Métodos cromatográficos

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Métodos cromatográficos. Métodos variados de separación de mezclas se conocen como cromatografía. Según la definición dada por Keulemans la cromatografía es un método de separación en el que los componentes a desglosar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales constituye un lecho estacionario de amplio desarrollo superficial y la otra es un fluido que pasa a través o a lo largo del lecho estacionario. La cromatografía se introduce en los métodos de separación en 1903 y su posterior desarrolló y evolución se produce hacia 1930. La primera persona que definió la cromatografía fue el botánico ruso Miguel Tswett (1872- 1913) en 1906 y eligió el término cromatografía procedente de las palabras griegas khromatos (color) y graphos (escrito) ya que utilizó el término cromatografía para describir la separación de pigmentos vegetales en distintas zonas coloreadas. Aunque la mayor parte de las separaciones que se realizan actualmente son de compuestos incoloros, el término inicial cromatografía se ha mantenido. Definición de cromatografía En 1906 Tswett definió la cromatografía como: Método en el cual los componentes de una mezcla son separados en una columna adsorbente dentro de un sistema fluyente. Recientemente la I.U.P.A.C define la cromatografía de forma más amplia como: Método usado principalmente para la separación de los componentes de una muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra es móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido soportado en un sólido o en un gel (matriz). La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna, extendida en una capa, distribuida como una película, etc... Métodos cromatográficos – textoscientíficos.com 1

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Métodos cromatográficos.Métodos variados de separación de mezclas se conocen como cromatografía. Según la definición dada por Keulemans la cromatografía es un método de separación en el que los componentes a desglosar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales constituye un lecho estacionario de amplio desarrollo superficial y la otra es un fluido que pasa a través o a lo largo del lecho estacionario.

La cromatografía se introduce en los métodos de separación en 1903 y su posterior desarrolló y evolución se produce hacia 1930. La primera persona que definió la cromatografía fue el botánico ruso Miguel Tswett (1872-1913) en 1906 y eligió el término cromatografía procedente de las palabras griegas khromatos (color) y graphos (escrito) ya que utilizó el término cromatografía para describir la separación de pigmentos vegetales en distintas zonas coloreadas. Aunque la mayor parte de las separaciones que se realizan actualmente son de compuestos incoloros, el término inicial cromatografía se ha mantenido.

Definición de cromatografía

En 1906 Tswett definió la cromatografía como:

Método en el cual los componentes de una mezcla son separados en una columna adsorbente dentro de un sistema fluyente.

Recientemente la I.U.P.A.C define la cromatografía de forma más amplia como:

Método usado principalmente para la separación de los componentes de una muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra es móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido soportado en un sólido o en un gel (matriz). La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna, extendida en una capa, distribuida como una película, etc...

Se utiliza el término general de lecho para definir las distintas formas en que puede encontrarse la fase estacionaria. Las separaciones cromatográficas se consiguen mediante la distribución de los componentes de una mezcla entre la fase fija y la fase móvil. La separación entre dos sustancias empieza cuando una es retenida más fuertemente por la fase estacionaria que la otra, que tiende a desplazarse más rápidamente en la fase móvil. las retenciones mencionadas pueden tener su origen en dos fenómenos de interacción que se dan entre las dos fases y que pueden ser :

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1.-La adsorción, que es la retención de una especie química por parte de los puntos activos de la superficie de un sólido quedando delimitado el fenómeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial.

2.- La absorción, que es la retención de una especie química por parte de una masa, y debido a la tendencia que esta tiene a formar mezcla con la primera, absorción pura, o a reaccionar químicamente con la misma, absorción con reacción química, considerando ambas como un fenómeno másico y no superficial.

Aspectos históricos de la cromatografía

Aunque procesos parecidos ocurren en la naturaleza cuando disoluciones pasan a través de arcilla, rocas, etc... la cromatografía como tal adquiere importancia cuando en 1850 el químico F.F.Runge, que trabajaba con tintas, descubrió que los cationes orgánicos se separaban por migración cuando se depositaba una disolución que los contenía sobre un material poroso, como papel.

En 1906 el botánico ruso Tswett utilizó la cromatografía en columna para separar extractos vegetales coloreados, y a este proceso le dió el nombre de cromatografía. Pero el mayor desarrollo se produce en 1930 con Lederer cuando consigue separar los colorantes de la yema de huevo. Posteriormente los químicos Khun, Kamer y Ruzucca desarrollan la cromatografía en el campo de la química orgánica e inorgánica, y obtienen el premio Nobel por sus trabajos en 1937, 1938, 1939 respectivamente.

A partir de 1940 los métodos cromatográficos adquieren extensión mundial de forma que en 1940 Tiselius divide los métodos cromatográficos en cromatografía por análisis frontal, desarrollo por elución y desarrollo por desplazamiento, obtuvo el premio Nobel por sus trabajos en 1948.

Al mismo tiempo la cromatografía se aplicaba en el campo de la bioquímica, y así Martin consigue separar algunos aminoácidos acetilados.

Aspectos históricos de los distintos tipos de cromatografía.

Cromatografía en papel

Fue desarrolla por Martin. Tiene como soporte un papel de celulosa. Adquirió una gran extensión por su sencillez y presenta la ventaja de poder utilizar miligramos y microgramos, además presenta la opción de utilizar tanto la técnica descendente ( en columna, etc...) como la técnica ascendente.

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Cromatografía en capa fina

Fue originada por los trabajos de los investigadores rusos Izmailov y Schraiberen en 1938 al separar mezclas de tinturas farmacéuticas. En este tipo de cromatografía la fase estacionaria se extiende sobre un soporte inerte, la dificultad que presentaba el método era el crear una capa homogénea, sin ningún tipo de rugosidad. La cromatografía en capa fina tuvo valor limitado hasta que Stahl estandarizó el método para elaborar capas finas por métodos mecánicos.

Cromatografía de intercambio iónico

Esta técnica apareció durante la II Guerra Mundial y en principio tenía la finalidad de separar las tierras raras y los elementos de transición. En 1938 Taylor y Urey utilizan este método para separar isótopos de Litio y Potasio utilizando resinas de zeolita. En 1939 Samuel logra sintetizar resinas de intercambio iónico.

Cromatografía de gel-filtración

Fodin y Porath en 1958 descubren que usando como fase estacionaria geles se consigue separar polímeros sintéticos de alto peso molecular.

Cromatografía de afinidad.

Ideada por Porath en 1967, usando como fuente un péptido o proteína unida covalentemente a un ligando y se utiliza para la separación de moléculas proteicas.

Cromatografía de gas.

Es una de las técnicas más utilizadas e importantes, de forma que ha revolucionado el campo de la química analítica.

Clasificación de los métodos cromatográficos

Clasificación según el procedimiento de separación

El principio básico de la separación de las sustancias que componen una mezcla se fundamenta en una serie de sucesivos equilibrios entre la fase estacionaria y la fase móvil. El equilibrio dependerá de la partición o diferente adsorción que tengan la fase estacionaria y los componentes de la mezcla.

La diferencia dependerá de las propiedades físicas y químicas de los componentes. El mayor o menor avance en el sistema cromatográfico dependerá de la afinidad del componente y la fase estacionaria. El

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componente con menor afinidad por la fase estacionaria en presencia de una fase móvil llamada eluyente será eluido en primer lugar, y por tanto se desplazará con mayor velocidad por el sistema cromatográfico.

Tabla de clasificación de métodos cromatográficos

F. estacionaria

F. móvil Soporte CromatografíaSiglas

sólido(adsorción)

gaslíquido

columna columna capa fina

sólido-gaslíquida en papel y/o capa fina

G.S.C / G.CC.L / H.P.L.C T.L.C

líquido (partición)

gasliquido

columna columna

líquido-líquidogas-líquido

C.G.LC.L.L / H.P.L.C

resina(intercambio iónico)

líquido columna intercambio iónico

 

gel(filtración en )

líquido columna filtración de gel  

*H.P.L.C : cromatografía líquida de alta presión.

Clasificación según el proceso de desarrollo

Según el procedimiento en que se desarrolla se utiliza la siguiente clasificación, que fue la usada por Tiselius en 1940:

Desarrollo por elución. Desarrollo por desplazamiento. Análisis frontal.

Desarrollo por elución

Representa el concepto básico de la separación cromatográfica y es la técnica más usada en los distintos métodos cromatográficos (gaseosa, líquido-gas, líquido-líquido, sólido-líquido). Para describir esta técnica considérese una mezcla de sólo dos componentes. Dicha mezcla se introduce en el extremo superior de una columna adsorbente y sus componentes se separan en zonas, al pasar uno o más eluyentes a través de la columna, debido a las distintas afinidades entre los componentes y ambas fases.

La fase móvil es adsorbida débilmente por la fase sólida estacionaria. Este ideal teórico de desarrollo por elución no siempre se consigue en la práctica. Es un método analítico esencial.

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Desarrollo por desplazamiento

Consiste en desarrollar con un disolvente que sea adsorbido por la fase estacionaria con mayor fuerza con que adsorbe a los componentes de la mezcla, al contrario que el desarrollo por elución. A medida que el disolvente pasa a lo largo de la columna, desplaza a la mezcla, que al mismo tiempo se separa parcialmente.

Parte del material menos fuertemente adsorbido se recupera de forma pura, seguido por una mezcla (interfase) y seguido posteriormente del otro componente en forma pura. Es un método preparativo útil.

Análisis frontal

Consiste en la aplicación continua de una mezcla en el origen. En principio el componente menos fuertemente adsorbido fluye a lo largo de la columna, mientras que el más fuertemente adsorbido se acumula cerca del origen. Sin embargo existe un límite en la capacidad del adsorbente y, cuando este límite se alcanza, también el componente más fuertemente adsorbido empieza a desplazarse a lo largo de la columna. Por esto, las primeras fracciones contendrán el material menos fuertemente adsorbido; más tarde aparecerá una mezcla de ambos componentes. Es una técnica preparativa más que analítica.

Consideraciones teóricas y parámetros cromatográficos

La cromatografía es un sistema de separación dinámica, porque contínuamente se producen equilibrios entre los componentes de la mezcla a separar y las fases móvil y estacionaria.

La fase estacionaria consiste en partículas, generalmente sólidas, pequeñas y con una superficie microporosa, de forma que presenta un amplio desarrollo superficial. Puede estar empaquetada en forma de columna o extendida en forma de capa. En ocasiones es necesario un tratamiento químico de la fase estacionaria para conseguir unas partículas de tamaño y poro adecuados.

La fase móvil puede ser un líquido o un gas, y su función es transportar a los componentes de la mezcla a través del sistema cromatográfico.

En el proceso de separación se produce una competición entre la fase móvil y la fase estacionaria por el componente, y a este proceso se le denomina partición del componente distribuido entre las dos fases. Es decir, se

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establece un equilibrio entre la concentración del componente presente en la fase móvil y la concentración presente en la fase estacionaria.

El coeficiente de distribución de un componente A se define como:

Donde DA es el coeficiente de distribución del componente A, y [Aest.] y [Amóv.] son respectivamente las concentraciones del componente A en la fase estacionaria y en la fase móvil. El valor del coeficiente de distribución es característico de un componente para una fase estacionaria y una fase móvil determinadas.

Los métodos cromatográficos actuales más modernos monitorizan la salida de los componentes y eluyentes, esto se consigue conectando a la salida del sistema cromatográfico unos aparatos electrónicos, denominados detectores, que detectan pequeñas cantidades de componentes. Si se representan los valores de la concentración de esos componentes frente al tiempo o al volumen de eluyente se obtiene unas curvas Gaussianas denominadas cromatogramas.

Principales parámetros del cromatograma de picos.

1.- Pico del aire.

Es el que corresponde a la detección de una cantidad muy pequeña de aire que entra a la columna cuando se introduce la muestra en el cromatógrafo.

2.- La línea de base.

Es la parte del registro que corresponde a la fase móvil pura (gas portador, ).

3.- Altura de pico (h).

Es la distancia entre la cima del pico y la línea de base. En el caso de que el vértice sea redondeado se trazan rectas tangentes a los dos puntos de inflexión de las laderas; el punto de corte de las dos rectas determina la altura del pico. (Ver el cuarto pico de la figura anterior).

4.- Anchura del pico (a).

Es la longitud del tramo de la prolongación de la línea de base, comprendida entre las intersecciones con la misma de las laderas del pico o, en su caso, de las líneas tangentes antes mencionadas.

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5.- Anchura del pico en la semialtura (ah/2).

Es la distancia paralela a la línea de base, entre las dos laderas del pico, tomada a la mitad de la altura del pico.

6.- Área del pico (S).

Es la comprendida entre el pico y la prolongación de la línea de base. Precisamente a obtener el valor de este parámetro, en los picos del cromatograma, se dedican los dispositivos integradores

Principales parámetros cromatográficos.

1.- Tiempo cero o tiempo de retención del componente inerte (t0).

El tiempo cero (t0) o tiempo muerto (tm), es el tiempo de retención del componente inerte o gas portador.

2.- Tiempo de retención de un componente (tii).

El tiempo de retención (ti o tR) es el tiempo transcurrido entre el instante en que se introduce la mezcla y el instante en que se detecta la señal propia del componente en su máxima intensidad. Los tiempos de retención no son reproducibles, ni siquiera en una misma columna cromatográfica.

3.- Tiempo de retención corregido de un componente (t'i).

Es le tiempo que transcurre entre la aparición de la sañal que corresponde a un componente inerte y a la del componenteconsiderado:

t'i = ti - t0

4.- Tiempo de retención relativa (rip).

Es la razón entre los tiempos de retención corregidos del componente considerado, i, y de otro, p, que se toma como patrón de referencia:

5.- Volumen de retención de un componente (VR).

Es el volumen necesario de fase móvil para transportar el soluto de un extremo a otro del sistema cromatográfico. Se define como:

VR = tR-Fm

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donde VR es el volumen de retención expresado como el producto del tiempo de retención de un componente (tR) y el flujo de la fase móvil (Fm). Y el flujo de fase móvil se define como:

donde d es el diámetro interior del soporte utilizado y ε es la porosidad de la fase estacionaria, que suele tener un valor de 0,4 para empaquetamientos sólidos.

6.- Volumen cero o muerto (V0 o Vm).

Es el volumen de eluyente que se consume sin que se detecte ningún componente. Se define igual que el volumen de retención pero el tiempo utilizado es el tiempo muerto:

Vm = tm ⋅ Fm

7.- Volumen de retención verdadero (V'R).

El volumen de retención verdadero de un componente es la diferencia entre el volumen de retención del componente y el volumen muerto.

V'R = VR - Vm

o lo que es lo mismo:

V'R = (tR - t0) ⋅ Fm

 

8.- Coeficiente de partición o de reparto de un componente (K).

Se define como el cociente entre la concentración de componente presente en la fase estacionaria y la concentreción de componente presente en la fase móvil:

donde Cs y Cm son las concentraciones de componente presente en las fases estacionaria y móvil respectivamente. El valor de K representa el valor de la pendiente de la recta que se obtiene al representar Cs frente a Cm .

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9.- Velocidad lineal media a lo largo de una columna (u).

Es la velocidad lineal media a la que se desplazan las moléculas de soluto a lo largo de una columna. Viene dada por la expresión:

donde u es la velocidad lineal media, L es la longitud de la columna y tm es el tiempo muerto.

10.- Factor de selectividad (α).

Es la relación entre los tiempos de retención de dos componentes:

donde α es el factor de selectividad, tRy y tRx son los tiempos de retención de los componentes x e y , y Kx y Ky son los coeficientes de distribución de los componentes. Dependiendo del valor de α se tiene una idea aproximada de como será la separación cromatográfica:

α > 2 se obtiene una mala separación ya que son necesarios periodos muy largos para realizarla.

1< α <2 se obtiene una buena separación cromatográfica.

11.- Factor de capacidad (K').

El factor de capacidad relaciona volúmenes o tiempos de retención de un componente respecto a la fase móvil. Se puede definir como:

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Es el cociente entre las probabilidades de encontrar una molécula determinada de soluto en la fase estacionaria o en la fase móvil, o lo que es lo mismo, el cociente entre el tiempo de permanencia de dicha molécula en la fase estacionaria y en la fase móvil.

12.- Eficiencia

Para definir la eficacia se utiliza el concepto de piso teórico, y se define éste como la sección teórico-transversal en la cual se realiza el equilibrio de partición durante el flujo de fase móvil. Cuanto mayor se el número de platos teórico (N) mayor será la eficiencia de la columna.

El número de platos teóricos mide la capacidad de la columna para separar los componentes, no la retención de los mismos. La eficiencia o el número de platos se puede observa directamente a partir del cromatograma, observando la agudeza de los picos.

Donde N es el número de platos teóricos, L es la longitud de la columna, H es la altura de cada plato, t'R es el tiempo corregido de retención de un componente y ai es la anchura del pico cromatográfico. Y:

Si H tiene un valor pequeño, la distancia entre platos es menor y por tanto la eficiencia será mayor. Por el contrario, si H es grande la columna es poco eficiente para separar ese componente ya que sus moléculas estarán muy difundidas.

La velocidad de la fase móvil influye en la eficiencia del sistema cromatográfico, ya que si la velocidad es pequeña los componentes tendrán más tiempo parta que se pueda realizar el equilibrio de reparto, por lo que el número de platos será mayor y la altura de los platos menor.

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13.- Resolución (R o Rs).

Es el parámetro que expresa el grado de separación que se puede obtener en un sistema cromatográfico para dos componentes dados. Relaciona la capacidad separadora de un sistema cromatográfico para dos componentes. Se define como:

Donde Rs es la resolución, tRA y tRB son los tiempos de retención de los componentes A y B, y aA y aB son las anchuras de los picos del cromatograma de los anteriores componentes.

La resolución puede observarse directamente sobre el cromatograma de picos. Se tendrá una buena resolución si los picos no se solapan, y está perfectamente delimitado cada pico, sin que coincida el final de uno con el principio del siguiente.

Si el valor de la resolución está próximo a 0,7 se obtendrá una mala resolución quedando los picos solapados, de forma que se distinguen las crestas, pero no la base, y si el valor de la resolución está próximo a 1,5 se obtendrán unos picos bien delimitados por lo que se obtendrá una buena resolución.

Una pobre resolución es debida principalmente a:

Hay demasiada muestra en la columna. La columna o placa es corta. La fase móvil no discrimina entre los componentes. La columna es demasiado gruesa.

Cromatografía en capa fina

Introducción

La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales son, pues, un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensión, otro para aplicar la capa de adsorbente, y una cámara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es preciso también poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas.

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La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares.

Polaridad de los compuestos orgánicos en orden creciente:

hidrocarburos < olefinas < fluor < cloro < nitro < aldehído

aldehído < ester < alcohol < cetonas < aminas < ácidos < amidas

Ventajas de la cromatografía en capa fina

La cromatografía en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros métodos cromatográficos (en columna, en papel, en fase gaseosa, ...) ya que el utillaje que precisa es más simple. El tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la separación es generalmente mejor. Pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre papel destruirían el cromatograma. El método es simple y los resultados son fácilmente reproducibles, lo que hace que sea un método adecuado para fines analíticos.

Adsorbentes

Al realizar la elección del adsorbente se debe tener en cuenta el tamaño de las partículas del adsorbente, cuanto más finamente dividido esté mayor será su adhesión al soporte, aunque también se le puede añadir un adherente (yeso,...). Algunos de los adsorventes más utilizados son:

Celulosa Almidón Azucares Gel de sílice (silicagel) Óxido de aluminio (alúmina) Carbón activo (carbón en polvo) Kieselguhr

Los tres primeros se utilizan para extraer componentes polifuncionales de plantas y animales.

Silicagel

El gel de sílice o ácido silícico es uno de los más utilizados, es débilmente ácido, su pH oscila entre 4-5. Con lo cual no se deberá utilizar con sustancias que se corrompan con los ácidos. Los geles de sílice normales suelen contener impurezas de hierro y/o aluminio, este factor también se debe tener

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en cuentas respecto al uso de componentes. El tamaño del grano suele ser de 10 a 40 micras (µ) y el tamaño de poro varía de 20 a 150Å.

Generalmente lleva incorporado un agente aglomerante, yeso (sulfato de cálcico semihidratado), para proporcionar firmeza al adsorbente. También han sido incorporados dos indicadores del ultravioleta, juntos o por separados (amarillo y/o verde), en diversos tipos de gel de sílice.

Se trata de un adsorbente polar, pero puede ser tratado con hidrocarburos para neutralizar los grupos -OH, de forma que se haga apto para separar componentes lipófilos (esteroides, ácidos grasos, ceras, vitaminas liposolubles, etc). A este proceso se le denomina cromatografía de fase reversa (silanizado).

Alúmina

La alúmina u óxido de aluminio es un adsorbente ligeramente básico debido a que en el proceso de extracción de la alúmina a partir de la bauxita quedan algunas moléculas de hidróxido de aluminio adheridas a la alúmina, dándole a ésta un carácter básico. No consigue un desarrollo tan alto de la sustancia depositada como el gel de sílice.

La alúmina puede ser tratada químicamente para conseguir alúminas ácidas, básicas y neutras. Puede contener aglomerantes y/o indicadores ultravioletas. Es un adsorbente de carácter polar, de tal forma que retendrá con mayor avidez a los componentes polares.

Preparación de placas.

El adsorvente se deslíe en agua destilada. Para mezclar la papilla homogéneamente es preferible agitar de modo mecánico. La proporción de adsorbente y agua depende del tipo de adsorbente. Dos parte de agua y una de adsorbente pueden tomarse como norma general, no obstante, habrán de consultarse la instrucciones del fabricante.

Originariamente se utilizaban, como soporte del adsorbente, láminas de vidrio, pero en la actualidad también se utilizan láminas de otros compuestos orgánicos más flexibles. Dependiendo del tipo de separación que se desee (cualitativa o preparativa) se utilizará un tamaño de placa u otro. En general para realizar una separación preparativa de un gramo de muestra es necesario una placa de vidrio de 20x20 cm., 35 gramos de adsorbente y 80 ml. de agua destilada.

Las propiedades de la fase estacionaria pueden alterarse mediante la adición de compuestos tales como disoluciones tamponadoras para mantener el pH

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deseado. En la preparación de las placas también se pueden adicionar indicadores fluorescentes o aglomerantes.

Cabe destacar la adición de nitrato de plata (AgNO3), a este proceso se le denomina argentación, y se utiliza para separar componentes insaturados.

El espesor de la placa es otro factor a tener en cuenta al preparar la placa, en general suele ser de:

0.1-0.2 mm. para separaciones analíticas.

0.5- 2 mm. para separaciones preparativas.

La placa debe quedar libre de grumos y rugosidades, que afectarían al desarrollo del proceso cromatográfico. Para ello existen en el mercado extensores que se utilizan para crear de forma mecánica placas homogéneas del espesor deseado. Si no se disponer de extensor, el proceso a seguir es el siguiente:

1. Mezclar en un Erlenmeyer el agua y el adsorbente.2. Agitar enérgicamente. 3. Extender la papilla sobre el soporte de vidrio.4. Hacer oscilar la papilla de un lado a otro.5. Golpear con el dedo la parte inferior del soporte.

Las placas, normalmente, se dejan reposar un corto espacio de tiempo después de cubrirlas; luego se colocan en bandejas metálicas. En este momento puede activarse el agente adsorbente, bien dejando las placas reposar toda la noche a temperatura ambiente, bien calentándolas durante 30-60 minutos a 105-110 ºC (las placas de celulosa no deben calentarse más de 10 minutos a 105 ºC) para expulsar así el aire. Es conveniente dejar secar las placas inicialmente al aire, para evitar los agrietamientos que se producirían por efecto del cambio de temperatura.

Aplicación de las muestras

Los productos a examinar se disolverán, cuando sea posible, en un disolvente orgánico no polar que tenga un punto de ebullición lo suficientemente bajo para que se evapore después de la aplicación.. Sin embargo a menudo se necesitan disolventes polares; la mezcla cloroformo:metanol (1:1) es efectiva. Frecuentemente se emplean disoluciones al 1%, de manera que al aplicar 2 µl resulta en la carga 20 µg de producto sólido. Muchos reactivos de revelado llegan a detectar 0.1 µg de material; por esto con esta carga puede llegarse a observar un 5% de impurezas.

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Existen una gran variedad de micropipetas y microjeringuillas para realizar el proceso de siembra de la muestra a analizar. También pueden usarse tubos capilares. El proceso de siembra se realiza tocando con la punta del capilar (micropipeta, jeringuilla, etc) sobre la placa preparada. Dejando una distancia al borde inferior de un centímetro aproximadamente. El punto de aplicación de la muestra se denomina toque.

Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de forma que en la placa solo quedará la muestra a analizar.

Elección del eluyente

La elección del eluyente dependerá lógicamente del componente que se va a separar y del material en que la separación se lleva a cabo.

Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:

Eter de petróleo.Eter dietílico.Ciclohexano. Acetato de etilo.Tetracloruro de carbono.*Piridina.Benceno.*Etanol.Cloroformo.*Metanol.Diclorometano.Agua.Ácido acético.

*compuestos cancerígenos.

En la elección del eluyente influyen varios factores:

Precio. Pureza. No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad). No utilizar compuestos muy volátiles. Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).

La elección del eluyente se realiza de forma empírica. Hay que estudiar la polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez menos polares.

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a) Toque de la muestra sin aplicar ningún eluyente.

b) Aplicando un eluyente poco polar.

c) Aplicando un eluyente más polar.

Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares, podemos seguir utilizando la misma placa para aplicar otros eluyentes más polares, hasta dar con el más apropiado.

Otra técnica para realizar la elección del eluyente consiste en sembrar varias muestras distanciadas suficientemente, y aplicar con un tubo capilar distintos eluyentes sobre el centro de cada muestra. Esto permite desarrollar cada eluyente radialmente por capilaridad, de forma que se aprecie el eluyente con el cual la separación se realiza de una manera más eficaz.

Desarrollo de la cromatografía

El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el método ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda por una placa casi en vertical, por la acción de la capilaridad. La cromatografía se realiza en una cubeta. Para conseguir la máxima saturación posible de la atmósfera de la cámara, las parades se tapizan con papel impregnado del eluyente. A veces pueden obtenerse separaciones mejores sin poner papeles en las paredes, cosa que no debe olvidarse.

Generalmente el eluyente se introduce en la cámara una hora antes del desarrollo, para permitir la saturación de la atmósfera. El tiempo de desarrollo, por lo general, no llega a los 30 minutos. El tiempo de una cromatografía cualitativa suele ser de un par de minutos, mientras que el tiempo de una cromatografía preparativa puede llegar a un par de horas.

Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado, o hasta que se alcance una línea dibujada a una distancia fija desde el origen. Esto se hace para estandarizar los valores de RF. Frecuentemente esta distancia es de 10 cm.; parece ser la más conveniente para medir valores de RF. Después del

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desarrollo, las placas pueden secarse rápidamente con una corriente de aire caliente.

La mejor posición de desarrollo para un componente es el punto medio entre el origen y el frente del eluyente, ya que permite separar las impurezas que se desplazan con mayor y menor velocidad. El frente del eluyente nunca debe llegar a tocar el borde de la placa.

Si la placa se estropea por acción del aire o de la luz, se secará en una cámara que contenga un gas inerte o aislada de la luz.

Localización de sustancias

Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posición de dichos compuestos, para ello existen dos tipos de métodos:

Métodos químicos. Métodos físicos.

Métodos químicos

Consisten en ralizar una reacción química entre un reactivo revelador y los componentes separados, para ello se pulveriza la placa con los reactivos reveladores con la ayuda de un pulverizador de vidrio y una pera de goma, o mediante un dispositivo que proporcione aire comprimido.

Es preferible pulverizar con las placas en posición horizontal. Si el reactivo revelador es peligroso o muy corrosivo, la pulverización deberá realizarse en una vitrina de gases bien ventilada.

La pulverización se realizará poco a poco. En cromatografía en capa fina no puede realizarse el bañado del cromatograma (en cromatografía en papel sí).

Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados con los componentes orgánicos (con tonos amarillo-marrón), pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente señalar las manchas aparecidas.

Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico, que reacciona con los componentes orgánicos produciendo manchas negras.

El tamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad de componente separado.

Además de estos reveladores generales, existen otros específicos:

2,4 - dinitrofenilhidracina (para aldehidos y cetonas).

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Verde de bromocresol (para ácidos carboxílicos). Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas). Ninhidrina (para aminoácidos).

Métodos físicos.

El más común consiste en añadir al adsorbente un indicador fluorescente. De tal forma que al colocar la placa bajo una lámpara ultravioleta, y dependiendo del indicador y de la longitud de onda, aparecen manchas fluorescentes en las zonas en las que hay componentes, o en otros casos aparece toda la placa fluorescente excepto donde hay componentes.

Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal) con lo que pueden ser detectados directamente en una lámpara de ultravioleta.

Constantes Rf Y Rx

La constante RF (Ratio of Front) es simplemente una manera de expresar la posición de un compuesto sobre una placa como una fracción decimal, mide la retención de un componente. Se define como:

La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la mancha, los cálculos se simplifican si el denominador es 10. Para que los RF sean reproducibles deben ser fijadas una serie de condiciones (Espesor de la placa, fase móvil, fase estacionaria, cantidad de muestra). El máximo valor de RF que se puede alcanzar es de 1, lo ideal es un RF entre 0.65 y 0.7.

Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la misma placa y se desarrolla con varios eluyentes. Una vez desarrollados se calculan los RF y si son distintos, puede deducirse con toda seguridad que no se trataba del mismo compuesto. Por el contrario si los RF son iguales los compuestos pueden ser iguales o no serlo.

Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la misma placa con el mismo eluyente u otros de menor polaridad, hasta apreciar una separación mínima. En este caso no se pueden usar reveladores químicos, ya que alterarían los compuestos, sino indIcador ultravioleta.

También se puede operar de la manera siguiente: Se selecciona un compuesto (X), que tenga una posición de desarrollo conveniente; todos los

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demás compuestos sobre la placa se relacionan con éste. De esta manera se tiene el , RX , ya que:

Cromatografía preparativa y bidimensional

Cromatografía preparativa

La cromatografía preparativa comprende un amplio campo de aplicaciones, desde el aislamiento de 1 µg. de muestra para identificación espectroscópica hasta el aislamiento de un compuesto puro de una mezcla de 100 g. La cromatografía preparativa se diferencia de la técnica básica en muchos aspectos, desde la preparación de la papilla. Ésta debe hacerse con menos agua que de ordinario. Una papilla más espesa ayuda a estabilizar el grosor de las placas que se precisa para una carga de mayor magnitud. El espesor óptimo oscila desde un mínimo de 1 mm. hasta un máximo de 2 mm.

Las placas utilizadas en cromatografía preparativa son placas grandes, de aproximadamente 20x20 cm. que permiten separar aproximadamente 1 g. de mezcla utilizando unos 35 g. de adsorbente.

La siembra de la muestra se realiza mediante la ayuda de una jeringuilla o tubo capilar. La siembra se realiza a lo largo de una línea recta (existen en el mercado diverso utensilios para evitar torcerse). Si al terminar la primera siembra todavía queda muestra, se seca la primera siembra y se aplica la segunda, intentando que ésta quede sobre la anterior, para así conseguir que el frente sea lo más estrecho posible. La siembra debe realizarse a lo ancho de la placa.

Una vez sembrada la muestra se desarrolla la cromatografía. Se utiliza un adsorbente con indicardor fluorescente para ver en la lápmpara ultravioleta donde han quedado las manchas de los diferentes compuestos, dichas manchas se marcan.

Una vez localizados los compuestos, éstos se extraen de la fase estacionaria, uno a uno, con la ayuda de una espátula, sobre un papel de filtro u otro soporte. Posteriormente se coloca cada componente en un erlenmeyer, y se mezcla con un disolvente (metanol). Una vez disuelto el compuesto se filtra varias veces para separar el compuesto y la fase estacionaria. Una vez separado se elimina el disolvente (destilación), con lo cual se obtiene el componente separado.

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Si no se dispone de indicador fluorescente, no se pueden usar reveladores químicos sobre toda la placa. El proceso a seguir es el siguiente: se raya la placa separando totalmente una pequeña franja de placa, sobre la cual se aplica el revelador químico, y a partir de esta franja se marcan las franjas de compuestos.

Cromatografía bidimensional

La cromatografía bidimensional se trata ampliamente en el tema de cromatografía en papel.

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