Manual de Bioquimica Clinica_10817

8/6/2019 Manual de Bioquimica Clinica_10817

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMADE MXICO

FACULTAD DE QUMICA

MANUAL DE PRCTICAS

BIOQUMICA CLNICA(CLAVE 1807)

MXICO, D. F. 2009


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El laboratorio clnico es un ambiente dinmico que esta continuamente cambiandopara a satisfacer las necesidades de salud pblica. El presente manual ser demucha utilidad como recurso informativo en la formacin de los alumnos en el

rea de Bioqumica Clnica. El aspecto valioso de la informacin es que tiene unenfoque actual de los procesos habituales de laboratorio como la tendenciatecnolgica de la automatizacin, lo que permite enfrentar el reto de manejarpruebas mas sensibles, especficas y efectivas en el monitoreo de la salud y laenfermedad. Adems, la posibilidad de obtener resultados a tiempo y el costo-beneficio que representa.Es recomendable la introduccin de la terminologa actual, completar lainformacin acerca de los organismos y guas de regulacin de las buenasprcticas de laboratorioLa elaboracin de ste manual estuvo a cargo de la Q.F.B Rosalinda VelzquezSalgado a travs de su seccin de Bioqumica Aplicada


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CONTENIDO

PRLOGO

INTRODUCCIN

UNIDAD I1. INFORMACIN SOBRE EL CONTROL DE CALIDAD EN EL LABORATORIOCLNICO1.1Etapa preanaltica1.1 Etapa analtica1.1.Etapa Post-analtica1.2Toma de muestra1.3Estudio de la variacin en condiciones de rutina

UNIDAD II2. PRUEBAS DE FUNCIONAMIENTO RENAL.2.1 Determinacin de cido rico. Mtodo enzimtico.2.2 Determinacin de Urea. Mtodo enzimtico2.3 Determinacin de Creatinina . Bossnes- Taussky.2.4 Determinacin de sodio/potasio/cloro . Mtodo In Selectivo2.5 Determinacin de pH, pPO2, pCO2 . Gasometra2.6Examen general de orina (EGO)

UNIDAD III

3.METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS Y LPIDOS3.|. Determinacin de Glucosa. Mtodo enzimtico (GOD-PAD)3.2. Determinacin de Colesterol total. . Mtodo enzimtico (CHOD-PAD)3.3. Determinacin de Triglicridos. Mtodo enzimtico

UNIDAD IV4. METABOLISMO SEO Y MINERAL4.1Determinacin de Calcio. Mtodo Colorimtrico4.2Determinacin de Fsforo. Mtodo UV

UNIDAD V

5. PRUEBAS DE FUNCIONAMIENTO HEPTICO. Mtodo colorimtrico5.1 Determinacin de Bilirrubina. MtodoDMSO Total y Directa5.2 Albmina. Mtodo verde de Bromocresol5.3Protenas totales. Mtodo de Biuret5.4. INTRODUCCIN A LA ENZIMOLOGA CLNICA.5.5 Determinacin de fosfatasa Alcalina. Mtodo cintico5.6Determinacin de gama Glutamiltransferasa. GGT Mtodo cintico5.7. Determinacin de aspartato aminotransferasa GOT (ASAT ) . Mtodo cintico5.8 Determinacin de alanino aminotransferasa GPT ( ALAT) . Mtodo cintico.5.9 Determinacin de lactato deshidrogenada ( LDH). Mtodo cintico.


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UNIDAD VIPRUEBAS DE FUNCIONAMIENTO PANCRATICO.6.1 Determinacin de lipasa. LPS Mtodo cintico

6.2 Determinacin de - amilasa. AMY Mtodo cintico

UNIDAD VII7. PRUEBAS DE FUNCIONAMIENTO CARDACO.7.1 Determinacin de alanino aminotransferasa GPT. Mtodo cintico.7.2 Determinacin de creatin cinasa CK. Mtodo cintico.7.3 Determinacin de lactato deshidrogenada. LDH. Mtodo cintico.

PRUEBAS AUTOMATIZADASAutoanalizador utilizado en Qumica Clnica

8. BIBLIOGRAFA

Glosario


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PRLOGO

La Bioqumica Clnica es un campo multidisciplinario cuya finalidad es la aplicacin

de la Ciencia Qumica para contribuir a la resolucin de problemas de salud.La funcin del laboratorio de Bioqumica Clnica es realizar anlisis, tantocualitativos como cuantitativos, en fluidos corporales como sangre, orina, lquidoseminal, lquido cefalorraqudeo, etc. Para que los resultados de dichos anlisissean tiles a los mdicos en el diagnstico, tratamiento y seguimiento de unaenfermedad, stos debern realizarse bajo un estricto control de calidad lograndoniveles ptimos de precisin y exactitud, caractersticas deseables en cualquierresultado de diagnstico.Los objetivos del curso son:

1. Que el alumno sea capaz de realizar el anlisis de productos biolgicosincluyendo una adecuada manipulacin de los especmenes, desde la toma

y/o recepcin de muestras hasta la entrega de resultados.2. Que el alumno adquiera una formacin y preparacin en Bioqumica que le

permita afrontar los retos que encontrar en su vida profesional, ante elcreciente nmero de tcnicas que continuamente se estn desarrollandopara la deteccin y cuantificacin de metabolitos de inters en la medicinamoderna.

3. Que el alumno realice los procedimientos correctos tanto en forma manualcomo automatizada utilizando un equipo mecanizado.

4. Que el alumno adquiera los elementos formativos que le permitandesarrollar una actitud y pensamientos crticos, y de independencia en eltrabajo.

Este proceso de enseanza incluye: planeacin, seleccin, elaboracin yejecucin analtica, evaluacin y resolucin de problemas con la metodologaempleada, aplicacin e interpretacin de programas de control de calidad,interpretacin de grficas y correlacin de los datos obtenidos con las alteracionesque se presentan en el organismo en los diferentes cuadros patolgicos.

Este manual fue elaborado con base en la Norma Oficia Mexicana NOM -166-SSA-1-1997 que actualmente se encuentra en revisin Proy- NOM -007-SSA1-2006, para la organizacin y funcionamiento de los laboratorios clnicos , mismaque pretende lograr que los laboratorios clnicos establezcan programas deaseguramiento de la calidad de sus servicios .

El curso de la asignatura prctica de Bioqumica Clnica hace nfasis en el controlde calidad. Las prcticas estn diseadas con el propsito que los alumnosdispongan de un conjunto de habilidades que les permitan la aplicacin flexible delas tcnicas manuales y adems utilicen equipos semiautomatizados comoautomatizados, (equipo de uro-anlisis, gasmetro, in selectivo y autoanalizadorpara qumica clnica que con ms frecuencia se emplean en las actividadespropias del mbito profesional.


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Los residuos originados en las prcticas permanecern en el laboratorio 301hasta que sean recogidos y tratados en la facultad de qumica en el programaUnidad de Gestin Ambiental a cargo de la Dra. Elvira Santos Santos.

Los residuos biolgico infecciosos como Punzo-cortantes, algodn con sangre,se recolectan y almacenan en los contenedores de deposito temporal (Lab.301) enrecipientes rgidos o bolsas de color rojo dependiendo del desecho, con elemblema RPBIs y son llevados cada mircoles por el personal auxiliar delaboratorio o laboratorista al camin de recoleccin de RPBIs. Los residuoscomo sangre, plasma, suero, paquete globular, materiales con sangre o susderivados se tratan internamente en el laboratorio de acuerdo a la NOM-087-ECOL-SSA1-2002.(12)

TRATAMIENTO DE RESIDUOS TXICOS:

Los desechos que se produzcan en cada sesin de prctica debenrecolectarse en recipientes previamente etiquetados con el siguiente emblema:

Facultad de Qumica

RESIDUO

Universidad Nacional Autnoma de Mxico

Facultad de Qumica

CARACTERISTICA:

Corrosivo ( ) Reactivo ( ) Explosivo ( ) Txico ( ) Inflamable ( )

Unidad de Gestin Ambiental

_______________________

Fecha

( ) Lquido_______________

( ) Slido________________

Laboratorio_______________

Responsable______________


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INTRODUCCIN

Los nuevos mtodos analticos se desarrollan con el fin de mejorar la exactitud y laprecisin de los mtodos existentes, tambin tiene el propsito de permitir elmanejo de equipo automatizado, para reducir los costos de los reactivos o de lamano de obra, o para medir un compuesto nuevo. En cualquier caso, se debeverificar experimentalmente el rendimiento analtico en el laboratorio clnicomismo, aun si se cree que el mtodo nuevo es una mejora con respecto a losmtodos anteriores. La extensin de los experimentos y la interpretacin de losdatos van a depender del propsito de la evaluacin y de quien la realiza, pero elfundamento bsico y el diseo experimental son similares en todas lasevaluaciones.El proceso de evaluar un mtodo es distinto del proceso rutinario para el control de

calidad, despus de haber sido introducido en la rutina diaria. El control de calidadrutinario (diario) es un proceso establecido por medio del cul se detectan losincrementos en los errores analticos de un mtodo con el fin de evitar la liberacinde datos incorrectos de los pacientes. El control de calidad rutinario detecta loserrores slo cuando estos son superiores a los errores presentes registrados en elmomento que se establecieron los intervalos para los controles. El uso del controlde calidad rutinario no le permite al investigador determinar la magnitud de loserrores inherentes del mtodo o de decidir si son aceptables.

EVALUACIN DE MTODOSEn Mxico las metas de calidad las rige el Reglamento de Ley General de Salud ,

que indica en su artculo 158 los laboratorios debern emplear reactivos ymedios de la ms alta calidad y se cuenta con organismos que acreditan lacompetencia tcnica, como la Entidad Mexicana de Acreditacin (EMA),ademsde CLIA `88. Es necesario experimentar la evaluacin de los mtodos paraestablecer los errores analticos inherentes del mtodo y relacionarlos con losrequisitos mdicos o reglamentarios.Las evaluaciones de los mtodos en la mayora de las veces son realizadas porel personal del laboratorio en los hospitales y laboratorios comerciales. Estasevaluaciones se hacen con el fin de determinar si el rendimiento del mtodocumple, primariamente con los requisitos de aplicacin mdica dispuestas para elusuario y, secundariamente las metas de calidad especificadas por CLIA88 se

cumplen para tener un rendimiento exitoso en las pruebas de aptitudLa decisin de aceptar o rechazar un mtodo posible para el laboratorio se debebasar en la capacidad del mtodo para cumplir con los requisitos del usuario final,el mdico, que por otra parte que es quien usa los resultados de la prueba dellaboratorio.


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Caractersticas del mtodoEl paso siguiente en el proceso de seleccin, es la definicin de las caractersticasmetodolgicas ideales que permitirn que el mtodo seleccionado tenga buena

probabilidad de xito en el laboratorio. Estas caractersticas incluyen lametodologa preferida, que tendr potencialmente la especificidad qumicanecesaria (libre de interferencias) y sensibilidad qumica (capacidad de detectarcantidades pequeas o pequeos cambios en la concentracin del compuestoanalizado). Tambin es importante la capacidad de usar estndares acuosos paracalibrar (libertad de efectos de matriz). La eleccin de reactivos, temperatura,tiempo de reaccin, tiempo de medicin y tipo de medicin (como mtodos dedeterminacin de un punto, dos puntos o cinticos), son caractersticas de unmtodo que deben definirse. La IFCC abreviatura de Internacional of FederationClinical Chemistry and laboratory Medicine y AACC asociacin Americana deQumica Clnica han desarrollado una serie de recomendaciones para los

mtodos empleados en qumica clnica, la familiaridad del operador con elprocedimiento del mtodo; la estabilidad de los calibradores, controles y reactivos;y la linealidad de la respuesta a travs de todo el intervalo de trabajo.

Error aleatorio y error sistemticoPor lo general, los errores que afectan el rendimiento de los procedimientosanalticos se clasifican en aleatorios o sistemticos. Los factores que contribuyenal error aleatorio, son los que afectan la reproducibilidad de la medicin. Entreestos se incluyen: (1) la inestabilidad del instrumento, (2) variaciones en latemperatura, (3) variaciones en los reactivos y calibradores (y la estabilidad de lacurva de calibracin), (4) variabilidad en las tcnicas de manejo como el pipeteo,

mezcla y control de los tiempos y (5) variabilidad en los operadores. Estosfactores sobreponen sus efectos entre s a diferentes tiempos. Algunos producenfluctuaciones muy rpidas y, otros, ocurre en perodos ms largos de tiempo.Por consiguiente, el error aleatorio (RE) tiene componentes diferentes de variacinque estn relacionados con la disposicin actual del laboratorio. El componentede variacin dentro de una corrida(c.v .wr) es causado por etapas especficas enel proceso, tales como la precisin en el pipeteo y variaciones a corto plazo de latemperatura y la estabilidad del instrumento. La variacin intradiaria entre corridas(c.v br) es causada por la inestabilidad de la curva de calibracin o por diferenciasen recalibracin que ocurren a travs del da, variaciones a ms largo plazo en elinstrumento, cambios pequeos en las condiciones del laboratorio durante el da yla fatiga del personal del laboratorio. El componente intradiariode variacin escausado por variaciones en el instrumento que ocurren a travs de los das,cambios en los calibradores y reactivos (especialmente s se abren frascos nuevoscada da) y cambios en el personal de da a da. Aunque no es un componentealeatorio real de variacin, cualquier variacin en la curva de calibracin a travsdel tiempo tambin afectar de manera considerable el componente intradiario devariacin. Estos componentes se pueden combinar de tal manera que se puedeobtener un clculo de la varianza total del mtodo.


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Entre los trminos usados para indicar el error aleatorio se incluyen precisin,imprecisin, reproducibilidad y repetibilidad. En cada uno de los casos se refierena la dispersin aleatoria de los resultados de las mediciones alrededor de algn

punto de tendencia central.El error sistemtico (ES) describe el error que es consistentemente alto o bajo. Siel error es consistentemente bajo o alto en la misma cantidad,independientemente de la concentracin se designa como error sistemticoconstante. Si el error es consistentemente bajo o alto en una cantidadproporcional a la concentracin del compuesto analizado, se conoce como errorsistemtico proporcional.Los factores que contribuyen al error sistemtico constante son independientes dela concentracin del compuesto analizado, y la magnitud del error es constante atravs de todo el intervalo de la concentracin del compuesto analizado. El errorsistemtico constante es causado por una sustancia interferente presente en las

muestras o los reactivos, provocando una seal falsa. El error puede ser positivoo negativo. Una reaccin entre una sustancia interferente y los reactivos causadapor una falta de especificidad es un ejemplo de error sistemtico constante.Otra causa de un error sistemtico es una sustancia interferente en la reaccin

entre el compuesto analizado y los reactivos. Se observa este tipo de error en losmtodos enzimticos que usan reacciones acopladas oxidasa-peroxidasa en lascuales el perxido de hidrgeno formado es destruido por agentes reductoresendgenos, tales como el cido ascrbico. Las sustancias interferentes tambinpueden inhibir o destruir el reactivo de modo que queda en cantidad mayor parareaccionar con el compuesto analizado. Una fuente no qumica de errorsistemtico constante es el error causado por el uso de blancos inapropiados de la

muestra o los reactivos.La causa ms frecuente de error proporcional es la asignacin incorrecta de lacantidad de sustancia en el calibrador. Si el calibrador tiene ms compuestoanalizado que la indicada en el rtulo, todas las determinaciones desconocidasdarn bajas; una menor cantidad del compuesto que el rotulado provocar un errorpositivo. El error ser proporcional al error de calibracin original. El errorproporcional tambin puede ser causado por una reaccin secundaria delcompuesto analizado. El porcentaje de la sustancia a determinar que participa enla reaccin secundaria, ser el porcentaje de error en el mtodo.

Error constante calculado a partir de estudios de interferencia

El estudio de interferencia mide el error constante causado por la presencia deuna sustancia sospechosa de interferir con el mtodo en estudio. Para realizareste estudio se toma una muestra a la cual se le ha agregado el interferente. Elvolumen de esta adicin debe ser pequeo, menos del 10% del volumen demuestra para que el efecto sobre la matriz de la muestra sea mnimo. Con el finde compensar la dilucin de la muestra se debe preparar una muestra de lnea debase mediante la adicin de una cantidad igual del solvente usado para elinterferente, en otra alcuota de la muestra. A continuacin se deben analizar lasdos muestras, por lo menos por duplicado. La diferencia entre los resultados enlas dos muestras se puede atribuir a la interferencia causada por la sustanciaaadida.


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El lmite de cuantificacin (LQ) que es el valor mnimo de la magnitud que puede

estimarse con una impresicin aceptada (habitualmente el 10%) (IUPAC).

EL lmite de deteccin (LD) que es el valor mnimo de la magnitud para el cual laprobabilidad de que el valor estimado no exceda al valor crtico es (habitualmente 0.05).El valor crtico (Lc)que es el valor mnimo de la estimacin de una magnitud para

el cual la probabilidad de que el valor verdadero de la magnitud sea cero es (habitualmente 0.05).En el laboratorio clnico, los interferentes ms frecuentes sonhemlisis, lipemia e ictericia .Un esquema para estudiar los efectos de la hemlisis consiste en tomar dosmuestras de sangre. Una es centrifugada y analizada directamente (muestra debase) y los glbulos rojos del otro tubo son traumatizados fsicamente para romperlas membranas celulares con el fin de obtener una cantidad elevada de

hemoglobina srica. La muestra hemolizada es analizada despus decentrifugarla. La diferencia entre las dos muestras se atribuye a los efectos de laSe puede simular una hemlisis ligera, moderada o severa dependiendo delvolumen de glbulos rojos traumatizados. Este enfoque tiene ms coherencia conlos problemas encontrados en el laboratorio, que el enfoque en el cual se aadehemoglobina pura a la muestra. Sin embargo, el procedimiento no es vlido si losglbulos rojos contienen el compuesto analizado.Se pueden estudiar los efectos de la lipemia dividiendo una muestra lipmica endos porciones; una se analiza directamente y la otra se somete aultracentrifugacin antes de su anlisis para eliminar las lipoprotenas.La eleccin de sustancias a probar es casi infinita. Para todos los mtodos

espectrofotomtricos se debe determinar los efectos de hemlisis, ictericia ylipemia. Tambin se deben ensayar otras sustancias que hayan sido reportadascomo interferentes para mtodos similares. El pipeteo debe ser (1) preciso, paraque las muestras de lnea de base y las que contienen el interferente reflejen elmismo grado de dilucin y (2) exactas con el fin de aadir una cantidad conocidade sustancia interferente. Nuevamente, resulta importante que la concentracindel compuesto analizado en la muestra est cercana a los niveles de decisinmdica. Se debe aadir la sustancia considerada como posible interferente, de talmanera que su concentracin final sea la mxima fisiolgicamente esperada. Sino se producen errores a esta concentracin tan elevada, se puede asumir queconcentraciones menores no afectarn de manera adversa el rendimiento del

mtodo. Si el error es demasiado grande a la concentracin mxima de sustanciainterferente, es conveniente comprobar las interferencias a concentracionesmenores. Una muestra ligeramente ictrica puede ser aconsejable, pero unafrancamente ictrica, no. Se recomienda que estos estudios de interferencia seanrealizados tambin al mismo tiempo con un mtodo comparativo, con el fin deverificar la tcnica experimental.

Medidas cinticas.Un mtodo frecuentemente usado para la correccin de la interferencia espectrales la medicin de una tpica reaccin de punto final, como lo es la reaccincintica de dos puntos. Si se monitorea la absorbancia de una reaccin


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colorimtrica no instantnea en funcin del tiempo, se observa una curva dereaccin. Una reaccin de punto final se monitorea a un solo punto de tiempo,cuando la reaccin casi se ha completado .Si no hay interferencias espectrales, la

curva de reaccin debera pasar por el origen. Si existe este tipo de interferencia,la curva ser paralela a la original, pero sesgada hacia valores ms elevadosdebido al color endgeno de la muestra. Si se usa un blanco de muestra pararestar el color endgeno, se obtendr una lnea idntica a la de la muestra que nocontiene interferencias.En un ensayo cintico de dos puntos, la absorbancia es medida a dos puntosdiferentes de tiempo; cuando (1) el desarrollo final de color no ha ocurrido y dehecho puede ser pequeo y, (2) cuando la respuesta de absorbancia versustiempo es todava lineal.La lectura inicial se toma realmente cuando casi no ha ocurrido formacin decolor. De esta manera, cualquier absorbancia a este tiempo es principalmente

ocasionada por interferentes espectrales endgenos. Despus de un tiempocorto se toma una segunda lectura cuando se ha formado solamente unapequea cantidad de color y la respuesta de absorbancia versus tiempo es todavalineal .Esta absorbancia por lo tanto incluye la del color endgeno original y la delcolor producido debido a la reaccin analtica especfica. Al substraer la primeralectura de la segunda, la delta de absorbancia calculada (DA) es causadasolamente por el color especfico formado por la reaccin analtica. En la curvaestndar basada en los anlisis cinticos se grafica el cambio en la absorbancia(DA) versus la concentracin .En esta curva estndar la presencia de uninterferente coloreado, no reactivo, endgeno, no tiene efecto. Por consiguienteno se necesita hacer una medicin separada de blanco de muestra; una reaccin

cintica de dos puntos es por s misma un blanco cuando no hay cambio en lanaturaleza del interferente durante la reaccin. Esta es una tcnica importantecuando se estn desarrollando anlisis qumicos automatizados en un grannmero de muestras.

Anlisis bicromtico.

Muchos instrumentos de uso corriente emplean diferentes tcnicas para lacorreccin de interferencias espectrales. Esta tcnica involucra la medicin de laabsorbancia de una mezcla de reaccin a dos longitudes de onda diferentessimultneamente. Estas son la longitud de onda principal (1) y otra longitud deonda cercana 2. y, 1 es la longitud de onda a la cual el cromgeno tiene la

mxima absorcin. En 2 hay un mnimo de absorcin del cromgeno. Como lareaccin es monitoreada simultneamente a dos longitudes de onda, sta esconocida como anlisis bicromtico. Esta tcnica est basada en la premisa queaunque un compuesto puede dar una interferencia espectral, la absorbanciamxima del interferente ser diferente de la de la reaccin analtica verdadera.Adems, este procedimiento se realiza bajo la presuncin que la absorcincausada por el compuesto interferente es aproximadamente la misma en 1 queen 2. Aunque la absorbancia medida a 1 ser producida por ambas, lareaccin analtica y el interferente, la absorbancia a la segunda longitud de onda (2) ser causada solamente por el interferente. El uso de este procedimiento


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permite tambin que cada muestra sea utilizada como su propio blanco para elcolor endgeno.Otro mtodo similar para la correccin de la interferencia de fondo es la medicin

de la absorbancia a la longitud de onda primaria Amax y a dos longitudes de ondaadicionales, generalmente equidistantes del pico, A1 y A2. Las lecturas deabsorbancia a estas dos ltimas longitudes de onda son promediadas par dar laabsorbancia de fondo promedio en la muestra. Esta tcnica para la correccin dela absorbancia de fondo de las sustancias interferentes es conocida como lacorreccin de Allen.

Dilucin.Como se discuti en el caso de la turbidez, la dilucin de una muestra quecontiene interferentes espectrales puede algunas veces reducir el problema. Sedebe ser cuidadoso en no diluir en exceso el compuesto deseado o el cromgenoa una concentracin por debajo del nivel mnimo detectable para ese ensayo.Muchas diluciones deben ser analizadas simultneamente para determinar ladilucin ms efectiva.

Interferencias qumicasTodas las interferencias que se discutieron hasta ahora han sido interferenciasespectrales causadas por compuestos que no participan en la reaccin qumicaanaltica. Sin embargo, muchas interferencias reaccionan con las sustanciasanalizadas. Los productos de reaccin de estas interferencias generalmenteprovocan interferencias positivas, aunque se han observado interferenciasnegativas.Los tipos de interferentes reactivos qumicamente, no especficos pueden variarampliamente,. El cido rico produce una interferencia positiva, y la bilirrubina y elcido ascrbico producen interferencias negativas en los mtodos de glucosaoxidasa usados para medir la glucosa. La reaccin de picrato alcalino para lamedicin de creatinina presentan ambas interferencias positivas (cetonas,protenas) y negativas (bilirrubina).

Correccin de las interferencias qumicasLa eliminacin de muchos de los interferentes qumicos no especficos se lografrecuentemente por medio de una o ms de las siguientes tcnicas:

1. Diluyendo el interferente.2. Aumentando la especificidad de la reaccin.3. Removiendo el interferente.4. Monitoreando un ensayo por medicin cintica.5. Monitoreando un ensayo por medicin bicromtica.

La dilucin de la muestra es un mtodo efectivo en los casos de los interferentesque no reaccionan a la misma velocidad o producen la misma intensidad de colorque el compuesto analizado. La interferencia por protenas se minimiza enmuchos analizadores automatizados por una dilucin grande de la muestra.


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El aumento de especificidad de una reaccin analtica es a menudo lograda por eluso de enzimas especficas como reactivos. Los ejemplos de este mtodo

incluyen: la medicin de glucosa por hexocinasa o glucosa oxidasa, cido ricopor uricasa, y urea por ureasa. Las reacciones con base inmunoqumica sontambin usadas para aumentar la especificidad del anlisis. Un ejemplo sera lamedida de teofilina por inmunoensayo enzimtico comparado con otros mtodos,los cuales emplean absorbancia ultravioleta.La separacin de un interferente del compuesto analizado puede lograrse por eluso de: una muestra libre de protenas, extraccin lquido-lquido, o cromatografade adsorcin o particin. Las muestras libres de protenas fueron originalmentepreparadas por precipitacin de las protenas del suero y separacin de la muestralibre de protenas por filtracin o centrifugacin.

Los mtodos de laboratorio logran confiabilidad diagnstica una vez realizados losprotocolos de validacin clnica, a travs de emplear grupo de pacientes enquienes se conoce la presencia o ausencia de niveles normales de lo quecuantifica el mtodo.


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1. INFORMACIN SOBRE EL CONTROL DE CALIDAD EN EL LABORATORIOCLNICO.

El laboratorio clnico es un servicio mdico indispensable, cuya importancia haido creciendo y desarrollndose a lo largo de los aos hasta ocupar un lugarcentral en la medicina.

La meta fundamental de los laboratorios clnicos es proporcionar datosconfiables acerca de la composicin de muestras obtenidas de pacientes, de talforma que puedan contribuir al diagnstico, tratamiento y seguimiento de diversasenfermedades. La obtencin de datos verdaderamente confiables, requiere de larigurosa aplicacin de diferentes tcnicas de control de calidad, teniendo siemprepresente que el mejor sistema de control es el que permite prevenir, identificar ycorregir los errores. Cuando no se dedica la atencin suficiente a la calidad, sepueden presentar deficiencias serias.(1)

Un laboratorio clnico debe tener como uno de sus propsitos principales, laproduccin de datos analticos de alta calidad por medio del uso de medicionesanalticas que sean precisas, exactas y adecuadas para tal fin; conduciendo esto aresultados confiables. Para concretar este propsito se hace necesario lautilizacin de programas de control de calidad interno y externo, entre otroselementos, se debe recordar que se puede tener buena o mala calidad en todotipo de sistemas analticos ya sean stos manuales o automatizados, por lo que sedebe tener mucho cuidado en ambos casos.(4)

La meta de un sistema de control de calidad deber ser que: La variacin enlas determinaciones que se llevan a cabo en el laboratorio sea lo suficientementepequea para que no se afecte la utilidad .(1)

La realizacin de cualquier procedimiento analtico puede estar amenazada porcometer un sin nmero de errores, algunos de los cuales pueden llegar a tenerconsecuencias realmente serias.

Actualmente, frente a la demanda creciente de los usuarios del laboratorioclnico (mdicos y pacientes) y como resultado del avance cientfico y tecnolgico,se requiere controlar la operacin total, incluyendo las etapas pre-analtica,analtica y post-analtica.(5)

1.1 ETAPA PREANALTICA

Las pruebas de laboratorio que miden un compuesto analizado en unespcimen de sangre u otro fluido corporal, son solicitadas por los mdicos paraevaluar el estado del paciente. Se asume que el resultado analtico obtenido esrepresentativo de la concentracin real del compuesto analizado en el paciente.Desafortunadamente, hay numerosos factores que pueden invalidar estasuposicin. Un nmero de errores no analticos pueden tambin cambiar laconcentracin de uno o ms compuestos analizados en un espcimen de tal formaque los resultados no reflejan la condicin fisiolgica del individuo. stos factoresson llamados colectivamente fuentes de error pre-analtico. De la misma forma


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en que al controlar la temperatura, la longitud de onda, y tiempo de incubacin selimitar el error analtico, el error pre-analtico tambin puede ser controlado.

Es responsabilidad de los laboratorios tomar medidas que minimicen las

fuentes de error, desarrollando procedimientos estandarizados referidos a lapreparacin del paciente, la recoleccin de la muestra, los mtodos de transportey la preservacin de la misma. (6)

1. Causas de Variacin Previas a la Recolecta

A) Variables del ciclo biolgico

Variacin cclica se refiere a los cambios en la concentracin de loscompuestos analizados, que ocurre de forma predecible a ciertas horas del da,semana o mes. El estudio de estos cambios cclicos es llamado "cronobiologa".

La variacin rtmica es tpica de muchas funciones biolgicas; la variacin diurnaen el metabolismo de drogas y la incidencia de infarto al miocardio son dosejemplos de la importancia de este campo. La variacin cclica ms reproduciblees la circadiana, la cual ocurre durante el transcurso de un solo da.

La variacin cclica durante un perodo de tiempo mayor que un da(infradiana), tambin puede afectar los resultados en las pruebas de laboratorio.La variacin circanual, la cual ha sido reportada en algunas sustancias, estrelacionada con cambios en la dieta debido a la estacin, o con la variacin delclima.Infradiana:mayor que un da (ejemplo, ciclo menstrual)Circadiana :alrededor de un da

Ulfradianos :menmor de 24 hr

Pruebas Sujetas a Variacin Diurna

Fosfatasa cida *ACTHCatecolaminasCortisol (y otros esteroides adrenales)Gastrina*Hormona del Crecimiento*Tolerancia a la Glucosa

HierroOsteocalcina*Hormana Paratiroidea*Prolactina*Renina/aldosteronaTSH**Ms alta en pasado meridiano ( PM) y las otras, ms altas en (A.M.)

Pruebas Afectadas por la Ingestin de AlimentosCloro*


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GastrinaGlucagnGlucosa

Hormona del CrecimientoInsulinaCalcio IonizadoFosfato *Potasio *TriglicridospH en Orina

*Ms bajo despus de los alimentos; todos los dems, ms altos. (6)

B)Variables fsicas relacionadas con el paciente

El ejercicio fsico es una causa comn controlable de variacin en losresultados de las pruebas de laboratorio.

Dentro de las pruebas qumicas de rutina se ha observado que: el potasio, elfsforo, la creatinina y las protenas sricas son significativamente alterados porun perodo breve de ejercicio. Con el ejercicio regular, hay un aumento en lasenzimas relacionadas con la actividad muscular y un aumento en la concentracinde cido rico en sangre. El ejercicio intenso, como correr en un maratn,produce una rpida elevacin en la concentracin del potasio, cido rico,bilirrubina y enzimas musculares, mientras que la concentracin de glucosa yfsforo disminuyen significativamente. En personas sometidas a entrenamientopara competencias de distancias largas, las concentraciones de gonadotropina y

esteroides sexuales estn marcadamente disminuidas, mientras que laconcentracin de prolactina est aumentada.

La postura es una causa de variacin preanaltica fcilmente controlable. En laposicin de pie, se observa que un incremento en la presin hidrosttica causaprdida de agua y electrlitos procedentes del compartimiento del lquidointravascular, lo que a su vez da como resultando un aumento en laconcentracin de protenas. (1)

Procedimientos para minimizar las variables en el paciente

a) Variables biolgicas cclicas.

El laboratorio deber determinar cuales de las pruebas realizadas tienencambios significativos de concentracin, ya sean cclicos o relacionados con laingesta de alimento. En condiciones ptimas, los especmenes para estas pruebasdebern ser colectados tan pronto como el paciente despierte y que est todavaen ayunas. Si hay un patrn de variacin ultradiana, como lo hay para la mayorade las hormonas pituitarias, se debern colectar varios especmenes a intervalosmayores del ciclo usual, para proveer una nocin exacta sobre la produccin dehormonas.

b) Variables fsicas.


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Si se estn colectando muestras para medir compuestos analizados, que sonafectados por el ejercicio, es necesario interrogar al paciente para saber si harealizado ejercicios vigorosos en las ltimas 24 a 48 horas. Cualquier historia de

ejercicio vigoroso deber ser anotada en la forma de requisicin e incluirse en elreporte final. Otra alternativa ser pedirle al paciente que regrese despus para latoma de esa muestra. Antes de la toma de muestra el estado de estrs es difcilde controlar; sin embargo, los mdicos debern estar informados sobre aquellaspruebas que pueden estar afectadas, as como de la magnitud del cambioinducido por el estrs, ya sea fsico o mental. Hay casos donde resultarecomendable que el laboratorio solicite asesora especial antes de llevar a cabopruebas que son severamente afectadas por el estrs del paciente, tales como laspruebas de funcin adrenal o pituitaria, metabolitos de catecolaminas, anlisis delpidos y prueba de tolerancia a la glucosa. Los efectos provocados por la posturapueden minimizarse pidiendo a los pacientes ambulatorios, que permanezcan

sentados por lo menos 15 minutos antes de la extraccin de la sangre. Para losanlisis que sufren alteraciones por la dieta, incluyendo las mediciones detolerancia a la glucosa, hidroxiprolina, 5-HIAA y los metabolitos de lascatecolaminas urinarias, es recomendable proveer al paciente con las indicacionespor escrito, antes de ser programado para la colecta de la muestra. Si pruebastales como la medicin de renina y aldosterona, tolerancia a la glucosa, orina de24 horas, grasa en heces de 72 horas, requieren de una preparacin especial delpaciente, resulta buena prctica citar entes al paciente antes para entregarle unaexplicacin detallada en una hoja impresa. (6)

2. Causas de Variacin en la Recolecta de Sangre

Tcnicas para la recolecta de sangre

El uso incorrecto de los procedimientos para obtener especmenes puedeinducir errores significativos en los resultados finales de las pruebas delaboratorio; los errores relacionados con la colecta de muestras en el laboratorioson las causas ms comunes de resultados errneos. En hospitales deenseanza, la flebotoma es llevada a cabo por una variedad de individuos(enfermeras, asistentes de mdicos y estudiantes) quienes tienen unentrenamiento formal limitado o incluso carecen de l, en tcnicas de flebotoma.

En la mayora de los laboratorios, los especmenes son colectados usandotubos al vaco y agujas especialmente diseadas, que simultneamente permitenla puncin de la vena y del tapn del tubo. Los tubos para colecta son hechos: devidrio, plstico los cuales estos ltimos son usados con ms frecuencia; ambosson apropiados para la mayora de las pruebas. Muchos tubos estn cubiertos consilicn, el cual reduce la adhesin del cogulo, permitiendo mejor separacin delsuero y de las clulas. Los tapones estn tpicamente hechos de hule.

En nios y adultos con difcil acceso venoso, puede hacerse una puncincapilar para la obtencin de la muestra. Ciertos micro tubos especiales, quecontienen anticoagulantes pueden llenarse por capilaridad. La contaminacin de lamuestra con fluidos de tejido es una causa potencial de preocupacin en todos los


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procedimientos de coleccin capilar de sangre, ya que el fluido tisular virtualmenteno contiene protenas y, por lo tanto, no tiene compuestos analizados unidos aprotenas. Este tipo de contaminacin puede ser minimizado usando solo la

sangre que fluye libremente del sitio de puncin. (6)

Tipos de muestras de sangre

Las diferencias que existen entre sangre arterial, venosa y capilar, son causasocasionales de resultados errneos. La sangre arterial es la fuente de nutrientespara todos los tejidos del cuerpo y es la mejor muestra para el anlisis de ladistribucin de sustancias necesarias para los tejidos corporales como el oxgeno.La sangre venosa difiere de la sangre arterial en que tiene menoresconcentraciones de sustancias usadas en el metabolismo, tales como oxgeno yglucosa, y ms altas concentraciones de productos de desecho tales como: cidos

orgnicos, amoniaco y dixido de carbono.Si sitios especficos como el pie se mantienen tibios, se pueden obtener

muestras de sangre capilar que son muy parecidas a las de sangre arterial. Enestados de poca perfusin tisular y en los neonatos, sin embargo, hay unadiferencia significativa entre la presin parcial de oxgeno (PO2) de la sangrecapilar y la arterial. (6)

a) Errores relacionados con preservativos y anticoagulantes

Los preservativos y anticoagulantes son ampliamente usados para colectarmuestras de sangre, orina y otros fluidos corporales. Cuando se extrae sangre del

cuerpo y se deja coagular, sta se separa en una fase lquida llamada suero y enun cogulo slido conteniendo clulas sanguneas y fibrina. Si se aade unanticoagulante como la heparina, la fase lquida es llamada plasma. El suero y elplasma son similares en muchos aspectos. El suero difiere del plasma en quecarece de fibrina, disminuyendo el total de protena en un promedio de 3 g/L. Enla coagulacin, las plaquetas liberan potasio al suero; la concentracin de potasioen el plasma es aproximadamente de 0.2-0.3 mmol/L ms bajo que el potasio ensuero. Por razones desconocidas, la concentracin de fsforo es ms baja enplasma por un promedio de 2 g/L. En pacientes con algunos trastornoshematolgicos estas diferencias son exageradas. Con estas pocas excepciones,el suero y el plasma heparinizado son usados indistintamente para pruebas de

laboratorio. La seleccin del tipo de muestra depende de la instrumentacin,mtodos de ensayos y de la necesidad de rapidez en los resultados.

El EDTA, contenido en el tubo utilizado para la recoleccin de muestras enhematologa, es usado tambin para algunos ensayos qumicos porque laquelacin de los cationes divalentes inactiva muchas enzimas y conduce acambios in vitro de hormonas peptdicas y lpidos. La quelacin de cationes talescomo el hierro, magnesio y calcio, sin embargo, causa una disminucin artificial delos resultados en la mayora de los ensayos colorimtricos y reduce la actividad deenzimas, que requieren cationes activadores (fosfatasa alcalina y creatin cinasa).La contaminacin de muestras con anticoagulantes, especialmente EDTA, es unproblema comn en muchos laboratorios. Debido al potencial del EDTA para


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interferir en muchos ensayos, los recomendable ser qu los tubos conteniendoEDTA deban llenarse al ltimo. Si se est usando anticoagulante lquido, esimportante asegurarse que sea proporcional la cantidad de sangre y

anticoagulante. (6)

b) Errores relacionados con los tubos separadores de suero

Los tubos separadores de suero y plasma son usados por muchos laboratoriospara simplificar el proceso de separacin del suero (o plasma) de los elementoscelulares. Los tubos separadores de suero y plasma, contienen un gelrelativamente inerte e impenetrable, el cual tiene una densidad intermedia entrelos elementos celulares y el plasma o suero. Durante la centrifugacin, el gel selevanta desde el fondo del tubo y forma una barrera mecnica que evita que loscambios metablicos afecten las concentraciones plasmticas. Los tubos que

contienen estos geles pueden ser centrifugados y almacenados sin serdestapados, reduciendo as el riesgo de producir aerosoles infecciosos y evitandoen forma simultnea la evaporacin. Algunos agentes teraputicos se adsorben enel gel, disminuyendo falsamente las concentraciones de antidepresivos tricclicos yciertas drogas antiarrtmicas como el flecainide. Con estas excepciones, lamayora de sustancias en plasma no son afectadas por el uso de gelesseparadores. (6)

c) Errores relacionados con las tcnicas de recolecta inadecuada

Torniquetes.

El uso de los torniquetes constituye una importante causa, ademscontrolable, de variacin en los resultados de pruebas de laboratorio. Lostorniquetes son ampliamente usados en flebotomas para bloquear el retornovenoso, causando dilatacin de las venas y haciendo ms fcil la identificacin deun sitio de venopuncin. Los torniquetes a menudo se permanecen colocadosdurante el proceso de venopuncin asumiendo que la continua dilatacin venosapermitir una colecta ms rpida de la muestra y evitar el "colapso" de la vena.

Aunque los torniquetes hacen el proceso de flebotoma ms fcil, ladisminucin en el flujo de sangre que stos inducen, causa cambios en losresultados de las pruebas de laboratorio que pueden predecirse. Un minutodespus de aplicar el torniquete, el incremento de presin causa prdida de agua

y electrlitos del plasma hacia el espacio del fluido extracelular, produciendo unaelevacin en la concentracin de protenas, clulas y sustancias unidas a clulas yprotenas. Si un torniquete se deja por 5 minutos, la elevacin en la concentracinpuede alcanzar hasta 15%. La magnitud de estos efectos puede diferir entre elprimero y el ltimo tubo colectados, mostrando una hemoconcentracin mayor enlas ltimas muestras. (6)

Hemlisis.La hemlisis ocurre cada vez que hay un trauma en los relativamente frgiles

eritrocitos, ya sea durante la colecta o con menor frecuencia despus de laflebotoma. Una causa poco comn de hemlisis, es cuando se lleva a cabo la


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flebotoma antes de que se seque el alcohol o cualquier otro desinfectante usado.Frecuentemente, la hemlisis es causada por un flujo turbulento no laminar,durante el proceso de colecta. Dentro de los tamaos de agujas que comnmente

se utilizan, la hemlisis no es causada por el uso de agujas muy grandes o muypequeas. El flujo no laminar ocurre comnmente cuando la sangre se muevemuy lentamente o demasiado rpido a travs de la aguja. Si la sangre se extraecon una jeringa, al sacar el embolo con fuerza o al inyectar la sangre en los tubosusando presin en el embolo, generalmente se produce hemlisis. En formasimilar, el flujo de sangre lento de una vena colapsada que es depositado a untubo con vaco a menudo produce una muestra hemolizada. La turbulencia en untubo conteniendo sangre tambin puede causar hemlisis despus de haberterminado la colecta; los transportadores mecnicos y centrfugas en mal estadoson causas raras de hemlisis.

La hemlisis altera los resultados de las pruebas de laboratorio. De manera

importante el contenido de los glbulos rojos es liberado, incrementando laconcentracin de sustancias intracelulares tales como lactato deshidrogenasa (LDH), potasio y magnesio, mientras que disminuye la concentracin de solutosextracelulares como el sodio. (6)

Contaminacin con fluidos intravenososA muchos de los pacientes hospitalizados,por prescripcin mdica se les

administra fluidos intravenosos, los cuales tpicamente tienen una concentracinms alta de glucosa, drogas y algunos electrlitos, que los que estn presentes enla sangre. La contaminacin con fluidos intravenosos ocurre, cuando la sangre esextrada de una vena conectada a la vena que tiene el catter. Aunque pudiera

parecer que una vena en el antebrazo es suficientemente distante del catter, hayuna gran cantidad de interconexiones. Cualquier extraccin de sangre de unavena que se encuentre en el mismo lado donde est instalado un catter, corre elriesgo de experimentar contaminacin por fluidos. (6)

c)Errores relacionados con la identificacin del paciente y la muestracorrespondiente.

Debido a que no hay forma de probar que una muestra sin etiqueta pertenece aun paciente dado, resulta esencial la identificacin apropiada de las muestras.Mientras que el etiquetado puede parecer la parte ms simple de la colecta de

muestras, en la mayora de los laboratorios es la causa ms comn de resultadoserrneos. Muchos errores se cometen cuando se etiquetan muestras de pacientescon nombres similares (6)

3. Causas de Variacin Posteriores a la Recolecta

La causas de variacin posteriores a la recolecta son ms fcilmentecontroladas por el laboratorio que las variaciones relacionadas con la flebotoma,ya que es posible desarrollar criterios para las condiciones aceptables dealmacenamiento y manejo de muestras despus de la colecta, durante el tiempoque las muestras estn en posesin del laboratorio. Dentro de las variables en el


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manejo de muestras que afectan los resultados de las pruebas estn: transporte,separacin del suero de los elementos celulares y las condiciones dealmacenamiento. (6)

Transporte de las muestras

Errores relacionados con el transporte de muestras.Comnmente las muestras son transportadas por los flebotomistas o por los

mensajeros. Una tardanza razonable en la transportacin, por lo general es bientolerada por la mayora de los compuestos analizados, ya que los cambiosmetablicos ocurren relativamente despacio a temperatura ambiente. As, latardanza hasta de una hora no cambia la concentracin de la mayora de loscompuestos analizados. La glucosa, a menudo considerada una de las sustanciasms lbiles en la sangre disminuye de 2 a 3% por hora, a temperatura ambiente,

en tubos sin inhibidores glucolticos como el fluoruro. Los productos delmetabolismo (como lactato, amonio y el ion hidrgeno) se acumulan en el plasmadespus de la toma de la muestra, a menos que las reacciones enzimticas seanretardadas. (6)

Procedimiento para minimizar errores de transportacinPara minimizar la variacin posterior a la colecta, los especmenes deben ser

entregados y almacenados rpidamente despus de la toma de muestras. Loscompuestos analizados que estn sujetos a cambios de concentracin in vitro atemperatura ambiente, inmediatamente deben ser transportados en hielo allaboratorio. Las instrucciones de manejo deben ser claras; en muchos casos, las

muestras son colocadas incorrectamente sobre hielo, transportadas sobresaliendode un recipiente con hielo o sumergidas en hielo sin agua. Debido a que un slidoconduce calor ms lentamente que un lquido, las muestras manejadas de estamanera, no se enfriarn tan rpido y pueden mostrar cambios en la concentracindel compuesto analizado.

Aunque el enfriamiento de las muestras durante su transporte minimiza muchoscambios artificiales en la concentracin de compuestos analizados, el enfriamientotambin incrementa la liberacin de potasio de las clulas.

Para una sustancia que sufre cambios en la concentracin debidos almetabolismo in vitro, debe indicarse un tiempo especfico tolerable de retraso. (6)

Procesamiento de muestras

Errores originados debido al procesamiento incorrecto de las muestrasLa centrifugacin es el mtodo ms comnmente usado para la separacin

inicial del suero y las clulas. En general, la centrifugacin de muestras por 5 a 10minutos a 1000-2000 G es adecuada para la completa separacin del suero yeritrocitos, incluyendo las muestras que contienen geles separadores de suero oplasma. Las muestras para obtener suero deben ser centrifugadas nicamentehasta que la formacin del cogulo sea completa (al menos 20 a 30 minutosdespus de su colecta). Se debe tener la precaucin de revisar que realmente elcogulo se haya formado, ya que puede haber razones fisiolgicas para que


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ocurran tiempos prolongados de formacin del cogulo. Por ejemplo, las muestrasde pacientes de dilisis pueden continuar coagulndose por horas despus de lacolecta debido a la heparina empleada en la preparacin de los pacientes para

dilisis. Con tubos que no contienen geles separadores, es necesaria una etapaadicional para completar la separacin. Antes de la centrifugacin, los objetostales como perlas de vidrio, tapones o cualquier otro objeto mecnico puede seradicionado a los tubos para realizar la misma funcin que el gel. El suero debe serseparado de las clulas, de otra manera, las clulas sanguneas continuarnllevando a cabo sus funciones metablicas y alterarn la composicin delespcimen. (6)

Almacenamiento de muestras

Errores originados debidos al almacenamiento inadecuado de muestras

Una vez que el suero o plasma ha sido separado de las clulas, la mayora delas sustancias en un perodo de 2-3 das muestran pequeos cambios en laconcentracin cuando se mantienen a 4 C. Para com puestos analizados lbiles,incluyendo, enzimas y algunas otras sustancias, las muestras deben sercongeladas para prevenir cambios relacionados con el almacenamiento. Loscompuestos analizados que pueden ser intrnsecamente estables enalmacenamiento, tambin pueden cambiar en presencia de otros compuestos.

La evaporacin puede incrementar la concentracin de la muestra. Cuandouna muestra no est cubierta, la velocidad de evaporacin es afectada por latemperatura, humedad, movimiento del aire y el rea superficial de la muestra. (6)

Procedimientos para minimizar errores por almacenamiento.Los errores por almacenamiento pueden ser evitados seleccionando

adecuadamente la hora, la temperatura y las condiciones de almacenamiento. Lamayora de los compuestos analizados son estables, cuando se almacenanrefrigeracin durante 72 horas. Si un compuesto analizado no es estable, lasmuestras deben ser congeladas, hasta su anlisis. La mayora de especmenespueden almacenarse a -70 C sin que sean afectadas las concentraciones de loscompuestos analizados, ms que cuando sean congelados por varios aos. A lastemperaturas estndares de congelacin de 10a 2 0C, la mayora de lassustancias sern estables por perodos ms cortos. Debe evitarse ladescongelacin y recongelacin repetidas de muestras; esto es especialmente

problemtico con los congeladores modernos "libres de escarcha", los cualesperidicamente incrementan la temperatura de congelacin para permitir la fusinde la escarcha. Los compuestos analizados que son susceptibles a ciclosrepetidos de congelacin y descongelacin, como el complemento, debern seralmacenados en otro tipo de congeladores. Las muestras congeladas deben serdescongeladas lentamente a temperatura ambiente o en un bao de agua a 37 C,y entonces ser mezcladas meticulosamente antes de su anlisis. (6)


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Criterio para el rechazo de especmenes

Para evitar el reporte de resultados falsos, cada laboratorio debe establecer el

criterio para el rechazo de especimenes. Un espcimen debe ser rechazadocuando los resultados obtenidos en su anlisis no representan el estado delpaciente. La causa ms comn de rechazo de un espcimen se origina por unaidentificacin inadecuada. Los especimenes debe tener el nombre del paciente ynmero de identificacin tanto en la muestra como en la requisicin. Losespecimenes que no son extrados por el personal del laboratorio debern sercuidadosamente revisados antes de ser aceptados en el laboratorio. Enespecmenes que requieren manejo especial, las causas ms comunes derechazo son la colecta y/o transporte inadecuado.

Cada laboratorio deber tener una lista de muestras alternativas aceptablespara cada prueba; por ejemplo, el manual del laboratorio puede sugerir la colecta

de suero para una prueba en particular, pero una muestra de plasma heparinizadopuede ser una alternativa aceptable. Si las muestras contienen otrosanticoagulantes o preservativos, deben ser rechazadas (aunque sean tiles paraotros anlisis). Cuan las muestras se manejen en tubos que contienenanticoagulantes o preservativos, se indicar la proporcin hay entre los mismos .Esto es ms crtico con preservativos en soluciones lquidas, pero puede ocurrirtambin con anticoagulantes en polvo. Los tubos que no tengan la proporcinapropiada no deben ser aceptados para anlisis. Para pruebas que requieren unapreparacin especial del paciente y si sta no se llev a cabo, las muestras debenser rechazadas. Si una prueba es afectada por hemlisis, los especmeneshemolizados deben rechazarse. As mismo, si el resultado de una prueba es

afectado por lipemia (y la muestra no puede ser clarificada por ultra centrifugacinantes del anlisis), este resultado de la prueba no deber ser reportado. Aunquemuchos mdicos se quejen cuando el laboratorio no les reporta el resultado de laspruebas que solicitaron para sus pacientes, si hay alguna duda a cerca de lavalidez de un resultado este no debe ser reportado. Los resultados errneospueden conducir al tratamiento inadecuado del paciente. (6)

1.2 ETAPA ANALTICA

En la fase analtica se realizan las mediciones y observaciones en funcin delos procesos o protocolos que cubre el laboratorio. Cada procedimiento de anlisis

describir no slo las mediciones y observaciones implementadas en ellaboratorio, sino tambin la verificacin de las caractersticas de ejecucin, quepretende la persona que elabor el procedimiento o el fabricante del sistemaanaltico. Los procedimientos, materiales de sistema de control, varan segn laespecialidad. Algunas veces los valores obtenidos son variables continuas(mtodo cuantitativo), en otros casos las variables son discretas (semi-cuantitativas y cualitativas), pero en todos los casos, en la fase analtica se debeconsiderar la medicin u observacin y un procedimiento de control. La seleccindel procedimiento se basa en los criterios de practicabilidad y confiabilidad. Losaspectos de practicabilidad incluyen la educacin y el entrenamiento requerido,disponibilidad de reactivos, los requerimientos instrumentales, el tiempo de


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laboratorio incorrectos o con que transcurre demasiado tiempo, desde que sesolicita la prueba de laboratorio hasta que se reciben los resultados finales. El otrotipo de vigilancia de la calidad en esta rea, se practica mediante la valoracin

continua del impacto de los resultados y procedimientos del laboratorio dentro dela institucin en la cual brinda sus servicios. El objetivo de estas valoracionescontinuas es promover la excelencia en los cuidados para los pacientes, pormedio de las relaciones humanas con todos los departamentos de la institucin.Los programas de preservacin de la calidad a nivel institucional toman la formade crculos de calidad, comits para preservacin de la calidad o comitsrevisores. El objetivo de estos grupos no es resolver problemas sino evitar queocurran. Adems es necesario que el laboratorio tenga algn mtodo parapreservar en forma continua la calidad, verificando peridicamente su capacidadpara funcionar como un departamento de buena calidad. Esto puede incluir laevaluacin de los espacios disponibles en el laboratorio para asegurar eficacia en

los servicios, revisar el grado de preparacin del personal y apoyarlo, para queparticipe en actividades de actualizacin de conocimientos y continuar con suformacin profesional.

Todos los miembros del personal de laboratorio son responsables de que sepreserve la calidad dentro del mismo. Esto ser una forma de convivencia y unaactitud evidente en todos los niveles de prctica. La calidad debe extenderse msall de los confines fsicos del laboratorio e incluye la responsabilidad de losservicios hacia cualquier mdico que ordene una prueba y una preocupacinpermanente para que el paciente reciba tratamiento eficaz como resultado de losdatos que arroja el laboratorio.(5)

Una vez que se propicie un aseguramiento de la calidad de los estudios encada una de las etapas anteriores, se podrn obtener resultados concretosrespaldados con bases slidas, es decir, se podr afirmar entonces que se tieneun laboratorio con la adecuada estructura operativa y administrativa.


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1.4 FLEBOTOMA

PUNCIN VENOSA1.0 INTRODUCCIN

La flebotoma constituye una de las etapas ms importantes en el trabajo dellaboratorio clnico. Por una parte representa el primer contacto entre el laboratorioy sus pacientes, y respecto a la muestra sangunea: la enorme importancia queconlleva una muestra apropiadamente colectada, la seguridad de su origen, y elcorrecto envasado y transporte constituyen factores fundamentales en laevaluacin e informe de los exmenes a realizar.(11)

El organismo utiliza la sangre para el transporte de oxgeno, alimento, residuosy otros materiales que hay en el interior del cuerpo, y tambin para regular latemperatura corporal, los lquidos y el equilibrio cido bsico. Debido a lasmltiples funciones de la sangre dentro del cuerpo, los exmenes de sta o desus componentes pueden suministrar indicios claves para el diagnstico demuchas condiciones mdicas.

La sangre est compuesta de una porcin lquida (plasma) y de una porcincelular; el plasma contiene varias substancias que estn disueltas en el lquido. Elsuero es lo que queda, cuando el fibringeno se ha separado del plasma (lquidoque queda despus de que se deja coagular la sangre en un tubo de ensayo). Laporcin celular de la sangre consta principalmente de glbulos rojos, pero tambin

tiene glbulos blancos y plaquetas.(8)Los tubos al vaco han reemplazado a las jeringas. Estos tubos pueden estar

siliconados para evitar la hemlisis de la muestra, vienen preesterilizados porirradiacin y presentan tamaos de 2 a 30 mL. Durante la recoleccin de lasangre y hasta que el suero es separado de los glbulos rojos, debe reducirse laposibilidad de hemlisis (utilizando agujas de calibre adecuado, tubos limpios ysecos, un mezclado suave, etc.) ya que la hemlisis produce la elevacin in vitrode la concentracin de los metabolitos del suero, al liberarse estos de loseritrocitos, p.ej. fsforo , sodio, hemoglobina, protenas totales, lpidos, enzimas,bilirrubinas, etc., tambin puede provocar un efecto de dilucin de loscomponentes qumicos del suero, al liberarse sustancias del interior de los

eritrocitos.(9)Si se toma varias muestras de sangre, con tubo al vaco y una sola puncin

venosa hay que tener precaucin de poner los tubos en un orden definido paraevitar la contaminacin cruzada entre tubos.

El orden recomendo de la toma, cuando se efecta una recoleccin mltiplede muestras es el siguiente: Tubos sin anticoagulante (Rojo). Tubos para pruebas de coagulacin. (Azul). Tubos con otros anticoagulantes (Lila, Verde, Verde-Gris y Amarillo).(10)

Cuadro I


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Validar la enorme importancia para obtener una muestra apropiadamente

colectada, su correcto envasado y transporte.

Realizar la puncin venosa entre los alumnos y utilizar el modelo brazomecnico para manejo de material utilizado en la punci

3.0 MATERIAL

Para desinfectar la piel:

Alcohol isoproplico al 70%. Algodn. Gasas.

Para puncin de la vena

Ligadura de goma de ltex (2-5 mm de dimetro por 35-40 cm. de largo). Tubos al vaco correctamente identificados. Soporte para tubos VACUTAINER Agujas desechables estriles calibre 20, 19 o 18.(9) recipiente para desechos punzo cortantes bolsas rojas para desechos biolgicos

4.0 CONDICIONES DE LA TOMA DE MUESTRA DE SANGRE VENOSA

Es necesario que la persona que va a tomar la muestra adopte actitud deconfianza, autoseguridad y equilibrio. Conocer y realizar los procedimientosnecesarios para minimizar los errores en la toma de muestras.

Debe explicar brevemente al paciente las maniobras que va a realizar paraobtener la mayor colaboracin posible. Debe tranquilizarse al paciente paradisminuir el estado de estrs.

Revisar que todo el material est listo (tubos rotulados, torundas de

algodn, alcohol, ligaduras, jeringa, gradilla, tapones). El paciente y el operador deben estar en posicin confortable y en un sitio

con buena iluminacin. El paciente debe estar sentado en una silla y debe extender el brazo sobre

el borde de una mesa, encima de una toalla desechable, para tener accesofcil y cmodo a la fosa antecubital. Evitar el uso de bancos altos sinrespaldo.

Es necesario tener en cuenta el tipo de anlisis, el volumen de la muestra yla edad del paciente.


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Para volmenes pequeos de muestra es recomendable utilizar el lbulo dela oreja, pues en caso de utilizar los dedos de la mano se corre el riesgo deinfecciones por contaminacin en el trabajo de laboratorio.

Para un volumen mayor, el sitio ms adecuado es la vena que se encuentraen el pliegue anterior de la flexin del codo, se recomienda utilizar la venamediana baslica o ceflica ver la Figura1

En los pacientes obesos las venas que se observan azulosas sondemasiado superficiales y pequeas y es mejor no utilizarlas.

Es conveniente que el paciente no mire mientras se est realizando lapuncin.(9)

5.0 SELECCIN DEL SITIO DE PUNCINFIGURA 1

VENAS SUPERFICIALES DEL BRAZO1. V. Ceflica.

2. V. Baslica.3. V. Media baslica.4. V. Mediana ceflica.5. V. Radial accesoria.6. V. cubital superficial.7. V. Radial superficial.(9)

6.0 PROCEDIMIENTO PARA LA PUNCIN VENOSA

6.1 DESARROLLO DE LA PRCTICA:


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1. Verificar que las etiquetas coincidan con la solicitud de las pruebas.2. Se identifica al paciente comprobando su nombre completo y fecha de

nacimiento. Si se encuentra inconsciente, debe de verificarse su identidad atravs de una enfermera o un familiar. No se debe extraer muestra algunasin identificar adecuadamente al paciente.

3. Si se solicita una muestra en ayunas, debe comprobarse que el paciente noha ingerido alimentos. Hay que dirigirse al paciente e informarle sobre elprocedimiento.

4. Se debe colocar adecuadamente al paciente, segn se encuentre sentado oen decbito prono, para tener acceso fcil a la fosa antecubital.

5. Se debe preparar todo el material, incluidos los tubos, la ligadura, losobjetos para limpiar la piel, las jeringas; cuando sea necesario, la agujaestril y el dispositivo para fijarla.

6. Se solicita al paciente que cierre el puo para que las venas resulten mspalpables.

7. Se selecciona la vena adecuada para la puncin (fig. 1 )8. Se limpia la zona de la puncin con una torunda humedecida con alcohol

isoproplico al 70%. Se comienza en el punto de la puncin y se prosigue lalimpieza hacia fuera siguiendo un movimiento espiral.

9. Se aplica un torniquete varios centmetros por encima de la zona depuncin. No dejarlo ms de un minuto.

10. Se fija la vena tanto por encima como por debajo del lugar de puncin, conayuda de los dedos pulgar y medio o ndice y pulgar.

Se realiza la venopuncin: a) se penetra la piel con la aguja formando un ngulo

de 15 con el brazo y con el bisel hacia arriba, se sigue la direccin de la vena; b)se introduce la aguja con suavidad pero con rapidez para reducir las molestias. Nohay que enterrar la aguja; c)si se utiliza una jeringa , se tira hacia atrs delmbolo, con tensin lenta y uniforme a medida que la sangre va fluyendo en suinterior; d)si se utiliza un tubo al vaco, en cuanto la aguja haya penetrado en lavena se dirigir el tubo todo lo posible hacia delante apoyndose en el dispositivode sujecin (de la misma forma en que se introduce el mbolo de una jeringa). Almismo tiempo mantenga firmemente la aguja en su lugar. Una vez que se hayallenado el tubo, se retira cogindolo por su extremo y tirando suavemente de l. Semezcla la sangre con el anticoagulante por inversin suave. Si la muestra ha sidoextrada con jeringa se transferir la sangre a los tubos correspondientes despus

de retirar la aguja.

7.0 CRITERIOS DE LABORATORIO PARA ESPECMENES INACEPTABLES

Las causas ms frecuentes de rechazo de especmenes sanguneos son:

1. Identificacin inadecuada. Cada laboratorio debe determinar la cantidadmnima de informacin del paciente que debe ser incluida en la solicitud delaboratorio y en el recipiente de la muestra. Esta informacin incluyegeneralmente nombre, direccin, habitacin, nmero de identificacin, sexo ,edad. El flebotomista debe verificar visual y verbalmente la identidad del


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paciente, comparando su nombre con el de la pulsera de identificacin, laprueba requerida y las etiquetas. El tubo y la solicitud de laboratorio debenvolverse a controlar para verificar su identidad luego de ser recibidos. Las

diferencias entre el nombre de la solicitud del laboratorio y el envase de lamuestra es causa de rechazo de sta.

2. Volumen de sangre inadecuado recogido en tubos o jeringas conaditivo. La cantidad de aditivo adicionada a un tubo al vaco presupone queste se llenar totalmente con sangre. Si se extrae menos sangre de larequerida, la cantidad excesiva de aditivo tiene el potencial de afectaradversamente la exactitud de los resultados de las pruebas. El EDTA ycitrato de sodio para hematologa y coagulacin son inaceptables conmenos del 100% del llenado del tubo. No se han investigadorecomendaciones de tolerancia absoluta para otros aditivos. Hasta ahora, el

lineamiento solamente puede alterar sobre los posibles efectos perjudicialesde los aditivos en exceso.

3. Utilizacin de tubos de recoleccin inadecuados. En general, el suero esla muestra preferida para la mayora de los anlisis bioqumicos. Los tubosde fluoruro de sodio diseados para la muestra de glucosa son inapropiadospara la mayor parte de los otros procedimientos. Los agentes quelantes soninaceptables para las determinaciones enzimticas la mayora de la veces.La heparina es tal vez el anticoagulante que menos afecta losprocedimientos de laboratorio, aunque esto depende en gran parte delmtodo.

4. Hemlisis. La hemlisis puede ser el resultado de una venipuntura difcil ode un manejo impropio del espcimen recolectado. La hemlisis tambinpuede resultar de un proceso de la enfermedad que causa la destruccinintravascular de los eritrocitos. La hemlisis visible es inaceptable (mayor a200 mg/L de hemoglobina) cuando se analizan estas sustancias utilizandociertos mtodos. El grado de interferencia depende del grado de hemlisis,la concentracin de la variable analtica y la metodologa empleada.

5. Transporte inapropiado. Las muestras para determinacin de cido lctico,gases en sangre, amonio y otros procedimientos donde existe unasignificativa susceptibilidad de stas al deterioro, no deben ser analizadas sino son transportadas al laboratorio en hielo y dentro de un tiempopreestablecido.

6. Tiempo preanaltico permisible. Cuando el tiempo mximo permisible esexcedido, deben tomarse medidas. La falsificacin de los resultados serasumida mdicamente. El responsable del laboratorio marcar el resultadoobtenido con una nota apropiada, o se negar a llevar a cabo la prueba. Laltima medida es especialmente aconsejable cuando la conclusin mdica


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puede deducirse del resultado, lo cual es una desventaja para elpaciente.(9)


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1.5 ESTUDIO DE LA VARIACIN EN CONDICIONES DE RUTINA (VCR)

1.0 INTRODUCCIN

Todos los laboratorios de salud deben tener un sistema para valorar la calidadde su trabajo. La experiencia ha demostrado que entre los laboratorios que hanaceptado esta recomendacin, existen muchos que han elegido mtodos deensayo de la variacin de los resultados que persiguen ms la satisfaccin y laseguridad que la informacin veraz y completa sobre su calidad.

Existen tres posibles causas de variacin en el laboratorio de la salud. Una deellas es la debida a errores al azar. Como ejemplos pueden citarse: Error en la lectura de los instrumentos. Errores aleatorios en los clculos. Errores de trascripcin incluyendo la transposicin de nmeros. Colocacin incorrecta de la coma decimal. El uso de un espcimen incorrecto del paciente debido al intercambio de

especimenes. El uso de un reactivo o patrn preparado incorrectamente.Las otras dos causas de variacin son la precisin: concordancia entre los

resultados de una serie de mediciones. Y la exactitud: concordancia entre lamedida de una serie de mediciones y el valor verdadero.

VARIACIN EN CONDICIONES PTIMAS:La variacin de las condiciones ptimas (VCO) es la menor variacin que

puede obtenerse para un mtodo analtico concreto en un laboratorio individual.

Deben realizarse aproximadamente 20 anlisis para obtener la (VCO). Elobjetivo es intentar repetir los anlisis en las condiciones analticas tan ideales yconstantes como sea posible. Han de aplicarse estrictamente todas las medidaspreventivas necesarias. Algunas son: Usar el mismo aparato para todas las determinaciones. Usar reactivos recin preparados y verificados. Realizar los anlisis sobre un material homogneo y estable. Verificar las lecturas del instrumento y los clculos. Realizar los anlisis en el menor intervalo de tiempo posible. Controlar cuidadosamente la temperatura y el tiempo. Evitar cambios bruscos en las condiciones ambientales; luz, temperatura,

humedad. Asegurarse de que todos los reactivos estn correctamente mezclados. Utilizar personal experimentado.(13)En resumen en el tratamiento de los resultados deben calcularse la media y la

desviacin estndar y ms importante an, deben representarse grficamente losresultados individuales en una grfica control como lo indica la siguiente grfica :


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Grfica de control en ptimas condiciones de variacin.(M: media ; S:

desviacin estndar).

En est grfica de control se han trazado cinco lneas horizontales, unacorresponde al valor medio de los valores observados, y dos lneas por encima ydos por de bajo de la media correspondiendo a dos y tres desviaciones estndarde la media.

En la valoracin de la VCO deben buscarse tendencias y anormalidades en ladistribucin de los resultados, buscar su causa y resolver el problema antes depasar al siguiente nivel.(13)

VARIACIN EN CONDICIONES DE RUTINA:Otra etapa en las tcnicas de control de calidad es determinar la varianza en

condiciones de rutina (VCR). Esta es la variacin de los resultados de una tcnicacuando el material es analizado en condiciones de trabajo similares a las que seencontrar cotidianamente.

Este tipo de control consta de dos partes. La primera se refiere al anlisis delmaterial de control cuando previamente se conocen los valores del mismo(VCRC). La segunda se refiere al anlisis de materiales cuyos valores no sonconocidos (VCRN).

Con frecuencia la variacin en condiciones de rutina ser mayor que laobtenida en condiciones ptimas. Para la mayora de las tcnicas colorimtricas larazn entre ambas variaciones es de 2. Esto se debe a la dificultad de mantener

las condiciones analticas en situacin totalmente estable durante un perodoprolongado de tiempo en condiciones de rutina.

Dentro de la variacin en condiciones de rutina con valores desconocidosdeben tomarse en cuenta tres componentes esenciales:

Utilizar ms de un nivel de concentracin del material de control. Asegurarse de que los valores esperados son desconocidos para el

operador. Colocar el material de control al azar dentro de las series de anlisis de la

misma forma en que se colocan los sueros de los pacientes.(13)


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Para el estudio de la variacin en condiciones de rutina se utilizar ladeterminacin cuantitativa de albmina.

La albmina tiene varias funciones en el torrente sanguneo incluyendo

nutricin, mantenimiento de la presin onctica y transporte de sustancias comoCa ++, bilirrubina, cidos grasos, drogas y esteroides.

Valores bajos en suero pueden resultar de mal nutricin en enfermedades delhgado, un incremento en el catabolismo, incremento en la excrecin en, orina oheces, o un cambio de distribucin entre los compartimientos intravascular yextravascular. Valores altos en suero pueden resultar de deshidratacin oquemaduras severas.(5)

2.0 OBJETIVOS

Proporcionar resultados de anlisis con exactitud y con precisin, de talmanera que se puedan obtener conclusiones y tomar decisiones basadasen una informacin que tenga niveles aceptables de error.

Realizar 20 repeticiones de una muestra control comercial determinandoprotena o cualquier analito en condiciones de rutina y determinar elcoeficiente de variacin que debe ser menor a 5%. El analito a evaluar se leinformar al alumno antes de la prctica.

analizar estadsticamente los resultados obtenidos de la misma muestra

para establecer el grado de precisin y exactitud.

Determinar las fuentes de variacin analtica ms frecuentes en el trabajodel laboratorio.

Manejar e interpretar adecuadamente las cartas control de Levey-Jennings.


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GRFICAS Y CARTAS DE CONTROL :

Cada equipo reportar los resultados obtenidos en el procedimiento de ladeterminacin de albmina en el pizarrn.

Los datos de los controles de cada equipo representaran los anlisis diarios delas mezclas de control de calidad de un laboratorio (cada equipo representara unda diferente de un mes). A partir de los datos reportados:

Calcule la media, la desviacin estndar y el coeficiente de variacin desus resultados.

Grafique sus resultados en las cartas control de Levey-jennings, resaltandolos lmites de alerta (x 2s).

Realizar la carta de control de calidad:NOMBRE__________________________________________MATERIA______________ EQUIPO__________FECHA____COMPONENTE_____________________________________METODO_______________UNIDADES__________________LONGITUD DE ONDA______nm. APARATO______________

(SIGUIENTE TABLA 1)


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tabla1

FECHA No. DE DETER- VALORES INDI- DESVIACIONES DEL CUADRO DE LASMINACIONES VIDUALES Xi VALOR MEDIO Xi-X DESVIACIONES (Xi-X)2

1

2345678910....

..

.

.

.

.

.

.

.

.25n= Xi= (Xi- X)2

Calculado el:__________Firma:________________


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Cul sera su conclusin, respecto de la precisin con la que se trabaja en el

laboratorio?

Superior x + 2sLmites de alerta

Inferior x 2s

Superior x + 3s

Limites de controlInferior x 3s

Realizar grafico de Levey-Jennings:

NOMBRE__________________________________________MATERIA______________ EQUIPO__________FECHA____COMPONENTE__________ ______________________MTODO_______________UNIDADES__________________LONGITUD DE ONDA________APARATO________________DATOS DEL CONTROL UTILIZADO:MARCA: NIVEL: LOTE: CADUCIDAD:

(SIGUIENTE GRFICO 2)


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Grfico 2 de Levey-Jennings

x + 2S

x + 1S

MEDIA x

x - 1S

x - 2S


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UNIDAD II2. PRUEBAS DE FUNCIONAMIENTO RENAL

2.1 CIDO RICOMtodo enzimtico colorimtrico

1. INTRODUCCIN

El cido rico en los mamferos es el metabolito final del catabolismo de lasbases pricas y su elevacin est asociada a la gota, es decir, los reumatismoshiperuricmicos. En los pacientes con tal disfuncin, aparecen cristales decido rico en las articulaciones y en los tendones, lo que origina lasmanifestaciones reumticas caractersticas.Niveles altos de cido rico estn tambin asociados a patologa renal por

retencin de productos nitrogenados, asocindose en estos casos a valorestambin altos de urea y de creatinina.

2. OBJETIVO Aplicar el manejo adecuado de la tcnica para la determinacin de cido

rico en una muestra biolgica. Establecer los valores de referencia de cido rico y comparar con el valor

de nuestra muestra problema a analizar. Definir cuales son las principales patologas que se presentan si tenemos

valores altos o bajos de cido rico en una muestra biolgica.

3. FUNDAMENTO DEL MTODO

El cido rico es oxidado por la uricasa a alantona y perxido de hidrgeno queen presencia de POD y 4-AF y DCPS forma un compuesto rosceo.

Uricasac. rico + 2H20 + 02 Alantona + CO2 + 2H202

POD2H202 + 4AF + DCPS Quinona + 4H20

4-AF = 4 aminofenazona

DCPS = 2,4,diclorofenol sulfonato

Guardar en refrigeracin a 2-8 C. Estos productos son, solamente, para uso delaboratorio y pruebas "in vitro".

4. PREPARACIN4.1MUESTRA CLNICA

MUESTRASuero, plasma u orina.Orina: Diluir la orina al 1:10 con agua destilada, mezclar y seguir la tcnica.Multiplicar el resultado por 10.


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4.2 REACTIVOS Y MATERIAL

1Micropipeta de 1 mL

1Micropipeta de 50 L.1Piseta con agua desionizada o destilada2Celdas de plstico de 3 ml4 Tubos de vidrio de 13X100Puntas para micropipeta.Gradilla.

EQUIPOFotmetro con filtro de lectura de: 520 nm.Centrfuga

CONTENIDO DEL EQUIPOReactivo 1 Fosfatos pH 7.4, 50 mM

Sol. Tampn 2-4 DCPS, 4 mMReactivo 2 Uricasa 60U/L

Vial Enzimas Peroxidasa 660 U/LAscorbato-Oxidasa 200 U/L4 - Aminofenazona 1Mm

Standard Sol. c. rico 6.0 mg/dL

PREPARACION Y ESTABILIDADDisolver, con agitacin suave, el contenido del vial de enzimas R.2 con un poco deR.1 tampn, una vez disuelto el liofilizado retornar al frasco original de tampn,homogeneizar la solucin. Esta solucin es estable 1 mes a 2-8C o 10 das atemperatura ambiente, protegida de la luz.

5. PROCEDIMIENTOTECNICALongitud de onda: . . . . . . . 520 nm (490-550)Temperatura : . . . . . . . . . . 25/30/37CPaso de luz : . . . . . . . . . 1 cm paso de luz

Ajuste del cero con blanco de reactivo.

Blanco Estndar MuestraEstndar 25 LMuestra 25 LReactivo 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mLMezclar e incubar durante 5 min a 37C 10 min a temperatura ambiente.

Efectuar las lecturas de las densidades pticas del estndar y de la muestra frenteal blanco del reactivo. Coloracin estable como mnimo 30 min.


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Clculo

Conc. Muestra mg/dL = D.O. Muestra / D.O. Estndar X Conc. estndar

Estndar= 6.0 mg/dLmg/dL x 59 485 = mol/L

Cuando la muestra sea orina, multiplicar el resultado por 10. Si la concentracinde la muestra es superior al lmite de linearidad (25mg/dL) diluir sta a la mitad yel resultado final se multiplicar por 2.

Lmite de Seguridad Biolgica

Mujeres HombresSuero o plasma

mg/dL 2.5 - 6.0 3.4 -7.0mmol/L 148 - 357 202 416

Orina de 24 horasmg/dL 250 - 750mmol/L 14,872 - 44,616

Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valoresde referencia, considerando edad, sexo, estado nutricional y demsfactores.

CONSIDERACIONES IMPORTANTES:-Si la muestra de orina es turbia, calentarla a 60C para disolver el cido rico.-El cido rico en suero es estable de 3 a 5 das en Tde 2-8C.-Los anticoagulantes como la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro no afectan losresultados de la prueba.

-Se sugiere procesar junto con las muestras algn suero control valorado conniveles normal y anormal que le permitir tener un control de la exactitud yprecisin de los resultados.-La hemlisis (hasta 100mg/dL de hemoglobina) y la bilirrubina hasta20mg/dL, no interfieren en los resultados.-El estndar es muy vido a contaminarse, cuidar mucho su manipulacin,ya que los agentes reductores tienden a disminuir la respuesta del color, mientrasque los oxidantes generan aparicin de color, aumentando las lecturas de losblancos.-Los detergentes son inhibidores enzimticos, asegrese de que el material devidrio este perfectamente lavado y enjuagado con agua desionizada.


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CONTROL DE CALIDADSPINTROL. Normal y Patolgico. Sueros control valorados.

2.2 CREATININAMtodo colorimtrico-cintico

1. INTRODUCCINLa creatinina es un producto final del metabolismo muscular. Se origina a partir dela creatina por prdida de una molcula de agua. A su vez, la creatina se producepor hidrlisis del fosfato de creatina, por accin de la creatin-fosfo-kinasa (CPK),

apareciendo como metabolitos de dicha reaccin el fosfato energtico y lacreatina. El radical fosfato puede aportar energa directamente por dicha reaccino a travs de su acoplamiento a una molcula de ADP para formar ATP yposterior hidrlisis por accin de ATPasa.

La eliminacin de creatinina en el cuerpo humano tiene lugar casi exclusivamentea travs de la filtracin glomerular, siendo un importante ndice del funcionalismorenal. A diferencia de la urea, la eliminacin de creatinina por la orina no vieneafectada por la diuresis, al mismo tiempo que para una misma persona es muyconstante su eliminacin diaria con casi independencia de la dieta alimenticia,siendo la masa muscular el factor condicionante ms directo de su excrecin total

por da. En resumen, podemos decir que la eliminacin de creatinina en unintervalo de 24 horas es un valor constante, dependiente principalmente de lamasa muscular del individuo, y que por otro lado el clculo del aclaramiento de lacreatinina ser un parmetro directo del funcionalismo renal.

2.OBJETIVOS

Aplicar el manejo adecuado de la tcnica para la determinacin decreatinina en una muestra biolgica.

Establecer los valores de referencia de la creatinina y comparar con el valor

de nuestra muestra problema a analizar. Definir cuales son las principales patologas que se presentan si tenemos

valores altos o bajos de creatinina en una muestra biolgica

3.FUNDAMENT0 DEL MTODO

La reaccin qumica aplicable para fotometra es la descrita por Jaffe, basada enel color anaranjado que se produce al reaccionar la creatinina con el picratoalcalino. Hay varias substancias en el suero y orina que actan como cromgenosinespecficos, lo que es un problema principalmente para el clculo delaclaramiento. Por este motivo tiene una gran importancia la adecuacin de todas


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las variables de la reaccin, muy especialmente el pH, con el fin de obtener lamxima sensibilidad para la creatinina y la mnima interferencia de cromgenos.Adaptando la reaccin a una medida cintica, se logra una gran especificidad

debido a que la creatinina reacciona con el picrato alcalino con ms rapidez quelos cromgenos (metilguanidina, picramato,), por lo que la medida del incrementode color en un breve perodo de tiempo inicial de la reaccin valorarnprincipalmente creatinina, con poca influencia de los cromgenos inespecficos,por esto es recomendable, de ser posible, la determinacin cintica.

4.PREPARACIN4.1MUESTRA CLNICA

Suero o plasma heparinizado.

La creatinina en suero y plasma tiene una estabilidad de al menos de 24 horas a2-8C.Orina .Diluir previamente a 1:50 con agua destilada, multiplicar el resultado por 50.

4.2REACTIVOS Y MATERIALMaterial necesario1 Micropipeta de 1 mL1 Micropipeta de 200 L.1 Piseta con agua desionizada o destilada2 Celdas de plstico de 3 ml5 Tubos de vidrio de 13X100

Puntas para micropipetaGradilla.

EQUIPOFotmetro termostable a 37C con filtro de 490-510 nm.Centrfuga

CONTENIDO DEL EQUIPOReactivo 1 Ac. pcrico 17.5 mmol/LReactivo 2 Hidrxido sdico 0.29 mol/LEstndar Sol. Creatinina 2.0 mg/Dl

PREPARACIN Y ESTABILIDADLos reactivos estn listos para su uso.Son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de caducidad indicada en elenvase.

Mezcla reactiva:Mezclar ambos reactivos a partes iguales segn necesidades.Esta mezcla es estable 10 das a temperatura ambiente.


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5. PROCEDIMIENTO

5.1TCNICA

Longitud de onda: . . . . . . . 490 nm (490-510)Temperatura : . . . . . . . . . . 25/30/37CPaso de luz : . . . . . . . . . 1 cm paso de luzAjuste del cero con blanco de reactivo.

Blanco Estndar MuestraEstndar 200 LMuestra 200 LReactivo 2.0 mL 2.0 mL 2.0 mLMezclar e incubar 5 min a 37C 10 min a temperatura ambiente.

Mezclar y poner en marcha el cronmetro.Anotar la D.Optica a los 30 segundos (E1) y a los 90 segundos (E2).Lectura a 492 nm (490-510)

6. RESULTADOS

6.1 Clculosmg/dL creatinina = . Extincin muestra/. Extincin estndar x conc. estndar

= conc. muestra

mg/dL x 88.4 = mol/L

DEPURACION DE CREATININADepuracin de creatinina

CC(ml/minuto/1.73 m2)= U x V x 1 x 1.73P T AS

U= Concentracin de orina en mg/dL

V= Volumen

P= Concentracin plasmtica en mg/dL

T= Tiempo en minutos

1.73= Factor estandarizado

AS= Superficie corporal en m2


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Valor de referencia Mujeres 70 130 mL/min Hombres 70 140 mL/min

6.2 LinealidadHasta valores de 15 mg/dL (1326 mol/L)Para valores superiores se deber diluir a 1:2 con sol. salina, multiplicando elresultado por 2.

6.3 Lmite de Seguridad BiolgicaSuero. 0.7 - 1.4 mg/dL (61.8 - 132.6 mol/L)Orina. 15 a 25 mg/Kg/24 h

NOTA: En orina debe multiplicar los valores de referencia por los Kg que pesa elpaciente.

DEPURACINHombres: 97 - 137 mL/minMujeres: 88 - 128 mL/min

OBSERVACIONESLa hemlisis interfiere en el test.No utilizar sueros lipmicos.

CONTROL DE CALIDADSPINTROL. Normal y patolgico.


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2.3 UREAMTODO CINTICO "UREASA-GLDH".

1. INTRODUCCINUrea y amonaco

La concentracin sangunea de amoniaco es superior en los infantes que en losadultos, debido a que el desarrollo de la circulacin heptica se termina despusdel nacimiento. La hiperamonemia es una entidad que se presenta confrecuencia debido a defectos congnitos en el ciclo de la urea. El error innato delmetabolismo ms comn es la deficiencia en ornitina transcarbamilasa. Lahiperalimentacin es una causa mucho ms frecuente de hiperamonemia eninfantes. Con frecuencia, se diagnostica el sndrome de Reye por un amoniacosanguneo elevado en ausencia de otra causa demostrable.

Los pacientes adultos muestran elevadas concentraciones de amonacosanguneo en las etapas terminales de: la cirrosis heptica, la falla heptica y lanecrosis del hgado aguda y subaguda. Se presagia el comienzo de laencefalopata heptica por una elevacin en el amonaco sanguneo. Se hademostrado que la medicin en lquido cefalorraqudeo (LCR) de la glutamina,correlaciona bien con el desarrollo de la encefalopata heptica. Tambin sepuede utilizar la medicin de la glutamina en el LCR, para diferenciar laencefalopata heptica de la sptica. Sin embargo, no es comn la medicin de laglutamina en el LCR. La excrecin de amonaco urinario se eleva con la acidosisy se disminuye en la alcalosis, puesto que la formacin de sales de amonio es unmecanismo importante para excretar el exceso de iones hidrgeno. Daos en los

tbulos renales distales, tal como ocurre en la falla renal, la glomerulonefritis, elhipercorticoidismo y la enfermedad de Addison, conllevan a una excrecin deamonaco dismin

Manual de Bioquimica Clinica_10817

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