INTRODUCCIÓN A LAS SEPARCIONES ANALÍTICAS · 2017. 8. 23. · Los métodos cromatográficos se...

Curso de Análisis Químico - Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales -UNLP

Técnicas Separativas 172

INTRODUCCIÓN A LAS SEPARCIONES ANALÍTICAS La enorme mayoría de los problemas analíticos reales comienzan con una compleja mezcla a partir de la cual es necesario aislar, identificar y cuantificar uno o más componentes. La primera pregunta que debemos hacernos es si alguno de los componentes de la mezcla interfiere con el componente que queremos cuantificar según el método que deseamos emplear, si así ocurriera, entonces dicho componente es llamado interferencia. ¿Qué son las interferencias? Son sustancias presentes en la matriz (toda la muestra menos el analito) de la muestra que afectan la señal del analito o bien aumentándola (error en exceso) o bien disminuyéndola (error por defecto) Las interferencias deben tratarse antes de proceder a la determinación cuantitativa del analito. El tratamiento puede ser:

a) Anulando el efecto (por ejemplo empleando agentes enmascarantes, como los empleados en la complejo volumetría)

b) Separación física Las principales técnicas de separación pueden ser:

1) Precipitación: es una técnica de separación en que las dos fases implicadas son un sólido y un líquido, y donde la segunda fase se genera insitu. Las fuerzas que predominan en el proceso son de tipo químico, tratándose de un proceso con control termodinámico, y desde el punto de vista operativo puede ser separación simple o repetitiva, pero imposible de adaptar a una separación múltiple.

2) Filtración: es el proceso de separación de sólidos en suspensión en un líquido mediante un medio poroso, que retiene los sólidos y permite el pasaje del líquido.

3) Destilación: es la operación de separar, mediante vaporización y condensación, los diferentes componentes líquidos, sólidos disueltos en líquidos o gases licuados de una mezcla, aprovechando los diferentes puntos de ebullición (temperaturas de ebullición) de cada una de las sustancias ya que el punto de ebullición es una propiedad intensiva de cada sustancia, es decir, no varía en función de la masa o el volumen, aunque sí en función de la presión.

4) Extracción con solventes: es una la extracción líquido-líquido que emplea para separar una mezcla la diferencia de solubilidad de los componentes entre dos líquidos inmiscibles. Ej: agua-cloroformo, éter-agua.

En las primeras técnicas de separación las propiedades de los componentes de la mezcla, ya sean químicas o físicas son bien diferentes: producto de solubilidad, el tamaño, la temperatura de ebullición la polaridad. A medida que estos valores se hacen más cercanos se necesitan técnicas de separación más eficientes, que nos permitan separar componentes con propiedades físicas y/o químicas muy similares. Estas técnicas son:

1) Cromatografía 2) Electroforesis

http://es.wikipedia.org/wiki/Suspensi%C3%B3n_(qu%C3%ADmica)

http://es.wikipedia.org/wiki/Porosidad

http://es.wikipedia.org/wiki/Operaci%C3%B3n_unitaria

http://es.wikipedia.org/wiki/Punto_de_ebullici%C3%B3n



http://es.wikipedia.org/wiki/Propiedad_intensiva



CROMATOGRAFÍA 1. Introducción 1.1- Experimento de Michael Tswett La cromatografía fue descubierta por el botánico ruso Michael Tswett a principios del siglo pasado. Tswett utilizó esta técnica para separar varios pigmentos de plantas, como clorofilas y xantofilas. Utilizó una columna de vidrio, la rellenó con un material adsorbente, como alúmina (Al2O3), sílica (SiO2), azúcar en polvo o CaCO3 finamente molido; colocó una solución con los pigmentos en la parte superior de la columna y luego agregó un solvente orgánico, de manera que los pigmentos circularan por la columna hasta salir por el otro extremo. A medida que los pigmentos se deslizaban por la columna iban dejando una serie de bandas de colores claramente separadas de zonas totalmente limpias. Cada banda coloreada correspondía a un componente específico de la solución. Twsett dio a esta técnica el nombre de cromatografía cuyo nombre proviene del griego chroma = color y graphein = escribir. Este método es en esencia lo que se emplea hoy en día. 1.2- Descripción general de la técnica La caraterística que distingue a la cromatografía de la mayoría de los métodos físicos y químicos de separación, es que se ponen encontacto dos fases mutuamente inmiscibles. Una fase es estacionaria y la otra móvil. Una muestra que se introduce en la fase móvil es transportada a lo largo de la columna que contiene una fase estacionaria distribuída. Las especies de la muestra experimentan interacciones repetidas entre la fase móvil y la fase estacionaria. Cuando ambas fases se han escogido apropiadamente, los componentes de la mezcla se separan gradualmente en bandas en la fase móvil. Al final del proceso los componentes separados emergen en orden creciente de interacción con la fase estacionaria. El componente menos retenido emerge primero, el más retenido eluye último. La distribución entre las fases aprovecha las diferencias entre las propiedades físicas/químicas de los componentes de la muestra. La columna de separción es el corazón del cromatógrafo. Proporciona versatilidad en los tipos de análisis que pueden realizarse. Esta caraterística, debido a la amplia gama de selección de materiales para las fases móvil y estacionaria permite separa moléculas que difieren muy poco en sus propiedades físicas y químicas. Podemos concluir entonces que la cromatografía agrupa un conjunto importante y diverso de métodos, que permite separar componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas (se entiende por mezclas complejas, aquellas en las que los componentes poseen características químicas o físicas muy similares) lo que en muchas ocaciones resulta imposible por otros métodos. En todas las separaciones cromatográficas, la muestra se disuelve en una fase móvil, que puede ser un gas o un



líquido. Esta fase móvil se hace pasar a través de una fase estacionaria (líquida o sólida) inmiscible, la cual se mantiene fija en una columna o sobre una superficie sólida. Las técnicas cromatográficas nos permiten separar, identificar y determinar los componentes de mezclas complejas. Ningún otro método de separación es tan potente y de aplicación tan general como la cromatografía. En toda técnica cromatográfica los componentes de la mezcla interaccionan de distinta forma con la fase estacionaria y con la fase móvil, de este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Después de haber pasado los componentes por la fase estacionaria y haberse separado pasan por un detector que genera una señal que puede depender de la concentración y del tipo de compuesto. 2- Clasificación de los métodos cromatográficos

Los métodos cromatográficos se pueden clasificar de diferentes formas: 2.1 Según la forma en como las fases estacionaria y móvil se ponen en contacto

a- Cromatografía en columna: la fase estacionaria está retenida en un tubo estrecho y la fase móvil se hace pasar a través del tubo por presión o por gravedad. Los equilibrios transcurren dentro de un conducto cilíndrico, inerte. La columna se carga de relleno, constituido por un sólido inerte (rellenas) o cubierto de líquido y la fase móvil percola a través de los espacios intersticiales

b- Cromatografía plana: la fase estacionaria está inmóvil sobre una placa plana o

en los poros de un papel. En este caso la fase móvil se mueve a través de la fase estacionaria por acción capilar o por efecto de la gravedad.

2.2 Según la naturaleza de las fases

Fase móvil Fase estacionaria cromatografía

Gas líquido Gas-liquido (CGL) sólido Gas-sólido (CGS)

Líquido líquido Líquido-líquido (CLL) sólido Líquido-sólido (CSL)

2.3 Según el tipo de equilibrio existente entre las fases

Cromatografía de adsorción: es la forma más antigua de cromatografía, en la cual se utiliza una fase estacionaria sólida y una fase móvil líquida o gaseosa. Generalmente la fase estacionaria es un sólido más polar que la fase móvil (polar en el sentido de los enlaces químicos). Algunas de las fases estacionarias pueden ser: polímeros de sílica (óxidos de silicio hidratados) o polímeros de alúmina (óxidos de aluminio hidratados). Estos soportes son activos porque forman puentes hidrógeno con los componentes de la muestra. El soluto puede adsorberse en la superficie de las partículas sólidas. El equilibrio entre el estado adsorbido y la solución es la causa de la separación de las moléculas del soluto. En esta cromatografía en componente menos polar es el primero en ser detectado.

http://es.wikipedia.org/wiki/Concentraci%C3%B3n



Cromatografía de reparto: en esta técnica, una fase estacionaria líquida forma una película delgada en la superficie de un soporte sólido inactivo. El soluto se equilibra entre este líquido estacionario y una fase móvil líquida o gaseosa. Cuando ambas fases son líquidas se puede distinguir dos tipos de cromatografía de reparto en función de las polaridades relativas de la fase móvil y estacionaria: Cromatografía líquida en fase normal donde la fase estacionaria es un líquido polar como el agua o el trietilenglicol y los compuestos menos polares eluyen primero. Cromatografía líquida en fase inversa: la fase estacionaria es menos polar que la fase móvil, generalmente hidrocarburos alifáticos y el este caso las sustancias más polares eluyen primero. Aplicaciones: Entre todas las cromatografía líquidas, la cromatografía de reparto es la más utilizada. Se emplea por ejemplo para: separar proteínas, aminoácidos, lípidos e hidratos de carbono. En la industria de productos alimentarios se analizan los contenidos de edulcorantes artificiales, antioxidantes y aditivos y también esta técnica permite analizar contaminantes como pesticidas, herbicidas y fenoles. Cromatografía de intercambio iónico: en este tipo de cromatografía, aniones como –SO3

- o cationes como –N(COH3)3

+ se unen covalentemente a la fase estacionaria sólida, por lo común una resina. Los iones de soluto de carga opuesta a los de la fase estacionaria son atraidos por esta última mediante una fuerza electrostática. La fase móvil es un líquido. Muchas sustancias sólidas, tanto naturales como sintéticas, pueden emplearse como intercambiadores de iones. Entre las primeras se encuentran las arcillas o ceolitas. Las resinas sintéticas de intercambio de iones fueron producidas por primera vez en 1935 y desde entonces han hallado gran aplicación en el laboratorio y la industria para ablandamiento de aguas (eliminación de Ca+2 y Mg+2), desionización de aguas, purificación de soluciones y separación de iones. Las resinas sintéticas de intercambio iónico son materiales poliméricos de alto peso

molecular que contienen muchos grupos funcionales iónicos por molécula. Las resinas de intercambio iónico pueden clasificarse en dos tipos principales: • las resinas de intercambio catiónico, que pueden ser de tipo ácido fuerte, con grupos sulfónicos RSO3

-H+ o de tipo ácido débil con grupos carboxílicos RCOOH. El la figura se muestra la estructura de una resina catiónica de poliestireno entrelazado.



Un ejemplo de la reacción de intercambio catiónico es el representado en la siguiente ecuación

soluciónsólidosoluciónsólidoHCaRSOCaHRSO ++−++− +↔+ 2)(2 2

232

3

R significa toda la molécula de la resina de intercambio iónico salvo el grupo ácido sulfónico y Ca+2 representa el catión separado de la fase solución. A medida que transcurre la reacción de intercambio, en dirección directa la solución adquiere iones hidrógeno acidificándose. • las resinas aniónicas que contienen grupos funcionales básicos, de los que un ejemplo es –NH3

+OH-. Los intercambiadores básicos fuertes son generalmente aminas cuaternarias (RN(CH3)3

+OH-) y los intercambiadores básicos débiles son aminas secundarias o terciarias. El ión hidróxido que está en la superficie de la partícula de resina puede entrar en reacción de intercambio con otro anión presente en la solución de la muestra como se ilustra en la reacción

soluciónsólidosoluciónsólidoOHClNHRClOHNHR −−+−−+ +−↔+− 33

En esta reacción la liberación de iones de hidróxido hace que aumente el pH de la solución. En la tabla se listan los principales grupos de intercambio que se usan en las resinas así como su aplicación

Tipo Grupo activo Intervalo de pH Aplicación

Cambiador de cationes fuertemente ácidos SO3 1-14

Aminoácidos, separaciones inorgánicas

Cambiador de cationes débilmente ácidos COO- 5-14

Elementos de transición, bases

inorgánicas Cambiador de aniones

fuertemente básico N+(CH3) 1-12 Alcaloides, ácidos grasos

Cambiador de cationes débilmente básico C2H4N(C2H5)2 1-9 Ácidos orgánicos,

animoácidos Todas las reacciones son reversibles, por lo tanto, cuando la resina se agota (han sido intercambiados todos los iones hidrógeno u oxhidrilo, según sea la resina catiónica o aniónica con la solución), puede regenerarse pasándole soluciones de ácido fuerte o hidróxido de sodio para luego utilizarlas nuevamente

Cromatografía de exclusión molecular: a diferencia de lo que ocurre en otras cromatografías, en el caso de la cromatografía de exclusión molecular no existen interacciones por atracción entre la fase estacionaria y el soluto. La fase móvil líquida o gaseosa pasa a través de un gel poroso. Los poros son suficientemente pequeños para excluir las moléculas grandes de soluto, pero no las pequeñas. Las moléculas pequeñas requieren más tiempo para pasar a través de la columna porque entran en el gel y por



tanto deben fluir a través de un volumen más grande antes de dejar la columna. Esta cromatografía también se conoce como filtración en gel o permeación en gel. La cromatografía de exclusión por tamaño es una técnica muy eficaz que se puede aplicar sobre todos a especies de elevado peso molecular. Los empaquetamientos para la cromatografía de exclusión constan de pequeñas partículas de sílice o polímeros (de aproximadamente 10 μm) que contienen poros uniformes, dentro del cual pueden difundirse las moléculas de soluto y solvente. Mientras están en los poro, las moléculas pueden quedar atrapadas y ser eliminadas del flujo de la fase móvil. El tiempo de residencia medio de las moléculas del analito depende del tamaño efectivo. Las moléculas que son mayores que el tamaño medio de poro no penetran, se excluyen, y por lo tanto no se retienen, migran con la fase móvil. Las moléculas que son menores que los poros pueden penetrar a través de la trama de los poros y de ese modo quedan retenidas la mayor parte del tiempo, siendo eluidas al final. Un ejemplo de la aplicación de esta cromatografía es la determinación del contenido de glucosa, sacarosa y fructosa en jugos envasados, también es muy utilizada para la determinación de pesos moleculares de productos naturales.

Cromatografía por afinidad: esta clase de cromatografía es muy selectiva. Se utilizan interacciones altamente específicas entre un tipo de moléculas de soluto y otras moléculas que se unen (inmovilizan) covalentemente a la fase estacionaria. Es la cromatografía más potente. Una molécula presenta una interacción específica con un solo soluto de la mezcla compleja que se une covalentemente a la fase estacionaria. El químico diseña una fase estacionaria para que interactúe con un soluto en particular. 3.- Elusión Este procedimiento consiste en el desplazamiento de los solutos a través de la columna por adición sucesiva de fase móvil. Se introduce una porción de la muestra, disuelta en la fase móvil en la parte superior de la columna, distribuyéndose a continuación los componentes entre



las dos fases. Al introducir más fase móvil (el eluyente) se fuerza a la porción de muestra disuelta a descender por la columna, donde tienen lugar los nuevos equilibrios entre la fase móvil y nuevas zonas de la fase estacionaria. A medida que se van añadiendo nuevas porciones de eluyente, las moléculas de soluto se ven arrastradas a lo largo de la columna a través de una serie continua de transferencias entre las dos fases. Puesto que el soluto sólo se puede mover con la fase móvil, la velocidad media a la que migra el soluto depende de la fracción de tiempo que pasa en esta fase. Esta fracción de tiempo es pequeña en solutos que son retenidos fuertemente por la fase estacionaria y grande cuando es más probable su retención en la fase móvil. Idealmente, las diferencias resultantes de velocidad determinan que los componentes de una mezcla se separen en bandas o zonas, a lo largo de la columna. Para conseguir, pues, la separación de especies hay que pasar a través de la columna una cantidad suficiente de fase móvil, hasta que emerjan y puedan ser recogidas cada una de las bandas por separado. Se dice entonces que las especies han sido eluidas de la columna, como se muestra en la figura. 4- Cromatograma Si en el extremo de salida de la columna se coloca un detector que responde a la presencia del soluto en la fase móvil y se registra su respuesta en función del tiempo (o del volumen de fase móvil que ha pasado), se obtiene una serie de picos o bandas casi siempre simétricos, como los que se muestran en la figura. Este gráfico, llamado cromatograma, es útil en análisis tanto cualitativo como cuantitativo. 4.1- ¿Qué significan los picos de un cromatograma? Las posiciones de los picos en el eje del tiempo se pueden utilizar para identificar los

componentes de la muestra. Las áreas bajo los picos aportan una medida cuantitativa de la cantidad de cada

especie.



4.2- Parámetros cromatográficos El término parámetro se emplea para referirse a una cantidad que toma diferentes valores y caracteriza a un proceso, operación o resultado, son datos primarios.

Los parámetros cromatográficos que se obtienen del cromatograma se correlacionan exitosamente con las descripciones de los procesos que ocurren en el curso de la separación Estos parámetros nos permiten tabular y comunicar los datos con mayor facilidad.

4.3- Parámetros de las bandas individuales



a- Tiempo de retención tR: es el tiempo que tarda eluir (salir) de la columna un analito que interactúa con la fase estacionaria. Se mide desde el momento de la inyección de la muestra (tiempo igual a cero) y la aparición del pico a la salida de la columna (medido en el máximo del pico). b- Volumen de retención VR: es el volumen que eluye de la columna desde la inyección de la muestra hasta que se produce el máximo del pico correspondiente a una sustancia que ha interactuado con la fase estacionaria. c- Tiempo muerto t0: es el tiempo que tarda en salir de la columna una especie no retenida por la fase estacionaria. La velocidad de migración de esta especie es igual a la velocidad media de migración de las moléculas de la fase móvil d- Volumen muerto o volumen extra columna (V0): es el volumen mínimo de eluyente que transporta a una sustancia no retenida por la fase estacionaria desde el punto de inyección hasta el detector. Para medir el tiempo muerto o el volumen muerto se inyecta junto con la muestra una sustancia que no interaccione con la fase estacionaria, por lo tanto el primer pico que aparece en el cromatograma corresponderá a dicha sustancia y nos da una medida del volumen entre las partículas de fase estacionaria, más el volumen de las conexiones y el detector. e- Ancho del pico en la base Wb: se obtiene trazando las tangentes en los puntos de inflexión a ambos lados del contorno de banda del analito. Para los picos gausianos Wb = 4σ f- FWHM: ancho del pico a la mitad de la altura este término nos permita describir picos que no son gausiannos. Cada uno de los parámetros anteriores describen cada pico y cada pico (si está resuelto) es una única sustancia, es decir que cada banda tiene su correspondiente conjunto de parámetros. Con frecuencia se usan además otras cantidades que se obtienen a partir de los parámetros anteriores: Volumen de retención neto: VNi = VRi – V0 Tiempo de retención neto: tNi = tRi – t0 Ambos nos permiten caracterizar la sustancia, puesto que nos independizan del volumen muerto de la columna que estamos empleando y nos permiten comparar nuestros datos con los obtenidos en otros experimentos, laboratorios o tablas. Estos parámetros son muy útiles para la identificación de sustancias sobre todo en cromatografía gaseosa. 5- Eficiencia de una columna cromatográfica El objetivo principal de las técnicas cromatográficas es separar componentes de una muestra. Por lo tanto cuanto más tiempo permanezca un compuesto dentro de la columna más interacciona con la fase estacionaria y más se separa de otro compuesto poco retenido por la fase estacionaria. Sin embargo, cuanto más tiempo permanece una



sustancia dentro de la columna, la banda se ensancha más y por lo tanto disminuye la eficiencia de la columna como técnica de separación. Podemos definir entonces a la eficiencia de una columna cromatográfica como el grado de ensanchamiento de bandas que experimenta un compuesto a través de la columna. Se han generalizado dos términos como medidas cuantitativas de la eficiencia de una columna cromatográfica Altura de plato o altura equivalente de plato teórico (HETP) H Número de platos teóricos N

En los primeros estudios teóricos de la cromatografía se trató a la columna cromatográfica como si estuviese constituida por un gran número de platos semejante dentro de los cuales existían continuamente condiciones de equilibrio del soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Este modelo de plato explica satisfactoriamente la forma gaussiana de los picos cromatográficos, así como los factores que influyen en las

diferentes velocidades de migración de los solutos. Pero no puede explicar el ensanchamiento de las bandas, dada que no se trabaja en condiciones de equilibrio, sino que las fases se mueven una respecto a la otra a una velocidad tal que no hay tiempo de alcanzar la condición de equilibro termodinámico. Como las bandas cromatográficas son generalmente curvas gaussianas y estas curvas están caracterizadas por la desviación estándar σ (ancho de la mitad del pico en el punto de inflexión) o la varianza σ2. La eficiencia de la columna se refleja en el ancho del pico cromatográfico, se usa la varianza (σ2) por unidad de longitud como medida de la eficiencia de la columna. Es decir, la altura de plato H esta dada por:

LH

2σ= y

2

=σ

RtN

Ambos están relacionados por la expresión:

HLN =

Donde L es la longitud (generalmente se expresa en cm) del empaquetado de la columna. La eficiencia de una columna cromatográfica aumenta a medida que aumenta el número de platos y a medida que disminuye la altura de plato. Es posible encontrar grandes diferencias en las eficiencias de las columnas debidos a diferencias de tipo de columna,



de fase móvil y fase estacionaria. La eficiencia en términos de números de platos puede variar de unos centenares a varios cientos de miles. No son raras alturas de plato entre pocas décimas y milésimas de centímetro y aun menores. La eficiencia (N), depende de factores de construcción y de empaque de la columna y de la velocidad de la fase móvil.

5.2- Estimación experimental de H y N En la figura se muestra un cromatograma típico para un único analito. La varianza del pico de soluto puede obtenerse por un procedimiento gráfico sencillo midiendo el ancho de la base del pico.

Como ya vimos: Wb = 4σ Entonces podemos reemplazar en la ecuación del número de platos y calcular N a partir de los parámetros medidos en un cromatograma según la expresión: Si el cromatograma está graficado en función del volumen de la fase móvil el número de platos queda expresado por:

22

16

=

=

b

RR

WVVN

σ

Reemplazando el valor de N calculado a partir de los parámetros cromatográficos en la expresión de la Altura equivalente de plato teórico HETP (H) se obtiene:

2

16

×==

R

b

tWL

NLH

El sistema es más efectivo, o sea la columna es más eficiente cuando la altura equivalente de plato teórico H tienda a cero. 6- Resolución de la columna La Resolución nos da una medida cuantitativa de la capacidad de la técnica cromatográfica para separar dos analitos. Una expresión sencilla de la resolución a partir de los parámetros cromatógráficos es la siguiente:

22

16

=

=

b

RR

WttN

σ

( )

( )BA

RARBs

BA

RARBs

WW

ttR

WW

VVR

+

−=

+

−=

21

21



El significado de la Resolución puede entenderse observando la figura, donde se han representado cromatogramas de mezclas de un analito A y otro B que fueron eluídos en tres columnas con diferente poder de resolución. Se ve claramente en la figura, que sólo cuando se obtiene una resolución de 1,5 se logra una separación prácticamente completa de los analitos A y B. Mientras que cuando la resolución es de 0,75 no consigue separar totalmente la mezcla. La resolución (RS) constituye una medida cuantitativa del grado de mezcla de los analitos. En la tabla se indica el contenido de impurezas para distintas

resoluciones

Resolución RS Contenido relativo de impurezas para

bandas gausianas de la misma área 1,5 0,001 1,0 0,023 0,8 0,045 0,5 0,16

La resolución o grado de separación depende de varios factores, entre ellos de la elección de la fase estacionaria, la fase móvil, la temperatura y la longitud de columna. 7- Factores que influyen en el ensanchamiento de bandas Si observamos la expresión de cálculo correspondiente a la resolución vemos que si la resolución no es lo suficientemente buena (mayor que 1,5) lo primero que pensamos que debemos hacer para mejorarla es aumentar el tiempo en que el soluto más retenido permanece en la columna. Sin embargo, si el soluto permanece un tiempo muy largo en el interior de la columna la banda en el cromatograma podría ensancharse mucho dificultando su detección. Por lo tanto es conveniente entender cuales son los mecanismos que dan lugar al ensanchamiento de las bandas cromatográficas. El ensanchamiento de las bandas es una consecuencia de la velocidad finita a la cual tienen lugar los distintos procesos de transferencia de materia que ocurren durante la migración de un soluto a medida que desciende por la columna. Algunas de estas velocidades se pueden controlar por ajustes de variables experimentales, permitiendo así mejoras en las separaciones. Las variables más importantes son: Velocidad de la fase móvil Coeficiente de difusión del analito en la fase móvil Coeficiente de difusión del analito en la fase estacionaria Diámetro de las partículas en el empaquetado Espesor de la capa líquida de la fase estacionaria



El grado de influencia de estas variables en la eficiencia de la columna, y por lo tanto en la resolución, depende del tiempo en que la fase móvil esté en contacto con la fase estacionaria, que a su vez depende de la velocidad de flujo de la fase móvil. Por esta razón, los estudios de la eficiencia de la columna se han llevado a cabo determinando como varía la altura equivalente de plato teórico en función de la velocidad de la fase móvil. La expresión que se obtuvo que puede aproximarse mediante la expresión conocida como la ecuación de van Deemter:

µµ

CBAH ++=

Donde A, B y C son constantes una vez que ha sido definida la fase estacionaria, el porcentaje de fase estacionaria, la fase móvil y la temperatura de trabajo. La variable µ representa la velocidad de migración de la fase móvil. Veamos ahora el significado de cada uno de los términos que forman parte de la ecuación de van Deemter.

o El término A proviene de considerar la difusión turbulenta o efecto Eddy. Es una constante que no depende de la velocidad de fase móvil, sino que depende principalmente del diámetro de las partículas de relleno. Este término se hace cero para columnas capilares y muy pequeño para columnas muy buen empacadas. Esto se puede ver en la expresión completa del término A, el cual depende del diámetro de las partículas de

relleno y de la irregularidad del empaquetamiento. Esto nos indica la ventaja del uso de columnas capilares (tubulares abiertas) que permiten un rápido intercambio entre las moléculas del analito entre la fase móvil y la fase estacionaria.

o El término B proviene de considerar

difusión molecular longitudinal. La difusión es un proceso por el cual las especies migran desde una parte más concentrada del medio a otra más diluida. En cromatografía, la difusión longitudinal se debe a la migración de un soluto desde el centro concentrado de una banda a las regiones más diluidas a ambos lados de la misma, como puede observarse en la figura. Este fenómeno es poco importante en la cromatografía de líquidos, pero es la causa más común de ensanchamiento de las bandas (pérdida de eficiencia) en la cromatografía gaseosa. La magnitud del término B está determinada en gran parte por el coeficiente de difusión del analito en la fase móvil. Es predominante a bajas velocidades de flujo de la fase móvil ya que las moléculas del analito tienen más tiempo de difundir. El término B depende principalmente de la composición d ela fase móvil.



o El término C proviene de considerar la transferencia de masa. Este término considera los equilibrios del soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Estos equilibrios se alcanzan lentamente. Las moléculas de soluto requieren de un tiempo para difundir en el interior de las fases móvil y estacionaria. En consecuencia las moléculas de analito en el frente de la banda migran hacia delante antes de que tengan tiempo

de equilibrarse con la fase estacionaria y por lo tanto ser retenidos por ella. De forma análoga, no se alcanza el equilibrio en la cola de la banda y las moléculas quedan retrasadas en la fase estacionaria por el rápido movimiento de la fase móvil. Si los procesos de transferencia de masa dentro de las dos fases fueran infinitamente rápidos no ocurriría ensanchamiento de la banda. Sin embargo las moléculas de soluto requieren de un tiempo para difundir en el interior de las fases móvil y estacionaria. Este término C es más importante a altas velocidades y debe ser tenido en cuenta tanto en cromatografía líquida como en cromatografía gaseosa. Este término depende de que sustancia es la que hemos empleado como fase estacionaria.

La representación gráfica de la ecuación de van Deemter tiene la forma:

El menor valor que puede tomar la altura equivalente de plato teórico (H) se conoce como H mínimo y se corresponde con una velocidad de fase móvil óptima. Esta última es la velocidad que nos permitirá obtener la mayor eficiencia y la mejor resolución. Si ahora queremos relacionar este valor de la velocidad óptima con la eficiencia de la columna, vemos que si la altura equivalente de plato es mínima la eficiencia será máxima:



8- Cromatografía gaseosa La cromatografía gaseosa utiliza como fase móvil un gas inerte, que eluye los componentes de una mezcla a través de la columna que contiene la fase estacionaria inmovilizada. En la cromatografía de gases no existe interacción entre la fase móvil y el analito. Esta cromatografía es empleada para separar y analizar compuestos orgánicos con punto de ebullición inferiores a 250ºC y con presión de vapor suficientemente alta para que puedan ser transportados por la fase móvil. Sin embargo debe tenerse en cuenta que no se descompongan con la temperatura. Equipamiento

1-gas portador, 2-inyector, 3-columna, 4-detector, 5-registrador y 6 cromatograma

1- El gas portador debe ser químicamente inerte, puede

ser helio, argón, nitrógeno o hidrógeno. El que más se usa es helio. Asociado con la fuente de gas portador, vienen asociados los reguladores de presión y los medidores de caudal o flujo.

2- El sistema de inyección debe introducir a la muestra rápidamente y en muy pequeña cantidad. Generalmente se usan microjeringas calibradas que introducen la muestra pinchando en un septum o diafragma de goma o silicona que se encuentra en la cabeza de la columna y que de ordinario está a 50°C por encima del punto de ebullición del componente menos volátil de la muestra, a fin de que tenga lugar una rápida vaporización.

Sistema inyector



3- Las columnas históricamente eran empaquetadas, y la fase estacionaria era una película de líquido retenida en la superficie de un soporte sólido inerte finamente dividido. Actualmente las columnas pueden ser:

columnas rellenas: son de hacer inoxidable o

vidrio con un diámetro interno de 2 a 4 mm. La fase estacionaria puede ser un sólido poroso, se emplea en la cromatografía gas –sólido ó- un líquido de alto punto de ebullición recubriendo un sólido inerte, y se emplean en la cromatografía gas – líquido.

columnas capilares: estas columnas tienen un

diámetro interno de 1 mm y las paredes están recubiertas con una película de fase estacionaria. La fase estacionaria recubre las paredes del capilar. Se emplean en cromatografía gas líquido. Las columnas capilares son más eficientes que las columnas rellenas. Por ejemplo en número de platos teóricos de las columnas capilares son del orden de 200000 contra 20000 de las rellenas.

4- Detectores: son dispositivos que deben responder

rápidamente a pequeñas concentraciones de solutos a medida que salen de la columna. Los detectores más generalizados en la cromatografía de gases se describen en la tabla que sigue

Tipo de detector

Límite de detección (g/s)

comentarios

Detector de conductividad térmica

10-5 -10-6 Se basa en el cambio de conductividad térmica que sufre el gas portador debido a la presencia del soluto. Se usa como gas portador He o H2 Responde a un amplio rango de compuestos

Ionización de llama 10-12

Los compuestos orgánicos al quemarse en la llama producen compuestos intermedios iónicos y electrones que son capturados por un colector. Es un detector de uso general para la mayoría de las muestras orgánicas y las muestras contaminadas con agua y óxidos de nitrógeno y azufre.

Captura de electrones 10-14

Es selectivo en su respuesta, es muy sensible para grupos funcionales tales como los halógenos, peróxidos, quinonas y grupos nitro. Es muy usado para la determinación de pesticidas clorados.

Fotometría de llama 10-13 Selectivo para compuestos que contienen S y P

Nitrógeno - Fósforo 10-8 -10-14 Selectivo para compuestos que contienen N y P

IRTF 10-10 Moléculas polares Espectrómetro de masas 10-12 universal



5- Horno termostatizado: la temperatura

de la columna es una variable importante que se debe mantener constante dentro de pocas décimas de grado. Es por ello que la columna va alojada dentro de un horno termostatizado. La temperatura óptima depende del punto de ebullición de la muestra y del grado de separación necesario

Aplicaciones de la cromatografía gaseosa La cromatografía gaseosa tiene dos aplicaciones importantes: la primera es una técnica de separación y en este sentido no la supera ninguna otra técnica en el caso de sistemas complejos. La segunda aplicación, es claramente distinta, es una técnica de análisis. Los tiempos de retención se emplean en la identificación cualitativa de los distintos componentes y las alturas o áreas de pico brindan información cuantitativa. Para fines cuantitativos la cromatografía es mucho más limitada que los métodos espectroscópicos, por lo tanto la tendencia actual es a combinar las notables cualidades de fraccionamiento de la cromatografía con las mejores propiedades de identificación de las espectroscopias de masas, infrarrojos y resonancia magnética nuclear, todas ellas empleadas como detectores. En la cromatografía gas- sólido la separación tiene lugar gracias a las diferencias entre las posiciones de los equilibrios de adsorción de los componentes gaseosos de la muestra sobre la superficie sólida de la fase estacionaria. Esta técnica se utiliza para separar especies gaseosas de bajo peso molecular como CO, O2, N2 e hidrocarburos. En la cromatografía gas-líquido la separación es debida a la diferente distribución de los analitos de la muestra compleja entre la fase estacionaria líquida (inmovilizada sobre un soporte sólido por adsorción o por enlace químico) y la fase móvil gaseosa. Esta técnica es una de los métodos más importantes para separar mezclas complejas de compuestos orgánicos, organometálicos o bioquímicos. Ejemplo: separación de los componentes de pesticidas, de ésteres metílicos de ácidos grasos, y como muestra el cromatograma la separación de los componentes volátiles de hojas de encino



9. Cromatografía líquida La cromatografía líquida en sus comienzos empleaba columnas de vidrio de 1 a 5 cm de diámetro y de 50 a 500 cm de longitud. Para que los caudales fueran razonables, el diámetro de las partículas de la fase estacionaria debían ser de 150 200 μm. Aún así, los caudales eran de unas pocas décimas de metros por minuto, por lo tanto el tiempo de separación se alargaba a varias horas. Más tarde, se constató que si se empleaban pequeño tamaño de partícula en los empaquetados de las columnas esto producía grandes aumentos en la eficiencia de la separación, pero ello llevaba a la necesidad de un instrumental más sofisticado que los necesarios para la cromatografía líquida clásica. Para que la separaciín tuviera lugar en un tiempo razonable debía incluirse dentro del instrumental un sistema de bombeo. A estos nuevos procedimientos se les designa cromatografía líquida de alta resolución CLAR (HPLC su sigla en inglés). Los métodos clásicos se emplean en general con fines preparativos. Instrumental empleado en la cromatografía líquida de alta resolución Esta cromatografía requiere de presiones de varios centenares de atmósferas para conseguir caudales razonables con los modernos empaquetados de cromatografía de líquidos, que usan partículas de un diámetro igual o inferior a 10 μm. A consecuencia de estas grandes presiones, el equipo de cromatografía de líquidos de alta resolución tiende a ser considerablemente más elaborado y caro que los otros equipos de cromatografía. En la figura se muestran los componentes básicos de un cromatógrafo de alta resolución:

1- Depósito de fase móvil: generalmente están equipados con uno o más depósitos que contienen alrededor de 500 ml de solvente. A menudo se incluyen accesorios para eliminar los gases disueltos y partículas en suspensión. La presencia de gases producen dispersión en las bandas y las partículas en suspensión interfieren con el funcionamiento del detector.

2- Sistema de bombeo: las exigencias que deben cumplir las bombas que se utilizan en cromatografía de líquidos son: posibilidad de presión de hasta 480 atm, salida libre de pulsaciones, caudales entre 0,1 y 10 ml/min, reproducibilidad de caudales de 0,5% y resistencia a la corrosión debida a los solventes.

3- Sistema de inyección: se puede inyectar la muestra mediante una jeringa a través de un diafragma, pero este sistema no es muy reproducible. Otro sistema es usar



dispositivos con un bucle de bombeo que inyecta la muestra directamente en la cabeza de la columna.

4- Columnas: se construyen generalmente con tubos de acero inoxidable, a veces de vidrio de paredes resistentes a presiones menores de 48 atm. Tienen una longitud de 10 a 30 cm y un diámetro de 4 a 10 mm. Los empaquetamientos típicos de columna son de un tamaño de partícula de 5 a 10μm obteniéndose de 40000 a 60000 platos por metro de columna. También existen microcolumnas con un diámetro de 1 a 4,6 mm y una longitud de 3 a 7 cm, con empaquetamientos de 3 a 5 μm y en ellas se pueden obtener alrededor de 100000 platos por metro de columna. Estas son más ventajosas que las anteriores debido a la rapidez del análisis y bajo consumo de solvente. Los empaquetamientos pueden ser de sílice, alúmina, partículas de polímeros porosos que se recubre con una fina película orgánica que se una química o físicamente a la superficie.

5- Detectores: no hay detectores universales, como en cromatografía gaseosa, el sistema de detección depende de la naturaleza de la muestra. En la tabla se indican algunos de los detectores más empleados:

Tipo de detector Límite de detección comentarios UV-visible 10-11g Específico para sustancias que absorben

luz

Indice de refracción diferencial 10-9-10-10g Mide cambios de índice de refracción. Universal

Florescencia 10-14g Detector específico para compuestos fluorescentes

Infrarrojo 10-8g Detector de

amperométrico 10-10-10-11g Detector específico para compuestos electro activos

conductimétrico 10-8g/mL Detector específico sirve para todos los iones

10- Cromatografía plana o en lecho abierto Los métodos de cromatografía plana o en lecho abierto comprenden la cromatografía de capa fina (TLC) y la cromatografía de papel (CP). Todos ellos hacen uso de una capa plana relativamente fina de material, que no necesita soporte o que está recubriendo una superficie de vidrio, plástico o metal. La fase móvil se mueve a través de la fase estacionaria por capilaridad, en ocasiones ayudada por acción de la gravedad. En la actualidad la mayor parte de la cromatografía plana está basada en la técnica de la capa fin, que es más rápida, tiene mejor resolución y es más sensible que la correspondiente de papel. 10.1- Cromatografía capa fina Las separaciones de capa se llevan a cabo sobre una placa de vidrio recubierta de una capa fina (algunos milímetros de espesor) y adherente de partículas finamente divididas, esta capa constituye la fase estacionaria. Los materiales adsorbentes más usados son: sílica gel, alúmina, tierras de infusorios y celulosa en polvo. Se prepara una placa delgada extendiendo una mezcla pastosa acuosa del adsorbente finamente molido (al que se le puede mezclar un ligante como CaSO4)



sobre una placa de vidrio. Luego se deja en reposo hasta que se ha formado la capa. Puede secarse a temperatura ambiente o estufa. Sembrado de la placa: la muestra se disuelve en un solvente volátil con una concentración de por lo menos 10 mg/ml (10μg/μl). Para efectuar la siembra de la mezcla sobre la placa se depositan, mediante un capilar de 0,5 mm de diámetro o micropipeta, pequeñas alícuotas (gotas) que abarquen, al extenderse sobre la plaza zonas de 2 a 3 mm de diámetro. La distancia entre los sitios de sembrado debe ser de por lo menos 1cm. Sobre una misma placa pueden cromatografiarse varias muestras, colocando los puntos de siembra sobre una línea recta, paralela al borde inferior de la placa. Desarrollo de cromatograma: se llama desarrollo del cromatograma al pasaje de un solvente a través de la fase estacionaria depositada sobre una placa de vidrio o en papel en el caso de la cromatografía de papel. Para desarrollar el cromatograma de la placa ya sembrada, la misma se introduce en una cámara de vidrio con tapa, que contiene una cierta cantidad del solvente elegido, de modo que su nivel esté en contacto con la capa adsorbente y pueda ascender por capilaridad, pero cuidando que la superficie del solvente quede debajo de la superficie de siembra. Antes de introducir la placa, la cámara debe estar saturada con los vapores del eluyente. Cuando el solvente de desarrollo alcanza una línea superior marcada previamente, se retira la placa de la cámara y se deja evaporar el solvente. Una vez que la placa se ha secado, se revela. Revelado del cromatograma: el revelado del cromatograma se puede efectuar pulverizando la placa con reactivos generales o específicos que permiten ubicar la sustancia mediante reacción de coloración. Aplicaciones Es muy empleada para determinar pureza, identificar compuestos, seguir el curso de una reacción. Una ventaja importante de esta técnica es que permite analizar diversas muestras y estándares en forma simultánea. Puede empelarse para establecer las condicione óptimas se separación en cromatografía en columna, debido a que es muy rápida y de bajo costo. Para muestras difíciles de resolver se puede trabajar en sentido perpendicular: haciendo un desarrollo bidimensional.



10.2- Cromatografía de papel La cromatografía de papel es un método de reparto o partición que utiliza como soporte de a fase estacionaria la celulosa se una hoja de papel de filtro especial (Whatman o Schleicher & Schull). La técnica de siembra de la muestra sobre papel, así como la cantidad de sustancia a cromtografiar es análoga a la indicada para la cromatografía en capa delgada. Desarrollo del cromatograma: una vez sembrada la muestra, la hoja de papel se coloca dentro de la cámara que está saturada con los vapores de la mezcla de solventes que se van a emplear para el desarrollo del cromatograma. Se deja en esas condiciones durante un período variable que se llama periodo de equilibrado, durante el cual el papel se satura sin entrar directamente en contacto con el solvente. Luego se sumerge el borde inferior del papel en el solvente contenido en el fondo de la cuba (cromatografía ascendente) o se agrega el solvente en una cubeta de la cual se cuelga el papel sostenido por la parte superior, la que queda sumergida en el solvente agregado (cromatografía descendente). El reparto o partición se lleva a cabo entre el agua (fase estacionaria) retenida por la celulosa del papel y el solvente empleado en el desarrollo del cromatograma (fase móvil) no miscible con el agua. Es decir que a medida que el solvente se desplaza sobre el papel, se verifica una distribución del soluto a cromatografiar entre el solvente orgánico y el agua retenida, lográndose así una separación de los componentes de una mezcla según sus respectivos coeficientes de reparto. Como consecuencia de esto, los componentes es moverán con distintas velocidades. Cuando el frente del solvente llega a una adecuada distancia del borde superior (en el caso de cromatografía ascendente), se retira el papel, se seca y se revela. Revelado del cromatograma: el revelado puede ser por pulverización o por inmersión del papel con reactivos que convengan a cada tipo de sustancia, apareciendo en este proceso los componentes de la muestra sembrada a diferentes alturas y en forma de manchas circulares. Se llama relación de frente Rf a la relación entre la distancia recorrido por la muestra y la distancia recorrido por el solvente

solventeelporrecorridadistanciamuestralaporrecorridadistancia

==fR

La relación de frentes Rf se calcula para cada componente midiendo las distancias desde el centro de la mancha y desde la línea del frente del solvente hasta el punto donde se sembró la muestra. El Rf depende de la sustancia y del sistema de solventes utilizado en la cromatografía. No obstante, dos sustancias pueden tener el mismo Rf en un sistema de solventes dado. Teóricamente, es posible encontrar un sistema de solventes que permita separar dos sustancias que corran igual en otros sistemas. Entonces, el hecho de encontrar dos manchas que posean el mismo Rf no nos permite afirmar que se trate de la misma sustancia. Sin embargo, cuando sus Rf son diferentes, podemos afirmar que no son la misma sustancia. Además del Rf debe tenerse en cuanta la forma de la mancha y el color producido por el revelador y siempre que sea posible comprar con un testigo.



Los Rf son siempre menores que la unidad, un Rf muy cercano a cero nos está indicando que la muestra es muy retenida por la fase estacionaria y por el contrario un Rf muy cercano a uno se corresponde con una muestra no retenida por la fase estacionaria. El Rf depende de la temperatura, de la composición del solvente usado para el desarrollo del cromatograma, del tipo de papel, de la técnica empleada (ascendente o descendente). Actualmente se prefiere utilizar como referencia alguna sustancia de estructura similar a la que se desea correr, en lugar de frente del solvente. La sustancia usada como referencia se corre en el mismo papel que la sustancia estudiada. Así, cuando se cromatografían hidratos de carbono se suele usar glucosa como patrón estándar y se mide el Rg.

glucosa laporrecorridadistanciamuestralaporrecorridadistancia

==gR

La cromatografía en papel no sólo permite hacer un análisis cualitativo de mezclas, sino también puede ser cuantitativo, en este caso, la aplicación de muestra en el origen se hace con pipetas calibradas, con las que pueden medirse hasta 0,2 μl. Después del revelado se dosan colorimétricamente las sustancias separadas. La cromatografía de papel puede ser: Unidimensional: descripta previamente Bidimensional: una vez corrida la muestra en una dirección, el papel se gira 90° y se corre en esta nueva dirección. Este tipo de cromatografía puede es útil para separa muestras muy complejas, como por ejemplo hidrolizados de proteínas.



ACTIVIDADES DE LABORATORIO 1- Separación de Fe+3, Ni+2, Cu2 por cromatografía de reparto en papel La muestra se siembra con la misma técnica empleada en cromatografía en capa delgada Se usa como disolvente una mezcla de: 17 ml de propanona más 1 ml de agua y 2 ml de HCl (concentrado). Una vez desarrollado el cromatograma, se rocía el papel seco con una solución alcohólica de dimetilglioxima, exponiendo luego el papel a los vapores de NH3 La aparición de una mancha de color rojo de Ni-dimetilglioxima indica la presencia de Ni+2. Luego se corta con tijera la zona de la mancha roja y se rocía el resto del papel con solución acuosa de ferrocianuro de potasio. La aparición de una mancha azul y de una mancha de color marrón revelan la presencia de Fe+3 (mancha azul de ferrocianuro férrico) y de Cu+2 (mancha marrón ferrocianuro cúprico) respectivamente 2- Separaciones de Ca+2 y Mg+2 en agua dura por cromatografía de

intercambio iónico Se utiliza una columna cargada con una resina catiónica fuerte que retiene el Ca+2 y el Mg+2 cuando se eluye una muestra de agua a través de la misma. La retención en la columna se confirma porque en el agua que se recoge después de tratamiento no se detecta presencia de ambos cationes. Técnica: a) Se toman 10 ml de una muestra de agua sin tratar, se agregan 5 ml buffer pH 10

(mezcla de NH4Cl y NH4OH)) y se agrega una pizca de indicador negro de eriocromo. La coloración rojo vinoso indica la presencia de Ca+2 y Mg+2.

b) Se toma otra otra alícuota de muestra, se hace pasar lentamente por la resina intercambiadora y se recoge en un vaso de precipitado. Se agregan 5 ml de buffer pH 10 y una pizca de negro de eriocromo. La aparición de una coloración azul indica la ausencia de los cationes Ca+2 y Mg+2, que fueron entonces retenidos por la columna.



Problemas 1. Asocie los términos de la primera lista con las características de la segunda:

a) Cromatografía de adsorción b) Cromatografía de reparto c) Cromatografía de intercambio iónico d) Cromatografía de exclusión molecular e) Croamtografía de afinidad A. Los iones de la fase móvil son atraídos por los contraiones unidos

covalentemente a la fase estacionaria B. El soluto en la fase móvil es atraído hacia grupos específicos unidos

covalentemente a la fase estacionaria C. El soluto se equilibra entre la fase móvil y la fase estacionaria D. El soluto se equilibra entre la fase móvil y la película de líquido que recubre

la fase estacionaria E. Solutos de diferente tamaño penetran en los espacios disponibles de la fase

estacionaria en grado variable. Los solutos más grandes eluyen primero 2. Para una sustancia se obtuvo un cromatograma cuyo tiempo de retención y ancho d

ebanda medido sobre la banda gausiana fueron 9,0 min y 4.0 min respectivamnete. ¿Calcular cuantos platos teóricos tiene la columna para dicha sustancia y si la longitud de la columna es de 10 cm¿cuál es la HEPT?

3. Los cromatogramas de los compuestos A y B que se muestran en la figura se

obtuvieron empleando dos columnas de la misma longitud y con el mismo caudal

a) ¿Cuál de las dos columnas tiene mayor número de platos teóricos? b) ¿Qué columna tiene mayor altura de plato teórico? c) ¿Qué columna tiene mayor resolución?

4. Los siguientes datos corresponden a una columna cuya longitud de relleno es de 24,7

cm y se empleó en un cromatógrafo para líquidos: El cromatograma de una mezcla de especies A, B, C y D proporcionó los siguientes datos:



Tiempo de retención en min Ancho de la base en min

No retinada 3,1 - A 5,4 0,41 B 13,3 1,07 C 14,1 1,16 D 21,6 1,72

Calcular: el tiempo de retención neto, el número de platos teóricos, la altura equivalente de plato teórico, y la resolución. A partir de los resultados obtenidos para la resolución indique si los componentes han sido separados satisfactoriamente.

Cuestionario 1. ¿Qué entiende por cromatografía? 2. ¿Cómo puede clasificar los procesos cromatográficos según los fenómenos

predominantes? 3. ¿A qué se denomina fase móvil? 4. ¿A qué se denomina fase fija? 5. ¿Cómo clasifica las técnicas cromatográficas según el estado de agregación de la

fase móvil? 6. ¿Qué tipos de cromatografía gaseosa existen? ¿Cuál es la más difundida? 7. ¿Cuáles son las partes constitutivas de un cromatógrafo gas- líquido? ¿Qué función

cumple cada uno de ellas? 8. ¿Qué tipo de columnas pueden utilizarse en la cromatografía gas-líquido? Detallar

ventajas y desventajas de cada una de ellas? 9. ¿Qué teoría intenta explicar los fenómenos intervinientes en la cromatografía? ¿A

qué se denomina altura equivalente de plato teórico? ¿Cómo puede modificar su altura y su cantidad?

10. ¿Qué trata de explicar la ecuación de van Deemter? ¿Cómo se representa gráficamente?

11. ¿Qué representan el volumen y el tiempo de retención? 12. ¿Qué tipos de detectores se pueden utilizar en la cromatografía gas-líquida? ¿Cuál es

el uso más importante de cada uno de ellos? 13. ¿Cuáles son las distintas cromatografías en fase líquida? 14. ¿A qué se llama cromatografía líquida de alta resolución CLAR o HPLC? ¿Para qué

puede utilizarla? 15. ¿Qué tipo de detectores pueden emplearse en la cromatografía líquida? 16. ¿Qué tipo de cromatografía puede utilizar para ablandar un agua? ¿Qué tipo de

sustancia utiliza como soporte? 17. Una vez agotadas las resinas de intercambio, ¿cómo puede regenerarlas? 18. Mencione las distintas cromatografía planas o en lecho abierto que conoce. 19. ¿En la cromatografía en placa fina que se emplea como fase estacionaria? Mencione

las más utilizadas. 20. Explique los procesos de sembrado, desarrollo y revelado del cromatograma en la

cromatografía de capa fina. 21. ¿En la cromatografía de papel, cuál es fenómeno que permite la separación?



22. En la cromatografía de papel ¿cuál es la fase estacionaria, cuál es el soporte que se emplea?

23. Explique los procesos de sembrado, desarrollo y revelado del cromatograma en la cromatografía de papel.

24. ¿Qué es el Rf? ¿Para qué se utiliza? ¿Qué valores puede tomar? ¿Qué significan? 25. Describa brevemente la cromatografía de papel unidimensional y bidimensional.



OTROS MÉTODOS DE SEPARACIÓN: ELECTROFORESIS 1. Introducción La electroforesis es un proceso en el cual las especies cargadas (iones o partículas coloidales) se separan en función de su distinta velocidad de migración en un campo eléctrico. Esta técnica fue empleada por primera vez por en el año 1937, pero su importancia se incrementó cuando en los años cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K. Tiselius, impulsaron la electroforesis para separar materiales en un campo eléctrico en presencia de algún tipo de soporte; aunque este término se limitó originalmente al análisis de coloides y partículas submicroscópicas, se ha convertido en estos últimos años en una metodología muy empleada con la finalidad de separar moléculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa.

2. Fundamento Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta es colocada en un campo eléctrico, éstas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta. Dejando transcurrir un cierto tiempo, las moléculas cargadas positivamente se desplazarán hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazarán hacia el ánodo (el polo positivo). El movimiento de las moléculas está

gobernado también por dos fuerzas adicionales: - inicialmente la fricción con el solvente dificultará este movimiento originando una fuerza que se opone, -por otro lado, las moléculas tienen que moverse en forma aleatoria (o

movimiento browniano) debido a que poseen energía cinética propia denominada difusión. La energía cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusión. La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una manera homogénea, de tal manera que, si las moléculas son colocadas en un cierto lugar de una matriz, los iones comenzarán a moverse formando un frente cuya anchura aumentará con el tiempo. Para reducir el ancho de este frente podemos reducir el movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga más resistencia a dicho movimiento. Una forma común de hacer esto es emplear un gel. El gel consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos, consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas será más lenta, pero el ensanchamiento del frente se verá reducido también.



3. Factores en que se basan los distintos tipos de electroseparciones Hay seis reglas fenomenológicas que describen los factores en que se basan los distintos tipos de electroseparaciones: o Los iones negativos tiendan a migrar hacia

el voltaje más alto (positivo). Los positivos tiendan a migrar hacia el voltaje más bajo (negativo)

Recordemos que un cuerpo cargado que se coloca en un campo eléctrico, experimenta sobre él una fuerza proporcional a la carga de la partícula que se desplaza y al voltaje aplicado a él. En las electroseparciones será:

o La velocidad promedio de migración de una especie de analito es proporcional a la carga promedio del ion. o La velocidad promedio de migración de una especie de analito es proporcional al voltaje que se aplica

La relación cuantitativa entre la velocidad del ion y el campo eléctrico (campo eléctrico = voltaje / distancia) se obtiene mediante un factor de proporcionalidad llamado movilidad iónica. La movilidad iónica en la solución se representa como µ y

LVvion /×= µ Donde V es el voltaje aplicado, v es la velocidad y L es la distancia en la cual se aplica el voltaje. El sentido del movimiento depende de la polaridad del voltaje. o La velocidad de desplazamiento promedio de un ion es inversamente proporcional a

su sección transversal promedio La sección transversal es el área del ion perpendicular al sentido de desplazamiento. Esto significa que, por ejemplo, un ion divalente de gran tamaño se desplazará con más lentitud que un ion divalente más pequeño. Mediante esta cuarta regla fenomenológica es posible comprender el fundamento de la mayor parte de los métodos que se clasifican como electroforesis (en griego foresis, significa que es transportado). La electroforesis separa sus los iones



según sus diferentes relaciones de carga con respecto al tamaño. o La calidad de las electroseparaciones en líquidos mejora a medida que se suprime

la convección. La convección de un líquido puede suprimirse de dos maneras:

- Llevando a cabo la electroseparación en una red polimérica, donde las cadenas moleculares de la red detienen la convección macroscópica porque el líquido queda retenido entre ellas y

- Llevando a cabo la separación dentro de un capilar pequeño, donde la pared interna del capilar ejerce el mismo efecto benéfico que las moléculas de polímero y, además, el tamaño reducido del capilar reduce al mínimo las diferencias de temperaturas que puedan surgir.

o La calidad de la electroseparación mejora cuando se mantiene constante la temperatura en el curso del experimento

El calentamiento del líquido en el curso de las electroseparciones puede evitarse, ya que la corriente eléctrica que atraviesa la solución la calienta en una cantidad igual a la potencia (P = V × I =I2 × R) donde V es el voltaje, I es la corriente en la solución iónica y R es la resistencia de la solución. Además de los problemas ocasionados por la convección, es necesario disipar el calor generado para mantener la temperatura constante en todo el proceso, por tres razones adicionales:

- la constante de equilibrio de cada grupo iónico y de los iones amortiguadores varía con la temperatura, de modo que es preciso mantenerla constante durante todo el proceso para que las bandas conserven su homogeneidad y el pH permanezca invariable.

- Las estructuras macromoleculares en general dependen de la temperatura, de modo que al mantenerla constante también se conserva su tamaño promedio (y con ello su velocidad migratoria)

- La viscosidad del disolvente disminuye al aumentar la temperatura. Una viscosidad menor permite un incremento en la velocidad de migración de todos los iones produciendo un ensanchamiento de las bandas.

4. Negativo positivo o neutro La primera información que se requiere antes de llevar a cabo una separación electroforética es estimar las cargas de los diversos analitos en las condiciones experimentales propuestas. Cuando una molécula tiene grupos positivos y negativos a la vez se llama ion doble o zwitterion (del alemán Zwitter que significa híbrido o hermafrodita). Algunos ejemplos sencillos son los aminoácidos y entre ellos la glicina es el zwitterion más sencillo: +H3N-CH2-COO-.



La glicina no es un zwitterion a pH alto, pues permanece en su forma aniónica H2N-CH2-COO-, ni tampoco a pH bajo, ya que permanece en su forma catiónica +H3N-CH2-COOH. A un pH intermedio la carga promedio de la glicina es cero, lo que se conoce como punto isoeléctrico.

La situación se complica un poco cuando los analitos tienen diversos grupos con carga positiva y negativa, característico de los proteínas. Al igual que la glicina, las proteínas tienen un punto isoeléctrico en donde el número de grupos con carga negativa (por ejemplo -COO-) es igual al número de grupos con carga positiva (-NH+

3). El punto isoeléctrico permite efectuar una clasificación de utilidad para las electroseparaciones. A valores de pH inferiores al punto isoeléctrico, la proteína tiene carga positiva neta por los protones perdidos. De manera similar, a valores de pH por encima del punto isoeléctrico la proteína presenta carga negativa neta. Evidentemente, cuando se modifica el pH de la solución amortiguadora de un lado del punto isoeléctrico al otro al efectuar las electroseparciones, el sentido de migración de las moléculas se invierte. En teoría, en el punto isoeléctrico la proteína, no experimenta migración. Esto ocurre en realidad, aunque no se debe sólo a la ausencia de carga, sino a que las proteínas tienden a precipitar en su punto isoeléctrico. Nos e desplazan por el campo porque forman masas de precipitado en algún sitio de la solución amortiguadora. 5. MÉTODOS DE OPERACIÓN 5.1. Separaciones electroforéticas en una matriz de gel Los métodos clásicos de electroforesis se llevan a cabo mediante separación en un gel polimérico. Las redes poliméricas no sólo impiden la convección, sino que actúan como tamices que retrasan e inclusive bloquean la migración de los analitos de gran tamaño. Sin embargo, los iones pequeños pueden moverse con libertad por la estructura porosa del gel. Por lo tanto, en la electroforesis en gel la separación ocurre por dos mecanismos más además de la carga:

o separación debido a la relación carga con respecto a la masa o separación debido al tamaño



La electroforesis en gel se emplea por sí sola para analizar presencia o ausencia de moléculas con relaciones específicas de carga con respecto al tamaño. Sin embargo, al emplearla con métodos especiales de detección se puede realizar una identificación de macromoléculas específicas. En este caso, las macromoléculas incluyen fragmentos de DNA y RNA que se separan en los métodos de secuencia de genes, además de proteínas y polipéptidos.

5.2 Los geles En la gran mayoría de los métodos de electroforesis se emplean dos tipos de geles: o La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar,

pero de composición homogénea), cuyas disoluciones (típicamente de 0.5 a 2 % p/v) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados °C y formar un gel, semisólido al enfriarse. Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas, se usa usualmente para separar moléculas grandes de alrededor 20.000 nucleótidos. Estos geles son frágiles.

o Los geles de poliacrilamida son más resistentes que los de agarosa. Se obtienen por copolimerización de la acrilamida (CH2═CH—COONH2) y la N-N-metilenbisacrilamida. Esta reacción es catalizada por el persulfato de amonio (PSA) y el acelerador tetrametilendiamida (TEMAD) Es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rápida y reproducible. Forma, además, geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten buena visualización de las bandas durante un tiempo prolongado. Además tiene la ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de



manera controlada en el tamaño del poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxocidad de la acrilamida

Ambos geles pueden moldearse fácilmente en forma de tubos, tabiques o capilares. Ambos están libres de cargas iónicas. Esto es importante para evitar que la solución amortiguadora sea expulsada del gel al encender el campo eléctrico.

5.3 Algunos modos de operación

Los métodos electroforéticos en gel son los más comunes, dada su alta aplicabilidad en diferentes campos. Son útiles para lograr la separación de mezclas complejas. Se aplican pequeñas cantidades de la disolución de proteínas a un soporte sólido poroso, (gel) que se impregna con una solución tampón. Este método tiene gran poder resolutivo por que se aplica una cantidad pequeña de proteína a una zona estrecha, mientras que la longitud del trayecto es mucho

mayor que la zona de aplicación. El equipamiento requerido es simple, fuente de poder, cubeta vertical u horizontal donde se colocan el soporte y dos electrodos. Los más utilizados son: 5.3.1 Electroforesis en condiciones desnaturalizantes Cuando las moléculas biológicas se desnaturalizan quedan biológicamente inactivas. En los biopolímeros desnaturalizados, los monómeros están enlazados covalentemente en el orden original, pero el polímero deja de estar plegado en su forma activa. Recordemos que el orden en que el monómero forma enlaces covalentes, se llama estructura primaria. La formación de hélices y placas es la estructura secundaria y el plegamiento de estas partes para dar la estructura funcional constituye la estructura terciaria. La estructura cuaternaria es la asociación de proteínas específicas, individuales para formar conjuntos mayores de tipo diferenciado. Si se efectúa la electroforesis en gel de la forma desnaturalizada, esto indica que se mantiene intactas las estructuras primarias de los analitos. Se sabe que los detergentes como el dodecil sulfonato de sodio (SDS) ayudan a romper las estructuras formadas por los enlaces covalentes, como por ejemplo las hélices y las estructuras de placas de las proteínas. En estas condiciones las proteínas migran una distancia que depende de su peso molecular y del tamaño promedio de los poros del gel; conforme la proteína es más grande, la migración es más lenta, de manera que este modo de trabajo se asemeja a la cromatografía de permeación por geles o exclusión molecular. El SDS se enlaza con las proteínas desnaturalizadas contrarrestando las cargas de los aminoácidos proteicos y la separación tiene lugar por tamaño. Ventajas:

o Separación rápida de proteínas o La separación no depende de la forma de la proteína nativa o Se puede estimar el peso molecular de las proteínas

5.3.2 Electroforesis en condiciones no-desnaturalizantes A veces, por la naturaleza del problema a resolver es necesario no destruir las proteínas durante la separación. Por lo tanto, ésta se debe realizar en condiciones no



desnaturalizantes. En este método de operación se conservan las siguientes características de la muestra, es decir: interacciones entre las subunidades, la conformación de la proteína nativa la actividad biológica de la muestra.

La separación se basa en la diferente carga y tamaño. Las ventajas son: o separa proteínas en estado nativo: las proteínas siguen siendo funcionales o permite separar complejos proteicos: proteínas multiméricas como una unidad

Sin embargo, tiene algunos inconvenientes: o muchas proteínas no migran por no tener carga neta o poseer carga neta positiva o el proceso de separación es muy lento debido a la debilidad de la carga neta de

las proteínas o el proceso de separación no sólo está afectado por el tamaño sino también por la

forma de la proteína 5.3.3. Detección de proteínas en geles Una vez finalizada la electroforesis, se desarma la celda, se separan las placas de vidrio. El gel probablemente quede adherido a una de las placas. La placa que contiene el gel se coloca en una solución fijadora o de tinción y se separa el gel de la placa. Existen diferentes técnicas par la detección de proteínas en geles:

1. Inmunodetección 2. Detección por fluorescencia 3. Tinción con Coomassie blue 4. Tinción de plata 5. Tinción de cobre 6. Radiomarcado

5.4 Isoelectroenfoque.

Esta técnica, habitualmente denominada electroenfoque se basa en el desplazamiento de las moléculas en un gradiente de pH. Las moléculas anfotéricas, como los aminoácidos, se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH. La región del ánodo es ácida y la del cátodo es alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las moléculas que se han de separar tenga su punto isoeléctrico dentro del rango. Las sustancias que

inicialmente se encuentran en regiones de pH inferior a su punto isoeléctrico estarán



cargadas positivamente y migraran hacia el cátodo, mientras aquellas que se encuentran en medios con pH más bajos que su punto isoeléctrico tendrán carga negativa y migraran hacia el ánodo. La migración les conducirá a una región dónde el pH coincidirá con su punto isoléctrico, tendrán una carga neta nula y se detendrán De esta forma las moléculas amfotéricas se sitúan en estrechas bandas donde coincide su punto isoeléctrico con el pH. 5.5 Electroforesis capilar. La velocidad de separación y la resolución mejora si se aumenta el campo eléctrico. Pero esto aumenta la temperatura, y se arruina la calidad de la separación. Para resolver el problema se usan tubos capilares de 0,1 cm de diámetro interno. El uso del capilar es eficaz porque la resistencia eléctrica de la solución es tan alta que la corriente permanece en niveles bajos (10 µA). La electroforesis capilar se basa en los mismos principios que las técnicas electroforéticas convencionales, pero utiliza condiciones y tecnología distinta que nos permiten obtener una serie de ventajas al respecto. El problema es que el tamaño de la muestra es de nL. Por lo tanto hay pocos métodos de detección. Podemos detectar

• proteínas • péptidos • aminoácidos • ácidos nucleicos • iones inorgánicos

• iones orgánicos • bases orgánicas • ácidos orgánicos • células enteras

5.5.1 Ventajas de la electroforesis capilar Alta eficiencia de separación o Poca cantidad de muestra (1 a 10 µl) o Separación rápida (aproximadamente 45 min)



o Automatización o Cuantificación (lineal) o Reproducible o Acoplable a muchos detectores 5.5.2 Detectores Los detectores se ubican entre los electrodos, por lo que los analitos son detectados conforme atraviesan el detector, por lo cual los electroferogramas tienen la misma apariencia que los cromatogramas. Muchos detectores utilizados en electroforesis capilar son similares a los empleados en cromatografía líquida de alta resolución, pero con dispositivos diseñados par capilares mucho menores. Cuestionario 1. ¿Por qué se produce la separación de componentes de una mezcla mediante un

proceso electroforético? 2. ¿Cuáles son los principios fenomenológicos de la electroforesis? 3. ¿Qué tipo de geles conoce? 4. ¿Cómo se realiza el proceso de detección en la electroforesis en gel? 5. ¿Qué técnica electroforética utilizaría para determinar el peso molecular de una

proteína desconocida? 6. ¿En qué consiste la electroforesis capilar? 7. ¿Cuáles son las ventajas de la electroforesis capilar respecto de otros métodos

electroforéticos? 8. ¿Qué es el isoelectroenfoque? ¿Cuál es el principio de esta técnica? BIBLIOGRAFIA 1. Rubinson, J.; Rubinson,K.: Química Analítica Contemporánea, Prentice-Hall Hispanoamericana 2000 2. Harris, D.C. “Analisis Químico cuantitativo”, Iberoamericana, 1992 3. Skoog, D.A., West, D.M. y Holler, F.J., “Química Analítica”, McGraw-Hill, Méjico, 1995 4. Skoog, D.A., West, D.M. y Holler, F.J., “Fundamentos de Química Analítica”, Reverté, 1996.

INTRODUCCIÓN A LAS SEPARCIONES ANALÍTICAS · 2017. 8. 23. · Los métodos cromatográficos se...

Documents

Transcript of INTRODUCCIÓN A LAS SEPARCIONES ANALÍTICAS · 2017. 8. 23. · Los métodos cromatográficos se...