Manual de Practicas de Bioquimica 1 y 2

QUÍMICA ORGÁNICA III

Los cursos de Química Orgánica incluyen ejercicios de laboratorio, con el propósito de reforzar el contenido de las lecciones teóricas y de desarrollar habilidades manuales éticas para el trabajo profesional subsecuente de los estudiantes de la carrera de Ingeniería Bioquímica.

En la Materia de Química Orgánica III, se proporciona a los alumnos la oportunidad de practicar el método científico, lo cual es indispensable en el ejercicio de cualquier profesión relacionada con las ciencias biológicas. Este Manual de prácticas de Laboratorio, pretende ser el complemento que permita afianzar los conocimientos teóricos impartidos en el aula.

PRACTICA No.1

CROMATOGRAFÍA DE AMINOÁCIDOS

INTRODUCCIÓN

Uno de los primeros recursos durante el desarrollo de las Técnicas cromatografías fue el uso de una hija de papel filtró (celulosa) como base estacioaria inerte para sostener un liquido; por esto la técnica se denomina cromatografía en papel. El papel se humedece por absorción de vapor de agua; así, la fase estacionaria es un líquido polar sostenido en papel. Luego se permite que otro disolvente (rico en otra sustancia mas polar, por ejemplo n-butanol/11,0; 8/I en volumen) migre hacia arriba o hacia abajo en el papel por acción capilar Cuando este disolvente de revelado llega al punto del papel (origen) en el cual se puso una porción de la muestra, cada sustancia de ésta se disuelve en distinta medida entre la fase apolar migratoria (sobre todo en el n-butanol) y la [use polar estacionaria (por Io general agua). Este fraccionamiento basado en la solubilidad prosigue mientras el disolvente siga moviéndose a lo largo del papel. Las sustancias más solubles en agua se mueven con mayor lentitud que las más solubles en la fase orgánica móvil. El grado de migración de una sustancia se expresa como el valor Rf el cual se define como sigue:

Rf= distancia recorrida por la sustancia

distanciatotal recorrida por el disolvente de revelado

Ambas distancias se miden a partir del origen (puma de aplicación de la muestra). Si las muestras contienen muchas sustancias, es posible aumentar las zonas de resolución dejando secar el papel y luciendo migrar después un segundo disolvente en dirección perpendicular a la de] primero. Este metodo se conoce como analisis dimensional.

OBJETIVO

Identificar el (los) aminoácido (s) presentes (s) en una muestra desconocida, utilizando la técnica de cromatografía en papel y soluciones de aminoácidos como estándar.

MATERIAL MATERIAL REACTIVOS

Vaso de p.p. de 400 ml Tijeras Soln. De ninhidrina

Plástico autoadherente Regla Soln. problema

Papel Whatman N0. 1 Lápiz n-butanol/ac. acético/H20

Guantes desechables Cordel (5:1:2 v/v)

5 Pipetas Pasteur Estufa Soluciones de aminoácidos

Recipiente rectangular 2 Pinzas para ropa

Diferentes de plástico

Engrapadora

METODOLOGIA

1. Colocar en un vaso de precipitados de 400 ml, 20 ml de un mezcla de n-butanol/ac. Acético/Agua (5:1:2 v/v).

2. Cubrir el vaso con envoltura plástica autoadherente. Esto permitirá que la atmosfera de la "cámara cromatografía" se sature con los solventes (un tiempo adecuado es de 20 a 30 minutos).

3. Recortar un rectángulo de papel Whatman No. 1 de 10 x 15 cm. Para tocar el papel utilizar guantes desechables.

4. Con un lápiz, hacer una linea que una los lados de 10 cm. del rectangulo, dicha línea debe estar a una distancia de 2 cm. de uno de los lados de 15 cm. (esta linea se denomina origen 0 punto de aplicación).

5. Colocar una gota de las soluciones de cada uno de los aminoácidos disponibles y una gola de la solución de la muestra desconocida, sobre la linea de aplicación (las aplicaciones deben sur los mas espaciadas posible, para evitar traslapes durante el corrimiento). Utilizar diferentes pripetas Pasteur pan aplicar y seguir usando los guantes.

6. Utilizar un orden de aplicación que permita: saber la posición de la muestra desconocida y de los aminoácidos que se estén empleando como estándar.

7. Con mucho cuidado engrapar los extremos del rectángulo, pan formar un cilindro que tenga una altura de 15 cm.

8. Colocar el cilindro dentro de la "cámara cromatografíca" apoyándolo sobre la base cercana a la linea de aplicación (el nivel de la mezcla de solventes debe estar por debajo de la línea de aplicación). Tapar nuevamente la camara con el plástico autodherente.

9. Cuando el solvente revelador alcance una altura aproximada de 14 cm. sobre el papel ( 45 a 60 minutos), retirar el papel de la cámara.

10. Colgar el papel en un cordel utilizando unas pinzas para ropa y esperar a que se seque.

11. Sumergir el cromatograma ya seco, en un recipiente de plástico que contenga la solución de ninhidrina o rociarlo con un recipiente tipo “spray” que contenga la solución.

12. Colocar nuevamente el cromatograma.

13. Cuando ya casi este seco el cromatograma, se coloca en una estufa a 100 °C durante 5 minutos.

14. Calcular el valor del Rf, para cada uno de los aminoácidos utilizados e identificar la muestra desconocida.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué significa la palabra cromatografía?

2. ¿En qué consiste la cromatografía?

3. ¿Cuales son los distimos tipos de cromatografía?

4. Realizar un dibujo de la "cámara cromatografica” utilizada y del cromatograma, señalando cada uno de sus componentes (dimensiones, linea de aplicacion, estandares, muestra desconocida, altura del solvente revelador, grapas, plastico autoadherente, etc...)

5. Escribir en forma general la reaccion que ocurre entre un aminoacido y la ninhidrina.

6. ¿Por qué razon el aminoacido prolina no puede ser revelado con ninhidrina?

7. ¿Porqué razon el papel utilizado en la cromatografia de aminoacidos, no debe ser manipulado con las manos desnudas.

8. Hacer una tabla indicando el nombre del aminolcido y su valor de R f

obtenido.

9. De acuerdo a los resultados de la tabla anterior ¿Qué aminoacido o aminoacidos estaban presentes en la muestra problema?

PRACTICA No.2

ELECTROFORESIS EN GEL

INTRODUCCIÓN

La electroforesis en gel es una técnica en la cual los componentes de una mezcla se separan en base a sus diferencias de carga y a su distinta atraccion por el gel. La electroforesis se utiliza tradicionalmente para separar moléculas que son muy grandes para ser separadas por tecnicas rapidas, tales como la cromatografia de liquidos o de gases. El metodo de electroforesis se utiliza para separar, identificar y purificar fragmentos de DNA y RNA. La anemia celular falciforme se diagnostica haciendo una electroforesis de la hemoglobina. Al pH utilizado, la hemoglobina normal y la hemoglobina de la anemia celular falciforme son atraidas por diferentes electrodos. Por medio de la electroforesis es posible diferenciar proteinas de origen animal distinto (res, caballc, perro, etc…), ya que presentan patrones electroforéticos distitos.

Durante la electroforesis, iones con la misma carga pueden ser separados debido a que interantuan de manera diferente con el gel. Estas interacciones pueden ser de tipo ion-ion, puente de hidrégeno o dispersiones de London. Las soluciones amortiguadoras se seleccionan para optimizar las separaciones, ya que pueden cambiar la carga de las especies en solución.

OBJETIVO

Separar una mezcla de colorantes utilizados en la industria alimenticia, por medio de la técnica de electroforesis en gel.


5 Pilas de 9 V Agitador Vinagre blanco

2 m de cable Tijeras NH4OH/H20 (2:1 v/V)

Cinta de aislar Pinzas para bureta Gelatina sin sabor

Cinta masking tape Soporte universal Hielo

Vaso de p.p. de 400 ml. Caja Petri Color rojo p/alimentos

Vaso de p.p. de 150 ml Pipetass de transferencia Color azul p/alimentos

de plastico

METODOLOGIA

1 FUENTE DE PODER

1.1 Conectar las cinco pilas de 9 V en serie para generar 45 V. Soldar o conectar por medio de cable, el polo color negro (-) de una pila con el polo color rojo (+) de Ia pila adyacente. Continuar de esta manera hasta que las cinco pilas queden conectadas en serie, es decir con un cable no conectado que salga del polo negro (-) y otro no conectado que salga del polo rojo (+).

1.2 Aislar todos los cables expuestos para evitar un corto circuito.

1.3 No conectar el ultimo cable del polo negro con el primero de polo rojo.

1.4 Unir las cinco pilas utilizando ciunta masking tape, para mantenerlas juntas.

2 SOLUCION AMORTIGUADORA

2.1 Mezclar en un vaso de precipitado de 400 ml, 1ml de vinagre con 2 ml de amoniaco diluido.

2.2 Diluir esta mezcla con 300 ml de agua de la llave.

3 PREPARACION DEL GEL

3.1 Adicionar una cucharadita de gelatina a un vaso de precipitado de 150 ml que contenga 50 ml de la solución amortiguadora.

3.2 Dejar en reposo la mezcla por 5 minulos, para permitir que la gelatina se hinche.

3.3 Calentar la mezcla casi a ebullicion (¡precaucion! la mezcla puede salir del recipiente).

3.4 Retirar el vaso y agitar la mezcla ocasionalmente hasta que toda la gelatina se disuelva. Enfriar por 5 minutos.

3.5 Cortar la parte superior de una pipeta de transferencia de plastico de talle largo y recto.

3.6 Adicionar la gelatina dentro del bulbo hasta Ia mitad del mismo.

3.7 Mover la pipeta para permitir que la gelatina fluya hacia el talle.

3.8 Permitir que la gelatina siga fluyendo hasta que todas las burbujas de aire sean desplazadas del talle.

3.9 lnterrumpir el flujo doblando la punta de la pipeta hacia arriba.

3.10 Colocar un cubito de hielo cerca de la punta de la pipeta para enfriar la gelatina.

3.11 Cuando el talle tenga un aspecto firme, bajar lentamente la punta de la pipeta para determinar si la gelalina aun fluye (continuar enfriando si fluye).

3.12 Cuando la gelalina deja de fluir, se endereza la punta de la pipeta y se enfria el resto del talle. Algo de gelatina debe permanecer en el bulbo, para mantener el gel en su lugar durante la electroforesis.

4 MONTAJE DEL GEL

4.1 Sujetar la pipeta con unas pinzas para bureta sobre un soporle universal (no apretar demasiado, ya que el gel se puede deformar).

4.2 Permitir que el gel se endurezca a temperatura ambiente (esta mezcla es mas concentrada que la preparada en forma casera y que requiere refrigeracién).

4.3 Limpiar Ia gelatina y el agua que hayan sido derramados durante la preparacion del gel.

4.4 Checar la punta de la pipeta, y si la gelaiina no lleno completamente la parte inferior, corte la punta con unas tijeras.

5 CARGA DE LA MEZCLA COLORIDA

5.1 Mezclar una gota de colorante rojo y una gota de colorante azul, sobre una superficie plana.

5.2 Sumergir la punta de la pipeta dentro de la mezcla colorida durante 1 minuto.

5.3 Retirar la pipeta y sin tocar el gel, se limpia el exceso de colorante del exterior con papel absorbente.

5.4 Permitir que la mezcla colorida se difunda dentro del gel durante 2 minutos.

6 CONEXION DE LA FUENTE DE PODER

6.1 Sujetar nuevamente la pipeta con las pinzas para bureta al soporte universal.

6.2 Colocar la solución amortiguadora en un caja Petri pequeña, hasta lograr que el nivel tenga una altura de 0.5 cm.

6.3 Agregar solución amortiguadora al bulbo de la pipeta.

6.4 lnsertar el electrodo positivo (cable del polo rojo) dentro de la solucion amortiguadora del bulbo de la pipeta.

6.5 lnsertar el electrodo negativo (cable del polo negro) dentro de la solucion amortiguadora de la caja Petri.

6.6 Sujetar los electrodos con masking tape, para mantenerlos en su lugar.

7. ELECTROFORESIS

7.1 Bajar la pipeta con mucho cuidado y sumergirla en la solución amortiguadora de la caja Petri, de tal manera que la punta quede cubierta.

7.2 Evita: mover la punta de la pipeta.

7.3 No agitar la solución amortiguadora del bulbo o de la caja Petri.

7.4 Observar la pipeta a intervalos de 40 rninutos y hacer anotacioncs.

7.5 Desconectar la fuente de poder para terminar.

7.6 Reconectar la fuente de poder, si es neoesario continuar el corrimiento mas tarde.

OBSERVA CIONES

*Si este experimento se realiza en forma demostrativa, se pueden utilizar varias pipetas y realizar Ia electroforesis a diferentes intervalos de tiempo.

** Almacenar las pipetas en un refrigerador para minimizar la difusion de los colorantes al terninar la electroforesis. Después de 2 dias en refrigeracion ya se aprecia difusion de los colores.

*** Remojar las pipetas en agua caliente, sumergirlas varias veces, enjuagarlas y reusarlas.

****Las soluciones pueden desecharse en el vertedero.

CUESTIONARIO

1. Escribir el diagrama de la conexion de las pilas en serie.

2. Hacer un esquema del aparato en ésta , utilizado en esta practica.

3. Elaborar una tabla de resultados en donde incluya el colorante, el corrimiento en mm y el tiempo de electroforesis, considerando los datos de todas las pipetas utilizadas.

4. Hacer una grafica de tiempo (min). Vs distancia (mm), co los datos de la tabla anterior.

5. ¿Qué se puede concluir de la grafica anterior?

6. ¿Qué colorante se mueve mas rápido? ¿Por qué razón?

PRACTICA No. 3

TITULACION DE UN AMINOACIDO CON UNA BASE

INTRODUCCION

Las propiedades de carga de los aminoácidos son muy importantes para determinar la reactividad de ciertas cadenas laterales de los aminoacidos y de las propiedades que confieren a las proteinas. Las propiedades de carga del aminoacidos en solucion acuosa son mejor interpretadas bajo el tratamiento general de la teoria de ionizacion acido-base.

Seguin el pH y conforme a los principios de la teoria de ionizacién acido-base, los grupos funcionales α-carboxil y α-amino de un aminoacido existen como una de las siguientes combinaciones interconvertibles:

-COOH/-NH3+ COO-/-NH3+ -COO-/-NH2

Notese que la sustancia totalmenle protonada -COOH/-NH3+ es un acido

diprotico. Por consiguiente, son posibles dos ionizaciones, las cuales se describen mediante dos valores distimos de pKa. Para la mayoria de los aminoácidos, pKa1 (del grupo -COOH que tiene mayor acidez) posee un valor aproximado de 2, mientras que el pKa, (del grupo -NH3+ menos acido) tiene un valor de 9 a 10. EI patron de ionizacion también incluye una tercera funcion ionizable presente en los grupos R (mdena lateral) de algunos aminoacidos.

OBJETIVO

Experimentar el comportamiento de un sistema amortiguador, utilizar la ecuación de Herderson-Hasselbalch, calcular el pK de un par acido-base, medir el pH y calcular la concentración de H+.

MATERIALES REACTIVOS

4 Vasos de precipitado de 100 ml Solucion para ajustar pH

1 Pipeta de 10 ml Glicina 0.025 M pH 1.8

1 Pipeta de 1 ml Lisina 0,025 M pH 1.8

Potenciémctro Ac. aspartico 0.025 M pH 1.8

NaOH 1.0 M

METODOLOGIA

1. Poner 20 ml de la solución de glicina en un vaso de precipitado de 100 ml. Hacer lo mismo para los otros aminoicldos.

2. Antes de proceder a las titulaciones de la solución, es necesario calibrar la escala de pH del potenciómetro sumergiendo los electrodos en

cuando menos una solución regulada, cuyo pH se conozca con exactitud.

3. Proceder a la medición del pH de cada uno de los aminoácidos.4. Añadir 0.1 ml de NaOH 1.0 M y volver a medir el Ph anotando los

resultados.5. Repetir los pasos 3 y 4 hasta llegar a un pH de 13.0 aproximadamente.

CUESTIONARIO

1. Hacer una grafica de pH vs ml de NaOH gastados, tomando en cuenta que cada ml de NaOH diluido en 20 ml, aumenta la concentracion de OH en 10 mmolas.

2. Localizar en la grafica los diferentes pK de los aminoácidos.3. Identificar a que pH tienen poder amortiguador los aminoácidos.4. ¿Qué es una solución amortiguadora?5. Determinar el pI de cada uno de los aminoácidos.6. Escribir las diferentes estructuras de la glicina, la lisina y el ac. Aspartico,

de acuerdo a sus propiedades acido-base. Incluir los pKa’s y el Pi.

PRACTICA No. 4

PRUEBAS CON PROTEINAS Y AMINOÁCIDOS

INTRODUCCIÓN

Debido a su importancia como nutrimentos, las proteínas se ahn convertido actualmente en el principal foco de atencio de la mayoría de los tecnólogos de alimentos de todo el mundo. La palabra proteína deriva del griego y significa “ser primero”, lo cual indica la gran importancia de estos compuestos para la vida. Para la síntesis de sus propias proteínas, de acidos nucleicos y de otras sustancias nitrogenadas de gran interés biológico, el hombre solo puede utilizar el nitrógeno organico proveniente de las proteínas animales y vegetales. Las proteínas desempeñan un papel muy importante en las funciones biológicas del organismo humano, entre las cuales se cuentan principalmente la regeneración y formación de tejidos, la síntesis de las enzimas, anticuerpos y hormonas, y como constituyentes de la sangre.

Los aminoácidos son los monómeros y los principales constituyentes de las proteínas, por lo que su distribucio y concentración determinan fundamentalmente las propiedades de cada proteína. En la naturales se encuentran mas de 120 aminoacidos; sin embargo, la mayoría de las proteínas están estructuradas solamente por 20 0 21 de ellos. El numero posible de polímeros que se pueden formar con 20 amonoacidods llega a ser muy grande ya que, por ejemplo, una proteína que contenga 100 aminoacidos alcanza hasta 20100 secuencias diferentes de amonoacidos y, por tanto, de proteínas. Generalmente no hay tantas combinaciones, sino que cada proteína tiene secuencia de amonoacidos muy establecida y bien definida, lo que repercute en sus propiedades y funciones biológicas.

OBJETIVO

Realizar pruebas que permitan conocer algunas propiedades de los aminoácidos y proteínas.

MATERIAL REACTIVOS REACTIVOS

Pinzas p/tubo de ensaye Albumina Urea

Matraz Erlenmeyer 125 ml Agua destilada Papel tornasol rojo

Agitador NaOH al 10% CuSO4 al 2%

Embudo de plástico HCI conc. Glicina

Tubo de ensaye grande Solucion de albumina Gelatina

con tapon Etanol del 95% HCl al 19%

6 Tubos de ensaye medianos AgNO, al 2% NaNO2 al 5%

Papel filtro HgCl, nl 5% HCI al 10%

HNO, conc. Histidinina

Tirosina al 1% Pb(CH3COO)2, al 5% `

METODOLOGIA

1 PROPIEDADES ANFOTERASLos aminoácidos pueden actuar como acidos y como bases, formando soles como las bases fuertes y con los acidos fuertes, respectivamente. A los compuestos que muestran este comportamiento se les llama anfóteros.

1.1 Poner 0.1 gr de albumina de huevo en un tubo de ensaye y añadir 3 ml de agua y 2 ml de solución de NaOH al 10 %.

1.2 Tapar el tubo de ensaye, agitar fuertemente y observar el resultado.1.3 Añadir HCl conc., gota a gota, a la solución anterior y observar el resultado.1.4 Continuar hasta que se hayan agregado 4 ml del acido, tapar el tubo de

ensaye, agitar fuertemente y observar lo que ocurre.

2 COAGULACION DE LAS PROTEINASLas proteínas se pueden desnaturalizar (precipitar o coagular) al calentarlas o al tratarlas con acidos fuertes o con alcohol.

2.1 colocar 2 ml de una solución de albumina de huevo en un tubo de ensaye yhervirla suavemente durante 5 minutos. Observar lo que sucede en la solución.

2.2 En otro tubo de ensaye colocar 2 ml de solución de albumina y agregar 7 ml de etanol del 95 %. Observar el comportamiento de la solución.

3 PRECIPITACION POR IONES METALICOSLos iones de metales pesados (Ag+, Pb2+,Hg2+ etc...) inducen la precipitación de las proteínas, debido a que se combinan con los grupos carboxilo libres de esta.

3.1 Colocar 2 ml de solución de albumiina en un tubo de ensaye y añadir, gota a gota, una solución de AgNO3 al 2 %. Observar lo que ocurre.

3.2 Repetir la experiencia anterior utilizando una solución de HgCl2 al 5%.

4 PRUEBA XANTOPROTEICAAlgunos de los aminoácidos presentes en las proteínas poseen anillos aromaticos que se nitran fácilmente. Asi, al tratar una proteína con HNO3

conc., la solución tomara un color amarilo claro, que se volverá intenso si se basifica el medio.

4.1 Poner 2 ml de solución de albumina en un tubo de ensaye y agregar 10 gotas de HNO3 conc.

4.2 Calentar ligeramente la muestra (¡precaucion!) y observar si tiene lugar algún cambio de color.

4.3 Enfriar la solución y añadir gota o gota una solución de NaOH al 10%, hasta que el medio este básico. Anotar si tiene lugar algún cambio de color.

4.4 Repetir lo indicado en las secuencias 4.1, 4.2, y 4.3 con una solución de tirosina al 1%.

5 PRUEBA DE AZUFRELas proteínas que contienen aminoaciods con azufre, tales como la cisteína (enlace disulfuro), se hidrolizan en, en medio básico dando un sulfuro inorgánico, que en presencia de acetato de plomo da lugar a un precipitado negro de sulfuro de plomo.

5.1 Agregar a un matraz erlenmeyer de 125 ml; 2 ml de solución de albumina, 5Ml de NaOH al 10% y 2 gotas de una solucionde acetato de plomo al 5%.

5.2 Hervir la mezcla cuidadosamente, agitar durante cinco minutos y observar El resultado.

6 PRUEBA DEL BIURETCuando se calienta la urea por encima de su punto de fusión, se convierte en biuret, perdiendo amoniaco:

2 NH2 – CO – NH2 NH2 – CO – NH – NH2 + NH3 Urea Biuret

Con los ions cupricos, el biuret forma en medio basico un complejo de color rosa o violeta. Todos los compuestos que contienen 2 o mas enlaces peptidicos dan con los iones Cu++ una coloración análoga a la que da el biuret. Los aminoaciods (excepto la serina y la treonina) no toman color violeta en esas condiciones por lo que se dice que dan prueba negativa (los aminoácidos dan color azul en presencia de iones Cu++.

6.1 Poner 1 gr de urea en un tubo de ensaye seco. Calentar ligeramente el tuboHasta que se funda la urea. Reparar en el olor del gas que se desprende y acercar un trozo de papel tornasol rojo, humedecido con agua destilado, a la boca del tubo de ensaye.

6.2 Continuar calentando ligeramente hasta que el producto solidifique. disolver El residuo blanco en 4 ml de agua caliente y filtrar la mezcla.

6.3 Añadir 4 ml de NaOH al 10% al filtrado. Agregar luego 10 gotas de una Solución de CuSO4 al 2%. Agitar la mezcla y observar el color.

6.4 En otro tubo de ensaye colocar 2 ml de solución de albumina y añadir 2 ml De 2 ml de NaOH al 10%, 5 gotas de solución de CuSO4 al 2%, mezclar bien y observar.

6.5 poner 0.1 gr de glicina en un tubo de ensaye y agregar 3 ml de NaOH al 10% para disolver el solido. Adicionar 10 gotas de CuSO4 al 2%, agitar la mezcla y observar el color desarrollado.

7 PRUEBA DEL ACIDO CITRICOLos aminoácidos reaccionan con el acido nitroso dando un α-hidroxiacido y nitrógeno gas:

R – (NH2) CH – COOH + HONO R – (OH) CH – COOH + H2O + N2

Ya que muchos grupos amino de la protein participant en el enlace peptidico

No puden experimentar la reacción que aquí se indica. Las proteínas contienen, sin embargo, algunos grupos amino libres, que corresponden principalmente la lisina. Estos grupos pueden reaccionar con acido nitroso desprendiéndose nitrógeno, pero, como es obvio, nunca se desprende tanto nitrógeno como si se tratara de aminoácidos libres. Ensayar las siguientes pruebas en forma simultanea.

7.1 Poner 4 o 5 gr de gelatina en un tubo de ensaye y añadir 3 gotas de HCL al19%. Agregar 3 gotas de solución de NaNO2 al 5%, mezclarlo bien y observar el desprendimiento de nitrógeno.

7.2 Poner 0.1 gr de glicina en un tubo de ensaye y agregar 5 ml de HCl al 10%. Añadir cuidadosamente 1 ml de una solución de NaNO2 al 5%, mezclar bien y observar la velocidad de desprendimiento de nitrógeno.

7.3 Repetir lo indicado en la experiencia 7.2 utilizando 0.1 gr de histidina.

CUESTIONARIO

1. Elaborar una tabla en donde se incluyan los resultados de todas las pruebas efectuadas.

2. Explicar porque el nitrato de plata y el cloruro mercúrico son buenos germicidas.

3. ¿Por qué se utiliza la clara del huevo o leche como antídoto para el tratamiento de pacientes que han ingerido sales metalicas, tales como nitrato de plata y cloruro de mercúrico?

4. ¿Por qué se emplea el alcohol como desinfectante?5. Cuando se derrama HNO3 sobre la piel, se produce una mancha

amarilla. Explicar este hecho.6. La prueba xantoproteica da positiva cuando la proteína contiene tirosina

¿Qué otros restos de aminoácidos pueden detectarse con esta prueba?7. ¿Por qué la velocidad de desprendimiento de nitrógeno es diferente

entre glicina e histidina?

PRACTICA No. 5

PROTEINAS CON ACTIVIDAD ENZIMATICA

INTRODUCCION

Las proteinas tienen muchas y muy diversas funciones en la naturaleza, agunas de ellas tienen actividad catalítica y se les denomina enzimas. La funcion de una enzima es incrementar la velocidad de una reaccion. Sin embargo las enzimas poseen tres caracteristicas sin paralelo. Primero, son los catalizadores mas eficientes que se conocen, pues bastan pequeñas cantidades (micromoleculares) de ellas para acelerar una reacción en forma impresionante. Segundo, tienen especificidad de accion, lo que significa que prácticamente da conversión de un reactivo (sustrato) en un producto es catalizada por una enzima determinada.Tercera, la actividad de muchas enzimas esta regulada, es decir, pueden cambiar alternativamente de un estado de baja actividad a otro de gran actividad. La individualidad de la célula viva se debe en gran medida al conjunto unico de enzimas que ésta produce por programación genética. La enzima polifenoloxidasa (tirosinasa) esta presente en las células de plantas y animales. No obstante que su función biologia especifica de las plantas no se conoce, tiene la capacidad de catalizar la hidroxilacion de varios monofenoles y la oxidacion aerobica de difenoles. Estas reacciones se observan rapidamente cuando productos vegetales como la papa, la manzana, los champiñones o el platano, toman un color marron al ser cortados. Esto se debe a la conversion de tirosina a melanina catalizada por la polifenoloxidasa. Las proteasas son un grupo de enzimas capaces de romper el enlace peptidico. La gelatina, una proteina preparada a partir del colageno, es rapidamente hidrolizada por proteasas de vegetales tales como la bromelina que se encuentra en la piña o la papaina de la papaya.

Los glucosinolatos (tioglucosidos) son un grupo de compuestos presentes en algunas plantas de la familia de las cruciferas (ejm.. col y coliflor). Una reaccion caracteristica de los glucosinolatos es su hidrolisis enzimática catalizada por una tioglucosidasa. Esta reaccién también ocurre cuando las semillas de papaya madura son maceradas.

OBJETIVO

Demostrar la actividad catalitica de algunas proteinas presentes en vegetales y algunas caracteristicas inherentes a dicha actividad.


Mortero con pistilo NaF 0.1 M Tirosina al 0.1%

Cuchillo Pirogalol al 0.1% Agua destilada

Colador Fenol al 0.1% NaCN al 0.1%

10 Tubos de ensaye Catecol nl 0.1% Gelatina

Gotero Hidroquinona al 0.1% Hg(NO3), al 2.0%

Baño maria Resorcinol al 0.1% Hielo

Termometro DL-DOPA al 0.1% Jugo de piña enlatado

4 vasos de precipitado Amortiguador de fosfatos Papa cruda

De 100 ml a Ph 7.2 piña y papaya

METODOLOGIA

1 POLIFENOLOXIDASA (TIROSINASA)Durante el proceso de formación de la melanina, la tirosinasa reacciona con la tirosina y con la L-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), ya que estas dos sustancias se ensamblan bien al arreglo tridimensional de la enzima. En esta experiencia se probaran varias sustancia para observar si se ensamblan bien a la tirosinasa.

1.1 Cortar un trozo de papa cruda en pequeños pedazos (aprox. Un volumen total de 10 ml) y triturarlos en un mortero.

1.2 Adicionar 10 ml de una solución 0.1 M de NaF (o 10 ml de una solución amortiguadora de fosfato de sodio 0.1 M de pH 7.2), para extraer la enzima. Mezclar perfectamente.

1.3 Filtrar la mezcla a través de un colador. Sta solución es el extracto enzimático (tirosinasa).

1.4 Preparar las siguientes mezclas, utilizando tubos de ensaye y goteros limpios.

a) 15 gotas de agua destilada y 15 gotas de extracto enzimático.b) 15 gotas de pirogalol 0.1% y 15 gotas de extracto enzimático.c) 15 gotas de fenol 0.1% y 15 gotas de extracto enzimático.d) 15 gotas de catecol 0.1% y 15 gotas de extracto enzimático.e) 15 gotas de hidroquinona 0.1% y 15 gotas de extracto

enzimático.f) 15 gotas de resorcinol 0.1% y 15 gotas de extracto

enzimático.g) 15 gotas de DL-DOPA 0.1% y 15 gotas de extracto

enzimático.h) 15 gotas de tirosina 0.1% y 15 gotas de extracto enzimático.

1.5 Colocar todos los tubos en un baño maria a 37ºC.1.6 Observar cualquier cambio de color después de 5 y de 10 minutos.1.7 ¿Qué sustancias se ensamblan a la tirosina?2 INHIBICION DE LA POLIFENOLOXIDASA

La tirosinasa de plantas y animales contiene cobre, el cual puede ser acomplejado con un agente quelante. La quelacion de cobre genera una enzima inactiva.

2.1 Preparar la siguiente mezcla en un tubo de ensaye; 15 gotas de unaSolución que haya resultado positiva en la experiencia 1, 15 gotas de extracto enzimático y 10 gotas de una solución 0.1% de NaCl (se puede utilizar también feniltiourea, dietilditiocarbomato, azida o cisteína).

2.2 Con esta mezcla repetir las experiencias 1.5 y 1.6.3 BROMELINA

Accion de la bromelina sobre la gelatina.3.1 Disolver 4 gr de gelatina en 20 ml de agua caliente.3.2 Diluir la solución en dos partes y colocarlas en vasos de precipitado

de 100 ml.3.3 Dejar enfriar hasta una temperatura de 50ºC.3.4 Agregar a uno de los vasos 2 ml de jugo fresco de piña y al otro 2 ml

de jugo de piña enlatado.3.5 Dejar los vasos en reposo durante 5 minutos.3.6 Colocar los vasos en un baño de hielo y observar la gelacion cada 5

minutos.4 INHIBICION DE LA BROMELINA

El sitio activo de la bromelina contiene un residuo de cisteína, se postula que el grupo sulfhidrilo (-SH) participa en la hidrólisis del péptido al formar un tioester con el enlace peptidico. Los iones de metales pesados tales como Hg2+ , Cu2+ y Pb2+ se ha demostrado que inhiben la actividad de la bromelina.

4.1 Disolver 2 gr de gelatina en 10 ml de agua caliente y colocarla en un vaso de precipitado de 100 ml.

4.2 Dejar enfriar hasta una temperatura de 50ºC.4.3 Agregar 2 ml de jugo fresco de piña y 5-10 gotas de una solución al

2% de Hg (NO3)2.4.4 Dejar el vaso en reposo 5 minutos.4.5 Colocar el vaso en un baño de hielo y observar la gelacion cada 5

minutos.5 TIOGLUCOSIDASA

La tioglucosidasa cataliza la hidrólisis del tioglucosido. La parte denominada aglucona sufre un rearreglo durante la reacción y se forma un isotiocianato como producto final.

5.1 Quitar la capa gelatinanosa (sarcotesta) de 3 semillas de una papaya madura y fresca.

5.2 Lavar las semillas al chorro de agua durante 1 minuto5.3 Colocar una semilla en la boca y triturarla con los dientes del frente

(incisivos).5.4 Saborear el contenido de la semilla con la punta de la lengua. Se

apreciara un sabor dulce con ligero sabor amargo. Si el periodo de prueba se prolonga, aparecerá gradualmente un sabor acre o picante parecido al de la mostaza.

5.5 Retirar de la boca la semilla triturada y lavarse la boca muy bien con agua.

5.6 Colocarse ahora una semilla con capa gelatinosa y romper dicha capa con los dientes incisivos. Apreciar que tiene contenido jugoso pero insípido.

5.7 Triturar la semilla y se apreciara en forma inmediata un fuerte sabor acre o picante.

5.8 La reacción que produce el sabor acre es: Tioglucosidasa

C6H5-CH2-C=(NSO4-)-S-C6H11O5+H2O C6H5-CH2-N=C=S+C6H12O6+SO42-+H+

5.9 ¿como se explica que el sabor acre se produce inmediatamente en las semillas con capa gelatinosa y muy lentamente en las semillas que no la tienen?

6 INHIBICION DE LA TIOGLUCOSIDASA6.1 Colocar en agua hirviente y durante 2 minutos, 3 semillas con capa

gelatinosa de una papaya madura y fresca.6.2 Retirar las semillas y triturarlas en la boca.6.3 ¿Se detecta el sabor acre? ¿A que se debe?

CUESTIONARIO

1. Escribir las reacciones que ocurren durante el proceso de formación de la melanina a partir de tirosina.

2. ¿Qué función tiene la melanina en los humanos?3. Escribir las formulas de la tirosina, L-DOPA, pirogalol, fenol, catecol,

resorcinol e hidroquinona.4. Elaborar una tabla con lo observado en la experiencia 1.6.5. Respuesta a la pregunta de la experiencia 1.7.6. ¿Qué puede concluir del experimento 2?7. ¿Qué resultados se obtuvieron en la experiencia 3.6?

8. ¿A que se debe que el jugo de piña enlatado no evita la gelacion?

9. Escibir la reacción que ocurre entre la cisteína y el ion Hg2+ en la experiencia 4.

10.Resultados obtenidos de la experiencia 4.6.

11.Respuesta a la pregunta de la experiencia 5.9.

12.Respuestas a las preguntas de la experiencia 6.3.

PRACTICA No. 6

EXTRACCION DE LA CAFEINA DEL CAFE

INTRODUCCION

El principio activo que hace que el té y el café sean utiles para el hombre es la cafeina que penenece al grupo delos alcaloides.

Los alcaloides generalmente rienen una ponunciada accion fisiologica en el organismo animal; muchos son venenosos. Son de considerable importancia en farmacologia, medicina y toxicologia. El término "alcaloide” (propiedades alcalinas) es aplicado a un gran numero de productos nuturales de origen vegetal que contienen nitrogeno en un anillo heterociclico, tales como; pirrol, piridina, pirrolidina, quinolina e isoquinolina, pero ocasionalmerrte se encuentran en una cadena alifitica.

El té y el café no son las unicas plantas de las que se puede extraer la cafeina. También se puede obtener a partir de las nueces de cola, de las hojas de mate, de las semillas de guarana y, en menor cantidad, de las semillas de cacao.

La cafeina en su forma natural, es probablemente el estimulante más antiguo empleado por el hombre. La cafeína excita el sistema nervioso central y los musculos esqueléticos, despejando la mente y disminuyendo la posible sensacion de sueño. Se puede desarrollar simultaneamente una tolerancia y una dependeneia a la cafeina. Se ha comprobado que un bebedor de café (mas de cinco tazas al dia) experimenta aletargamiento, dolores de cabeza y, a veces, nauseas después de una abstinencia de 18 horas. Una dosis excesiva de cafeina produce angustia, irritabilidad, insomnio y temblores rnusculares, pudiendo llegar incluso a ser toxica, pero se ha estimado que para alcanzar una dosis letal serla preciso beberse 100 tazas de café en un tiempo relativamente corto.

La cafeina siempre ha sido objeto de controversias. Algunas religiones prohiben la ingestion de bebidas que la contengan, pues consideran que produce dependencia. Recientemente se ha vuelto a criticar su consumo debido a su semejanza estructural con las bases puricas edenina y guanina, que son dos de las cinco bases que forman los acidos nucleicos en los seres vrvos. Se teme que la substitucion de una de ellas por la cafeina en cualquiera de estos compuestos que forman los genes se traduzca en defectos en los cromosomas.

OBJETIVO

Extraccion de la cafeina, identificacion de Ia misma y pruebas generales para detectar alcaloides.

MATERIAL REACTlVOS

Trozos de porcelana Café molido

Matraz esférico de 500 ml Agua destilada

Refrigerante de rosario o serpentin Papel filtro rapido

Aparato de extraccion al vacio Pb(CH,COO)2 al 10%

Matraz Erlemneyer de 250 ml Cloroformo

Baño mria con aros NaOH al 10%

Agitador Na2SO4 anhidro

2 Embudos de separacion Benceno V 1 2:2 s

Matraz Erlenmeyer de 125 ml Eter de petréleo (60—90°)

Filtro de pliegues HNO3 conc.

Vaso de precipitado de 100 ml HCl 1 N

Pinzas para tubo de ensaye Reactivo de Mayer

Capsula de porcelana Reactivo de Bouchardat

4 Tubos de ensaye Reactivo de Dragendorff

METODOLOGIA

1 AISLAMIENTO DE LA CAFEINA

1.1 Colocar 35 gr de café molido, un pedacito de porcelana porosa y 125 ml de agua destilada en un matraz esférico de 500 ml equipado con refrigerante de reflujo.

1.2 Calentar la mezcla a reflujo durante 20 minutos con el mechero.

1.3 Apagar el mechero, y cuando el polvo ha sedimentado en parte pero la solucion esta todavia caliente, se filtra al vacio con la ayuda de un embudo de Bûchner y un papal de filtro rapido.

1.4 Pasar el Eltrado a un matraz Erleumeyer de 750 ml y afardir 20-25 ml de solucion de acetato de plomo al 10%.

1.5 Se calienta justo hasta llegar a ebullicion en un baño de agua y se agita durante 10 minutos, mientrs Ia solucion esta todavia caliente, para coagular el precipitado.

1.6 Se filtra al vacio en caliente. Se deja enfriar el filtrado hasta temperatura ambiente y se lleva a un embudo de separacion.

1.7 Se extrae con 25 ml de cloroformo. No se debe agitar demasiado fuerte, ya que se puede formar una emulsion. Para evitarlo hay que agitar suavemente para mezclar las dos capas e invertir el embudo con cuidado varias veces. Se hace esto durante 5 minutos.

1.8 Dejar en reposo el embudo y esperar hasta que las capas se separen, y se toma la inferior, que es la cloroformica, conservandola aparte.

1.9 Se agregan otros 25 ml de cloroformo a la capa acuosa. Se vuelve a agitar suavemente durante 5 minutos y se separa la capa inferior.

1.10 Se juntan las dos fracciones cloroformicas y se lavan en utro embudo de separacion, primero con 10 ml de solucion de NaOH al 10% y después con 10 ml de agua destilada.

1.11 Pasar la solucion cloroformica ya limpia a un matraz Erlenmeyer seco de 125 ml, y añadir 1 gr de Na2SO4. inhidro para secarla.

1.12 Agitar la mezcla varias veces durante unos 10 minutos o hasta que la solucion se aclare, lo que indica que ya esta seca.

1.13 Eliminar el agente desecante filtrando a traves de un filtro de pliegues sobre un vaso de precipitado de 100 ml. Lavar los cristales de Na2SO4 con unos 10 ml de cloroformo, que se unirán al filtrado. ml. Lavar los cristales de Na2SO4 con unos 10 ml de cloroformo, que se uniran al filtrado.

1.14 Agregar un pequeño pedazo de porcelana poroso al vaso y evaporar a sequedad en un baño de agua en la campana de extraccion. El residuo que queda es la cafeima impura.

2. RECRISTALIZACION DE LA CAFEINA2.1 La cafeina impura se disuelve en la minima cantidad posible de benceno

caliente.2.2 Se agrega éter de petroleo de alto punto de ebullicion (60-90º) hasta que

aparezca una ligera turbidez.2.3 Enfriar la solucion y separar los cristales por filtracion al vacio. Hacer pasar

el aire hasta que el producto esté seco.3. REACCION DE LA MUREXIDA

La cafeina es oxidada por el acido nitrico, formando un compuesto amarillo, cuya sal de amonio tiene un color rojo violaceo.

3.1 En una capsula de porcelana se ponen 0.05 gr de cafeina y se agregan 1.5 ml de HNO3 concentrado.

3.2 Se evapora la mezcla, calentandola en Ia campana de extraccion en un baño de agua.

3.3 Al residuo amarillo se le añade una gota de NH4OH, poniéndose inmediatamente de color rojo purpura.

4. PRUEBAS GENERALES PARA DETECTAR ALCALOIDES4.1 Colocar en tres tubos de ensaye una pequeña cantidad de cafeina, a cada

tubo agregar 1 ml de HCl 1 N y disolver la cafeina.4.2 Añadir 2 o 3 gotas de los reactivos precipitantes de Mayer, Bouchardat y

Dragendorff (un reactivo por tubo).

4.3 Una prueba positiva es indicada por la formacion de un precipitado coloreado; blanco (Mayer), naranja (Dragendorft), y café (Bouchardat).

CUESTIONARIO

1. ¿Qué caracteristicas presenta la cafeina obtenida en la practica?2. ¿En que consiste el proceso de descafeinado?3. ¿Cual de los atomos de nitrogeno que forman parte de la estructura de

la cafeina es mas basico? ¿Por qué?4. lndustrialmente la cafeina se rocoge en las chimeneas de los tostadores

de café. ¿A qué se debe que se le encuentre en ese lugar?5. ¿Por qué se agrega HCI a un alcaloide antes de demostrar su presencia

con los reactivos precipitantes?6. Esquematizar los resultados de las experiencias 3 y 4.

PRACTICA No. 7

CARBOHIDRATOS

INTRODUCCION

Los carbohidratos son los nutrimentos mas abundantes y baratos que se encuentran en la naturaleza y por tanto los mas consumidos por los humanos en muchos paises constituyen del 50 al 80% de la dieta del pueblo. Los carbohidratos de las especies del reino vegetal se sintetizan por el proceso de fotosintesis y son los principales compuestos quimicos almacenadores de la energia radiante del sol. Los azucares glucosa y sacarosa, al igual que los polisacáridos, almidon y celulosa, son carbohidratos producidos a través de este mecanismo, y se localizan en frutas y vegetales. La mayoria de los compuestos organicos que se encuentran en las plantas y en los animales son derivados de carbohidratos, ya que aun Ia misma sintesis de proteinas se lleva a cabo a través de aminoacidos que se generan de la reaccion entre carbohidrtos y compuestos nitrogenados.

Carbohidrato es un término muy general aplicable a gran numero de materiales cuya estructura quimica y funciones biologicas abarcan un amplio espectro. Esta designacion fue sugerida hace casi un siglo para referirse a Ias sustancias naturales que presentan una composición quimica acorde a la formula Cn(H2O)n,es decir, carbonohidratos.

Entre las funciones realizadas por los carbohidratos naturales cabe mencionar que hay sustancias tipo gel que lubrican las articulaciones oseas, determinantes de los diferentes grupos sanguíneos, componentes de algunos antibióticos, secreciones gumiferas que ayudan a cicatrizar las heridas de los vegetales, cubiertas protectoras de las bacterias y componentes de la pared celular bacteriana.

OBJETIVO

Realizar algunas pruebas que permitan caracterizar los diversos hidratos de carbono.


10 Tubos de ensaye Xilosa al 1% Xilosa

Vaso de precipitado Arabinosa al 1% Xilosa

De 400ml Glucosa al1% Glucosa

2 Pinzas para tubo Galactosa al 1% Glucosa

Agitador Fructosa al 1% Fructosa

Balanza granataria lactosa al 1% lactosa

Microscopio Sacarosa al 1% Sacarosa

Portaobjetos Almidon al 1% Almidon

Cubreobjetos Glucogeno al 1% Glucogeno

Algodón Agua destilada Papel tomasol rojo

H2SO4 conc. Reactivo de Molisch

HCI conc. Reactivo de Bial

1-pentanol Reactivo de Seliwanoff

Lugol Reactivo de Benedict

Na2S2O3 al 1% Reactivo de Barfoed

NaOH al 10% Hidrocloruro de fenil-

CH3COONa hidrazina

METODOLOGIA

1. PRUEBA DE MOLISCHEs una prueba general para hidratos de carbono

1.1 Colocar 4 ml de cada una de las siguientes soluciones de carbohidratos al 1% en nueve tubos de ensaye (una solucion por tubo), xilosa, arabinosa, glucosa, galactosa, fructosa, lactosa, sacarosa, almidon (agitarlo) y glucogeno.

1.2 En otro tubo de ensaye colocar 4 ml de agua destilada, este tubo servira como blanco o control.

1.3 Añadir 2 gotas del reactivo de Molisch a cada uno de los tubos de ensaye y mezclar complemente el contenido.

1.4 lnclinar ligeramente cada uno de los tubos y agregar con precaucion 5 ml de H2SO4 conc., dejándolo resbalar por las paredes del tubo. En el fondo de los tubos se formara una capa de acido.

1.5 Observar el color que se forma en Ia interfase, en cada tubo, y tomar nota del mismo. Si aparece un color purpureo, indica que la prueba es positiva.

2. PRUEBA DE BIALEsta prueba permite diferenciar las pentosas de las hexosas.


2.2 Agregar 2 ml de agua destilada en otro tubo de ensaye para que sirva de control.

2.3 Añadir 3 ml del reactivo de Bial a cada uno de los tubos de ensaye.

2.4 Calentar cuidadosamente cada tubo sobre la llama de un mechero, hasta que la mezcla comience a entrar en ebullicion.

2.5 Observar el color que se forma en cada uno de los tubos de ensaye.2.6 Si los colores no son diferentes, añadir 5 ml de agua y 1 ml de 1-

pentanol a cada tubo de ensaye.2.7 Agitar los tubos, observarlos y anotar la coloracion. EI producto de

condensacion coloreado se concentrara en la capa de 1- pentanol. Las pentosas desarrollan un color verde azulado y las hexosas verde, pardo o pardo rojizo.

3. PRUEBA DE SELIWANOFF En esta prueba se pone de manifiesto las velocidades relativas de deshidratacion de los cerbohidratos. Una cetohexosa reecciona rapidamente, mientras que una aldohexosa reacciona mas lentamente.

3.1 Preparar un baño de agua a ebullicion en un vaso de precipitado de 400 ml.


3.3 Agregar 1 ml de agua destilada en otro tubo de enseye para que sirva de control.

3.4 Añadir 4 ml de reactivo de Seliwanoff a cada uno de los tubos.3.5 Colocar los 10 tubos en el vaso de precipitado con agua ebullicion

durante 1 minuto. Retirarlos y anotar los resultados. 3.6 Dividir los 10 lubos en tres grupos; grupo l 3 tubos, grupo II 3 tubos y

grupo lll 4 tubos.3.7 Colocar los tubos del grupo I en el baño de agua a ebullicion. Observar

el color de cada uno de los tubos a intervalos de 1 minuto durante 5 minutos.

3.8 Realizar la experiencia 3.7 con los tubos del grupo Il primero y finalmente con los tubos del grupo III.

4. PRUEBA DE BENEDICTEl ensayo de Benedict se realiza en condiciones basicas suaves. El reactivo da prueba positiva con todos los azucares reductores, formando un precipitado rojo de oxido cuproso.

4.1 Preparar un baño de agua a ebullicion.4.2 Colocar 1 ml de cada una de las siguientes soluciones de carbohidratos

al 1% en nueve tubos de ensaye (una solucion por tubo), xilosa, arabinosa, glucosa, galactosa, fructosa, lactosa, sacarosa, almidon (agitarlo) y glucogeno.


4.4 Añadir 5 ml del reactivo de Benedict a cada uno de los tubos de ensaye.

4.5 Colocar los tubos en el baño de agua a ebullicion durante 2 o 3 minutos. Retirar los tubos y enotar los resultados. Un precipitado rojo, marron o amarillo indica que la prueba es positiva. Olvidarse del cambio de color de la solucion. Para poder dar la prueba como positiva debe formarse un precipitado.

5. PRUEBA DE BARFOEDEsta prueba distingue entre monosacaridos reductores y disacaridos reductores, sobre la base de las diferencias de velocidades de reaccion.

5.1 Colocar 1 ml de cada una de las siguientes soluciones de carbohidratos al 1% en nueve tubos de ensaye (una solucion por tubo), xilosa, erabinosa, glucosa, galactosa, fructosa, lactosa, sacarosa, alimidon (agitarlo) y glucogeno.


5.3 Añadir 5 ml del reactivo de Barfoed a cada uno de los tubos de ensaye.5.4 Colocar los tubos en un baño de agua a ebullicion durante 10 minutos.

Retirar los tubos y anotar los resultados. Los monosacaridos reductores reaccionan mas rapidamente que los disacaridos reductores.

6 PRUEBA DEL YODO PARA EL ALMIDONEl almidon forma un tipico color azul con el yodo. Este color es debido a la absorcion de yodo en los espacios abiertos de las moleculas de la amilosa (en forma de hélice) presentes en el almidon. Las amilopectinas, el otro tipo de moléculas presentes en el almidon, dan con el yodo una coloracion que va del rojo al purpura.

6.1 Colocar 2 ml de cada una de las siguientes soluciones de carbohidratos al 1% en tres tubos de ensaye (una solucion por tubo), glucosa, almidon (agitarlo) y glucogeno.


6.3 Añadir una gota de lugol a cada tubo de ensaye, agitarlos y observar el resultado.

6.4 Adicionar unas gotas de tiosulfato de sodio al 1% a cada tubo y anotar los cambios.

7 HIDROLISIS DE LA SACAROSALa sacarosa se hidroliza en solucion acida dando fructosa y glucosa. Estos componentes pueden someterse luego a la prueba de Benedict.

7.1 Colocar en un tubo de ensaye 5 ml de una solucion de sacarosa al 1%7.2 Agregar 2 gotas de HCI conc. y calentar el tubo en un baño de agua a

ebullicion durante 10 minutos.7.3 Enfriar el tubo y neutralizar con una solucion de NaOH al 10% hasta que

la mezcla sea basica al papel tornasol (se necesitaran aprox. 20 gotas).7.4 Sobre esta solucion ensayar el reactivo de Benedict (experiencia 4).

Anotar los resultados y compararlos con los obtenidos con la sacarosa no hidrolizada.

8 FORMACION DE OSAZONASLa mayor parte de las osazonas tienen tiempos de formacion definidos cuando los azucares con que se verificaron las reacciones son puros, ademas, algunas de las osazonas tienen estructuras cristalinas típicas y que varian entre si con respecto a su solubilidad en el agua caliente.

8.1 Colocar 0.1 gr de cada una de los siguientes carbolhidratos en diferentes tubos de ensaye: xilosa, arabinosa, glucosa, galactosa, fructosa, lactosa, sacarosa, almidon y glucógeno.

8.2 Agregar a cada uno de les tubos 0.2 gr de hidrocloruro de dinitrofenilhidrazina 0.3 gr de acetato de sodio y 2 ml de agua destilada.

8.3 Agitar vigorosamente los tubos para conseguir una disolucion completa.8.4 Tapar los tubos con algodon (¡precaucion! no apriete los tapones) e

introducirlos sin pérdida de tiempo en un bañi de agua a ebullicion, tomando el tiempo en ese momento.

8.5 Agitar fuertemente los tubos a intervalos de 2 minutos durante los primeros 20 minutos.

8.6 Las osazonas que no se hayan cristalizado en los primeros 20 minutos son aquellas que son solubles en agua hirviente y que no cristalizan sino con el enfriamiento de las soluciones.

8.7 Observar cuidadosamente los tubos durante los primeros 25 minutos y retirar del baño todos los tubes en los que se note la formacion de cristales amarillos, anotando el tiempo transcurrido y relacionandolo con el contenido del tube.

8.8 Dejar el resto de los tubos en el baño hirviente hasta completar 40 minutos y al final de este tiempo agreguese a cada uno de esos tubos, en los que no se formaron los cristales, 4 ml de agua destilada fria.

8.9 Colocar estos tubos nuevamente en el baño Maria con el proposito de redisolver los cristales.

8.10 En el momento en que los cristales se redisuelvan, se retirar el mechero y se deja que los tubos se enfríen Ientamente junto con el baño Maria hasta la temperatura ambiente.

8.11 Observar los cristales utilizando un microscopio, colocandolos entre porta y cubreobjetos. Hacer dibujos de los mismos y comparar unos con otros. Los cristales se deben observar dentro de la primera hora de su formacion.

CUESTIONARIO

1. Elaborar un cuadro en donde sc concentren los resultados de las 8 pruebas efectuadas, anotando el nombre de la prueba, el carbohidrato analizado y su rcesultado positivo u negativo.

2. Tomando en consideracion los resultados obtenidos, sacar conclusiones para cada uno de los carbohidratos empleados.

3. Escribir el fundamento en el cual se basan las pruebas de Molisch, Bial, Seliwanoff, Benedict y Barfoed.

4. Escribir el mecanismo de hidrolisis del enlace acetal de Ia sacarosa.

5. ¿Por qué razon la determinacion del punto de fusion de una osazona no es util para identiticar el carbohidrato del cual proviene?

6. Hacer los dibujos de los cristales de las osazonas observadas al microscopio.

PRACTICA No. 8

SINTESIS DE OCTAACETATO DE SACAROSA

INTRODUCCION

La sacarosa es el disacarido mas abundante en las plantas y se prepara comercialmente a partir de la caña de azucar, de la remolacha azucarera y de Ia savia de arce. Es conocida por su sabor dulce y es utilizada en muchos alimentos como edulcorante. La acetilacion de Ios ocho grupos hidroxilo de éste azucar, genera la formacion de octaacetato de sacarosa que posee un sabor amargo muy intenso.

El octaacetato de sacarosa es un producto natural que ha sido aislado de las raices de muchas especies de Clematis. La raiz de la Clematis japonica contiene un 0.15% en peso seco de este compuesto. Presumiblemente, el sabo amargo de este compuesto impide la predacion de estas plantas. Los humanos han utilizado comercialmente esta sustancia como un repelente gustatorio a causa de su sabor amargo. Se ha utilizado para desnaturalizar el alcohol, como un disuasivo para evitar que las personas se coman las uñas de las manos y para hacer que el azucar destinada a Ia alimentacion de animales sea no comestible para los humanos. A una concentracion de 0.06%, este compuesto amarga el azucar Io suficiente para no ser ingerido. Se ha demostrado que este compuesto no es toxico y que no afecta el sabor de la carne o la leche de los animales que la consumen.

OBJETIVO

Sintetizar el compuesto octaacetato de sacarosa y probar su sabor amargo.


Cuerpos de ebullición Baño Maria Sacarosa

Refrigerante para reflujo Embudo de Buchner CH3COONa anhidro

Pinza de tres dedos Bomba para vacio Anhidrido acético

Pinzas para bureta Balanza granataria Hielo

Matraz Erlenmeyer 250 ml nuez Agua destilada

Varilla de vidrio Papel Whatman No. 1 Etanol del 95%

Etanol del 95% frio

Cristales de octaacetato

de sacarosa

METODOLOGIA

1 SINTESIS DE OCTAACETATO DE SACAROSA1.1 Pesar 2 gr (5.8 mmoles) de sacarosa y 1 gr (12 mmoles) de acetato de

sodio anhidro.

1.2 Agregar los compuestos anteriores y unos cuerpos de ebullicion, a un matraz de fondo redondo perfectamente limpio y seco.

1.3 Adicionar cuidadosamente 10 ml (10.8 gr, 106 mmoles) de anhidrido acético.

1.4 Adaptar un condensador de reflujo al matraz y calentar la mezcla hasta que empiece a reflujar (¡precaucion!) lavar con mucha agua si la mezcla entra en contacto con la piel).

1.5 Retirar la flama por unos minutos, para pemtitir que la reaccion exotérmica termine, y después, continuar calentando.

1.6 Mantener la reaccion a reflujo hasta que todos los reactivos se disuelvan (5 a 10 minutos).

1.7 Calentar otros 5 minutos.1.8 Dejar enfriar el matraz de reaccion hasta que sea posible tocarlo. Una

vez frio, pasar el contenido a un matraz Erlenmeyer de 750 ml que contenga 50 gr de hielo y 50 ml de agua destilada.

1.9 Agitar la mezcla con una varilla de vidrio durante 5 a 10 minutos (hasta que los productos se condensen como una miel densa en la varilla, en las paredes y fondo del matraz).

1.10 Decantar el agua de la miel y adicionar 100 ml de agua destilada al matraz.

1.11 Agitar el matraz durante 5 minutos, de tal manera que los productos se laven con el agua.

1.12 Decantar el agua de lavado y repetir la misma operacion de lavado 2 veces mas, utilizando 100 ml de agua destilada en cada ocasion.

1.13 Cuidadosamente se decanta toda el agua del lavado final.2 CRISTALIZACION DEL OCTAACETATO DE SACAROSA2.1 Adicionar 20 ml de etanol del 95% al matraz Erlenmeyer y calentado en

un baño Maria hasta que el producto se disuelva.2.2 Enfriar el matraz en un baño de hielo y adicionar una pequeña cantidad

de cristales de octaacetato de sacarosa cuando esté frio.2.3 Agitar la solucion durante varios segundos, hasta que los cristales de

siembra hayan sido distribuidos homogeneamente.2.4 Dejar en reposo la solucion hasta que se complete la cristalizacion.2.5 Filtrar la solucion utilizando una bomba de vacio, un embudo Buchner y

papel Whatman N0. 12.6 Lavar los cristales con 5 ml de etanol del 95% frio.2.7 Dejar que los cristales se sequen al aire y después pesarlos (no olvidar

restar el peso del papel).3 PRUEBA DE SABOR

No se debe probar el producto obtenido en el laboratorio. La prueba se hace con una muestra de octaacetato de sacarosa preparada para consumo humano. Para reducir la potencia, este compuesto debe diluirse antes de ser probado.

3.1 Preparar una solucion que contenga 10 mg de octaacetato de sacarosa en 100 ml de etanol del 95%

3.2 Humedecer con esta solucion un papel filtro limpio.3.3 Dejar secar el papel filtro al aire.3.4 Recortar cuadros de 1 cm.3.5 Masticar un pedazo de papel durante unos 30 segundos, ya que el

sabar amargo no es evidente instantaneamente.

CUESTIONARIO

1. Escribir la reaccion de obtencion del octaacetato de sacarosa.2. ¿Qué otro nombre tiene el octaacetato de sacarosa?3. EI octaacetato de sacarosa presenta dos formas cristalinas, bacer un

dibujo de cada una de ellas.4 ¿Cual fue el rendimiento?5 Elaborar una monografia acerca del octaacetato de sacarosa.6 Por su caracteristico sabor amargo ¿Qué usos se le podrian dar al

octaacetato de sacarosa?

PRACTICA No. 9

EL ETANOL Y LA QUIMICA DE LA FERMENTACION

INTRODUCCION

Entre los procesos quimicos que se conocen desde mas antiguo se encuentran la elaboracién del vino, de la cerveza y del pan. Aunque las fermentaciones se hayan empleado durante siglos, no fue sino hasta el siglo pasado cuando los quimicos empezaron a entenderlas desde un punto de vista cientifico.

La transformacion del azucar en etanol y dioxido de carbono se debe a un complejo enzimatico notablemente activo llamado zimasa. La zimasa es un complejo de al menos 22 enzimas distintas, cada una de las cuales cataliza uno de los pasos de la secuencia de reacciones que produce la fermentacion.

Las principales fuentes de azucares para fermentaciones son los almidones y melazas que se obtienen como residuos del refinado del azucar de caña. La zimasa es segregada por celulas de levadura tales como Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces ellipoidus.

En el proceso se libera calor, por lo que debe enfriarse la mezcla para mantener la temperatura por debajo de los 32 °C y evitar la inactivacion de las enzimas. Al principio se necesitan grandes cantidades de oxigeno para que las células de levadura se reproducen en condiciones optimas, pero el proceso de elaboracion de alcohol es en si mismo anaerobico. Durante la fermentacion, el desprendimiento de dióxido de carbono establece en seguida las condiciones anaerobias necesarias, ya que si hubiese un aporte continuo de oxigeno solo se produciria agua y dioxido de carbono.

OBJETIVO

Obtencion de etanol a partir de sacarosa por medio del proceso de fermentacion.


Tapon monohoradado Aparato para destilación Sacarosa

Frasco de boca angosta Vaso de p.p. de 400 ml Agua destilada

de 3 o 4 litros Papel filtro Solucion Pasteur

Fresco reactivo de 250 ml Levadura de parmderia

Manguera de 1 m Ba(0H)2 al 5%

Bomba para vacio Tierra de diatomeas

Embudo Buchner Xileno, queroseno o

Tubo de vidrio doblemente aceite mineral

Acodado

METOLOGIA

1. OBTENCION DE ETANOL1.1 Colocar 80 gr de sacarosa en un frasco de 4 litros; añadir 700 ml de

agua destilada a temperatura ambiente, 70 ml de solucion Pasteur y unos 15 gr de levadura de panaderia.

1.2 Agitar vigorosamente y tapar el frasco con un tapon monohoradado del que salga un tubo que conduzca a un recipiente con una solucion de Ba (OH)2.

1.3 Proteger la solucion de hidroxido de bario del aire, con una capa de xileno o queroseno que la cubra. La formacin de un precipitado blanco de carbonato de bario nos indicara el desprendimiento de CO2.

1.4 Una vez montado el aparato, dejar reposar Ia mezcla a 25 °C hasta que la fermentacion sea completa, es decir, hasta que no se desprenda mas gas. En general, se precisara una semana para ello.

1.5 Cuando la fermentacion se ha completado, se destapa el frasco y se "sifona" el liquido procurando no agitar el sedimento.

1.6 Si el liquido esta turbio, se puede clasificar como sigue; añadir 2 cucharadas de tierra de diatomeas a 200 ml de agua, agitar vigorosamente y filtrar al vacio, se formara una fina capa de tierra de diatomeas sobre el papel filtro, se desecha el tiltrado y se procede a filtrar la solución alcoholica.

1.7 La solucion clarificada se pasa a un aparato de destilacion simple y se destila hasta que se hayan recogido 200-250 ml del liquido o se ha alcanzado la temperatura de ebullición del agua (94 °C para Ia ciudad de Morelia).

1.8 Calcular el rendimiento en etanol suponiendo que el producto obtenido tiene un 75% de agua.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuales son los métodos empleados industrialmente para obtener etanol absoluto?

2. ¿Por qué es necesario impedir la entrada de aire durante la ultima parte de la fermentacion?

3. El porcentaje de agua en la solucion hidroalcoholica se puede determinar midiendo la densidad. Explicar el fundamento de este método.

4. El etanol y el agua forman un "azeotropo" (¿Qué es un azeotropo?

5. ¿Cual es la maxima concentracion porcentual que se puede obtener de etanol a partir de una mezcla de hidroalcoholica ?

6. ¿Qué es la solucion Pasteur? ¿Qué utilidad tiene en el proceso de fermentacion?

7. ¿Que significa que un alcohol este desnaturalizado?

PRACTICA No. 10

AISLAMIENT0 DE LA LACTOSA

INTRODUCCION

El carbohidrato que se presenta en mayor proporcion en la leche es la lactosa (alrededor del 5%). La lactasa es el unico carbohidrato sintetizado por los mamiferos. Cuando se hidroliza da una molécula de D-glucosa y otra de D-galactosaLa lactosa se sintetiza en las glandulas mamarias, y es en ellas donde tiene lugar la conversion de una molécula de glucosa en galactosa y la posterior union de esta ultima a la glucosa.

Cuando la leche se deja durante mucho tiempo a temperatura ambiente, se agria. En la leche hay muchas bacterias, particularmente lactobacilos. Estas bacterias actuan sobre Ia lactosa de la leche proporcionandole un gusto agrio debido al acido lactico. Estos microorganismos hidrolizan la lactosa y producen acido lactico a partir de la galactosa. Dada que la formacion de acido láctico implica un descenso del Ph de la leche, ésta coagula cuando se agria. Muchos derivados de la Ieche se elaboran permitiendo que esta se agrie antes de empezar a elaborarlos. Por ejemplo, se suele dejar que la leche o la crema se agrie un poco por accion de las bacterias del écido lactico antes de batirla para preparar la mantequilla; el fluido que queda después de batir esa léche ligeramente acida se denomina suero de mantequilla. Otros productos similares son la crema agriada, el yogurt y ciertos tipos de quesos.

OBJETIVO

Aislar la α-lactosa de la leche y hacer su caracterizacion.

MATERIAL REACTIVOS

2 Vasos de precipitado de 400 ml Leche descremada

Matraz Erlenmeyer de 250 ml Acido acético glacial/agua (1:10 v/v)

Vaso de precipitado de 600 ml CaCO3 o soln. Saturada de (NH4)2SO4

3 Agitadores Etanol del 95%

Espatula Carbon activado

3 Tubos de ensaye Etanol al 25% frio

Pinzas para tubo de ensaye Lactosa

Placa calefactora Glucosa

Bomba para vacio Galactosa

Embudo Buchner Agua destilada

Crisol HNO3 conc.

Abatelenguas de madera HCI conc.

Papel filtro Whatman No. 1 Hielo

Termometro CaO

Microscopio y portaobjetos NH4OH conc. y KOH al 5%

METODOLOGIA

1. AISLAMIENTO DE LA α-LACTOSA1.1 Colocar 200 ml de leche descremada en un vaso de precipitado de 600

ml y calentar la leche hasta aproximadamente los 40 ºC.1.2 Añadir gota a gota una solucion de acido acético diluido, con un gotero.

Agitar continuamente la mezcla con una varilla de vidrio durante todo el proceso de adicion.

1.3 Continuar agregando acido acético hasta que no precipite mas caseina (aprox. a un pH de 4.7), Debe evitarse un exceso de acido porque puede hidrolizarse parte de la lactosa (utilizando papel pH se puede ir verificando el cambio de pH).

1.4 Agitar la caseina hasta que se forme una gran masa amorfa. Separar la caseina con ayuda de una varilla o espatula y colocarla en atro vaso.

1.5 Agregar, inmediatamente, 5 gr de carbonato de calcio en polvo al vaso que contiene el liquido del que se ha separado la caseina y agitar esta mezcla durante unos minutos.

1.6 Calentar la mezcla a ebullicion suave durante aproximadamente 10 minutos. Este provocara la precipitación casi completa de las albuminas.

1.7 Filtrar la mezcla caliente al vacio y utilizando papel filtro Whatman No, 1. Con esto se lograra separar las albuminas precipitadas y el carbonato de calcio que aun quede.

1.8 Concentrar el filtrado, en un vaso de precipitado de 600 ml con un mechero, hasta aproximadamente 30 ml. Utilizar varios agitadores para ayudar a conseguir una ebullicion homogénea y evitar las salpicaduras que se producirian al ir aumentando el precipitado.

1.9 También se puede formar espuma si Ia mezcla entra en ebullicion con demasiada fuerza.Esto puede controlarse soplando suavemente sobre la superficie de lu disolucion de lactosa.

1.10 Agregar 175 ml de etanol del 95% (¡cuidado! lejos de cualquier llama) y 1.5 gr de carbon activado a la disolucion caliente.

1.11 Después de mezclar bien, filtrar la solucion caliente al vacio a través de papel filtro Whatman No, 1. El filtrado debe ser transparente.El filtrado puede enturbiarse debido a la cristalizacion rapida de Ia lactosa,

después de la filtracion al vacio. Si la turbidez aumenta con relativa rapidez al dejarla en reposo, debe evitarse otra filtracion, ya que se puede perder el producto.

1.12 Pasar Ia solucion a un matraz Erlenmeyer y dejarla reposar durante una semana. En algunos casos, se requieren varios dias para que la cristalizacion termine.

1.13 La lactosa cristaliza en la pared y en el fondo del matraz. Desalojar los cristales y filtrarlos al vacio. Lavar el producto con unos pocos mililitros de etanol acuoso frio al 25%.

1.14 La lactosa cristaliza en una molécula de agua C12H22O11.H20. pesar el producto cuando esté completamente seco.

1.15 La densidad de la leche es de 1.03 gr/ml, Con este valor, calcular el porcentaje de lactosa en la Ieche.

2. PRUEBA DEL ACIDO MUCICOEsta prueba permite identificar a la lactosa.

2.1 Colocar 0.2 gr de Ia lactosa aislada, 0.1 gr de glucosa y 0.1 gr de galactosa en tres tubos de ensaye.

2.2 Añadir 2 ml de agua destilada a cada uno de los tubos y disolver los solidos mediante calentamiento, si es necesario.

2.3 Agragar 2 ml de HNO3 conc. a cada uno de los tubos.2.4 Calentar los tubos en un baño de agua a ebullicion durante 1hora,

utilizando una placa calefactora y la campana de extraccion (se desprenderan oxidos de nitrogeno muy toxicos).

2.5 Retirar los tubos del baño y dejar que se enfrien lentamente. Rascar los tubos de ensayo con agitadores limpios, para inducir la cristalizacion.

2.6 Cuando los tubos hayan alcanzado la temperatura ambiente, colocarlos en un baño de hielo.

2.7 Aproximadamente una hora y media después de haber apartado los tubos del baño de agua, empezara formarse un fino precipitado de acido mucico en los tubos de galactosa y de lactosa.

2.8 Dejar reposar los tubos de ensaye durante una semama, para que se complete la cristalizacion.

2.9 Asegurarse de la insolubilidad del solido formado, añadiendo aproximadamente 2 ml de agua destilada y agitando la mezcla resultante. Si el solido no se disuelve, es que se trata de acido mucico H6H10O8(acido galactarico).

2.10 Filtre al vacio y lave el producto varias veces con agua destilada. Conservar los cristales para las siguientes pruebas.

3. IDENTIFICACION DEL ACIDO MUCICO El acido mucico se puede identificar por la formacion de; mucato de potasio, furano o pirrol.

Formacion de mucato de potasio3.1 Colocar un pequeño cristal de acido mucico sobre un portaobjetos y

adicionar una gota de KOH al 5%.Utilizar el microscopio para observar la formacion de los prismas caracteristicos de mucato de potasio.

C6H10O8 + KOH C6H9O8K + H2OFormacion de furano

3.2 Colocar una pequeña cantidad de acido mucico con un poco de CaO en un crisol. Calentar el crisol y ecercar a la boca del mismo un abatelenguas humedecido con HCI concentrado. Si el HCl se pone verde, indica Ia formacion del gas furano.

C6H10O8 + 2CaO C4H4O + 2CaCO3 + 3H2O Formacion de pirrol

3.3 Colocar una pequeña cantidad de ac. mucico en un tubo de ensaye y agregar unas gotas de NH4OH conc. hasta que ya no se vea reaccion (se produce mucato de amonio). Calentar la sal que se formo y acercar a la boca del tubo un abatelenguas humedecido con HCI concentrado. La formacion de un color rojo indica la evolucion de pirrol.

C6H8O8(NH4)2 C4H5N + NH3 + 2CO2 + 4H2O

CUESTIONARIO

1. Dar un mecanismo para la hidrolisis catalizada por acido del enlace acetal de la lactosa.

2. En el equilibrio existente entre la α-lactosa y la β-lactosa en solucion acuosa, esta ultima se encuentra en gran proporcion ¿Por qué?

3. En una mezcla de lactosa en equilibrio hay una pequeña cantidad en forma de aldehido libre sin embargo, la prueba de Benedict da positiva. Explicar este hecho.

4. ¿Qué porcentaje de lactosa se aislo de la leche? 5. ¿Qué resultado se obtuvo en la experiencia 2.9?6. Escriba las reacciones de formacion de acido mucico (exp. 2) a partir de

la lactosa y la galactosa.7. ¿Qué compuesto se forma al utilizar glucosa en la experiencia 2?8. Si se determinara la rotacion optica del acido mucico ¿Qué valor seria

de esperar? ¿Por qué?9. Hacer un dibujo de los cristales de mucato de potasio observados al

microscopio.10.En las experiencias 3.2 y 3.3 se pone de manifiesto la relacion existente

entre las hexosas y los compuestos heterociclicos de cinco miembros como el furano y el pirrol. ¿Cual es la estructura de estos compuestos? ¿Qué resultados se obtuvieron en estas experiencias?

PRACTICA No. 11

HIDROLISIS DE POLISACARIDOS

INTRODUCCION

La hidrolisis de una macromolécula puede efectuarse ulilizando diversos procedimientos; catalizando con acidos o bases fuertes, con catalizadores organicos e inorganicos y por medio de enzimas hidroliticas. Las enzimas son especificas en su moda de accion, tienen la particularidad de acelerar el desdoblamiento (digestion) de diversas moléculas, introduciendo una molécula de agua entre las uniones glicosidicas (en el caso de los polisacaridos). En el caso del almidon, casi todos los vegetales contienen dos enzimas hidroliticas diferentes, conocidas tradicionalmente como α-amilasa y β-amilasa. Ambas atacan Ia fraccion de amilosa y amilopectina en los enlaces α(1,4). Existen otros catalizadores, llamados enzimas desramificados, que hidrolizan especificamente el enlace α(1,6) presente en la amilopectina.

A diferencia de la celulosa, el almidon puede ser digerido por los seres humanos (y por la mayoria de los organismos) debido a la presencia de amilasa salival y amilasa pancreatica en las secreciones digestivas (la acción de ambas enzimas es parecida a la de la α-amilasa de las plantas), las cuales, en accion combinada con otras enzimas digestivas (sobre todo maltasa y enzimas desramificadoras), degradan por completo el almidon a α-D-glucosa, la cual es absorbida y metabolizada posteriormente.


Pipeta Pasteur Baño Maria Almidon al 1%

Vaso de p.p. de 50 ml Pipeta de 5 ml HCl conc.

Agitador Probeta graduada Lugol

2 Vasos de p.p. de 100 ml NaOH al 20%

12 Tubos de ensaye Papel pH

Tubo de ensaye grande Reactivo de Lucas

Placa excavada de porc. Reactivo de Benedict

o azulejo blanco NaCl 0.1 M

METOLOGIA

1 HIDRÓLISIS ACIDA DEL ALMIDON

1.1 Colocar 20 ml de la solucion de almidon al 1% en un vaso de precipitado de 100 ml, agregar 20 gotas de HCL conc. y calentar de modo que hierva suavemente. Agitar constantemente.

1.2 Cada 5 minutos, se toma una gota de la mezcla con una pipeta Pasteur y se deposita sobre una excavación de una placa de porcelana (o sobre un azulejo blanco).

1.3 Adicionar una gota de lugol y anotar el color producido.1.4 Continuar calentando hasta que ya no se produzca la coloracion azul con la

solucion indicadora de lugol (un color amarillo indica hidrolisis total).1.5 Tomar con una pipeta 1 ml del hidrolizado que queda en el vaso y colocarlo

en un tubo de ensaye. Ajustarle el pH a neutralidad, adicionando NaOH al 20% (aprox. 18 gotas).

1.6 Realizar la prueba de Benedict con el hidrolizado neutro.2 HIDROLISIS ACIDA CA TALLMDA DEL ALMIDON2.1 Colocar 10 ml de la solucion de almidon al 1% en un vaso de precipitado de

100 ml y agregar 3 ml del reactivo de Lucas (¡precaucion! causa quemaduras graves).

2.2 Calentar el vaso durante 3 minutos de modo que la mezcla hierva suavemente, dejar enfriar y tomar una muestra para realizar la prueba de lugol.

2.3 Neutralizar el hidrolizado del vaso, adicionando NaOH al 20)% (aprox. 8 ml).

2.4 Tomar una muestra de 1 ml del hidrolizado neutralizado y realizar la prueba de Benedict.

3 REACCION CON I3

3.1 En un tubo de ensaye se colocan 5 ml de la solucion de almidon al 1% y se agregan 2 gotas de lugol. Calentar el tubo a ebullicion.

3.2 Dejar enfriar el tubo de ensaye a temperatura ambiente. ¿Como se explica que ocurran estos cambios de color? (azul rojizo).

4 HIDROLISIS ENZIMATICA DEL ALMIDON4.1 Enjuagarse la boca con agua.4.2 Colectar unos 3 ml de saliva en un vaso de precipitado de 50 ml (una

persona normalmente secreta 1500 ml de saliva por dia). 4.3 Determinar el pH de la saliva utilizando papel pH.4.4 Utilizando una pipeta, se colocan 2 ml de saliva en una probeta graduada y

se diluyen con agua destilada hasta obtener un volumen final de 50 ml. 4.5 Preparar un lote de 10 tubos de ensaye, cada uno conteniendo 4 ml de

agua destilada y 5 gotas de lugol.4.6 En un tubo de ensaye grande, se agregan 10 ml de una solucion de

almidon al 1% y 2 ml de una solución 0.1 M de NaCl.4.7 Preparar un baño de agua a una temperatura de 38±2 °C e introducir el

tubo de ensaye que contiene la solucion almidon/NaCl.4.8 Adicionar 1 ml de la muestra diluida de saliva al tubo que contiene la

solucion almidon/NaCl y se mezcla perfectamente.

4.9 A intervalos de 1 minuto se pipetea 1 ml de la mezcla en digestion en uno de los tubos que contiene lugol.

4.10 Si Ia mezcla en digestion alcanza el "punto acromatico" en menos de 4 minutos, se debe diluir mas la muestra de saliva y se repite el experimento. Si la digestion toma mas de 10 minutos (se utilizan todos los tubos y no se observa el "punto acromatico”), se repite el experimento utilizando una menor dilucion.

OBSERVACIONES

Para propositos de este ultimo experimento, definiremos una unidad de amilasa como la cantidad de saliva que digiere 10 ml de una solucion de almidon al 1% en 4 minutos.

Por lo tanto, para calcular el número de unidades de amilasa en la muestra de saliva, se utiliza la siguiente formula:

1 ml (4minutos)

(x minutos paralamuestra)(y dilucién) = unidades

Por ejemplo si 1 ml de la muestra diluida (1:25) tomo 8 minutos, entonces:

1 ml 4min8min (25) = 12.5 unidades

CUESTIONARIO

1. Hacer un cuadro en el cual se comparen las diferentes condiciones utilizadas (pH, temperatura y catalizador) y el tiempo necesario para la hidrolisis del almidon, en cada uno de los distintos métodos empleados.

2. ¿Por qué se realiza la prueba de Benedict como parte de los experimentos?

3. ¿Por qué razon se realiza la prueba de lugol?

4. ¿Por qué es necesario neutralizar los hidrolizados para realizar la prueba de Benedict?

5. ¿Cual es el modo de accion de un catalizador?

6. Respuesu a la pregunta del inciso 3.2

7. ¿Por qué la hidrólisis enzimatica se realizo a una temperatura de 38±2 °C? `

8. ¿Que funcion tiene el NaCl durante la hidrolisis enzimática?

9. Elaborar una tabla con los resultados obtenidos en la hidrolisis enzimática. Anotando el nombre del donador de la muestra, el pH de la saliva y las unidades de amilasa salival (cunsiderar todos los donadores del grupo que realice la priactica).

10. Hacer una grafica con los resultados de la tabla de la pregunta anterior, en donde se grafique en el ejé las x’s el nombre del donador, en uno de los ejes de las y’s (el izquierdo) las unidades de amilasa y en el otro (el derecho) el pH.

11. ¿Cual es el rango "normal" de pH y de unidades de amilasa salival en el grupo donador?

PRACTICA No. 12

CUANTIFICACION DE VITAMINA C

INTRODUCCION

La unica vitamina para Ia cual es valedora una investigacién sencilla es la vitamina C (acido ascórbico). Esta investigacion puede utilizarse para indicar la presencia de acido ascorbico en un alimento y también puede usarse para calcular Ia cantidad que del mismo existe. El método que aqui se describe no se puede utilizar en alimentos fuertemente coloreados.

EI acido ascórbico es una sustancia que actua naturalmente como reductor. Por esta acción reductora, decolora la tintura azul de diclorofenol-indofenol, con la que se une, produciendo una solucion incolora. La cantidad de solución de tintura azul (de concentracion conocida), que se decolora por un cierto volumen de solucién problema, es una medida de la cantidad de acido ascorbico presente en la solucion.

El acido ascorbico es un antioxidante natural, razon por la cual inhibe el pardeamiento de frutas y verduras, pero llega un momento en que él mismo llega a oxidarse y de esta manera se inutiliza su accion. Por esto si se agrega acido ascorbico, hay un retraso en la aparición del pardeamiento. EI retraso es aun mayor, consiguiendo una concentracion alta de acido ascorbico. Es esta, una de las aplicaciones de la vitamina C en la tecnologia de los alimentos.

OBJETIVO

Determinar la presencia de vitamina C, cuantiticarla en jugos de naranja comerciales y demostrar su efecto de antioxidante natural.

MATERIAL REACTIVOS

Embudo de separacion Eter etilico

Bomba para vacio Carbon activado

Embudo de Buchner Acido oxalico

Mortero y pistilo Agua destilada

5 Tubos de ensaye Acido acético al 5%

Embudo de plastico Solucion de 2,6-diclorofenol-indofenol

Pipeta de 10 ml Acido ascorbico al 1%, 2.5% y 5%

Matraz volumétrico aforado de 250 ml HCI 2 M

Bureta Hortalizas y frutas

Pinzas para bureta Una marnzana

3 Matraces Erlenmeyer de 125 ml Jugos de naranja de diferentes marcas

5 Vidrios de reloj comerciales

Papel filtro y gasas

METODOLOGIA

1 VITAMINA C EN FRUTAS Y VERDURAS1.1 Preparar 5 ml de solucion de cada una de las frutas y verduras por

analizar. Utilizar mortero, pistilo, embudo, papel filtro y agua para ello. Colocar las soluciones preparadas en tubos de ensaye.

1.2 Agregar 2 ml de acido acético al 5% a cada una de las soluciones anteriores.

1.3 Finalmente añadir unas gotas de solucion de la tintura azul de diclorofenol-indofenol. La decoloracion de la tinturu indica la presencia de acido ascórbico.

2 EFECTO DE LA VITAMINA C COMO ANTIOXIDANTE2.1 Poner 5 trozos de manzana sobre vidrios de reloj y tratar a cada uno, con

una de las cinco soluciones siguientes:

A- ac. Ascorbico al 5% .

B- ac. Ascorbico al 2.5%

C- ac. Ascorbico al 1%

D- agua

E- HCl 2 M

2.2 Anotar el tiempo en que cualquier trozo llega a ponerse mas marron que el trozo E. Este actua como un testigo cuyo pardeamiento es imposible por la adicion de HCL 2 M.

3 CUANTIFICACION DE VITAMINA C (enjugos de naranja comerciales) 3.1 Preparacion de la muestra 3.1.1 Depositar 30-40 ml de jugo de naranja en un matraz Erlenmeyer de 125

ml y adicionar 0.2 gr de acido oxalico (¡precaucion! el ac. oxalico es venenoso).

3.1.2 Agitar el matraz hasta la disolucion total del Ac. oxalico y agregar un poco de Carbon activado.

3.1.3 Filtrar el jugo utilizando un embudo de Buchner y una bomba de vacio. Recibir el filtrado en un recipiente limpio.

3.1.4 La solucion resultante debe toner un color naranja palido y ser ligeramente transparente. Esta solucion se utiliza para la cuantificacion.

3.2 Preparacion de muestra (método alternativo)3.2.1 Depositar 30-40 ml de jugo de naranja en un matraz Erlenmeyer de 125

ml y adicionar 0.2 gr de acido oxalico (¡precaucion! el ac. oxalico es venenoso). Agitar el matraz hasta Ia disolucion total del ac. Oxálico.

3.2.2 Transferir la solucion a un embudo de separación y adicionar 20 ml de éter etilico (¡cuidado! el éter es altamente inflamable).

3.2.3 Agitar el embudo para extraer el color naranja. Evitar la formacion de una emulsion, ya que tardaria mucho en lograrse la separacion de las fases.

3.2.4 Dejar en reposo el embudo de separacion. El color naranja sera transferido al éter (capa superior) y la mayoria de la pulpa se concentrara en la frontera entre la fase acuosa y la etérea.

3.2.5 Se colecta la fase acuosa, dejando la pulpa y la fase etérea en el embudo de separacion.

3.2.6 La fase acuosa obtenida, se utiliza para la cuantiticacion.3.3 Estandarizacion del 2,6-diclorofenol-indofenol3.3.1 Pesar exactamente 50 mg de acido ascorbico y transferirlos a un matraz

volumétrico aforado de 250 ml que contenga 2 gr de acido oxalico solido.3.3.2 Disolver en un poco de agua destilada y aforar hasta la marca.3.3.3 Adicionar 25 ml de la solucion estandar de ac. ascorbico a un matraz

Erlenmeyer y diluir con 30 ml de agua destilada.3.3.4 Titular la solucion anterior, con la solucion de 2,6-diclorofenol-indofenol.

La solucion de tintura azul se pondra rosada al contacto con la solucion acida y se decolorara seguidamente por el acido ascórbico.

3.3.5 Continuar la adicion de solucion de tintura, hasta la formacion de una débil coloracion rosada persistente. En este momento se ha añadido suficiente cantidad de tintura para que reaccione con todo el acido ascórbico presente (5 mg).

3.3.6 Anotar el volumen en ml de solucion de tintura utilizados. La valoracion deberá repetirse al menos dos veces, y tendra que existir estrecha concordancia.

3.4 Titulacion de la muestra3.4.1 Poner en un matraz Erlenmeyer, 5 ml de la muestra de jugo preparado

en la experiencia 3.1 o 3.2.3.4.2 Titular la muestra de jugo con la tintura azul de 2,6-diclorofenol-

indofenol, tomando en cuenta las indicaciones dadas al estandarizar la tintura.

3.4.3 Si el punto de vire se logra con menos de 10 ml de tintura azul, el volumen de Ia muestra de jugo debe incrementarse a 10 ml o a mas si es necesario.

3.4.4 La titulacion debe repetirse hasta obtener resultados consistentes.3.4.5 Para calcular el contenido de vitamina C, se utiliza la siguiente ecuación.

mgde ac .ascorbico /100ml de jugo=(mlde tinturautilizados en lamuestra(5)(100))

(mlde tintura p/estandarizar )(mlde jugotitulado)

CUESTIONARIO

1 Elaborar una tabla con los resultados de la experiencia 1, en donde se indique la verdura o fruta analizada y su resultado positivo o negativo de la presencia de vitamina C.

2 ¿Qué resultados se obtuvieron en Ia exp. 2.2? Sacar conclusiones de los mismos.

3 ¿Por qué no se puede utilizar el HCI 2 M para inhibir el pardeamiento de las frutas?

4 ¿Qué finalidad tiene el agregar acido oxalico a las muestras de jugo?5 ¿Qué posibles errores pueden ocurrir durante una valoración?6 Elaborar una tabla que incluya los resultados obtenidos al cuatificar la

vitamina C, anotar la marca comercial y los mg de ac. ascorbico/100 de jugo (incluir los resultados de todos los jugos analizados).

7 FDA (Food Drug Administration) en los Estados Unidos en su normatividad referente a los jugos de naranja comerciales, maneja un valor estandar para el contenido de acido ascorbico de 40 mg/100 ml de jugo. Tomando en consideracion esto y los resultados de la tabla anterior, que se puede concluir para los jugos de las distintas marcas comerciales analizadas.

PRACTICA No. 13

AISLAMIENTO DE ACIDO OLEICO

INTRODUCCION

El aceite de oliva ha sido apreciado desde tiempo lnmemorial. Se ha utillzado como ingrediete en la preparación de alimentos. cosmeticos y modicamentos. Su presencia en nuestros dias aun ess muy importante. El aceite de oliva consiste principalmente de glicerol esterificado con acidos grasos. El mas importante constituyente del aceite de oliva es la trioleina (el glicerol esta esterificado con tres moléculas de acido oleico). Al lgual que otros triglicéridos, la trioleina existe como tres poliformas. El acido oleico presenta un doble enlace tipo cis y tiene la formula C17H33COOH, representa del 64-80% de los acidos grasos presentes en el aceite de oliva.

OBJETIVO

Aislar el acido oleico del aceite de oliva.


Matraz erlenmeyer 125 ml Aceite de oliva Acetona

Placa calefactora Trietilenglicol Hielo/acetona

2 vasos de p.p. de 100 ml KOH Urea

Embudo de separación Agua destilada Metanol

Embudo HCl conc.

Papel filtro Whatman No.1 Eter etílico

Baño Maria Sol. saturada de NaCl

Bomba p/vacio y E. Buchner

METODOLOGIA

1 SEPARACION DE ACIDOS GRASOS SATURADOS

1.1 Pesar 10 gr de aceite de oliva en un matraz Erlenmeyer de 125 ml, adicionar 20 ml de trietilenglicol y 2.0 gr de KOH.

1.2 Calentar la mezcla a 160 °C en una placa calefactora durante 10 minutos, para hiidrolizar los ésteres glicerol.

1.3 Dejar enfriar la mezcla. Agregar 50 ml de agua destilada y 10 ml de HCI concentrado.

1.4 Extraer la mayoria de los acidos grasos no-saturados presentes en la emulsion resultante, utilizando un embudo de separacion y tres porciones de 10 ml de éter etilico. Reunir los 30 ml de extraccion etérea.

1.5 Reducir el contenido de agua del extracto etéreo, lavando con una sulucion saturada de NaCl y por adicion de un poco de Na2SO4 anhidro.

1.6 Filtrar la mezcla y evaporar la solucion resultante a volumen constante utilizando un baño Maria (hacerlo en la campana de extraccion).

1.7 Agregar 75 ml de acetona y enfriar la mezcla en un baño de hielo/acetona (-15 °C), para crislalizar los acidos grasos saturados presentes.

1.8 Filtrar la mezcla para remover los cristales, utilizando papel fritro Whatman No. 1, embudo Buchner y bomba de vacio.

1.9 Finalmente se evapora el filtrado en baño Maria bajo campana de extraccion.

2 AISLAMIENTO DEL ACIDO OLEICO 2.1 Preparar una solucion de 10 gr de urea y 50 ml de metanol (¡cuidado! es

muy toxico, se absorbe por la piel), adicionar todo el volumen de esta solucion al filtrado obtenido en la experiencia 1.9

2.2 Enfriar la solucion en un baño de hielo/acetona, para cristalizar el complejo de inclusion urea-acido oleico.

2.3 Separar los cristales usando tiltracion al vacio (esto deja a los otros acidos grasos no saturadcs en el filtrado).

2.4 Transferir los cristales a un embudo de separacion y adicionar 50 ml de agua destilada.

2.5 Extraer tres veces utilizando 20 ml de éter etilico en cada ocasion y reunir los extractos etéreos.

2.6 Evaporar el éter etilico con un baño de agua hirviendo bajo la campana de extraccion, para obtener el acido oleico puro.

CUESTIONARIO

1 Escribir la formula de la trioleina y del acido oleico.2 ¿Qué caracteristicas presentan los cristales de acidos grasos saturados,

obtenidos en la exp. 1.8?3 ¿Como se podria demostrar que los cristales obtenidos en la exp. 1.8 son

de compuestos saturados?4 ¿Cuales son las caracteristicas toxicas del metanol y del eter etilico? ‘5 ¿Cuales son los acidos grasos no saturados que van en el filtrado de la

exp. 2.3?6 ¿Qué caracteristicas presenta el acido oleico puro?

PRACTICA No. 14

EXTRACCION DE LIPIDOSY ALGUNAS DE SUS PROPIEDADES

INTRODUCCION

El termino lipido se utiliza para describir a las sustancias grasas que son insolubles en agua pero solubles en solventes organicos tales como etanol, cloroformo y éter. Químicamente son esteres de acidos grasos de cadena larga y se clasifican de acuerdo a la naturaleza de su aocohol. La hidrolisis alcalina de los lipidos da como productos un alcohol y sales de sodio o potasio de los acidos grasos que los constituyen. Esto es conocido como saponificación y los productos de la hidrólisis frecuentemente son solubles en agua, a diferencia de los lípidos originales. Químicamente, se pueden dividir en dos grandes grupos: lípidos simples y lípidos compuestos. Los esteroides y las vitaminas liposolubles también se consideran como lípidos a causa de susu características de solubilidad, a estos compuestos se les conoce como derivados de lípidos. Sin embargo, muchos de los derivados de lípidos son alcoholes y no esteres y por tanto no pueden ser saponificados.

OBJETIVO

Realizar la extraccion de los fosfulipidos lecitina y cefalina de la yema de huevo, y determinar algunas de las propiedades generales de los lípidos.


20 Tubos de ensaye Eter etilico Etanol del 95% frio

Pipeta Pasteur con goma Acetona Hielo

3 Vasos de p.p. de 100 ml Agua destilada Huevo

Embudo Anhidrido acético Mantequilla

Agitador H2SO4 conc Margarina

Baño Maria Ciclohexano Manteca

Pinzas para tubo Ciclohexano Aceite de olivo

Bomba p/vacio y E. Buchner NaOH 6 M

Papel filtro Whatman No. 1 KMnO4 0.1 M

METODOLOGIA

1 EXTRACCION YSEPARACION DE CEFALINA Y LECITINA DE LA YEMA DE HUEVO

1.1 Separar la yema de un huevo y colocarla en un vaso de precipitado de 100 ml. previamente pesado y determinar el peso de la yema.

1.2 Agregar al vaso 18 ml. de éter etilico y agitar suavemente con la varilla de vidrio hasta homogenizar bien la mezcla.

1.3 Adicionar lentamente y sin dejar de agitar, 18 ml. de acetona. La acetona provoca la precipitacion de los fosfolipidos, en tanto que las grasas y el colesterol permanecen en solución.

1.4 Dejar la mezcla en reposo 10 min. y filtrar utilizando un embudo y papel Whatman No. 1 (previamente pesado). Guardar el filtrado.

1.5 Lavar el precipitado (contiene cefalina y lecitina) con 20 ml. d etanol bien frio, recibir el filtrado en un vaso seco y limpio previamente pesado. La lecitina es mas soluble en alcohol frio, por lo tanto en el papel filtro queda solamente la cefalina.

1.6 Extender la cefalina sobre el papel filtro y colocarlo sobre una hoja de papel dentro de una charola metalica.

1.7 Introducir la charola en un horno a 50 °C hasta que la cefalina esté completamente seca. Se deja enfriar y se pesa.

1.8 Para obtener la lecitina, se coloca a baño Maria el vaso de precipitado que contiene el filtrado obtenido en la experiencia 1.5 y se evapora Ientamente el alcohol.

1.9 Dejar enfriar el vaso con la lecitina, secarlo y pesarlo.2 SOLUBILIDAD DE LOS LIPIDOS2.1 Utilizando una pequeña cantidad de cada una de las muestras y 1.5 ml de

solvente, completar el siguiente cuadro de acuerdo al caracter de soluble (S), medianamente soluble (MS) o insoluble (I).

2.2 Tomando en cuenta los resultados obtenidos en el cuadro de solubilidad, colocar gotas de la mezcla mas soluble en un trozo de papel filtro.

2.3 Dejar secar las gotas y observer el resultado colocando el papel filtro frente auna fuente lumnosa.

2.4 Nuevamente considerando el cuadro de solubilidad, seleccionar una mezcla preparada con etanol y que haya resultado soluble.

2.5 Adionarle 1 ml de agua destilada y mezclar perfectamente.

Margarina Mantequilla

Manteca Aceite de olivo

Agua

Acetona

Cloroformo

Éter

Etanol

2.6 Observar la solucion inmediatamente después de agitar, dejar en reposo el tubo 10 minutos y observarlo nuevamente.

2.7 En 2 tubos de ensaye colocar 3 ml de agua destilada, agregar 10 gotas de aceite de oliva a uno de los tubos y al otro 10 gotas de una solucion de lecitina disuelta en aceite de oliva (se repara agregando 2 ml de aceite de oliva al vaso que contiene la lecitina obtenida en la experiencia 1.9 y agitando vigorosamente).

2.8 Mezclar fuertemente cada tubo y comparar la solubilldad.3 DETECCION DE ACIDO GRASOS SATURADOS Y NO SATURADOS

Estandarización 3.1 Colocar en tubos por separado, 1 ml de ciclohexano y 1 ml de ciclohexeno

(¡cuidado! son inflamables).3.2 Agregar a cada tubo 1 ml de NaOH 6 M y 2 ml de KMnO4 0.1 M3.3 Tapar los tubos, agitarlos y colocarlos en un baño Maria durante 20

segundos. 3.4 Anotar la coloracion que se observa en cada uno de los tubos después de 2

minutos. lnsaturaciones en los alimentos

3.5 Obtener porciones de 1 ml de mantequilla, margarina, manteca y aceite de oliva, y colocarlas en tubos diferentes.

3.6 Con cada tubo repetir las experiecias 3.2, 3.3 y 3.4 (la agitacion debe ser cuidadosa y vigorosa para asegurar suficiente contacto entre los reactantes).

3.7 Anotar los resultados comparando con la prueba de estandarizacion. 4 PRUEBA DE LIEBERMANN-BURCHARD

Esta prueba es rutinariamente aplicada para detectar la presencia de colesterol y compuestos relacionados.

4.1 Colocar en un Iubo de ensaye 0.5 ml del filtrado obtenido en la experiencia 1.4.

4.2 Adicionar 2 ml de cloroformo y agitar hasta la disolucion total.4.3 Agregar 1 ml de anhidrico acetico. 4.4 Finalmente, con mucho cuidado, añadir 2 ml de H2SO4 conc. por las

paredes del tubo. Un color verde indica la presencia de colesterol.4.5 Realizar las experiencias 4.2, 4.3 y 4.4, agregando en diferentes tubos una

muy pequeña cantidad de margarina, mantequilla, manteca y aceite de olivo.

CUESTIONARIO

1. Calcular el rendimiento de lecitina y cefalina obtenido de la yema de huevo (en peso fresco).

2. ¿Qué carateristicas presentan la lecitina y la cefalina abtenidas?

3 ¿Se observaron signos de oxidacion al exponer al aire a la cefalina y la lecitina? ¿Cuales?

4. Transcribir el cuadro de solubilidad y anotar conclusiones.

5. Explicar, porque al poner una gota de la solucion de lipidos en el papel filtro, queda una mancha al secarse (experiencia 2.3).

6. Describir lo que se observo en la experiencia 2.6 y concluir acerca de lo observado.

7. ¿Que efecto tiene la lecitina sobre la solubilidad del aceite de oliva? ¿Como se explica tal efecto? (experiencia 2.8)

8. ¿Cual es el proposito de realizar la prueba de estandarizacion? (experiencia 3)

9. Describir lo observado en la experiencia 3.4

10. ¿Qué resutados se obtuvieron en la experiencia 3.7? ¿Qué se puede concluir acerca de los mismos?

11. Anotar los resullados obtenidos en la experiencia 4

PRACTICA No. 15

INDICES DE SAPONIFICACION, DE YODO Y DE

PEROXIDO, EN GRASAS Y ACEITES

INTRODUCCION

Existe un gran numero de anllisis para evaluar las caracteristicas fisicas y quimicas de las grasas y aceites, pero los mas comunes son los desarrollados por la American Oil Chemists’ Society (AOCS) que muchos paises han adoptado posteriomente. Los métodos instrumentales de cromatografia y de resonancia magnética nuclear actualmente son muy impactantes y probablemente en un futuro proximo se desarrollen algunas técnicas que reemplacen totalmente a los analisis quimicos clasicos de Iaboratorio. Actualmente los indices de yodo, de saponificacion y de peróxido, el punto de fusion, el indice de solidificacion de acidos grasos (titer) y la prueba fria, son las determinaciones rutinarias que mas se emplean para caracterizar e identificar una grasa o aceite. Los resultados de todos estos análisis pueden ofrecer mucha informacion sobre la naturaleza, el origen y el posible comportamiento de la grasa o aceite en diferentes condiciones de procesamiento en la elaboracion de alimentos.

OBJETIVO

Realizar tres de las determinaciones rutinarias que mas se emplean en la industria alimentaria, para la caracterización de aceites y grasas comerciales.

MATERIAL REACTIVOS

Balanza granataria Soln. alcoholica de KOH 0.5 N

2 Matraces Erlenmeyer de 500 ml Fenolftaleina

2 Tapones de neopreno monohoradados HCl 0.5 N

2 Tapones de neopreno sin horadacion CHCl3 o CCI4

Tubos de vidrio de 1 m Soln. de Wijs

Baño Maria Agua desiilda

Bureta KI al 10%

Pinzas dobles para bureta Na2S2O3 0.1 N (recién preparada)

Casquetito de vidrio Almidon al 1%

Papel aluminio Solvente A

Solvente B

Na2S2O3 0.002 N

Grasas y aceites

METODOLOGIA

1 INDICE DE SAPONIFICACION

La determinacion del indice de saponificacion, cuya medida indica Ia cantidad de materia saponificable presente, se expresa como el numero de mg de KOH requeridos para saponificar 1 gr de muestra.

1.1 En un matraz Erlenmeyer de 500 ml colocar 1 gr de muestra (grasa o aceite) y agregar 25 ml de la solución alcoholica de KOH 0.5 N.

1.2 Cerrar el matraz con un tapon de neopreno monohoradado y atravesado con un tubo de vidrio de 1 metro de Iongitud.

1.3 Agitar vigorosamente y correr un blanco.1.4 Colocar los matraces en baño Maria a ebullicion durante 30 minutos,

agitando de vez en cuando.1.5 Retirar los matraces del baño y agregar 8-10 gotas de fenolftaleina a cada

uno.1.6 Valorar el exceso de potasa en la muestra, usando HCI 0.5 N1.7 Titular también el blanco.

Calculos:De Ia diferencia entre la cantidad de HCI 0.5 N utilizada en Ia prueba en blanco, y la cantidad empleada en Ia muestra, se determina el indice de saponificacin.

Ind. De saponificacion = (mI HCI bco .−ml HCI muestra)(0.5)(56.1)

gr demuestra

Para Ia interpretacion de resultados, considerar Ia siguiente escala de valores:

ACEITE O GRASA MINIMO MEDIO MAXIMO

Oliva 185 190 194

Uva 185 190 195

Mani 186 190 194

Girasol 188 192 194

Maíz 188 192 195

Algodón 191 193 196

Coco 246 253 260

Manteca 221 227 233

Cebo vacuno 193 195 198

2 INDICE DE YODO

Este indice se define cumo el numero de gramos de yodo que reaccionan con 100 gr. De lípidos, y es una medida del promedio de dobles enlaces o insturaciones que contienen los aceites y las grasas.

2.1 Pesar 0.5 gr de muestra detro de un matraz Erlenmeyer de 500 ml con tapon.

2.2 Disolver la muestra en 15 ml de cloroformo o tetracloruro de carbono. Calentar si es necesario empleando un baño Maria y la campana de extracción.

2.3 Dejar enfriar complemente. 2.4 Hacer un blanco en otro matraz, poniendo 15 ml de cloroformo o

tetracloruro de carbono, pero sin muestra.2.5 Agregar a cada uno de los matraces 25 ml de solucion de Wijs.2.6 Agitarlos vigorosamente y dejarlos reposar justo 60 minutos en la

oscuridad (envolver totalmente los matraces con papel aluminio.2.7 Agregar 150 ml de agua destilada y 20 ml de solucion de KI al 10% a cada

matraz (enjuagar el tapon y las paredes del matraz).2.8 Titular la solucion con Na2S2O3 0.1 N agregandolo lentamente, con

agitacion vigorosa y constante, hasta que el color amarillo casi desaparezca.

2.9 Agitar fuertemente y adicionar 1 ml del indicador de almidon y titular con agitacion vigorosa hasta la desaparicion del color azul.

2.10 Titular el blanco y la muestra. La muestra debe ser valorada antes de 30 minutos (contados a partir de que se realice la exp. 2.7), en casa contrario el analisis no es valido.Calculos:

Ind. De Yodo¿(ml Na2 S2O 3bco .−ml Na2 S2O 3muestra ) (0.1N )(12,692)

gr demuestra

Escala de valores de algunos aceites:

ACEITE MINIMO MAXIMO ACEITE MINIMO MAXIMO

Oliva 78 90 Maíz 107 120

Mani 93 106 Soja 125 135

Nabo 102 108 uva 130 140

Sésamo

103 105 Girasol 123 137

Algodón

104 117 cacahuate 88 98

Coco 6 10 Ricino 83 84

3 INDICE DE PEROXIDOSe define como los milimoles de peroxido (-0-0-) por Kg de aceite. Esta prueba proporciona una idea del grado de oxidacion de una grasa o aceite, y con ello un indice de su mayor o menor propension al enranciamiento.

3.1 Pesar exactamente 0.2 gr de aceite en un casquetito de vidrio, previamente tarado.

3.2 lntroducirlo en un matraz Erlenmeyer con tapon y agregar 25 ml del solvente A.

3.3 Agitar suavemente para disolver la muestra.3.4 Agregar 1 ml del solvente B. Agitar por rotacion suave durante 60

segundos exactos a la oscuridad (envolver totalmente el matraz con papel aluminio).

3.5 Inmediatamente agregar 100 ml de agua destilada recientemente hervida y fria, y 2 ml de solucion de almidon al 1%.

3.6 Titular con solucion de Na2S2O3 0.002NCalculos

Ind.de peroxido =mlde Na2S2O 3gr de muestra

Escala de valores para este indice:

3 Aceite fresco

10 Aceite viejo pero no rancio

15 a 20 Aceite que comienza a enranciarse

CUESTIONARIO

1 ¿Que utilidad tiene el conocer el indice de saponificacion de una grasa o aceite?

2. Calculo del indice de saponificacion de la muestra.

3. ¿Qué relacion existe entre el peso molecular del material a saponificar y su indice de saponificacion?

4. Calculo del indice de yodo de la muestra.

5. Tomando como base el indice de yodo ¿Qué es un aceite secante, semisecante o no secante?

6. ¿Qué problema se puede presentar cuando se determine el indice de yodo de un aceite secante?

7. ¿Cual es el fundamento quimico de la determinacion del indice de peroxido?

8. Calculo del indice de peroxido de la muestra.

9. ¿Que limitantes tiene la determinación del indice de peróxido, con respecto a la oxidacion de una grasa o aceite hasta compuestos con carbonilos e hidroxilos?

PRACTICA No. 16

PREPARACION DE UN JABON

INTRODUCCION

El jabon, tal como lo conocemos hoy en dia, no apareció hasta el siglo I de nuestra era. Hasta ese momento la ropa se lavaba mojandola y restregandola sobre roca. Algo mas tarde se desucubrio que ciertas hojas, raices, frutos y cortezas formaban espumas jabonosas que solubilizaban y eliminaban la suciedad. Actualmente se conoce a estas sustancias naturales por el nombre de saponinas.

Las saponinas fueron probablemente los primeros “jabones” conocidos. También se encuentran entre los primeros productos contaminantes, ya que son toxicos para los peces.

EI descubrimiento de lo que en la actualidad llamamos jabon probablemente tuvo lugar a Io Iargo de siglos, a partir de experimentos con sustancias grasas y alcalinas. Plinio el Viejo ya describe la fabricacion del jabon en el siglo I. En Pompeya, por ejemplo, ya existia una pequeña fabrica de jabon. Sin embargo, durante la Edad Media la limpieza personal o de los vestidos carecia de importancia. Los que podian permitirselo usaban perfumes para ”enmascarar” su olor corporal. Los perfumes, como los vestidos, eran para los ricos un simbolo o indicadcr de su "status" social. El interés por la limpieza volvio a aparecer en el siglo XVIII cuando se empezaron a descubrir diversos microbios causantes de enfermedades.

El proceso de fabricacion del jabon se ha mantenido practicamente inalterado durante 2000 años. Se basa en la hidrolisis alcalina (saponificacion) de una grasa, es decir, en el tratamiento en caliente de esta con una base. La solucion alcalina se obtenia originalmente de la lixiviacion de cenizas o de Ia evaporacion de aguas alcalinas naturales, pero hoy en dia se emplea el NaOH o el KOH. La solucion alcalina descompone la grasa en sus componentes: un alcohol (glicerol) y una sal de un acido graso de cadena larga (jabon). Cuando se añade sal común el jabon precipita. Se lava para limpiar de restos de hidroxido y se funde dandole la forma que convenga.

OBJETIVO

Pparacion de un jabon a partir de una grasa animal o vegetal (aceite), y ensayos con el mismo.


Vaso de p.p. de 400 ml Estufa Agua destilada

Vaso de p.p. de 250 ml Balanza granataria NaOH

Vaso de p.p. de 100 ml Bomba de vacio Etanol del 95%

Baño Maria Embudo Buchner NaCl

Abatelenguas Hielo

Papel filtro CaCl2, al 4%

Matraz Erlenmeyer 125 ml Na3PO4

con tapon de neopreno Grasa o aceite

METODODOGIA

1 PREPARACION DE JABON

1.1 Preparar una disolucion de 10 gr de NaOH en una mezcla de 18 ml de agua y 18 ml de etanol del 95%.

1.2 Poner 10 gr de manteca de cerdo (o de otra grasa o aceite) en un vaso de precipitado de 250 ml y agregarle la solucion anterior.

1.3 Calentar la mezcla en un baño de agua durante unos 30 minutos, durante los cuales, y para evitar la formacion de espuma, se iran añadiendo poco a poco 40 ml de una mezcla al 50% de etanol y agua. Mantener una agitacion constante.

1.4 Preparar una solucion de 50 gr de NaCl en 150 ml de agua en un vaso de precipitado de 400 ml. Si es necesario, calentar el vaso para favorecer la disolucion de la sal, pero antes de continuar es conveniente enfriar la solucion.

1.5 Agregar rapidamente la grasa saponificada sobre la solucion fria de NaCl.1.6 Agitar vigorosamente durante unos minutos y enfriar hasta temperatura

ambiente en un baño de hielo.1.7 Recoger el precipitado formado por filtracion al vacio con un embudo

Buchner y lavarlo dos veces con agua helada.1.8 Dejar pasar aire a través del precipitado hasta que quede medianamente

seco.1.9 Secar el producto en una estufa, pesarlo y calcular el rendimiento.2 ENSAYOS CON JABON2.1 Colocar 0.15 gr del jabon obtenido y 10 ml de agua destilada en un matraz

Erlenmeyer de 125 ml.2.2 Disolver el jabon, cerrar el matraz con un tspon de neopreno y agitar con

fuerza durante 15 segundos.2.3 Dejarlo reposar durante 30 segundos y observar el nivel de la espuma.2.4 Agregar 4 gotas de solucion de CaCl2 al 4%2.5 Agitar vigorosamente la mezcla 15 segundos y dejar reposar 30 segundos.

Observar el efecto del CaCl2 sobre la formacion de espuma.

2.6 Añadir 1 gr de fosfato de sodio y agitar de nuevo 15 segundos, dejar en reposo 30 segundos y observar.

CUESTIONARIO

1. ¿Por qué Ias sales de potasio de los acidos grasos resultan ser jabones mas blandos?

2. ¿Por qué el jabon que se obtiene del aceite de coco es tan soluble?

3. ¿Por que al agregar la solucion de NaCl precipita el jabon?

4. ¿Por qué se utiliza para la saponificacion una mezcla de etanol-agua en lugar de agua sola?

5. ¿Por qué limpia un jabon?

6. ¿Qué ingredientes se le pueden añadir a un jabon? ¿Con que fines?

7. ¿Qué efecto tiene el CaCl, sobre la formacion de la espuma?

8. ¿Qué es el agua dura?

9. ¿Qué efecto tiene el fosfato de sodio sobre la formacion de espuma?

10. ¿Como puede eliminarse la dureza del agua?

11. Al hervir el agua, ¿Cambia de dureza? ¿Tiene esto alguna relacion con la costra blanca que aparece en el fondo de los recipientes que frecuentemente se utilizan para hervir agua? ¿Cuales pueden ser las consecuencias?

PRACTICA No. 17

MITOSIS EN APICE RADICAL DE HABA (Vicia faba)

INTRODUCCION

En la década de 1860, F. Miescher aislo de los nucleos celulares una sustancia acida a la que dio el nombre de nucleina y mas tarde, acido nucleico. La funcion biologica de este material no se descubrio sino casi un siglo después, cuando (en la década de 1940) Avery, MacLeod y McCarty establecieron que ese material nucleico acido y especialmente el DNA- contenia la informacion hereditaria. Cuando Watson y Crick informaron en 1953 que habian resuelto la astructura molecular del DNA, dio comienzo una nueva era en la bioquimica y la biologia.

Existen dos clases de acidos nucleicos presentes en todo organismo viviente: acido ribonucleico (RNA) y acido desoxirribonucleico (DNA). Por otra parte, los virus contienen un solo tipo, sea RNA o bien DNA. Entre las funciones biologicas de los acidos nucleicos cabe mencionar el almacenamiento, la replicacion, la recombinacion y la transmision de informacion genética. En resumen, son las moléculas que determinan lo que es y hace cada célula viva.

La division celular (Mitosis) es un proceso biologico cuya caracteristica principal es asegurar la continuidad de los rasgos hereditarios en los seres vivos, transmitiéndolos de una genencién a otra. Este proceso es una particularidad de las células somaticas cuya funcion primordial es el crecimiento y desarrollo, permitiendo mantener el número e identidad de los cromosomas de Ia célula de la cual derivan. Es importante señalar que en organismos unicelulares la division celular equivale a la reproduccion.

OBJETIVO

Observar y diferenciar las distintas fases en que se lleva a cabo la division celular en apices radicales de haba (vicia faba). Profase, metafase, anafase y telofase.

MATERIAL REACTIVOS

Lámpara de alcohol Soln. Aceto-orceina

Vidrio de relej Soln. Farmer

Estuche de diseccion Ac. Acético al 45%

Papel secante HCI 1 N

Porta y cubreobjetos 5 Semillas de haba .

Vaso de p.p. de 150 ml

Microscopio

METODOLOGIA

1 OBTENCION DEL MATERIAL1.1 Para obtener los apices radicales de haba, se colocan las semillas en una

maceta pequeña con bastante humedad. Por lo menos con 4 dias de anticipacion a Ia practica.

1.2 La semillas deben quedar con la caruncula hacia abajo y que apenas queden cubiertas por la tierra.

1.3 Asegurarse que diariamente tengan humedad.2 FIJACION2.1 Una vez germinadas las semillas se toman los apices radicales y se fijan en

solucion Farmer por 15 a 20 minutos a 60 °C.3 PROCESO CITOLOGICO3.1 Colocar una porcion de 1 a 2 cm del apice radical en un vidrio de reloj que

contenga una mezcla de 10 ml de aceto-orceina y 1 ml de HCI 1 N.3.2 Calentar el vidrio de reloj sobre una lámpara de alcohol de 3 a 4 veces en

un lapso de 10 minutos. Evitar que llegue a ebullicion.3.3 Transferir aproximadamente 1 mm del apice a un portaobjetos y se agrega

una gota de colorante diluido (acetato-orceina/ac.acético al 45% 1:1 v/v), tratando de desmenuzar el tejido con una aguja.

3.4 Calentar nuevamente, pasando el portaobjetos sobre la lampara de alcohol y evitando que la preparación llegue a ebullicion.

3.5 Utilizando papel, se sbsorbe la mayor cantidad posible de la solucion y se agrega nuevameme una gota de colorante diluido.

3.6 Repetir las exp. 3.4 y 3.5 de dos a tres veces.3.7 Una vez que se absorbe la solucion (del ultimo calentamiento), se agrega

una gota de aceto-orceina sobre el tejido y se coloca el cubreobjetos. Calentar nuevamente sin llegar a ebullicion.

3.8 Cubrir la preparación con papel secante y presionar ligeramente con Ia yema del pulgar.

3.9 Observar la preparacion al microscopio con el objetivo 10X y si es necesario se presiona por segunda vez con mas fuerza.

3.10 Sino es suficiente con la presion aplicada, se agrega una gota de ac. acético al 45% y se calienta sin llegar a ebullicion. Posteriormente se presiona como se indico en Ia exp. 3.8

3.11 Utilizando el objetivo de 10X es mas facil encontrar las fases de la mitosis, si se localizan las células adecuadas, se cambia al objetivo de 40X para observarlas con mayor detalle.

3.12 Esquematizar cada una de las fases de la división celular observadas en el microscopio.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué ventajas representa la utilizacion de apices radicales en estudios citogenéticos?

2. ¿En qué consiste cada una de las fases mitoticas?

3. ¿Qué es la cariocinesis?

4. ¿Qué es la citocinesis?

5. ¿Qué es la eucromatina?

6. ¿Qué es la heterocromatina?

7. Esquemas de la experiencia 3.12

PRACTICA No. 18

T E R P E N O S

INTRODUCCION

Sometiendo a destilacion suave las partes mas fragantes de una planta se puede aislar una mezcla de las sustancias volatiles responsables de su olor o aroma caracteristico. A este”concentrado" de la planta se le suele dar el nombre de aceite esencial. En la actualidad los métodos mas usuales para obtener dichas esencias vegetales son destilación por arrastre de vapor y la extraccion con solventes organicos.

Las primeras investigaciones sobre la composicion quimica de los aceites esenciales, demostraron que, entre los constuyentes fundamentales habia hidrocarburos de formula C10H16; a estos hidrocarburos de 10 carbonos se les llamo terpenos. La palabra terpeno se refiere a una estructura de hidrocarburo derivada de la union de dos o mas unidades de isopreno [CH2=C(CH3)-CH=CH2]. Luego se descubrió que algunos constituyentes de los aceites esenciales, que también contenian 10 atomos de carbono (monoterpenos), poseian funciones oxigenadas (alcoholes, cetonas y aldehidos, principalmente). Por utro lado, de las plantas también pueden aislarse a menudo otros componentes menos volatiles, que tienen 15 C (sesquiterpenos), 20 C (diterpenos), 30 C (triterpenos) o 40 C (tetraterpenos).

El Iicopeno es un pigmento rojo del jitomate, un carotenoide de 40 C (tetraterpeno) formado por 8 unidades de isopreno. El β-caroteno, pigmento amarillo de la zanahoria, es un isomero del licopeno, en el cual los dobles enlaces en C1 – C2 y C1’ - C2’ se han sustituido por enlaces entre C1 - C6 y C1’ - C6' para formar anillos. El croroformo en cada caso es un sistema de 11 dobles enlaces cunjugados en posicion trans; al cerrarse los dos anillos dan β-caroteno, que es menos coloreado que el licopeno.

La presencia de dobles enlaces permite la bromacion de estos tetraterpenos y su distinto color su cromatogzfia.

OBJETIVO

Obtencion de un aceite esencial por arrastre de vapor, caracterizacion de grupos funcionales de dicho aceite, bromacion y cromatografía de carotenoides.


Balanza Pinzas para tubo de ensaye Agua destilada

2 matraces redondos 500 ml Embudo de talle corto Acetona

2 Pinzas simples p/bureta Probeta Cloroformo

2 Tapones bihoradados Agitador Na2SO4 anhidri

2 Tapones monohoradados Mortero con pistilo Etanol

2 M. Erlenmeyer de 125 ml Pipeta Pasteur Soln. 2,4 DNFH

Refrigerante de tubo recto Tapon ranurado Reactivo de Schiff

Pinzas tres dedos 2 Anillos Reactivo de Tollens

Tubo de vidrio recto Nuez Agua de bromo saturado

2 Tubos de vidrio acodados Cuerpos de ebullición Solvente p/cromatografia

Embudo de separación 2 Rejillas de asbesto Arena

Vaso de p.p. de 400 ml 2 Soportes universales Canela molida

Tubo de ensaye pequeño Papel aluminio Jugo de tomate

Tubo de ensaye grande Hojas verdes

METODOLOGIA

1 EXTRACCION DEL ACEITE ESENCIAL DE CANELA

El aceite esencial de canola (Cinnamonum zeylanicum), tiene 85% de cinamaldehido (trans-3-fenilpropenaI).

1.1 Montar un aparato como el que se muestra en la figura.

1.2 En el matraz [A] se adicionan 200 ml de agua y unos cuerpos de ebullición1.3 Al matraz [B] se le ponen 15 gr de canela molida y 100 ml de agua caliente.1.4 Se abre la llave del agua de entrada al refrigerante [C].1.5 Se pasa vapor a través del matraz [B], a velocidad lenta pero

continua.Calentando primeramente el matraz, [A] y cuando comienza a hervir el agua se procede a calentar suavememe el matraz [B] para evitar Ia condensacion del agua. Se regresa posteriormente al calentamiento en el matraz [A].

1.6 Se destila hasta que se hayan recogido 100 ml (para recoger el destilado emplear un Erlenmeyer [D] de 125 ml.

1.7 Para imterrumpir la destilación, basta con suprimir el calentamiento en el matraz [A].

1.8 Pasar el líquido destilado a un embudo de separacion y extraer con 2 porciones de 10 ml de cloroformo. Reunir las fases orginicas y desechar la fase acuosa.

1.9 Secar con una pequeña cantidad de Na2SO4 annhidro.1.10 Filtrar la sulucion y evaporar practicamenre todo el solvente sobre un

baño Maria, en la campana de extraccion. 1.11 Depositar el concentrado en un tubo de ensaye pequeño previamente

pesado, y concentrar el contenido del tubo mediante calefaccion cuidodosa en baño Maria, hasta obtener un residuo aceitoso.

1.12 Secar el exterior del tubo y pesarlo. Calcular el rendimiento sobre la cantidad de corteza de canela de partida.

2 GRUPO FUNCIONAL PREDOMINANTE Se caracteriza el grupo funcional predominante de los terpenos del aceite esencial de canela.

2.1 A una gota de aceite esencial, se le agregan 2 gotas de etanol y 1 gota de una solución de 2,4-dinitrofenilhidrazina (2,4-DNFH) Los precipitados rojos indican carbonilos aromaticos, los naranja, carbonilos α ,β insaturados y los amarillos, carbonilos saturados.

2.2 A una gota de aceite esencial, se Ie agregan 2 gotas de reactivo de Schiff. Los aldehidos dan coloncion violeta o rosa-azuloso con este reactivo.

2.3 Colocar 0.5 ml de aceite esencial (o el aceite restante si es menor la cantidad) en un tubo de ensaye y agregar 1 ml de reactivo de Tollens. Introducir el tubo en un baño Maria durante 10 minutos. Observar y anotar el resullado.

3 BROMACION DE CAROTENOIDLES 3.1 Colocar 40 ml de jugo de tomate en una probeta graduada. 3.2 Agregar 8 ml de una sulucion saturada de agua de bromo, empleando una

varilla de vidrio para evitar que caiga con fuerza sobre el jugo.3.3 Agitar con la varilla de vidrio solamente la parte superior de esta mezcla,

hasta la aparicion de un color azul.3.4 Agregar 2 ml más de agua de bromo operando como en las exp. 3.2 y 3.3

hasta la formacion de un color verde.3.5 Repetir el paso 3.4 dos veces mas, hasta la aparicion de un color amarillo

primero y naranja después.3.6 ¿Por qué ocurre la formacion de este "arcoiris' al bromar los carotenoides? 4 SEPARACION DE PIGMENTOS NATURALES4.1 Macerar en un mortero 3 6 4 hojas de alguna planta verde, con 3 ml de

acetona y una pequeña cantidad de arena.4.2 Filtrar para separar el material insoluble.4.3 Utilizando una pipeta Pasteur, se aplican gotas del filtrado sobre una tira de

papel filtro de 18 cm. Secar la gota después de cada aplicación y continuar hasta concentrar la mancha.

4.4 Efectuar el cromatograma en un tubo cerrado, utilizando el solvente cromatografico.

4.5 El solvente cromatografico debe colocarse en el tubo 30 minutos antes de efectuar el cromatograma, para saturar la atmosfera de la camara (tubo de ensaye).

4.6 El tubo de ensaye debe envolverse en papel aluminio, para proteger los pigmentos de fotodescomposicion y para reducir los gradientes térmicos en el sistema cromatogratico.

4.7 Después de que el solvente cromatografico ha llegado a una distancia de 1 cm antes del tapon (aprox. En 30 minutos), se retira el papel filtro, se seca al aire y se marcan con un lapiz las zonas coloridas que se observan.

Carotenos Amarillo-naranja

Luteína Amarillo

Violaxanthina Amarillo

Clorofila a Verde

Clorofila b + Neoxantina

Amarillo - verde

CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son las caracteristicas organolépticas del aceite esencial de canela?

2. ¿Cuál fue el rendimiento del aceite esencial obtenido?

3. ¿Qué resultados se obtuvieron en las exp. 2.1, 2.2 y 2.3?

4. ¿Qué es desterpenar un aceite esencial?

5. ¿Como se desterpena un aceite esencial?

6. Respuesta a la pregunta de la exp. 3.6

7. Observaciones y resultados pedidos en la exp. 4.5

8. ¿A qué pigmentos corresponden cada una de las manchas obtenidas en el cromatograma?

PRACTICA No. 19

EXTRACCION DE COLESTEROL

INTRODUCCION

Los esteroides forman un grupo importante de productos naturales, cuya caracteristica esencial es la estructura tetraciclica de ciclopentanoperhidrofenantreno. Los podemos encontrar tanto en animales como en plantas, aunque los mas importantes se hallan en los primeros en donde cumplen varias funciones esenciales. Las hormonas masculinas y femeninas de los mamiferos son esteroides, como también lo son los acidos biliares y las hormonas de la corteza adrenal.

El esteroide mas abundante es el colesterol. Se encuentra en todos los tejidos de los mamiferos, siendo particularmente abundante en la espina dorsal, en el cerebro y en los calculos biliares. En un hombre de 75 Kg de peso hay unos 250 gr. de colesterol en promedio. Gracias a su amplia distribucion fue el primer esteroide que se aislo. Sin embargo, debido a su complicada estructura, pasaron 160 años entre su descubrimiento (1770) y la determinacion gruesa de dicha estructura en 1932. Posee 8 centros asimétricos y son posibles, por tanto, 2n o 256 estereoisomeros, se precisaron otros 23 años (1955) hasta que se pudo elucidar su estructura tridimensional.

Los mamiferos poseen la capacidad de absorber colesterol de su alimentacion, pero pronto se comprobo que excretaban mas del que cunsumian. Por tanto, deben ser capases de sintetizarlo. De hecho, se ha demostrado que todos los tejidos pueden hacerlo en mayor o menor grado.

La importancia del colesterol proviene del hecho de ser uno de los primeros intermediarios en la biosintesis de todos los demas esteroides.

OBJETIVO

Extraccion y purificación de colesterol partiendo de cálculos biliares humanos.

MATERIAL REACTIVOS

2 Matraces Erlenmeyer de 125 ml Dioxano

Embudo de pliegues Metanol

Placa calefactora Carbon activado

2 Vasos de p.p. de 400 ml Agua destilada

Vaso de p.p. de 250 ml Eter etilico anhidro

Embudo Buchner Br2+CH3COONa/ac. acético

Balanza Hielo

Gotero Acido acético glacial

Agitador Zn en polvo

Embudo de separacion NaOH al 10%

2 Tubos de ensaye Papel tornasol azul

Microscopio Soln. saturada de NaCl

Papel filtro Na2SO4 anhidro

Bomba de vacio Cloroformo

Anhidrido acético

H2SO4 conc.

Calculos biliares

METODOLOGIA

1 AISLAMIENTO1.1 Pesar 2 gr de calculos biliares triturados, en un matraz Erlenmeyer de 125

ml.1.2 Añadir 10 ml de dioxano, calentar Ia mezcla agitando suavemente para que

se disgregue el solido y se disuelva mejor el colesterol (calentar sobre placa calefactora).

1.3 Filtrar en caliente en un filtro de pliegues; para ello es aconsejable calentar el embudo previamente (el residuo pardo que quedara en el filtro es la bilirrubina).

1.4 Diluir el filtrado con 10 ml de metanol.

1.5 Agregar un poco de carbon activado para decolorar la solucion resultante y calentarla en un baño de vapor.

1.6 Filtrar en caliente rapidamente a través de un filtro de pliegues.1.7 Calentar de nuevo Ia disolucion verdosa y añadir agua gota a gota hasta

que se enturbie (de este modo se consigue mantener saturada la solucion en caliente).

1.8 Dejar enfriar la solucion para que cristalice el colesterol.1.9 Separar los cristales por filtracion al vacio en un embudo Buchner. Lavarlos

con metanol frio y dejarlos en el embudo hasta que se sequen. Pesar el producto.

2 BROMACION2.1 En un matraz Erlenmeyer de 175 ml, disolver 1 gr del colesterol obtenido en

10 ml de éter etilico anhidro es posible que sea necesario calentar suavemente en un baño de vapor (¡cuidado! es muy inflamable).

2.2 Con Ia ayuda de un gotero añadir lentamente 5 ml de una solucion de bromo y acetato de sodio en aicido acético (¡precaucion! esta soln. produce quemaduras si entra en contacto con la piel), hasta obtener un color amarillento persistente.

2.3 El dibromocolesterol empezara a cristalizar al cabo de 1 minuto más o menos. Enfriar con hielo y agitar para obtener una cristalizacion completa.

2.4 Separar los cristales por filtracion al vacio y lavarlos con una solucion fria de 3 ml de éter en 7 ml de ac. acético glacial.

2.5 Volver a lavar con metanol frio y mantener el paso de aire a través del embudo hasta que los cristales estén secos.

3 DESBROMACION 3.1 Pasar los cristales de dibromuro a un matraz Erlenmeyer de 125 ml, añadir

20 ml de éter. 5 ml de ac. Acético glacial y 0.2 gr de Zn en polvo.3.2 Si la reaccion es lenta agregar algo mas de zinc y calentar suavemente. El

dibromuro se disolvera y precipitara acetato de zinc a los 5-10 minutos.3.3 Agitar durante otros 10 minutos y añadir agua gota a gota hasta que se

redisuelva.3.4 EI sobrenadante se pasa a un embudo de separación, y se extrae la

solucion etérea con agua (dos veces) para eliminar el acetato y el dibromuro de zinc.

3.5 Lavar la parte etérea con NaOH al 10% que arrastrara el acido acético.3.6 Repetir el paso anterior hasta que una gota de disolucion etérea no vire a

rojo el papel azul de ternasol.3.7 Agitar, por ultimo, con una solucion saturada de NaCl para reducir el

contenido de agua.3.8 Separar la fraccion eterea y filtrarla a través de una capa de Na2SO4

anhidro, para completar el secado.4 RECRISTALIZACION

4.1 Colocar 10 ml de metanol a la disolucion etérea y evaporar los disolvente sobre un baño de vapor, hasta que se haya eliminado la mayor parte del éter y el colesterol empiece a cristalizar.

4.2 Dejar reposar la solucion a temperatura ambiente durante unos minutos y enfriarla luego en un baño de hielo para favorecer la cristalizacion.

4.3 Separar los cristales por friltracion al vacio, lavarlos con algo de metanol frio y dejarlos secar.

4.4 Una vez seco el producto, observar los crisiales al microscopio y hacer un esquema de lo observado.

5 IDENTIFICACION Reaccién de Liebermann-Burchard

5.1 Poner en un tubo de ensaye seco, una pequeña cantidad de colesterol, 2 ml de cloroformo, 10 gotas de anhidrido acético y 2 gotas de H2SO4

concentrado.5.2 Agitar el lubo y observar la aparicion y cambio de colores, ya que, la

solucion se pondra de color azul, que pasa a verde en caso de ser positiva la prueba.

Reaccion de Salkowski5.3 Colocar en un tubo de ensaye seco, una pequeña cantidad de colesterol y 3

ml de cloroformo. 5.4 Teniendo el tubo de ensaye inclinado, viertase lentamente por la pared del

tubo 2 ml de H2SO4 concentrado, de manera que formen dos capas superpuestas.

5.5 Agitar cuidadosamente el tubo para que haya una ligera mezcla de las dos capas. Observar los colores en ambas capas. Una coloracion amarilla en la capa acida (superior) y roja en la capa cloroformica (inferior), indica que la prueba es positiva.

CUESTIONARIO

1. Esquematizar el método seguido en la extraccion del colesterol de los calculos biliares.

2. ¿Qué cantidad de colesterol impuro se obtuvo en Ia exp. 1.9? ¿Qué caracteristicas presentaba?

3. El bromo se adiciona en trans al doble enlace del colesterol. Dibujar un modelo tridimensional del mecanismo de este proceso, representando los dos anillos que intervieron en él, en su conformacion de silla o semisilla.

4. Describir los cristales de bromocolesterol obtenidos en la exp 2.5

5. ¿Por qué razon se realiza la bromacion del colesterol?

6. Escrbir la reaccion de transformacion del dibromocolesterol en colesterol. ¿Por qué se forma acetato de zinc?

7. Hacer un dibujo de los cristales de colesterol observados al microscopio en la exp. 4.4

8. Esquematizar la reaccion de Liebermann-Burchard ¿Fue positiva?

9. ¿Qué se observo en la reaccion de Salkowski?

10. Elaborar una monografia acerca de las bondades y perjuicios del colesterol en el humano.

PRACTICA No. 20

IDENTIFICACION DE SAPONINAS

INTRODUCCION

Las saponinas son glicosidos triterpenoides o esteroidales. Muchas saponinas se encuentran en plantas y en algunos organismos marinos tales como el pepino marino y la estrella de mar. Son producidas por los organismos marinos para defenderse de sus predadores. Se ha demostrado que las saponinas de plantas poseen actividades biológicas muy interesantes, tales coma actividad espermicida y muluscocida. Las saponinas de pepinos marinos han mostrado una gran actividad en contra de hongos patégenos, tales como Trichophyton mentagrophytes, Microsporum gypseum, Candida albicans y Candida utilis.

Las interesantes propiedades farmacologicas asociadas con la droga China ginseng, la cual es considerada una panacea y una droga para la longevidad, son atribuidas a las varias saponinas presentes en el ginseng, Saponinas de plantas tales como la dioscina son comercialmente importantes ya que se utilizan como material de inicio para la sintesis de hormonas esteroidales. Las saponinas, son pues, un grupo quimica y farmacologicamente interesante de productos naturales.

Las saponinas, cuando se agitan en agua, reducen la tension superficial del agua y producen espuma. Las saponinas se comportan como jabones, razon por la cual su nombre derive de la palabra Latina para jabon. Todas las saponinas hemolizan la sangre, estos rompen a los eritrocitos. Esta propiedad se utiliza como prueba de identificación de las mismas.

OBJETIVO

Identificar saponinas naturales por medio de la prueba de hemolisis.

MATERIAL REACTIVOS

Balanza granataria Metanol al 75%

Extractor Soxhlet con cartucho Base de Agar-sangre

Cajas Petri Agua deslilada

Olla de presión Plantas medicinales

Tubo de ensaye pequeño Organismos marinos

Varilla de vidrio Sangre desfibrinada

Pipetas Pasteur Ginseng

Centrifuga clinica NaCl al 0.85%

Jeringa y aguja estériles

METODOLOGIA

1 EXTRACCION DEL MATERIAL BIOLOGICO1.1 Pesar 10 gr de material biologico (plantas medicinales u organismos

marinos).1.2 Extraer la muestra durante 1 hora en un extractor tipo Soxhlet, utilizando

metanol acuoso al 75%.1.3 El extracto obtenido se utiliza en la prueba de hemolisis.2 PREPARACION DE SANGRE DESFIBRINADA2.1 Extraer 5-10 ml de sangre y suspenderlos inmediatamente en 50 ml de

suero fisiologico (NaCl al 0.85%).2.2 Centrifugar la suspension y decantar el Iiquido sobrenadante.2.3 Agregar nuevamente 50 ml de suero fisiologico y repetir la centrifugacion y

decantacion.2.4 Dos globulos rojos sedimentados se suspenden en 50-200 ml de suero

fisiologico y estan listos para preparar las placas de agar-sangre.3 PREPARACION DEL MEDIO DE AGAR-SANGRE3.1 La base de agar-sangre (8 gr) en 200 ml de agua destilada se esterilizan

en una olla de presion.3.2 Se enfria a 45 ºC y se agrega la sangre desfibrinada (5 ml de sangre por

cada 100 ml de medio).3.3 Se mezcla haciendo rotar el recipiente que contiene el medio.3.4 Hecha la mezcla, en un ambiente estéril se vierte cuidadosamente el agar

en cajas Petri esterilizadas, hasta una profundidad de 3-6 mm (si la capa es muy gruesa puede no apreciarse la hemolisis).

3.5 Evitar agitar enérgicamente el agar, ya que las burbujas de aire que se forman pueden hacer que quede rugoso.

3.6 Si aparecen burbujas de aire en las placas, se eliminan pasando una llama de Bunsen rapidamente por las supeficies, antes de que se solidifique el agar.

3.7 Las placas pueden almacenarse en el refrigerador antes de usarse.4 APLICACION DE LAS MUESTRAS4.1 Bajo un ambiente estéril, con un tubo de ensaye pequeño, se quitan 5

trozos de agar de las placas. EI tubo de ensaye se utiliza como sacabocados.

4.2 Se calienta una varilla de vidrio y con ella se sella el agar de la parte inferior de los orificios formados. Con esto se evita que al colocar las muestras liquidas en los orificios, estas se distribuyan por todo el agar.

4.3 Utilizando diferentes pipetas Pasteur, se colocan distintos extractos en 3 de los orificios.

4.4 En un cuarto orificio se agrega metanol acuoso al 75% (control negativo).4.5 En el quinto orificio se agrega el extracto de ginseng (control positivo).4.6 Se tapa la caja Petri y se observa a las 24 horas para localizar las zonas

de hemolisis.4.7 Si existen zonas de hemolisis, se mide la distancia (en mm) entre el borde

del urificio y el punto mas lejano de la hemolisis.

CUESTIONARIO

1. ¿Por qué es necesario esperar a que el medio base de agar este a una temperatura de 45 °C, para agregar Ia sangre?

2. ¿Qué es la sangre desfibrinada?

3. ¿Por que es necesario adicionar las muestras al agar-sangre en un ambiente estéril?

4. Elaborar una tabla en donde se anote el nombre del producto biologico utilizado, la presencia o no de hemolisis y la zona de hemolisis en mm de los que resulten positivos. lncluir en la tabla todos los extractos probados en la practica.

PRACTICA No. 21

PIGMENTOS VEGETALES

INTRODUCCION

El color es una propiedad de la materia directamente relacionada con el espectro de la luz y que por lo tanto se puede medir fisicamente en terminos de su energia radiante o intensidad, y por su longitud de onda. El color es muy importante, ya que es el primer contacto que se tiene con los productos naturales.

Normalmente, cuando se habla de color de los vegetales nos referimos a frutas, flores, hojas, tallos y raices, ya que son los que contienen la mayor concentracion de pigmentos. En general, los pigmentos vegetales se clasifican en seis grupos:

a) Carotenoides

b) Clorofilas

c) Antocianinas

d) Flavonoides

e) Taninos

f) Betalainas

La mayoria de los colorantes naturales de los vegelales se encuentran en el protoplasma de las células vegetales, dentro de los organelos especializados llamados plastidos, que se pueden observar bajo el microscopio, ya que forman

pequeñas placas o agujas de estructura cristalina. En algunos casos cuando son solubles en agua, se concentran en forma disuelta en las vacuolas de las células.

La separación y el aislamiento de los pigmentos naturales, se facilita debido a que algunos son hidrosolubles, mientras que otros son solubles en solventes organicos (hexano, benceno, éter, alcohol, etc..). La medicion del color se puede realizar, aprovechando la propiedad de cada pigmento de absorber una cierta longitud de onda del espectro visible.

OBJETIVO

Identificar algunos tipos de pigmentos vegetales por medio de reacciones coloridas.


Mortero y pistilo Agua destilada H2SO4 conc.

5 Tubos de ensaye HCI al 5% Solvente C

Embudo CH3COOH al 2% Solvente D

Embudo de separación CH3COOH Benceno

Vaso de p.p. de 100 ml NaHCO3 KOH al 5%

Papel filtro NaOH al 10% Hojas y tallo de apio

NH4OH Betabel y pétalos

Etanol del 95% Flor de jamaica

Mg Alas de mariposa

HCI conc. Fresas, moras, etc...

METODOLOGIA

1 ANTOCIANINAS

Se analizara el efecto en el pigmento por variacion del pH de la solucion.

1.1 Desmenuzar alrededor de 25 gr de una hortaliza roja.1.2 Triturarla en un mortero, añadiendo agua poco a poco, hasta un volumen

aproximado de 25 ml.

1.3 Decantar Ia solucion roja formada. Tomar cinco tubos de ensaye (marcarlos como A,B,C,D y E) y poner en cada uno 5 ml del extracto.

1.4 Adicionar a los tubos, lo que a continuacion se indica:

Tubo A - Gotas de HCI al 5% (acido fuerte)

Tubo B - Gotas de CH3COOH al 2% (acido débil)

Tubo C - Gotas de H20

Tubo D - Un poco de polvo de NaHCO3 (alcali débil)

Tubo E - Gotas de NaOH al 10% (alcali fuerte)

1.5 En el tubo C, añadir gotas de acido, seguidamento gotas de álcali, y nuevamente gotas de acido. Observar los cambios reversibles de coloración que se producen.

2 FLAVONOIDES2.1 Someter a Ia accion de vapores de amoniaco, pétalos blancos y amarillos.

Interpretacion: Si los pétalos blancos viran a amarillo, indica Ia presencia de flavonas y flavonoles.Si los pétalos amarillos viran a rojo, indica Ia presencia de chalconas y auronas.

2.2 Obtener 5 ml de un extracto acuoso de tres distintos vegetales y añadirles NaOH al 10% hasta que se aprecie un cambio de coloración.

PIGMENTO COLOR

Flavonas y flavonoles Amarillo

Flavonas e isoflavonas

Tonos de rojo

Chalconas Purpura

Flavonoles Café-naranja

Antocianinas Azul

2.3 Obtener 5 ml de un extracto alcoholico (incoloro o ligeramente amarillo) de tres distintos vegetales, agregarles un trocito de Mg y unas gotas de HCl concentrado (prueba de Shinoda).

PIGMENTO COLOR

Flavona Naranja

Flavononas Rosa

Flavonoles Rojo-azuloso

Flavononoles

Violeta

Ocasionalmente los flavanoles, flavanonas y los flavanonoles dan coloración verde o azul.

2.4 Disolver una pequeña cantidad de tres muestras distintas en H2SO4

concentrado.

PIGMENTO COLOR

Flavonas y flavonoles

Amarillo

Flavanonas Naranja o guinda

Chalconas y auronas Rojo guinda o azuloso

2.5 Obtener el extracto de tres distintos vegetales, utilizando el solvente C.

PIGMENTO COLOR

5-hidroxiflavonas Naranja o rojo

2.6 Obtener el extracto de tres distintos vegetales, utilizando el solvente D.

PIGMENTO COLOR

5-hidroxiflavonas Amarillo con fluorescencia verdosa

3 QUINONAS3.1 Obtener el extracto de tres distintos vegetales, utilizando benceno. Una vez

extraidos se les adiciona NaOH al 10% hasta que viren de color.

PIGMENTO COLOR SIN ALCALI COLOR CON ALCALI

1,4-naftaquinonas Amarillo Rojo

1,2-naftaquinonas Rojo Azul violaceo

3.2.1 Agregar 10 ml de KOH al 5% a 0,5 gr de muestra y llevarlos a ebullicion durante 10 minutos.

3.2.2 Enfriar, filtrar y acidular con 10 gotas de acido acético.

3.2.3 Utilizando un embudo de separacion, extraer con 8 ml de benceno.

3.2.4 Separar la capa de benceno, agregarle 8 ml de NH4OH y volver a agitar.

3.2.5 Si la fase de benceno se decolora y la alcalina se pone roja, se interpreta como presencia de naftaquinonas y antraquinonas. (hacer lo mismo con otras 2 muestras).

CUESTIONARIO

1. Elaborar un cuadro en donde se incluyan todos los resultados, anotando; el nombre de la muestra, coloración, prueba positiva o negativa e interpretación.

2. ¿Qué son las auronas y las chalconas?

3. ¿Qué utilidad tienen los pigmentos vegetales?

4. ¿Los pigmentos antocianinas se pueden utilizar como indicadores de pH? ¿Por qué?

5. lndicar cuando menos una de los pigmentos que se encuentran presentes en: fresa, higo, mora, betabel, cereza, granada, alas de mariposa, te negro y sandia.

PREPARACION DE SOLUCIONES ESPECIALES

A (solvente) 3 vol. De ac. Acético glacial con 2 vol. De cloroformo. Se coloca en frasco ambar y se deja en reposo 24 horas antes de su uso.

ACETO-ORCEINA (solución) 45 ml. De ac. Acético glacial y 55 ml de agua, se calientan a ebullición, se retira del calor y se la agrega 1 gr de orceina. Se pone a hervir por 2 o 3 horas (hacerlo en un matraz con tapon y tubo largo, para evitar la evaporación total), se deja enfriar y se filtra. Guardar en refrigeración en frasco ambar.

ALBUMINA (solución) 2 gr de albumina seca en 100 ml de agua destilada. Se deja reposar la mezcla durante toda la noche y después se filtra.

ALMIDON AL 1% (solución) Con 1 gr almidon soluble formese una pasta fina y alisada con un poco de agua, viértase en 100 ml de agua hirviente y disuélvase 1 gr de KI.

AMINOACIDO (solución) Se preparan soluciones 0.01 M, disolviendo el aminoácido en alcohol isopropilico al 20% (el alcohol evita que se desarrollen hongos)

B (solvente) Solución saturada de KI, se coloca en frasco ambar en lugar fresco y oscuro.

BARFOED (reactivo) 13.3 gr de acetato cúprico y 2 ml de ac acético glacial en 200 ml de agua.

BENEDICT (reactivo) Disolver 173 gr de citrato de sodio y 100 gr de carbonato de sodio en aproximadamente 800 ml de agua caliente. Filtrar, recibiendo el filtrado en una probeta de 1000 ml y completar con agua hasta 850 ml. Por otro lado se disuelven 17.3 gr de sulfato de cobre en aproximadamente 100 ml de agua y se completa hasta 150 ml. Se vierte la primera solución e un vaso de precipitado de 2 litros y se añade lentamente la solución de sulfato de cobre agitando continuamente.

BIAL (reactivo) Disolver 6 gr de resorcinol en 200 ml de etanol al 95% que contenga 40 gotas de FeCl3 al 10%.

BOUCHARDAT (reactivo) Disolver 4 gr de KI en 100 ml de agua y saturarla con I2.

Br2-CH3COONa-ac. Acético (solución) 1 ml de Br2 y 2 gr de acetato de sodio se disuelven en 100 ml de ac. Acético.

C (solvente) 3 gr de H3BO3 se disuelven en 100 ml de anhídrido acético.

CROMATOGRAFICO (solvente) Éter de petróleo – benceno – cloroformo – acetona - isopropanol 50:35:10:0.5:0.17: v/v

D (solvente) 3 gr de H3BO3 y 2 gr de ac. Cítrico se disuelven en 100 ml de acetona.

DICLOROFENOLINDOFENOL(DPIP) (solución)

0.25 gr de 2,6 diclorofenolindofenol y 0.21 gr de NaHCO3 EN 1000 ml de agua (se puede calentar el agua). Preparar el mismo dia de uso.

DINITROFENILHIDRAZINA (DNFH)(solución)

Se prepara en agua al 2 o 3%

DRAGENDORFF (reactivo) Se disuelven 8 gr de Bi(NO3)3 5H2O en 20 ml de HNO3 (densidad 1.18 o sea al 30%) y 27.2 gr de KI en 50 ml de agua. Se mezclan las dos

soluciones y se deja reposar 24 horas. Se decanta la solución y se afora con agua a 100 ml

FARMER (solución) Etanol de 95% y ac. Acético glacial 3:1 v/v

LUCAS (reactivo) Disolver 136 gr de ZnCl2 en 89 ml de HCl conc.

LUGOL (solución) 1 gr de I2 y 2 gr de KI se disuelven en 25 ml de agua y después se agregan 75 ml de agua para un total de 100 ml.

MAYER (reactivo) Se disuelven 1.36 gr de HgCl2 en 60 ml de agua y 5 gr de KI en 10 ml de agua. Se juntan las dos soluciones y se afora a 100 ml. Se adicionan unas gotas de ac. Acético.

MOLISH (reactivo) Disolver 5 gr de α-naftol en 100 ml de etanol

Na2S2O3 0.002 N (solución) Tomar 10 ml de una solución 0.1 N de Na2S2O3, y llevar a 500 ml en matraz aforado.

NINHIDRINA (solución) Se prepara al 0.15%, disolviendo en etanol 95%

PASTEUR (solución) 2.5 gr de fosfato de potasio, 0.2 gr de fosfato de calcio, 0.2 gr de sulfato de magnesio y 10 gr de tartrato de amonio, disueltos en 860 ml de agua.

SCHIFF (reactivo) Disolver 0.2 gr de clorhidrato de p-rosalina (fushina) en 100 ml de agua. Añadirle 2 gr de bisulfito de sodio, y luego 2 ml de HCl concentrado. Se afora la mezcla a 200 ml, debe estar incoloro.

SELIWANOFF (reactivo) 0.5 gr de resorcinol en 1 Lt. De HCl 3 N

TOLLENS (reactivo) Disolver 3 gr de AgNO3 en 30 ml de agua, se añaden 1.5 gr de NaOH disueltos en 30 ml de agua, en seguida se agrega, gota o gota, NH4OH diluido (1:1) hasta que se disuelva el precipitado formado. Se prepara al momento del uso, después de 10 horas de preparado forma compuestos explosivos.

WIJS (solución) La preparación de esta solución es muy lenta y además envuelve el uso

de materiales peligrosos y toxicos, puede adquirirse con un proveedor de laboratorios químicos. Se debe almacenar en un lugar seco y oscuro, nunca con temperaturas mayores de 30ºC.

REFERENCIAS

1) UNAM, Manual de prácticas de laboratorio de Bioquimica y Biologia Molecular (1993), facultad de Medicina.

2) Bohinski C. Robert , Bioquimlca (1991), ed. Addison-Wesley lberoarnericana

3) Zubay Geoffrey, Biochemistry, (1989), ed. Maxwell Macmillan lnternational Editions

4) Pavia, Lampman y Kriz; Quimica Organica Experimental, Eunibar- ed. Universitaria de Barcelona.

5) Gabb M. H. y Latchem W. E., Manual de soluciones de Laboratorio (1973), Ediciones Bellaterra, S. A.

6) Dominguez Xorge A., Métodos de lnvestigacion Fitoquimica (1979), ed. Limusa,

7) Fieser louis F., Experimentos de Quimica Organica (1967), wl. Reverté, S. A.

8) UMSNH, Manual de Practicas de Bioquimica (1994), Facultad de Biologia

9) Dominguez Xorge A., Experimentos de Quimica Organica (1980), ed. Limusa

10)Muñoz Mena E., Experimentacion en Quimica Organica (1975), Publicaciones Cultural S. A.

11) Todd-Sanford, Diagnostico Clinico por el Laboratorio (1979), ed. Salvat

12) Abbott y Andrews, Introduccion a la Cromatografia (1982), ed. Alhambra

13) Salheld R., Practicas de Ciencia de los Alimentos (1977), ed. Acribia

14) Badui Dergal S., Quimica de los Alimentos (1981), ed. Alhambra

15) Braverrnan J.B.S., Bioquimica de los Alimentos (1980), ed. el Manual Moderno.

16) Helser Terry L., Journal of Chemical Education (1990) 964-966

17) Haddad Paul, Joumal of Chemical Education (1977) 192-193

18) McCullough and Lechtenberg, Journal of Gremiml Education (1970) 141

19) Boyer Rodny F., Journal of Chemical Education (1977) 585-586

20) Reigh Darryel L., Journal of Chemical Education (1976) 386

21) Friedman and Harlow, Journal of Chemical Education (1977) 256-757

22) Tang Chung·Shih, Joumal of Chemical Education (1970) 692

23) Brooks and Brooks, Journal of Chemical Education (1995) A2.8-A29 .

24) Maldoni Betty. Journal of Chemical Education (1991) 700703

25) Mann, Mosher and Wood, Joumal of Chemical Education (1992) 668-669

26) Lampard M., Joumal of Chemical Education (1976) 756

27) Macanrlla y Goiii, Biomoléculas (1990) ed. Reverré _

28) Bailey C. A. and Bailey P. S., Experimental Chemistry for Contemporary Times (1975) ed. Allyn and Bacon Inc.

29) Quigley M. N., Joumal of Chemical Education (1992) 332-335 1

30) Broniec Rick, Joumal of Chemical Education (1985) 320

31) Farias Chagoya H. A., Practicas de Laboratorio dc Genética (1995) Facultad de Biologia UMSNH 1

32) MacBeath and Richardson, Joumal of Chemical Education (1986) 1092-1094

33) Subramaniarn Sotheeswaran, Joumal of Chemical education (1988) 161-162

Manual de Practicas de Bioquimica 1 y 2

Documents

Transcript of Manual de Practicas de Bioquimica 1 y 2