones flojas.

- Solución: Apriete o reemplace conexiones.

9.6.2 Fuga en el detector

- Posible causa: Falla en el sello del detector.

- Solución: Reemplace el sello del detector o empaque.

9.6.3 Fuga en la válvula del inyector

- Posible causa: Rotor de la válvula dañada. - Solución: Reemplazar la válvula del rotor.

9.6.4 Fuga en la bomba

-Posible causa: Falla en el sello de la bomba.

-Solución: Reemplace el sello de la bomba; revisar el pistón y si tiene rayaduras, reemplazar.

9.6.5 Picos negativos

- Posible causa: En detector de I.R., el índice de refracción del soluto es menor que el de la fase móvil.

- Solución: Invierta la polaridad para hacer positivo al pico.

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- Posible causa: en detector UV, la absorbancia del soluto es menor que el de la fase líquida.

- Solución: Utilizar fase móvil con menor absorbancia UV; sí se recicla el disolvente, detener el reciclado cuando el reciclado afecte a la detección.

- Solución: Fluya la columna con un disolvente fuerte;

limpie las muestras; utilice disolvente grado HPLC. - Posible causa: “spikes”(líneas verticales) por burbujas

en el detector. - Solución: Desgasifique el gas.

##, 200Pa 10.0 CONCLUSIONES Los problemas en columnas de HPLC son: • Presión alta • Forma de pico indeseable • Cambios en la retención/selectividad La mayoría de estos problemas se resuelven lavando la columna. Frecuentemente estos problemas no están asociados con la columna y pueden ser causados por el instrumento y condiciones experimentales. La columna se comporta de acuerdo a cómo la tratemos.