Métodos Cromatográficos 1
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BIO 368 ANALISIS INSTRUMENTAL Métodos cromatográficos I
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BIO 368
ANALISIS INSTRUMENTAL
Métodos cromatográficos I
CROMATOGRAFIA
Conjunto de técnicas utilizadas para la separación de mezclas desolutos, basada en la diferente solubilidad (afinidad) de los solutospor dos solventes (fases) inmiscibles.
Se la clasifica según los criterios físico-químicos responsables dela separación.
Se desarrolló en Inglaterra en la década del ‘40 para la separación desustancias coloreadas (de allí su nombre: cromatografía).
El fundamento de todas las formas de cromatografía es el “coeficiente de
partición” (Kd ) que describe la distribución de un compuesto en las dos
fases inmiscibles:
concentración en la fase A
Kd = ---------------------------
concentración en la fase B
Las dos fases de todo sistema cromatográfico se denominan:
- Fase estacionaria o fase fija: un sólido, un gel, un líquido.
- Fase móvil: un líquido o un gas, que fluye sobre o a través dela fase fija.
Se escoge las fases de modo que los coeficientes de partición de loscomponentes de la mezcla sean lo más distintos posible.
TIPOS DE CROMATOGRAFIA
Se los clasifica de acuerdo al principio físico-químico que permite laseparación:
ADSORCION: equilibrio entre una fase fija sólida y una fase móvillíquida. (Ej: cromatografía de adsorción; cromatografía de interacciónhidrofóbica).
PARTICION: equilibrio entre una fase fija líquida y una fase móvillíquida o gaseosa. (Ej: cromatografía en fase reversa; cromatografíagas-líquido; cromatografía de contra-corriente).
INTERCAMBIO IONICO: equilibrio entre un intercambiador iónicofijo y una fase móvil con electrolitos. (Ej: cromatografía de intercambioiónico; cromatoenfoque).
TIPOS DE CROMATOGRAFIA (continuación)
EXCLUSION: equilibrio entre un líquido atrapado en los poros de una fase fija sólida y un fase móvil líquida. (Ej: cromatografía de filtraciónmolecular).
AFINIDAD: equilibrio entre un ligando inmovilizado (fase fija) y unligando en solución (fase móvil). (Ej: cromatografía de afinidad; cromatografía de inmunoafinidad; cromatografía de ligando-colorante).
En la práctica, es común que dos o más de estos tipos de equilibriooperen en forma simultánea en una determinada cromatografía.
En el ejemplo se agregan 32 mg de una sustancia en 1 ml de fase móvily se supone un coeficiente de partición igual a 1. Al cabo de un númerode equilibrios el compuesto se distribuye en una banda simétrica. ¿Quéocurre si tenemos además otro compuesto con coeficiente 100?
PARAMETROS DE RENDIMIENTO CROMATOGRAFICO
En cromatografía, dos tipos de procesos afectan el comportamiento de los analitos y con ello el éxito de la separación:
1.- Mecanismos físico-químicos básicos que definen el proceso (p.ej., partición, adsorción, intercambio iónico, etc.).
2.- Procesos que tienden a oponerse a la separación, p. ej. difusión,que producen bandas más anchas y “tailing”.
ALGUNAS DEFINICIONES:
- Tiempo de retención (tr): tiempo requerido por un analito paraemerger de la columna.
- Volumen de elución (Ve): volumen de fase móvil requerido paraeluir el analito.
-Velocidad de flujo (Fc) de la fase móvil (ml/min). Influenciado por las dimensiones de la columna, la característica física de las partículas,y la viscosidad de la fase móvil.
Ve = tr x Fc
UN CROMATOGRAMA:
Se grafica la respuesta del detector en función del tiempo de retención(o volumen de elución).La asimetría de un pico puede tener distintas causas: aplicación de unexceso de analito, mal empaque de la columna, deficiente aplicación dela muestra, etc.
El éxito de una cromatografía se mide por su capacidad de separar(resolver) completamente un analito de una mezcla.
La resolución de dos picos A y B (Rs) depende de las propiedades de éstos:
2 (trB - trA)Rs = ---------------- donde: trA y trB son los tiempos de retención
wA + wB de A y de B. y wA y wB el ancho de la base de los picos respectivos.
Valores de Rs de 1,0 corresponde a una separación del 98 %, lo quees adecuado para análisis cuantitativo.
Se considera que las columnas cromatográficas consisten de unconjunto de zonas adyacentes donde hay suficiente espacio para quelos solutos logren un equilibrio completo entre las fases fija y móvil.Cada una de estas zonas hipotéticas se denomina un "plato teórico" y su altura en la columna es la "altura del plato" (H).
Una columna es más efectiva mientras más platos teóricos tenga.
El número de platos teóricos (N) involucrados en la elución de unanalito determinado está dado por:
N = 16 (tr/w)2 o N = 5,54 (tr/wh)2
Donde w es la anchura de la base de cada pico, wh la anchura del pico medida a la mitad de su altura y tr el tiempo de retención.
El número N puede, dentro de ciertos límites, ser aumentado alargandola columna, pero también aumentan el tiempo de retención y el anchodel pico.
Efecto del número de platos teóricos en la distribución de un soluto.Mientras mayor sea N, (y menor H) más angosto será el pico del analito.
PROCESOS QUE TIENDEN A AUMENTAR LA ANCHURA DELPICO DE ELUCION DE UN ANALITO
-Tiempo requerido para aplicar la muestra a la columna.
- Difusión longitudinal. El analito tiende a difundir de zonas de altaconcentración a aquellas de baja concentración.
- Caminos múltiples. El empaque de la columna es aleatorio y estogenera muchos caminos entre las partículas para el analito y la fasemóvil.
-Tiempo requerido para el equilibrio entre las dos fases. Mientrasmás pequeñas las partículas de la fase estacionaria, más rápido esel equilibrio y menor la tendencia a la difusión.
El éxito de un sistema cromatográfico determinado se evalúa por su capacidad de resolución y depende de los siguientes parámetros:
- Selectividad. Capacidad del sistema de discriminar entre compuestos relacionados estructuralmente. Se refleja en los valoresde Kd. Depende de la naturaleza química de las fases fijas y móvil. Alta selectividad muestra la cromatografía de afinidad.
- Eficiencia. Es una medida de los efectos de difusión que producenpicos más anchos y que se sobreponen. Importante el empaque de lacolumna.
- Capacidad. Es un índice de la cantidad de material que puede ser resuelto sin sobreposición de picos. La cromatografía de intercambioiónico y el cromatoenfoque son de alta capacidad.
CLASIFICACION DE LA CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ACUERDO A LA PRESION GENERADA DENTRO DE
LA COLUMNA
Cromatografía de baja presión: presiones menores a 5 bar (0,5 MPa,5,1 Atm).
Cromatografía de presión media: genera presiones entre 6 y 50 bar.(FPLC ~20 - 50 bar)
Cromatografía de alta presión: presiones sobre 50 bar. Denominadatambién HPLC.
HPLC (high performance liquid chromatography): Cromatografía líquida de alto rendimiento
La capacidad de resolución de una columna cromatográfica aumentacon el número de platos teóricos y éstos con el largo de la columna(dentro de ciertos límites, por la tendencia al ensanchamiento de lospicos).
El número de platos teóricos está asociado al área de las partículas dela fase fija (mientras más pequeñas, mejor la resolución pues se reduceel tiempo de equilibrio entre fase fija y móvil).
Al achicarse las partículas, aumenta la resistencia al flujo, y esto obligaa aplicar altas presiones.
Isocrático: igual composición
Diferencias entre una elución isocrática y una elución por gradienteen una cromatografía HPLC de una mezcla de 16 aminoácidos.
El sistema de bombas en una elución por gradiente es más complejopues requiere mezclar solventes, pero se obtiene una mejor resolución.
COMPONENTES DE UN EQUIPO DE HPLC
Columnas: se las fabrica de acero inoxidable para que resistan presionesde hasta 55 MPa (550 bar). Largo hasta 50 cm; diámetro: 1 a 4 mm.
Matrices (fases estacionarias): partículas esféricas de tamaño uniforme para minimizar difusión. Tres tipos:
Microporo (5-10 μm diámetro); microporos que se ramificanen toda la partícula.
Pelicular (porosa superficial); partículas porosas que cubrenun sólido inerte (bolitas de vidrio de ~40 μm de diámetro).
Fases unidas (bonded phases). La fase estacionaria estáquímicamente ligada a un soporte inerte como sílice.
Fase móvil: solventes de alta pureza, que deben ser desgasificados.
Bombas: deben operar hasta 55 MPa, sin generar pulsos
COMPONENTES DE UN EQUIPO DE HPLC (Continuación)
Detectores: deben ser muy sensibles (poca muestra) y estables.
Longitud de onda variable. Son espectrofotómetros de luzultravioleta y visible con celdas de flujo continuo.
Arreglo de diodos. Permiten detectar el espectro completo.Fluorescentes. Alta sensibilidad. Pocos analitos fluorescentes.Indice de refracción. Sensibilidad limitada pero responden a
cualquier analito.Espectrómetro de masas. Detección y determinación simultánea
de la estructura del analito.Electroquímicos. Muy sensibles. Utiles en la detección de analitos
que pueden ser oxidados o reducidos. Dos electrodos, uno de referencia yel otro “de trabajo”, al que se aplica un potencial constante. Al fluir un analito, éste se reduce u oxida, pasando una corriente entre ambos electrodos, la que es registrada.
A: detector de arreglode diodos.
B: detector ultravioleta.
