ndice Prlogo Material de Laboratorio Preparacinde soluciones smosis Obtencin de muestras de sangre Protenas totales y albmina sricas Emulsificacin de aceite Amilasasrica Fosfatasaalcalina srica Glucosaplasmtica Lactatoplasmtico Triacilgliceroles sricos Colesterol srico Colesteroi-LBD y Colesteroi-LAD sricos Transaminasas sricas Ureasrica Capacidadamortiguadora delplasma sanguneo Cuantificacinde Hemoglobina glicada Examen general de orina Creatininasrica y depuracin Hematocrito, hemoglobina y concentracinmedia de hemoglobina celular Identificacin de grupos sanguneos Recuento plaquetario Bilirrubinas sricas cidorico srico Fosfatasacidasrica Pgina 2 3 7 11 14 18 24 27 31 36 40 44 48 53 60 67 72 78 83 93 99 104 109 115 120 125 PRLOGO LaBioqumicaesunacienciaqueexplicalanaturalezaqumicademuchosymuydiversosprocesosque formanparte esencial de lo que determina la vidade unaclula y del organismo ensuconjunto. Paraelestudiante deMedicina,laBioqumicaesunadisciplinafundamentalde apoyoparalacomprensin delosfenmenos fisiolgicoscuyasalteracionespresentanrelacindirectaconlasmanifestacionesclnicas de laspatologas. Elconocimientobioqumico,igualqueocurreconotrasdisciplinas,avanzagradualmenteconformese desarrollalainvestigacin.Estohapermitidoentenderlosfundamentosbioqumicosrelacionadosconlas manifestacionesclnicasdemltiples patologas,pudiendo interpretar lapresentacindesignosy sntomas desdelaperspectivabioqumica.Sinembargo,existentodavacasosenlosculeslainformacines insuficienteparaestablecerdichasrelacionesyenelloslasasociacionesdelaspatologasconsus expresiones clnicassecatalogancomo empricas. LosprogramasdeBioqumicadelasescuelasyfacultadesdeMedicinadelasuniversidadesmexicanas deberan estar orientados fundamentalmente a que losconocimientos que construyanlosalumnosvinculen cadavezmsloscontextosbsicoyclnico.Esteeselcaminoquehemosseguidoennuestroprograma durante muchos aos. EnestecontextoseenmarcaelpresenteManualdePrcticasdeBioqumica,cuyospropsitos fundamentalessonqueelalumnoreafirmelosconocimientosadquiridosconelprogramaterico1 relacionndolosconaspectosfisiolgicosypatolgicosrelevantes,queaprendaelmanejobsicodel laboratorio deBioqumicaClnica,y demaneramuyespecial,queaprendalapertinenciadelaspruebasde laboratorio paralaobtencin de datos que lepermitan fundamentar diagnsticos conun criterio cientfico. Aunqueseharealizadounesfuerzoserioparaquetantoloscontenidoscomolapresentacindeeste trabajoseancongruentesconlasnecesidadesacadmicasdegrancompetitividadqueprevalecenenla actualidadenelmundo delaMedicina,sindudaesunaobraperfectible y serbienvenida toda sugerencia que permita mejorarlo. Los autores 2 MATERIAL DELABORATORIO OBJETIVO Elalumnoidentificar y explicarlautilidaddel equipo y delosdistintos materiales comnmente utilizados enellaboratorio de Bioqumica. GENERALIDADES Latecnologadellaboratorio de anlisis clnicosseempleapararealizar conlamayor exactitudlas diversaspruebasqumicasafindequelosresultadosgeneradosseancorrectos,dadala importanciaque esto tieneparaquelainterpretacin quehagaelmdicopermitaundiagnstico confiable.Paralograr estepropsito,elalumnodebeseguircuidadosamenteelmtododecada prctica,utilizando los materiales y equipo apropiados. Por otra parte, esmuy importante que el alumno preste mucha atencin enlo que estrealizando afindeevitaraccidentesquepodransergraves.Debetenerpresenteentodomomentolas posiblescausasdeaccidentesparapoder evitarlos oportunamente ydisminuir aslaprobabilidad de sufrir daos ensuintegridad fsica. Peligros a los que seencuentra expuesto el alumno al trabajar enellaboratorio: l.Quemaduras y escaldaduras (quemaduras producidas por lquidos o por vapor) 2.Laceraciones por vidrierarota 3.Infecciones diversas 4.Intoxicacin por reactivos venenosos o custicos CLASIFICACIN Y USODEMATERIAL Y EQUIPODELABORATORIO Medicin de masa (peso) Balanzagranataria.Seutilizaparamedircantidadesdemasarelativamentegrandes(>0.5g)desustancias generalmente slidas Balanzaanaltica.Seutilizaparamedir conexactitudcantidades demasarelativamente pequeas (aproximadamente 5 a 500 mg),aunque tambin pueden medirse masas mayores. 3 Medicin de volumen Pipetasgraduadas.Sontuboscondimetrointernouniforme,dediferentescapacidadesy calibradas.Sonmuyutilizadasdebidoa queconunamismapipetasepuedenmedirdiferentes volmenes.Debeutilizarselapipetaqueseamsadecuadaalvolumenpor medir.Perejemplo, paramedir2.5ml seutilizaunapipetade5ml,paramedir0.5ml,unade1ml,etc.Deben cargarsemediantedispositivosespecialesqueevitenpipetear conlaboca(propipetas), evitando as elriesgodecontacto delasolucin conlaboca. PipetasPasteur.Sontubosdevidrioconunapuntadelgadaylarga.Notienengraduacinyse utilizanfundamentalmenteparatransferir a untubolimpioelsueroo elplasmadeunamuestra desangredespus decentrifugada, y parallenar consangre completalos tubos deWintrobepara ladeterminacin delhematocrito. Micropipetas.Soninstrumentosmuy tiles paralamedicin devolmenespequeosconunalto gradodeexactitud.Existenmicropipetas condiferentes capacidades,siendolasmscomuneslas que miden 1-10 .tl, 10-250 .tl y 100-1000 .tl. Probetas.Soncontenedorescilndricosdevidrio,graduadosydediferentescapacidades.Se utilizan paramedir volmenes aproximados yaque sonmateriales debajaexactitud. Matracesaforadoso volumtricas.Soncontenedoresdevidrioquetienenuntallorelativamente delgadoquepresentaunamarcadenominadaafore,lacualindicaelnivelalquedebellevarseel lquidoparaqueelvolumenmedidocorrespondaalindicadoenelmatraz.Seutilizaparala preparacin de soluciones conconcentracinporcentual(% p/v), molar, osmolar o normal. MatracesErlenmeyer.Soncontenedoresdevidriodeformacnicay fondoplanoqueseutilizan paramedir volmenes aproximados delquidos y siesnecesario,paracalentarlos conbajogrado deevaporacin. Vasosdeprecipitados.Sonrecipientesdevidrioutilizadosparamedir volmenesdelquidos,con muybajaexactitud. Tambinseutilizanparacalentar ohervir lquidoscuandonoimportaquese evaporen en grado importante, o simplemente como contenedores desustancias lquidas. Tubosdeensayo.Son tubos de vidrio condiferentes dimensiones que seutilizan parallevar a cabo lasreacciones qumicas. Materiales varios Mechero deBunsen.Esundispositivo que seutilizaparacalentar lquidos, mediante lacombustin de gas. 4 Gradillas.Dispositivosgeneralmentemetlicosutilizadosparamantenerlostubosdeensayoen posicin vertical Esptulas.Dispositivosgeneralmentemetlicos,planos,sinfiloyconelextremoromo,utilizados para transferir sustancias slidas, tpicamente almedir determinadas masas de ellas. Equipo Centrfuga.Esuninstrumentoquecontieneunrotor capazdegirar variosmilesderevoluciones por minuto.Presentaespaciosenlosquesecolocanlostubosquecontienenelmaterialquese deseacentrifugarparalograrlaseparacindesuscomponentes.Tpicamenteseutilizapara separar elsuero del cogulo o elplasmadelpaquete globular, enmuestras desangre. Potencimetro.Esuninstrumentoelectrnicoquecuentaconunelectrodosensibleala concentracindehidrogenionesdecualquiermediolquido.Antesdemedir elpHdelasolucin queinterese, debe calibrarse conunamortiguador depH7.0.Proporcionalalecturadirectamente como un valor depH. Espectrafotmetra.Esunaparatoelectrnico capazdemedir lacantidaddeluz quepasaa travs deunasolucin (transmitancia) o laque absorbe dicha solucin (absorbancia, extincin o densidad ptica).Laluzqueincideenlasolucintieneunalongituddeondaespecficaqueseselecciona conunaperillau otro dispositivo del aparato.Seutilizaparaladeterminacin delaconcentracin desolutosgeneralmentecoloridos,bajoelprincipiodequemientrasmsconcentradose encuentraelso luto,menor eslatransmitanciadelasoluciny mayor suabsorbanciasiseutiliza luz conlalongitud de onda adecuada. EJERCICIOS 1.Comparelaexactituddeunmatraz volumtrico de100 ml y deunaprobetade100 ml, midiendo100mldeaguaenlaprobetaypasandoellquidoalmatraz.Anotesus observaciones. 2.Midalossiguientes volmenes deagua:25.L,40.L,0.2ml, 0.7ml, 1.5ml, 2.8mL,4.5 ml, 7.5ml y 9.5 ml, indicando qupipetautiliz encadacaso. 3.Transformelosvolmenesquesemencionanenelpunto2,demaneraquecadauno quede expresado enmicro litros, mililitros y litros. S RESULTADOS,DISCUSIN Y CONCLUSIONES 6 PREPARACINDE SOLUCIONES OBJETIVO l.Elalumnoprepararvariassoluciones,paralo cualcalcularpreviamentelascantidades de so luto y/o solventenecesarias. 2.Elalumnoejercitarlainterconversindeunidadesparaexpresarlaconcentracinde soluciones. GENERALIDADES Lassolucionessonmezclashomogneasdedos omssustancias.Enunasolucin,elso luto esla sustancia disuelta y elsolvente eslasustanciaque disuelve.Enelcampo delaBiologa, elsolvente mscomneselagua,lacualdisuelvesustanciaspolares,esdecirsustanciascuyaestructura molecularpresentacargasformales(positivas,negativasoambas),y/odipolos.Porejemplo,el clorurodesodio(NaCI),constadeionesNaycr;losazcares,comolaglucosa,tienengran cantidaddegruposoxhidrilo(-OH),loscualessonestructurasdipolares(presentany-.En cualquier caso,elprincipiodedisolucinestdadopor lacapacidaddeinteraccin elctricaentre lasmolculasdeaguaylasmolculasdesoluto.Lassustanciashidrofbicas,quecarecende grupospolares,nosonsolublesenagua.Entreellasseencuentranelaceite,lagasolina,elter, etc. Laconcentracindelassolucionespuedeexpresarseendiversasformas:porcentajepeso/ volumen(%p/v), que es el nmero de gramos de soluto disueltos encada100 mL de solucin (100 mL=1dL);molaridad(M),queeselnmerodemolesdesolutodisueltosencadalitrode solucin;osmolaridad(OsM),queeselnmerodeosmolesdesolutodisueltosencadalitro de solucin;normalidad(N),queeselnmero deequivalentes qumicos desoluto disueltos encada litro de solucin;molalidad(m),que eselnmero demoles de solutodisueltos encadakilogramo desolvente;yosmolalidad(Osm),queeslacantidaddeosmolesdesolutodisueltosencada kilogramo de solvente. IMPORTANCIA CLNICA Ensumayora,losnutrientessehacenllegaralosdistintostejidosdisueltosenelplasma sanguneo y por elmismo medio secanalizanlos productos de desechohacialas vas de excrecin. Desde estepunto de vista, elplasmasanguneo esunasolucinque contiene muy diversos so lutos 7 aconcentracionesvariables.Enmuchoscasosladeterminacindelaconcentracindeestos so lutos tiene granimportancia diagnstica. Enlaclnica,laconcentracin delos so lutos seexpresa enlasunidades ms convenientes de acuerdo conlas concentraciones normales correspondientes. As,laconcentracindealbminaseexpresaen% p/v oeng/l,conunintervalonormalde3.6a 4.7g/dL o36a47g/L. Encambio,laconcentracindeglucosa,ureay otrassustancias,se expresaenmg/dl oenmilimolaridad(mM'nmerodemilimolesdesolutoporcadalitrode solucin)debidoaquelaconcentracindeestossolutosesrelativamentebajaencondiciones normales:55a110mg/dL(3.0a 6.1mM)y 20a 45mg/dL(3.3a7.5mM)paraglucosay urea, respectivamente. Enelplasmaexisten solutos conconcentraciones normales anmenores,debiendo utilizarse para talescasosunaunidadmenor,como.tg/dL(microgramospor decilitro)o.tmoles/L(micromoles porlitroomicromolaridad).Porejemplo,laconcentracinnormaldehierroenlasangrede hombres adultos esde80 a 180 .tg/dL o14 a32.tM. Laconcentracintotaldesolutosenelplasmasanguneoseexpresaenunidadesde miliosmolalidad(mOsm),lacualdependefundamentalmentedelsodioysusaniones,dela glucosaydelaurea.Loslmitesnormalesdedichaconcentracinsonde280a300mOsm aproximadamente. MATERIAL 1.Balanza granataria 2.Esptulas 3.1 matraz volumtrico de 50 mL 4.3 matraces volumtricos de 100 mL 5.1 matraz volumtrico de 250 mL 6.1 vaso de precipitados de 100 mL 7.1 vaso de precipitados de 250 mL 8.Glucosa, cloruro de sodio y sulfato desodio 8 PROCEDIMIENTO l.Calcularlacantidaddesoluto(engramos)y/osolvente(enmililitros)necesariapara preparar cadaunade las soluciones propuestas. 2.Pesar el so luto conlamayor exactitud posible,utilizando una balanzagranataria. 3.Transferirlamasadesolutoalrecipientecorrespondiente.Sisetratadeunmatraz volumtrico,aadirunpocodeaguadestiladaparadisolver elsolutoy aforar enseguida. Encasodequeexistariesgodequesetireelsolutoalmomentodepasarloalmatraz,es preferibleponerelsolutoenunvasodeprecipitados,disolverloahyposteriormente pasarlo almatraz. 4.Alprepararunasolucinconmolalidaduosmolalidaddefinida,aadiralvasode precipitados que contenga also lutolacantidadtotal desolventenecesaria,medidaconel recipiente graduado ms adecuado y disolver agitando conuna varilla de vidrio. PREPARELASSIGUIENTES SOLUCIONES: l.50ml de solucin de glucosa al5%p/v 2.100 ml desolucin de cloruro desodio al 0.9% p/v 3.100 ml de solucin de sulfato desodio 0.05M 4.100 ml de solucin desulfato de sodio 0.1 N 5.250 ml de solucin decloruro de sodio 0.1 OsM 6.solucin 0.2 m de glucosa, utilizando 2g de so luto 7.solucin 0.5 Osmde cloruro de sodio, utilizando 3g de soluto EJERCICIOS a)Calcule lamolaridaddelas soluciones 1 y 2 b)Calculelaosmolaridad de lasolucin 3 e)Calculelamolaridad y laosmolaridad de lasolucin 4 d)Calculelamolaridad y lanormalidad de la solucin 5 e)Sienlugardeprepararlasolucindelpunto6aadiera100gdeaguaalacantidadde soluto indicada, qu molalidad producira? f)Silasolucin7sepasaintegraaunmatrazvolumtricode1litroyseafora,qu concentracin molar y osmolar tendralasolucinresultante? g)Calculelamilimolaridad delassoluciones 1 a 5y lamiliosmolalidad de las soluciones 6 y 7 9 BIBLIOGRAFA Mendoza-Medelln, A.Nociones deQumica para las reas mdica y biolgica,UAEM2007 RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES 10 SMOSIS OBJETIVOS 1.Elalumno demostrar el fenmeno delasmosis enundispositivo experimental 2.Elalumnoexplicarlaimportanciadelasmosisenladistribucindelquidosenlos distintos compartimentos del organismo GENERALIDADES Lossistemasseparadospormembranas,endondeexistendiferenciasenlaconcentracinde solutosnodifusibles,tiendenaequilibrarlasconcentracionesdesolutoaambosladosdela membranatransfiriendosolventedelcompartimientomsdiluidoalmsconcentrado.Este fenmenoseconocecomosmosisy,sediferenciadelosprocesosdedifusinenqueenestos ltimoseselsolutoelquesetransfiereatravsdelamembranaenelsentidoenquelas concentraciones de so luto tienden a igualarse enambos compartimientos. Lapresinosmticaesunamedidadelafuerzaconqueocurrelasmosisydependedel gradiente deconcentracin osmolal delos solutos no difusibles, demaneraque a mayor gradiente correspondemayorpresinosmtica.Lapresinosmticaqueejercenlossolutoscoloidales, como sonlasprotenas, seconoce como presin onctica. IMPORTANCIA CLNICA Ladistribucindeloslquidosenlosdiversoscompartimentosdelorganismohumanoseregula por eventos de smosis que dependen delaconcentracin de los solutos no difusibles. Enel espacio intravascular los principales solutos no difusibles sonlasprotenas, siendopor tanto responsablesdelapresinosmticaintravascularqueactacomocontrapartedelapresin hidrosttica debidaalimpulso cardiaco,permitiendo elretorno dellquido allecho vascular. Laprotena plasmticaque ejerce elprincipal efecto onctico eslaalbmina,lacualessintetizada enelhgado a una tasade aproximadamente 12 g diarios. Deestamanera,dichaprotenaseencuentrasujetaa unrecambio elevado,presentandounavida promedionormal de17 a 20dasenelplasma. Alparecer,elsitiodonde secatabolizalaalbmina eselmismo hgado, tanto enlos hepatocitos como enlas clulasdeKpffer. 11 Lamanifestacinclnicadelahipoalbuminemia(versuscausasenlaprcticadeprotenas plasmticas)eslaextravasacindelquido o edema, lo cualocurrecomoconsecuenciadirectade ladisminucin de la concentracin del principal agente que ejerce presin osmtica intravascular. MATERIAL 1.Unhuevo de gallina 2.Unpopote 3.Un vasodeprecipitados de SOmL 4.Cerade Campeche,plastilinao parafina S.Unbao deagua termo-regulado PROCEDIMIENTO 1.Seremueve elcascarnenunazonaaproximadamente circular del extremo ms anchode unhuevo de gallina, cuidando de no romper lamembrana subyacente. 2.Enelextremo msangosto delhuevo sepracticaunaabertura enelcascarn(incluyendo lamembrana) apenas suficiente paraque paseunpopote a travs de ella. 3.SeintroduceelpopoteysefijaalcascarnmedianteceradeCampeche,plastilinao parafina, cuidando que noqueden grietas y que el popote no toque layemadelhuevo. 4.ElhuevoaspreparadoseasientasobreunvasodeprecipitadosdeSOmLytodoel dispositivo seintroduce enunbaode aguatermo-reguladoa 37e, de talmaneraque el niveldelaguasobrepaseapenaselniveldelvasodeprecipitados,asegurandoasquela membrana expuesta quede encontacto conelagua. S.Sedejaeldispositivoenesascondicionesduranteeltiemponecesarioparaobservarla elevacindelniveldelquidoenelinteriordelpopotedebidoalefectoosmticoque propicialatransferencia de aguaalinterior del huevo. NOTA:Elprocesoosmticopuedellevarseacabousandoaguaatemperaturaambiente,pero puede ser algoms lento. 12 BIBLIOGRAFA Mendoza-Medelln, A.Nociones deQumica para las reas mdica y biolgica,UAEM2007 RESULTADOS,DISCUSIN Y CONCLUSIONES 13 OBTENCINDEMUESTRASDESANGRE OBJETIVO Elalumno aprenderla tcnicaprecisaparalaobtencin de muestras de sangre venosa GENERALIDADES Lasmuestrasdesangregeneralmenteseobtienenporpuncinvenosayaquesetratadeun mtodosencilloquepermiteobtenerunvolumensuficientedesangreparaladeterminacinde losdiversosparmetrosdeinters.Sisedebeobtenersuero,lamuestradesangresedeja coagular y posteriormente secentrifuga5-10 minutos a 3500 r.p.m.,lo cualpermite queelsuero quede como sobrenadante y elcogulo enel fondo del tubo (debido a que elcogulo seadhiere al vidrio,sedebeseparardelcuidadosamenteconunpalilloantesdelacentrifugacin).Sise requiere sangre completa,seaadeunanticoagulantealtubo enelque sevaa verter lamuestra obtenidayunavezconlasangre,semezclaporinversinsuavemente,tapandopreviamenteel tuboconparafilm.Debeevitarselaagitacinvigorosaylaformacindeespumayaqueesto producehemlisis.Siserequiereplasma sanguneo,seaadeanticoagulantealtubo y semezcla como sehaindicado, centrifugandoposteriormente. MATERIAL 1.Jeringa estril de 5-10 mL o sistemavacutainer 2.Torundas de algodn conalcohol 3.Tubos de ensayo limpios y secos o tubos vacutainer(con vaco) 4.Ligadura PROCEDIMIENTO 1.Elpacientedebeestarsentadoenunaposicincmodaquelepermitacolocarelbrazo sobreunasuperficieplanaadecuadaparamantenerloextendidoeinmvilsinmayor esfuerzo. 2.Sepreparaelbrazo frotando lareginanterior delantebrazoconunatorunda dealgodn humedecida conalcohol etlico(96). 3.Seaplicauntorniquete conlaligaduraaproximadamente 7 cmpor arribadelplieguedel codo.Lapuncinsuelehacerseenlavenamedianaceflica,lacualesfcilmente localizableencasitodaslaspersonas.Sipor algunaraznnoseobservadichavena,debe indicarsealpacientequeabray cierresupuoaltiempoqueseaplicamasajeenlacara 14 anteriordelantebrazo,conlocualfrecuentementeselograqueresaltelavena.En ocasionessernecesarioutilizarlasvenasdeldorsodelamano,locualdeberhacerse concuidados especiales yaque dichas venas sonmviles por carecer de fijacin. 4.Secompruebaqueelmbolosedesliceadecuadamenteenlajeringaysellevahastael fondodeestaparaminimizar elcontenidodeaire.Setomalajeringademaneraqueel biseldelaagujaquedehaciaarriba,sesujetalaparteposterior delbrazodelpaciente(a nivel del codo) conlaotra mano y manteniendo lajeringa paralela al trayecto de la venase perforalapiel,seintroducelaaguja0.5-1.0cmeneltejidosubcutneoyseperfora entonces lapared de la vena.Eneste momento puede observarse que lasangre empieza a fluirhacialajeringa.Encasocontrarioseretraeligeramenteelmbolo.Sinofluyela sangre a lajeringa significaque laagujano sehallabienposicionada.Unavezque fluyela sangre, seretrae elmbolo lentamente hastaque seharecolectadolacantidadrequerida de sangre. S.Eltorniquete sesuelta encuanto seaseguralaposicinadecuadadelaagujasisetiene la destreza suficiente paraevitar quesepierdalavena. Sino, sesueltahastaque setermine deobtener lamuestra, siempre y cuando no seademasiado tiempo. 6.Unavezqueseconcluylasangrasecolocalatorundasobreelsitiodelapuncinyse retiralaaguja.Semantienelatorundapresionandoelsitiodelapuncinunos segundos ms y secolocasobre dicho sitio unparche redondo tipo curita. 7.Seseparalaagujadelajeringay seviertelasangrelentamente sobrelaparedinterna de un tubo de ensayo debidamente etiquetado. 8.Lajeringa y laagujasedepositan enrecipientes especialmente destinados a eseuso. ANTICOAGULANTES Existeciertonmerodeanticoagulantes,Loscualesengeneralactanimpidiendoqueelcalcio desempeesufuncinenelprocesodelacoagulacin.Porejemplo,eloxalatodeamonioode potasio secombinaqumicamente conelcalciodisuelto, ca',conlocualseprecipita.Laausencia decalciodisuelto impide laactivacin dediversos factores dela coagulacin. Demanera similar actan el citrato y la salsdica o potsica del EDTA(etilendiaminotetracetato). ElEDTA(secuestreno)permiteademsqueloselementos formesdelasangresemantenganen buenascondicioneshastapor4horasdespusdehaberobtenidolamuestrayevitaquelas plaquetas seadhieran a lasuperficie del tubo. 15 Laheparinaesunpolisacridonaturalqueseunea laantitrombina111,lo cualpotenciaelefecto anticoagulante de estaltima sustancia. SISTEMAS VACUTAINER Elsistemavacutaineresundispositivoalternativoparalatomademuestrasdesangre, consistenteenunapiezadeplstico(adaptador)conformadejeringaalaqueseenroscauna agujacondoblepunta.Laparte largade estaagujaquedapor afueradeladaptador y eslaque se utilizaparallevar a cabolapuncindelvaso.Elotroextremodelaagujaquedapor adentrodel adaptador.Unavezquesehapracticadolapuncindelavena,seintroduceeneladaptadorun tubo vacutainer,que tiene untapndehule blando, fcilmenteperforablepor laagujadentro del adaptador. Debido a que el tubo vacutainer sehalla sellado concierto grado de vaco,encuanto la agujaperfora eltapndehuleempiezaa fluir lasangrehaciaeltubo.Almomentodeperforar el tapndehuledebemantenersealadaptadortaninmvilcomoseaposibleparaevitarquela agujasesalgadelavenao seintroduzcamsenella.Despus detomadalamuestra, seremueve el tubo del adaptador antes de sacar laagujade la vena. Los tubos vacutainer pueden tener ciertos aditivos, como anticoagulantes(EDTA,heparina, citrato, oxalato,etc.),inhibidoresenzimticos(fluoruro)paraevitarquedisminuyalaconcentracinde glucosa,etc.Elcolor deltapncorrespondealaditivoquecontiene.Porejemplo,lostuboscon tapnvioletacontienenEDTA,losdetapnazulclarocontienencitrato,etc.Lostubos contapn color rojo no contienen ningn aditivo. NOTA.- Serecomienda a los alumnos que sehabiten a extremar lasprecauciones enelmanejo de lasangre,conelfindeevitarcualquiercontactoconlamisma.Debenutilizarseguantes quirrgicos parahacer latoma demuestras y tener todoslos cuidados paraminimizar elriesgode picadurasconagujasquehansidoutilizadasyquepor lotantopudieranestar contaminadascon agentes biolgicos, comosonlos virus productores de hepatitis, elVIH,etc. 16 RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES 17 PROTENAS TOTALES Y ALBMINA S RICAS OBJETIVOS l.Elalumnodeterminarlaconcentracindeprotenasenunamuestradeplasma sanguneo 2.Elalumnoexplicarlaimportanciadelaconcentracinnormaldelasprotenas plasmticas y las principales causas de suvariacin GENERALIDADES Enelplasmasanguneoexistenmsde100protenasdiferentes,ademsdelosmltiples anticuerpos,generandounaconcentracintotalde6a8g/dLbajocondicionesnormales. Medianteelectroforesisenacetatodecelulosalasprotenasplasmticasseresuelvenen5 fracciones.Unadeellassehallaconstituidaexclusivamenteporalbmina,ylasrestantes4se conocencomoglobulinasa1,a2, yy.Cadaunadeestasfraccionessehallaconstituidaporun conjunto deprotenas diferentes que presentan unamovilidad electrofortica similar. Laalbminaeslams abundante de lasprotenas plasmticas y aunque solo representaalrededor del52%delamasatotaldedichasprotenas,ejerceaproximadamentedel80%delapresin oncticaintravascular debidoa quesuosmolaridadrepresentael80%delaosmolaridadtotal de lasprotenas plasmticas. Adems,laalbminadesempeaunafuncindetransportedesustanciashidrofbicasquese encuentrannormalmenteenlasangre,comoloscidosgrasoslibres,labilirrubinaindirecta,el urato, etc., y cuandoseingieren, diversos medicamentos. Entrelasglobulinasa1 sehallanlaslipoprotenasdealtadensidad(LAD),involucradasenel transporte inversodecolesterol(detejidos perifricosalhgado);laglobulinafijadoradetiroxina (transportededichahormona);globulinafijadoradecorticosteroides,tambinllamada transcortina(transportedecortisol)ylaantitripsinaa1 (hidrlisisdeenzimasproteolticas liberadasapartirdelosleucocitosenlosprocesosdedefensaquedesarrollanestasclulas, particularmente enlos pulmones, contra agentes biolgicos infecciosos que penetran por esava). Entrelasglobulinas a2 sehallanlahaptoglobina, que transportahemoglobinaliberadaenellecho vascular,alsistemareticuloendotelial;ceruloplasmina,que actacomo ferroxidasa,esdecir oxida Fe+2 aFe+3;laslipoprotenasdemuybajadensidad(LMBD),involucradaseneltransportede triacilgliceroles y colesteroldelhgadoa otros tejidos;y lamacroglobulina a2 (apesar deque esla 18 protenamayoritariadeestafraccindeprotenasplasmticasnosehadefinidosufuncin, habindose encontrado solamente que presenta actividad inhibitoria de endopeptidasas). Entrelasglobulinas!3sehallanlaslipoprotenasdebajadensidad(LBD),lascualesseformana partirdelaslipoprotenasdedensidadintermedia(LDI)yllevancolesteroldelhgadoaotros tejidos;latransferrina(transporteplasmticodehierro),lahemopexina(transportedelhemo liberadoenellechovascularalsistemareticuloendotelial);elfibringeno(precursor delafibrina enelproceso delacoagulacin sangunea) y los factores del complemento. Lasglobulinasycorrespondenalosanticuerpos,siendosufuncinunirseaantgenosen reacciones especficas como parte delarespuestainmune. Lagranmayora de las protenas plasmticas que noson globulinas y sesintetizan enelhgado.Las globulinas y seforman enclulas especializadas del aparato inmunocompetente. IMPORTANCIA CLNICA l.Hiperproteinemia concociente A/G(albmina/ globulinas), normal. Solamente sepresenta enprocesosqueproducenhemoconcentracin,comoson:choque,vmitosydiarreas intensas, quemaduras, comadiabtico, etc. Seconsideranhiperproteinemias falsas. 2.Hipoalbuminemia. Sepresenta encasosdepatologaheptica, particularmente cuando es crnica(estoserelacionaconelhechodequelavidapromediodelaalbminaenla sangre esdeaproximadamente20das)ascomoencasosdedesnutricin.Enlamayora delasenfermedadesrenalessepresentaproteinuria,perosloenelsndromenefrtico disminuye significativamentelaconcentracinplasmticadealbminapueslaprdidade protenas enestaenfermedad essuperior a S g/ da. 3.Transferrina.Sufuncineseltransportedehierroenelplasmasanguneo.Su concentracinaumentaenestadosdedeficienciadehierro.Encasosdehemocromatosis puedeestar bajaonormal.Laingestindemedicamentospuedealterar esasrelaciones. Porejemplo,elcloranfenicolproducedisminucindelatransferrinaylaspldoras anticonceptivasproducensuaumentoporefectosmetablicosnobiendefinidos.Porlo tantodebentenerseencuentaestosfactoresparainterpretaradecuadamentelos resultados delacuantificacin de transferrina. 4.Haptoglobina.Sufuncineseltransportedehemoglobinaliberadaapartirdelos eritrocitosenellechovascular.Sepracticasudeterminacincuandosesospechade anemiahemolticaenelpacienteoparadistinguirladeotros tipos deanemia.Enelcaso 19 deanemiahemolticadisminuyelaconcentracinplasmticadehaptoglobina.Laanemia hemolticaseasociatambinconelincrementodelrecuentodereticulocitosy disminucin delnmero deeritrocitos, delhematocrito y delahemoglobinaensangre.La concentracindehaptoglobinadisminuyeenlaenfermedaddeWilson(patologa hereditaria quecursaconretencindecobrepor elorganismo. A travsdelos alimentos elintestinoabsorbecobreperoelhgadonolotransfierealabiliscomoocurre normalmenteysuacumulacinlesionaalhgado.Eventualmenteelcobrehepticose liberaalacirculacinysedistribuyeportodoelorganismo,produciendodao principalmenteenriones,cerebroyojos.Sinoseinstituyeeltratamientoadecuado puedepresentarsedaocerebralsevero,insuficienciahepticaymuerte.Sutratamiento esalargoplazoconpenicilaminauotrassustanciasquesecombinanconelcobre, promoviendosuexcrecin,obienconacetatodezinc,queimpidelaabsorcindecobre por elintestino).Enalgunos casosladisminucin delahaptoglobina enlaenfermedadde Wilsonsedebeaquelapatologaseacompaadeunafasetempranadeanemia hemoltica,peroenrealidadestonoescomn,porlocualdebesuponersequeenesta enfermedadsealteraelmetabolismohepticoyentrelasmanifestacionesdedichas alteracionesseencuentralabajaproduccindehaptoglobina.Estaprotenaplasmtica aumentaduranteelembarazoydisminuyeenmujeresquetomanpldoras anticonceptivas, sinque secuente conlaexplicacin de dichos efectos. 5.Macroglobulinaa2Aumentanotoriamenteenpacientesconsndromenefrticoyen algunospacientesconcirrosis.Presentaactividadantifibrinoliticasimilaraladela antiplasmina a2,lacualsemanifiestasolamente cuando lacapacidadinhibitoria deestase hasaturado. 6.Globulinasy.Tambinconocidascomoanticuerpos,puedenhallarsedisminuidasen patologas genticamente determinadas (hipogammaglobulinemia)o adquiridas (leucemia linfticacrnicaySIDA).Suincrementoocurreeninfeccionesagudasperoms notoriamenteenlascrnicas,enenfermedadhepticacrnica,comolacirrosis,yen enfermedadesautoinmunescomoellupuseritematoso(trastornoautoinmune inflamatorioycrnicoquepuedeafectarlapiel,lasarticulaciones,losrionesyotros rganos.Afectamsalasmujeresquealoshombres,enproporcinde9a 1,ypuede presentarseacualquieredad)ylatiroiditiscrnica.Tambinocurreincrementodela concentracindeglobulinasy enalgunosprocesosmalignoscomoelmielomamltiple 20 (proliferacindeclulasplasmticasysusprecursoras)ylamacroglobulinemiade Waldenstr6m(proliferacindelinfocitosmsquedeclulasplasmticas,congran producci6n delgM, a tal grado quepuede aumentar laviscosidad de lasangre). PROCEDIMIENTO (Randox) Fundamento:lasprotenasensolucinbsicadesulfatocpricoytartratoformanuncomplejo azul violeta cuyaintensidad esproporcional a laconcentracin de protenas. Laalbminaseunecuantitativamenteconelindicador3,3',5,5'tetrabromo-m-cresol sulfoneftalena (verde debromocresol, VBC).Laintensidad del color del complejo albmina-VBC es proporcional a laconcentracin de albmina. Protenas totales Pipetear entubos de ensayo: Aguadestilada20.rL Suero (oplasma) Patrn Reactivo de trabajo1.0 mL1.0 mL1.0 mL Mezclar e incubar a temperaturaambientedurante30minutosy medirlaabsorbancia (A)a 546 nmdelamuestray delpatrn frentealblanco. CLCULO (A moesua/ApatcoolX 5.2- ___ g/dLProtenas totales VALORESDEREFERENCIA Neonatos:5.3-8.9 g/dL Nios (hasta 6 aos): 5.6-8.5 g/dL Adultos:6.6-8.7 g/dL 21 Albmina Pipetear en tubos de ensayo: Aguadestilada10 .L Suero (oplasma)10 .L Patrn10 .L Reactivo de trabajo3.0ml3.0 ml3.0 ml Mezclar e incubar entre20y 252( duranteS minutosy medirlaabsorbancia(A)a 578 nmdelamuestray delpatrn frentealblanco. CLCULO (A m"'""/A ''"0,)x 4.8 = ___ g/dl Albmina VALORESDEREFERENCIA Adultos:3.4-4.8 g/dl BIBLIOGRAFA Balcells, A.LaClnicay el Laboratorio.Ed.Marn, 1989 Gornall, A.G.Applied Biochemistry of Clinical Disorders.Harper & Row, 1980 Devlin,T.M.(Editor)Textbookof Biochemistrywithc/inicalcorrelations,s'hedition.Wiley-Liss, 2002 H.Lehr,M.Pauschinger,E.Pittke,E.KurrleandH.Heimpel(1988).Haemolytic anaemiaasinitial manifestation of Wilson's disease. Annals of Hematology: 56 (1) http://digestive.niddk.nih.gov/ddiseases/pubs/wilson/ (enfermedadde Wilson) http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/000435.htm 22 RESULTADOS,DISCUSIN Y CONCLUSIONES 23 EMULSIFICACINDEACEITE OBJETIVOS 1.Elalumno compararlacapacidaddelabilis, deundetergente y del aguaparaemulsionar muestras de aceite de cocina 2.Elalumnoexplicarlarelevanciafisiolgicayclnicadelaemulsificacindelagrasa dietaria GENERALIDADES Laemulsificacin delagrasadietaraeselprocesomediante elcualloscomponentes lipdicos de losalimentos sufrenlaaccindelperistaltismo intestinal y delas sustancias antipticas presentes enlabilis,resultandodeellalageneracindepartculaspequeasdegrasadietaraque interaccionan canrelativo grado de estabilidadconelmedio acuoso. Loscidosgrasosyotrosproductosdeladigestinestimulanlasecrecindelahormona colecistocinina-pancreocimina,lacualprovocalacontraccindelavesculabiliar,necesariapara quelabilisfluyahaciaelduodeno.Labiliscontiene,entreotrassustancias,salesbiliaresy fosfolpidos,que coadyuvan a emulsionar lagrasadebido a sunaturaleza antiptica, enconjuncin conelmovimientoperistlticodelintestino,aunqueesteltimo factor eselfundamentalparael procesoemulsificante.Lagrasaemulsionadaconsisteenpartculasde200-5000nmdedimetro demateriallipdico, principalmente triacilgliceroles, colesterol esterificado y vitaminas liposolubles (A,D,E yK),queensusuperficieinteraccionanconlasparteshidrofbicasdelasmolculas antipticas, quedando lashidroflicas interaccionando a suvez conelaguadel ambiente. Laemulsificacinesunprocesoimportantedebidoaquepermiteunaaccinadecuadadelas enzimas digestivas conactividadlipoltica, fundamentalmentelalipasapancretica y lacolesterol esterasa.Losproductos deladigestindelostriacilgliceroles(cidos grasosy monoacilgliceroles) y delos esteres decolesterol(cidos grasos y colesterollibre), enasociacin conlas salesbiliares y losfosfolpidos,configuranestructurasesferoidalesde3a10nmdedimetro,denominadas micelasmixtas,lascualescontienenensuparteinternalasregioneshidrofbicasdesus componentes, y enlasuperficielashidroflicas.Lasvitaminas liposolubles tambinseencuentran presentes enlaparte interna dedichas m ice las. Lasmicelasmixtas sedesplazanpor elintestino y enelbordeencepilloliberan suscomponentes deorigendietario,loscualespenetrana lasclulasdelepitelio intestinal.Enelleonsereabsorbe lamayor parte de las sales biliares y participan enlacirculacin enteroheptica 24 IMPORTANCIA CLNICA laausenciadesalesbiliaresyfosfolpidosenelintestinopuedeocurrirdebidoaproblemas obstructivosdelas vasbiliares.Enestascondicionesloslpidosdietarios seemulsionanengrado importanteporefectodelaperistalsis,locualpermitelaaccindigestivadelasenzimas pancreticas,perolaausenciadematerialesantipticosimpidelaformacindemicelasmixtasy por lo tantonoseabsorbenlosproductosdeladigestindeloslpidos dietarios,ocasionandoel sndrome de malabsorcin de grasa,conocido tambin como esteatorrea. Lapermanenciadelagrasaenelintestino tiene algunos efectos adicionales.Por ejemplo, lagrasa puedeinteraccionar conotros componentes deladieta,impidiendolaaccindigestivaapropiada sobreellos;ylaabsorcindeficientedegrasapuedeprovocarquelasvitaminasliposolubles tampoco seabsorban apropiadamente. MATERIAL 1. Bilis de pollo o de bovino 2. Aceite vegetal 3.Detergente extrn 4. Tubos con tapn derosca S.Pipeta graduada de10 ml 6.Pipeta graduada de S ml 7.Pipeta graduada de 1.0 ml 8. Aguadestilada 9.Agitador "vortex" PROCEDIMIENTO Control Bilis Extrn 3 ml 3 ml 3 mL 2mL Sml 2 mL 3 1 1 2 10ml 1 ml 1 mL 1 ml 1 mL 1 ml Mezclarelcontenidodecadatuboenelagitadorvrtexdurante15 segundosyobservaryanotarlosresultadosinmediatamentey despusde algunosminutos. 2S BIBLIOGRAFA Mathews, C.K.& K.E.VanHolde. Bioqumica, 2a.ed.McGraw-Hili,1998 Devlin, T.M. (Editor) Textbaok of Biochemistry with clinical correlations, s'hedition. RESULTADOS,DISCUSIN Y CONCLUSIONES 26 AMI LASA SRICA OBJETIVOS 1.Elalumno determinar laactividad de amilasa enunamuestrade suero sanguneo 2.Elalumno explicarlaimportancia clnicade ladeterminacin delaamilasa srica GENERALIDADES Laamilasaesunaenzimaqueparticipaenladigestindelalmidny delglucgenodietarios. Cata lizalahidrlisis delos enlaces glucosdicos al-4 queunena lasmolculasdeglucosaentre s endichos polisacridos. Laamilasaseproduce enlas glndulas salivales,principalmente enlas partidas, y enelpncreas, nombrndoseamilasasalival(ptialina)y amilasapancretica,respectivamente.Laactividaddela amilasasalivaleslimitadadebidoalcortoperiododetiempoquepermaneceelboloalimenticio enlaboca,yaquepocodespusdequeestepasaalestmagosepierdelaactividadamilsica debido alpHcido del jugo gstrico. Lafuncindelaami lasasalivalesiniciar lahidrlisis delalmidny del glucgenopresentes enlos alimentos,generandocomoproductosfundamentalmentedextrinasyenmenorproporcin maltosa.Lasdextrinas sonoligosacridos opolisacridos depesomolecular variablequeresultan delahidrlisis alazar de los enlaces al-4 del almidn o del glucgeno. Laamilasapancreticaseviertea travsdeljugopancreticoalintestino,dondetransformalos productos generadospor laamilasasalival,enmaltosa y dextrinas lmite.Lasdextrinas lmite son oligosacridos ramificados que contienenunenlace a 1-6.Ninguna de lasdos amilasas es capaz de hidrolizar estos enlaces. Sehandocumentadocasosdepersonasquecarecendeamilasasalivaly nopresentanninguna alteracinenelprocesodigestivodelospolisacridosmencionados,locualindicaquesetratade unaenzimanoindispensable.Evidentemente,laexplicacindeestoesque laamilasapancretica actaenlamismaformaquelasalivalypuedepor lo tantodigerirpor smismaalalmidny al glucgeno. Enelsuero delos lactantes no sedetecta actividadamilsica sinohastauno o dos mesesde edad, alcanzndose ellmite inferior delintervalo normal del adulto hasta elprimer ao de edad. 27 IMPORTANCIA CLNICA SEPRESENTA AUMENTODELA AMILASEMIAENLOSSIGUIENTES CASOS: l.Pancreatitis aguda. Seregistranelevaciones dehasta 5 veceslos niveles normales. Encaso dequesemantenganlosvaloreselevadospormsde5das,puedepensarseenuna necrosis continuadadelpncreasoenlaformacindeunpseudoquiste(acumulacinde tejido,lquido,residuos,enzimaspancreticas y sangre,quesepuededesarrollar despus deunapancreatitisaguda.Confrecuenciaocurrecuandoserompenlosconductos pancreticospor efectodelainflamacinpropiadelapancreatitis).Enmuchoscasosla pancreatitis aguda seencuentra asociadacon ingesta agudade etanol. 2.Pancreatitis secundaria a hepatitis viral. 3.Afeccionestxicasdelpncreas,debidasa infeccionescomolatifoidea,elpaludismo,la neumona, elsarampin y lameningitis meningoccica. 4.lceragstricapenetrantedepncreas,encuyocasolosaumentossonmenoresalos registrados enlapancreatitis aguda. 5.Padecimientosabdominalescomolceraduodenalperforada,gastritis,peritonitisy obstruccinabdominal.Soncuadrosquecursanconincrementosdiscretosdela amilasemia. 6.Parotiditis,particularmente cuando esbilateral.Elaumento delaamilasemia sedetecta al 5o rdadespus de iniciado elpadecimiento. 7.Insuficienciarenal.Elincrementodelaamilasemiaenestoscasossedebeala disminucindelaexcrecindelaamilasa,apareciendonegativalaamilasuria. Normalmente alrededor del25% de laami lasaplasmtica seexcretapor los riones. 8.Administracindefrmacoscomomorfina,codenayotrosopiceos.Enestoscasosla hiperamilasemia es muy marcada,posiblemente por espasmo del esfnter de Oddi. PROCEDIMIENTO (Hycel) Fundamento:Semidelahidrlisis delalmidnpor laamilasasricamediantelaformacinde uncomplejocolorido (azul-verde)entre elalmidn y elyodo,cuyaintensidad esdirectamente proporcionalalacantidaddealmidn.Mientrasmssehidrolizaelalmidn(pormayor actividadamilsica),menos complejo colorido seformaconel yodo,por lo tanto laintensidad del color varaenproporcin inversaconla concentracin de ami lasaen lamuestra. 28 Marcar 2 matraces volumtricos de 50mL como "problema" y "blanco" l.Transferir exactamente 5.0 ml desolucin desustrato dealmidn a cadamatraz. 2.Incubar elmatraz problema enunbao de aguaa 37"C durante S minutos. No es necesario incubar elmatraz blanco. 3.Transferir exactamente0.1ml desueroalmatraz problema,mezclarbieny regresarloal bao de agua,donde deberestar 7.5minutos exactos. 4.Aadir5.0ml desolucindeyodoN/100a cadaunodelosmatraceseinmediatamente despus atorarlo conaguadestilada. Mezclar bien por inversin y agitar. S.Leerdeinmediatolaabsorbanciaa660nmdelproblemaydelblancocontraagua destilada. CLCULO [(A bleoco- A pcoblem,)/A bleocolX 800 =---unidades de amilasa/dL NOTA:Unaunidaddeamilasasedefinecomolacantidaddeenzimaquehidroliza10mgde almidn en 30minutos a un grado tal que el yodonoproduzcaningn color. VALORESDEREFERENCIA 60-160 unidades de amilasa/dL BIBLIOGRAFA Balcells, A.LaClnicay el Laboratorio. Ed.Marn, 1989 Mathews, C.K.& K.E.VanHolde. Bioqumica,2a.ed.McGraw-Hill, 1998 Devlin,T.M.(Editor)Textbookof Biochemistrywithc/inicalcorrelations,5thedition.Wiley-Liss, 2002 29 RESULTADOS,DISCUSIN Y CONCLUSIONES 30 FOSFATASA ALCALINA SRICA OBJETIVOS l.Elalumnodeterminarlaactividaddefosfatasaalcalinaenunamuestradesuero sanguneo 2.Elalumno explicarlaimportancia clnicadelacuantificacindelaactividadde fosfatasa alcalina enel suero GENERALIDADES Fosfatasaalcalina(FAL)eselnombreconqueseconoceungrupodeenzimasquepresentan actividadptimaparahidrolizar fosfosteres enunintervalo depHde 9.0 a 10.5. Comoproductos delasreaccionesquecatalizanseobtienenlosalcoholescorrespondientesyfosfatoinorgnico, segnindicalasiguiente reaccin general: R-0-PO,W+H20R-OH+H2Po.-LaFALseencuentradistribuida ampliamente enlos tejidos delorganismo.Duranteelcrecimiento seencuentraenmayorcantidadenlososteoblastos(clulasproductorasdetejidoseo)y condroblastos(clulasembrionariasquedanorigenalcartlago)deltejidoseo.Eneladulto,la mayor proporcin seencuentraenlamucosaintestinal, elhgado,los pulmones y elbazo, aunque tambin seproduce enelendotelio vascular,los t bulosrenales,elepitelio tiroideo, elepitelio del conductobiliar,placentayclulasdelaseriemieloide.Selocalizaenelcitosol,microsomasy lisosomas.Sufuncinbioqumicaprecisanoseconoceaunquealparecer enelhgado yelhueso participa eneltransporte de membranapues endichos tejidos laactividad de fosfatasaalcalinase halla asociada a lamembrana celular. LaFALsricaesprincipalmentedeorigenhepticoyseo,ylosincrementossedebenmsal aumento de susntesis que a incremento de suliberacin por los tejidos lesionados o necrticos LasisoenzimasdelaFALsondistinguiblesporsuspropiedadesfisicoqumicas,segnindicael siguiente cuadro: Propiedades de las isoenzimas de lafosfatasaalcalina PROPIEDADHIGADOHUESOINTESTINOPLACENTA RAPIDEZELECTROFORTICA*1232 DESACTIVACINA 56 CS0-7090-100S0-60o INHIBICIN CONFENILALANINA (%)0-100-107S75 *AMENORNMERO,MAYORRAPIDEZ 31 IMPORTANCIA CLNICA LAFAL AUMENTAENLOS SIGUIENTES CASOS: l.Padecimientos del hueso asociados conaumento de laactividad delos osteoblastos 2.Enfermedad dePaget.Tambinconocidacomoostetisdeformante, atacaprimeramente loshuesosdelcrneo,conaumentobilateraly algoasimtricodeltamaodelacabeza. Apareceosteoporosisy elsntomamsconstanteeseldolor reumatoide,especialmente enlastibias.Sepresentanfrecuentementecalambresmusculares,incurvacindetibias y cifosis(desviacinanormaldelacolumnavertebral),pudiendopresentarfracturasque consolidanrpidamente.Nosealteralacalcemia.Seatribuyeaunaalteracindel metabolismoseo,enespecialenlapelvis,elcrneoyelfmur.Loshuesospuedenser tanblandosquepuedencortarseconunbistur.Lospacientesregistrandisminucinde estaturadehasta20cmysepresentaconmayorfrecuenciaenhombresdeedad avanzada.Enelsuero de los pacientes seeleva en grado importante laFAL (10a 100 veces mayores allmite superior normal) debido a unexcesodeactividadde los osteoblastos. Se iniciaconresorcinseaexcesivae incrementoenelnmerodeosteoclastos(elemento celular gigante multinucleado de lamdula seacuyafuncin eslaresorcin o destruccin delhueso). Simultneamentea laresorcinseproducehuesonuevopor activacindelos osteoblastos,locualgeneraunpatrndedepsitosseosqueconstituyeunmosaico caracterstico de resorcin y formacin dehueso. Setrata deunpadecimiento de causano definidaaunquealgunosestudiossugierenqueseiniciaporunainfeccinviral.Llegaa afectar hasta el3% delapoblacin dems de 40 aos. 3.Raquitismo y osteomalacia.Producidaspor deficienciade vitaminaD,estaspatologas se caracterizanporformardepsitosdematrizseanocalcificada,loqueaumentala actividad de los osteoblastos 4.Tumores seosprimarios, como elsarcomaosteognico,producenincrementos variables delaFALsricadependiendodelgradodeafeccin.Laactividaddelaenzimaseutiliza paravigilar laevolucin de laenfermedad y surecurrencia. S.Metstasisseasderivadasdeneoplasiasdeprstata,pulmnyglndulamamaria.La presenciade actividad elevadadeFAL es signo de afeccin sea. 6.Hiperparatiroidismo.Enestapatologaaumentaexcesivamentelasecrecindela hormonaparatiroidea,lo cualalteraelmetabolismo delcalcioy del fsforo ypor lo tanto 32 laintegridad sea.Losincrementos delaactividadsricadelaFALseregistransolamente cuando elhueso seencuentramuy afectado. 7.Reparacinseaporrecuperacindefracturas.ElaumentodelaFALsedebeala formacin dehueso nuevo. 8.Crecimiento.Durante elcrecimiento esnormal que laactividad s ricadeFAL seencuentre aumentada respecto a las cifras normales del adulto. Los incrementos sonmsnotables en adolescentes de sexomasculino.Las y los jvenes alcanzanlos niveles deladulto a los 15 y 18 aos,respectivamente. 9.Embarazo.Elincrementoseregistraenelsegundoytercertrimestresdebidoaquees entoncescuandoseestimulaeldesarrolloseodelproducto.Elincrementotambinse debe a lapresencia delaisoenzimaplacentaria.Lascifras senormalizan aproximadamente a las seis semanas posparto. 10.Menopausia. Elaumento significativo delaactividad deFAL serelacionaconlaprdidade huesosecundariaaldescensodelosnivelesdeestrgenos.LascifrasdeFALenmujeres mayores aumentan hasta enun 40%respecto alintervalo normal 11.Enfermedades hepticas. Enlamayora de estas enfermedades seregistraunaumento de FAL,perocuandoelincrementoesmayoraltripledellmitesuperiornormalesms probablequesetratedeunapatologaobstructiva,yaquelospadecimientosquecursan connecrosisdeloshepatocitosporlogeneralnoregistranincrementosaltosdeFAL srica, exceptositambinocurrenecrosis enlos canalculos o enlosconductos biliares. Si unpacienteictrico presentaniveles normales de FAL sedescartalaobstruccin biliar. 12.Tratamientoconcorticosteroides.Sehaobservadoincrementogeneralmentepequeo delaactividaddeFALydelastransaminasasdespusdeltratamientocon corticosteroides,revirtiendo luego de suspenderse el tratamiento. PROCEDIMIENTO (Randox) Fundamento:lahidrlisisdelp-nitrofenilfosfato,catalizadaporlaFAL,producefosfatoyp--nitrofenol.Esteltimoesuncompuestocolorido.Laintensidaddelcoloresdirectamente proporcional a laactividad deFAL. 33 l.Transferir 20JlL de suero a unaceldilla del espectrofotmetro 2.Aadir 1.0 mL del reactivo de trabajo 3.Mezclar y leer la absorbancia(A0)a 405 nm frente alaire(celdilla vaca) 4.Sinsacarlaceldillaleernuevamentelaabsorbanciaalcabode1(A1),2(A2)Y 3(A3) minutos CLCULO Obtener los 3 valores de Mdelamuestra como sigue:A1- A0,A2- A1 y A3- A2 y promediarlos. Mpmmod;ox2760=__ U/L Fosfatasaalcalina Los sueros hemolticos interfieren conladeterminacin. VALORESDEREFERENCIA Hombre/ Mujer: 73-207 U/L BILBLIOGRAFA Balcells,A. Laclnica y el Laboratorio.Ed.Marn Gonzlez deBuitrago, J.M., E.Arillo Ferreiro, M. Rodrguez-Segade& A.Snchez Pozo.Bioqumica Clnica.McGraw-Hill, 1998 Devlin,T.M.(Editor)Textbookof Biochemistrywithclinicalcorrelations,5thedition.Wiley-Liss, 2002 http://www.facmed.unam.mx/bmnd/plm2k8/src/prods/34930.htm (efecto decorticosteroides) 34 RESULTADOS,DISCUSIN Y CONCLUSIONES 35 GLUCOSA PLASMTICA OBJETIVOS 1.Elalumno determinar laconcentracin de glucosaenunamuestra de suero sanguneo 2.Elalumno explicarlaimportancia clnicade ladeterminacin de la glucemia GENERALIDADES Laglucosaeselmonosacridodemayor importanciaqueutilizanlasclulasparalaobtencin de energa.Elorigen de la glucosapuede ser exgeno, cuando se obtiene a partir de los carbohidratos dietarios(almidn,glucgeno,sacarosaylactosa),yendgeno,cuandosesintetizaenel organismo a travs dela vagluconeognica. Laglucemia(glucosaensangre)sehallareguladafundamentalmentepordoshormonas,el glucagonylainsulina.Lahipoglucemiaeselefectorparalasecrecindeglucagon,elcual estimulalaglucogenlisis enelhgado.Laglucosaliberadaa partir del glucgeno pasaentonces a lasangre,restableciendolanormoglucemia.Enlahiperglucemiaencambio,lainsulinaactivael mecanismoquepermitelaincorporacindelaglucosaalostejidosadiposoymuscular, reduciendoaslaconcentracindeglucosasanguneahastalograrlanormoglucemia.Aunquela insulinaserequiereparalaincorporacindeglucosaporloshepatocitos,sintervieneenforma importante estimulando la glucognesis. Laconcentracinnormaldeglucosaenlasangreonormoglucemiadespusdeunayunodeal menos8horasvaradentrodeunintervalodeaproximadamente75a 115mg/dL o4.16a 6.39 mmoi/L, pudiendo variar segnelmtodo utilizado. Encondiciones normales la glucemiaposprandialraramente superalos 140 mg/dL,recuperndose lanormoglucemiaantesde2.5horas.Sielgradodeglucemiaenayunosuperaellmitesuperior delintervalonormalobiensilahiperglucemiaposprandialsemantienedurantemstiempodel indicado, muy probablemente setrata de algunapatologaque cursaconhiperglucemia. Seconsideraque enelayunolos mnimos valores de glucemia tolerablespor elorganismo sinque sepresentedaocerebralsonde40a50mg/dL,sinembargoestonoesaplicablea todaslas personas debido a quelasensibilidadesmuy variable entre los distintos individuos, de tal manera quedebeprocurarseentodosloscasosmantenernormoglucmicoalpacienteparaprevenir cualquier efecto de lahipoglucemia. 36 IMPORTANCIA CLNICA SEPRESENTA AUMENTODELA GLUCEMIA ENLOS SIGUIENTESCASOS: l.Hiperglucemiafisiolgica.Setratadeunincrementodiscretoytransitorioquenose acompaadeglucosuria.Sepresentacomoresultadodelaexposicina baoscalientes, excitaciones psquicas y ocasionalmente por efecto del periodo menstrual. 2.Asfixiaeintervencionesquirrgicas,probablementedebidoadescargasdeadrenalina, con efectos pasajeros. 3.Diabetesmellitus.Eslacausamscomndehiperglucemia,debindosealaausencia total o parcial deinsulina, o bien a unefecto insuficiente de dichahormona. 4.Sndromes diabetoides extrainsulares,pudiendo ser hipofisiario,comoenlaenfermedad de Cushing (adenomahipofisiario que cursaconhipercorticismo crnico), suprarrenal,por presenciadefeocromocitoma(tumor delamdulaadrenal)queprovocaaumentodela secrecindeadrenalina, y tiroideo,por hiperfuncin delaglndulatiroides.Enestecaso lahiperglucemia esmuy discreta. S.Traumatismo cerebral. 6.Infartoalmiocardio,registrndoselahiperglucemiasloenlosprimerosdosdas.En ocasiones seacompaa de glucosuria. 7.Tratamiento con ciertas hormonas esteroides, debido a suefecto gluconeognico. SEPRESENTA DISMINUCINDELAGLUCEMIAENLOSSIGUIENTES CASOS: l.Esfuerzos musculares agotadores 2.Hiperinsulinismo, debido a insulinoma (neoplasiapancretica) 3.Sobredosis de insulina, pudiendopresentarse comahipoglucmico 4.Insuficiencia heptica grave,por alteracin delmetabolismo del glucgeno 5.Trastornos digestivos que cursanconmalabsorcin intestinal, como vmitos y diarrea 6.Hipoglucemiadelalactancia,queafectaalasmadreslactantesporalimentacin insuficiente 7.Alcoholismo agudo,por elefecto inhibidor del alcohol sobre lagluconeognesis. PROCEDIMIENTO (Randox) Fundamento:laglucosareaccionaconoxgenoyagua,transformndoseengluconato y perxido dehidrgenomediantelaglucosaoxidasa.Elperxidodehidrgenoproducidoreaccionacon fenaly4-aminofenazona,formandoquinoneiminayagua,porcatlisisdelaperoxidasa.La 37 quinoneiminaesuncompuestocoloridocuyaconcentracinesproporcionala ladeglucosaenla muestra. Pipetear en tubos deensayo: Plasmao suero20 j.!L Patrn Reactivode trabajo2.0 mL2.0mL2.0 mL Mezclar e incubara 3r e durantealmenos10minutosy medir laabsorbancia(A)dela muestra y delpatrn frente alblanco a 500 nm. Elcolor esestabledurante 60 min. CLCULO (A m"""'/ A pwn)X100 = ___ mg/dL Glucosa Elmtodo eslineal hasta valores de 500 mg/dl. Silaconcentracin de glucosa es superior a este valor, debe diluirse lamuestra 1:2 con solucin salina,multiplicando alfinallaconcentracin obtenida por el factor 2 VALORESDEREFERENCIA 75 a 115 mg/dL BIBLIOGRAFA Balcells,A.La clnica y el Laboratorio.Ed.Marn Gonzlez de Buitrago, J.M.,E.ArilloFerreiro,M. Rodrguez-Segade& A.SnchezPozo.Bioqumico Clnica.McGraw-Hill, 1998 Scriver, C.R.,A.L.Beaudet, W. S.Sly & D.Valle (Ed.)TheMetabolic Bases of lnherited Disease,7'h ed.McGraw-Hill, 1995 Devlin, T.M. (Editor) Textbook of Biochemistry with clinical correlations,51h edition. Wiley-Liss, 2002 38 RESULTADOS,DISCUSIN Y CONCLUSIONES 39 LACTATOPLASMTICO OBJETIVOS 1.Elalumno determinar laconcentracin delactato enunamuestrade plasma sanguneo 2.Elalumno explicarloscontextos terico-clnicos enqueesrelevantelacuantificacindel lactato enla sangre GENERALIDADES Laglucosa secatabolizaen todos los tejidos a travs delagluclisis, vaque transformalaglucosa enpiruvato(glucosa---+2piruvato). Siocurreencondicionesaerbicas,elpiruvatoingresaalas mitocondriasy ahescatabolizadohastaC02 yH20,locualpermitelaliberacindecantidades importantes deenergatilparalaformacindeATPy otrassustanciasa travsdelascualesse aporta energa a los procesos celulares que larequieren. Entiposcelularesenlosquelaglucosanosecatabolizaaerbicasinoanaerbicamente (eritrocitos, clulas de gla, clulas de lamdularenal, etc.), o bien enaquellos otros que, teniendo normalmenteunmetabolismoaerbicoentrana unafasedelimitacin oausenciadeoxgeno(el comndelostiposcelulares,demaneraimportantelasclulasdelmsculoesquelticoylos cardiomiocitos),elpiruvato producido a partir delaglucosasereduce a lactato de acuerdoconla siguiente reaccin: Piruvato + NADH + H'---+Lactato+ NAD' Estareaccinescatalizadaporlaenzimadenominadalactatodeshidrogenasa,deamplsima distribucin enelorganismo humano. Ellactato que seformaenlasclulaspasaalacirculacinpor untransportador delamembrana celularque enrealidadesunsimportador delactato ehidrogeniones,conlo cualsepreservala electroneutralidad. Deestamanera, conforme seproduce puede ir pasando a lacirculacin. Bajolas condiciones apropiadas, el hgado y enmenor proporcin el rin, captan y metabolizan el lactatodelasangre,transformndoloenglucosaatravsdeunavaconocidacomo gluconeognesis.Encondicionesnormales,laconcentracindelactatosemantienebaja(menos de20mg/dL deplasma) gracias a este proceso metablico. 40 IMPORTANCIA CLNICA Elincrementoenlaconcentracindelactatopuedeocurrirporqueseproduzcaencantidades mayores a lo normal oporqueelhgado sehalleinsuficiente parametabolizarlo,especialmentesi concurre unacondicin de sepsis o de etilismo. SEREGISTRA INCREMENTODELACTATOENSANGREENLOSSIGUIENTES CASOS: l.Insuficiencia cardiaca congestiva 2.Choque de cualquier origen (hipovolmico, anafilctico,etc.) 3.Necrosis heptica aguda y cirrosisheptica 4.Insuficiencia respiratoriaavanzada 5.leo paraltico (prdida delaactividadmotora intestinal, conisquemia) 6.Algunostiposdetumores,comolinfomas(cncerdelsistemalinftico)y hemangioblastomas(neoplasiasvascularesbenignaslocalizadasprincipalmenteenel cerebelo). PROCEDIMIENTO (Randox) Fundamento:ellactatoseoxidaapiruvatomediantelaenzimalactatooxidasa,produciendo ademsperxidodehidrgeno(H202).Elperxidodehidrgenoreaccionacon4-clorofenoly4-aminoantipirinaparaproducir quinoneimina, aguay cidoclorhdricomedianteunareaccinque catalizaunaenzimaperoxidasa.Laintensidaddelacoloracinproducidaesdirectamente proporcional a laconcentracin de quinoneimina y staa suvez esdirectamente proporcional a la concentracin delactato. Pipetear en tubos de esnayo: Plasma10 .tL Patrn10 .tL Reactivo de trabajo1.0 mL1.0 mL1.0 mL Mezclar e incubara 37, C durante5 minutosy medirlaabsorbancia(A)delamuestray delpatrn frente alblanco a 550 nm.Elcolor esestabledurante 30 min. 41 CLCULO (Amuestr,/ Apotco)X40 = __ mg/dL Lactato VALORESDEREFERENCIA 4.5-20 mg/dL BIBLIOGRAFA Balcells, A.La Clnica y el Laboratorio. Ed.Marn, 1989 Devlin, T.M. (Editor) Textbook of Biochemistry with clinical correlotions,5thedition. Wiley-Liss, 2002 http://www.ranc.com.ar/pdf/2003/Volumen2/utilidadesresonancia _magnetica.pdf ?PHPSESSID=42f6bba09d0b75fb6cc50891ea8fc5f1(tumores asociadosconincremento de lactato) http://www.neurocirugia.com/anatpat/hemangioblastoma/hemangioblastoma.htm (significado y localizacin de hemangioblastomas) 42 RESULTADOS,DISCUSIN Y CONCLUSIONES 43 TRIACILGLICEROLES S RICOS OBJETIVOS l.Elalumnodeterminarlaconcentracindetriacilglicerolesenunamuestradesuero sanguneo. 2.Elalumnoexplicarelcontextoclnicoenqueesrelevanteladeterminacinde triacilgliceroles sricos GENERALIDADES Lostriacilgliceroles(triglicridos)sonlpidosformadospor laesterificacindetresmolculasde cidosgrasos conunade glicerol. Seencuentranpresentes enlosaceites y las grasasque forman partedelasdietascomunesyeneltejidoadiposo,dondeconstituyenlaprincipalformade almacenamientoenergtico.Lostriacilglicerolesdietariossedigierenporaccindelalipasa pancretica,generandoprincipalmentemonoacilgliceroles y cidosgrasos,productos capacesde ser absorbidos por elintestino. Enlosenterocitoslosmonoacilglicerolessereesterificanconloscidosgrasos,ylos triacilglicerolesresultantesseasocianconotroscomponentesparaestructurarlaslipoprotenas conocidascomoquilomicrones,loscualessonsecretadoshacialalinfa,a travsdelacualson llevadosalacirculacingeneral.Enloscapilaressanguneosdediversostejidos,principalmente del adiposo y del muscular,lalipoprotena lipasa (LPL)hidro lizams del 80% delos triacilgliceroles delosquilomicrones,ylamayorpartedeloscidosgrasosliberadospenetranalasclulasdel tejido correspondiente, mientras que el glicerol es captado y meta bol izado por elhgado. DespusdequeactalaLPLsobrelosquilomicrones,stosquedanconvertidosenlipoprotenas pequeasderelativoalto contenidodecolesterol,llamadasremanentesdequilomicrones,cuyo destino esser endocitadas por los hepatocitos. Elhgadoformatriacilglicerolesapartir deloscarbohidratosdietarioscuandostossehallanen exceso.Debidoa queelhgadonormalmentenoalmacenagrasa,sustriacilglicerolesseasocian conotroscomponenteslipdicosyprotenicosparaestructurarlaslipoprotenasdemuybaja densidad(LMBD),lascualessecretaalasangre.Demanerasimilaraloqueocurreconlos quilomicrones,laLPLhidrolizalamayorpartedelostriacilglicerolespresentesenlasLMBD, penetrando los cidos grasos liberados, a las clulas del tejido correspondiente. 44 IMPORTANCIA CLNICA Laelevacindelaconcentracinplasmticadetriacilglicerolesconstituyeunfactorderiesgo aterognico.Laconcentracinnormalesmenor a 200mg/dL,aunqueseconsiderasospechade hipertriacilglicerolemia entre 150 y 200 mg/dL.Aquellos pases con dietas altas en grasas animales tienenelevadaprevalenciadeaterosclerosis y suscomplicaciones.Porelcontrario,enpasescon ingestabajadegrasasaturada,comoeselcasodeJapny dealgunospasesmediterrneos,la prevalencia de aterosclerosis es baja. Sehadocumentado que lascampaas exitosasparadisminuir laingesta de grasaanimal enpases conaltaprevalenciadeaterosclerosisy cardiopataisqumica,logranreducirlamortalidadpor estacausa. Elhombreprimitivorequeraelalmacenamientodegrasaensucuerpodebidoaloinciertode cundopodra tomar suprximoalimento, sinembargo,enlamayoradelassociedades actuales esinnecesarioelalmacenamientodegrasa,dadaladisponibilidaddealimentos a cualquier hora del da y a que elesfuerzo fsico cadavez es menor. Lasgrasasinsaturadassondeorigenvegetal,aunquetambinexistenenproporciones importantes enlos alimentos deorigen animal.Laingestin de grasas de origen vegetalno sehalla asociadaporsmismaalaingestadecolesterol.Adems,dichafuenteproporcionaloscidos grasos esenciales, que no pueden sintetizarse enel organismo humano. Lahipertriacilglicerolemiaendgenaprimariaesunapatologagenticamentedeterminadaque sepresentaaproximadamenteen1decada100individuosenlapoblacinadultay sehereda comorasgoautosmicodominante.Eldefectomolecularesdesconocidoaunquealparecer determina unasobreproduccinhepticade triacilgliceroles. PROCEDIMIENTO (Randox) Fundamento:lahidrlisisdelostriacilglicerolesproducecidosgrasosy glicerolpor accindela lipasa.Elglicerol formadoreaccionaconATP,produciendo glicerol-fosfato y ADPpor catlisis dela glicerolcinasa.Elglicerol-fosfatoasuvezreaccionaconoxgenoyproducedihidroxiacetona-fosfatoyperxidodehidrgeno,enunareaccincatalizadaporlaglicerol-fosfatooxidasa.El perxidodehidrgenoreaccionacon4-aminofenazonay 4-clorofenol,generandoquinoneimina (compuestocolorido),cidoclorhdricoyagua.Laconcentracindelcompuestocoloridoes proporcional a laconcentracin de triacilgliceroles. 45 Pipetear en tubos deensayo: Patrn Reactivo de trabajo1.0mL1.0 mL1.0 mL Mezclar e incubar a 37"C duranteS min.y medirlaabsorbancia(A)delamuestray del patrn frentealblancoa 500 nm.Elcolor esestabledurante 60min. CLCULO (A muestcaf A '"'") X 200 = __ mg/dL Triacilgliceroles VALORESDEREFERENCIA Sospechadehipertriacilglicerolemia:a partir de 150 mg/dL Hipertriacilglicerolemia:a partir de200 mg/dL BIBLIOGRAFA Balcells,A.La Clnicay el Laboratorio.Ed.Marn, 1989 Gonzlez deBuitrago, J.M.,E.ArilloFerreiro,M. Rodrguez-Segad e & A.SnchezPozo.Bioqumica Clnica.McGraw-Hill, 1998 Devlin, T.M. (Editor) Textbook of Biochemistry with clinical correlations,s'hedition. Wiley-Liss, 2002 46 RESULTADOS,DISCUSIN Y CONCLUSIONES 47 COLESTEROL SRICO OBJETIVOS 1.Elalumnodeterminarlaconcentracindecolesteroltotalenunamuestradesuero sanguneo tomada despus de ayuno de12 horas. 2.Elalumnoexplicarelcontextoclnicorelevanteparaladeterminacindela colesterolemia GENERALIDADES Elcolesterolesunderivadodelciclopentanoperhidrofenantreno.Esunamolculainsolubleen aguaque seencuentraen todoslos tejidos corporales,especialmenteencerebro,hgado,mdula sea y piel. CONTENIDODECOLESTEROL DE ALGUNOS ALIMENTOS COMUNES ALIMENTO (100 g)COLESTEROL (mg) RINDERES700 HGADODERES440 CARNEDERESO CEROO8S CARNEDEBORREGO9S POLLO O PAVO80 CAMARONES1SO ALMEJAS6S PESCADOMAGRO*43 OSTIONES*40 QUESOO CREMA111 REQUESN19 YEMASDEHUEVO (2)S40 ClARA DEHUEVOo LECHEENTERA (1 TA2A))33 VEGETALESo * alimentos cocidos Enelhgadoseproducelamayor parte del colesterol endgeno.Estergano tambin participa en laexcrecindecolesteroltransformndoloensalesbiliares,lascualessonllevadasporlabilis haciaelintestino,dondefuncionancomoagentesemulsionantesdelagrasadietara,en conjuncinconelmovimientoperistltico.Enelleonunagranpartedelassalesbiliaresse reabsorbe,participandoenlacirculacinenteroheptica.Lapequeafraccinquenose reabsorbesufrelaaccindelaflorabacteriana,dandocomoresultadocoprostanoly colestanol, 48 quesoneliminadosenlashecesfecales.Ladietapromediosuministraalrededorde0.3gde colesterol diariamente. Elcolesterolseencuentraentodaslasclulasanimalesformandopartedelasmembranas. Tambin seencuentra formandoparte delos distintos tipos delipoprotenas, siendoprecursor de las salesbiliares, de lavitamina O y de toda lafamilia de hormonas esteroides. IMPORTANCIA CLNICA SEPUEDEENCONTRARHIPERCOLESTEROLEMIAENLOSSIGUIENTES CASOS Y SITUACIONES: l.Dietasricasencolesterol.Elconsumodealimentosricosencolesterolpropiciauna hiperconcentracindecolesterolenloshepatocitos,locualinhibelaexposicindelos receptores paralasLBDen susuperficie celular.Esto ocasiona que cantidades importantes ycrecientesdelcolesterolcirculante(deorigendietario o endgeno)no tenganaccesoa dicho tejido. 2.Ictericiaobstructiva.Enestepadecimientoseobstruyenloscanalculosbiliaresoel coldoco,dificultndosepor tantolaeliminacindelcolesterol.Enestoscasoslosniveles decolesterol sanguneo pueden aumentar aldoble o al triple de lo normal. 3.Cirrosisbiliar.Estepadecimientocursacondeteriorocrnicodelaexcrecindebilis.Se observandatosmorfolgicosdedestruccinprogresivadeJosconductosbiliares intrahepticos.Laenfermedadpuededeberseacolestasiscrnicaintrahepticaoala obstruccin del coldoco. 4.Sndromenefrtico.Padecimientorenalquesecaracterizaporproteinuria, hipoalbuminemia,edemaehiperlipidemia.Puedecursarconeliminacinurinariade colesterolyotroslpidos.EstesndromeesocasionadoporlesindeJosglomrulos.El efectohiperlipidmicoaparentementesedebealamayorproduccindelipoprotenas paracompensar laprdidadealbminapor lavaurinaria,reduciendo aslaalteracinde lapresin onctica intravascular. 5.Mixedema(hipotiroidismo).Enestecasohayinsuficienciadelaglndulatiroidesyel efecto seatribuye a ladisminucin de receptores hepticos paralasLBD. 6.Diabetes sacarina(Diabetesmellitus). Lahipercolesterolemia sepresenta frecuentemente enestaenfermedad.Aldisminuirlahiperglucemiatambindisminuyela hipercolesterolemia. 49 7.Hipercolesterolemiafamiliar.Padecimientogenticamentedeterminado,causadopor faltadereceptoreshepticosparaLBD,loqueocasionaquelosnivelesdecolesterol circulante seincrementen. 8.Enfermedadcardiovascularyaterosclerosis.Epidemiolgicamenteestapatologaesla ms importante que seasociaconhipercolesterolemia, siendolacausafundamentaldela presentacin deinfarto agudo almiocardio. Existendatosqueindicanquelasconcentracionesdecolesterolplasmticosuperioresa200 mg/dlseasocianconunamayorfrecuenciadeaterosclerosis,demaneratalqueamayor concentracin,laaterosclerosisaparecea unaedadmenor.Partanto,comomedidapreventiva debe tenerse cuidado dequelas cifras decolesterol semantenganpor debajo de dicho lmite. PROCEDIMIENTO (Randox) Fundamento:Paradeterminarelcolesteroltotal,primeramentesehidrolizansusesteres mediante colesterol esterasa,liberando colesterol y cidos grasos.Enseguidaseoxida elcolesterol mediantecolesteroloxidasa,generndosecomoproductoscolesten-3-onayperxidode hidrgeno.Esteltimoreaccionaconfenaly4-aminoantipirinaporcatlisisdelaperoxidasa, produciendoquinoneimina(compuestocolorido).Laconcentracindequinoneiminaes proporcional a la concentracin de colesterol total. Pipetear en tubos deensayo: Aguadestilada10 Jll Patrn Suero o plasma Reactivode trabajo1.0 ml1.0 ml1.0 ml Mezclar e incubar a 3r C duranteS min.y medirlaabsorbancia(A)delamuestray del patrn frentealblanco a 546 nm.Elcolor esestabledurante 60min. 50 CLCULO (A m""'"/ A potc,)X 200 = __ mg/dL Colesterol VALORESDEREFERENCIA Deseable: Lmite alto: < 200 mg/dL 200-239 mg/dl Hipercolesterolemia: 240 mg/dl BIBLIOGRAFA Gonzlez deBuitrago, J.M.,E.Arillo Ferreiro,M.Rodrguez-Segade& A.SnchezPozo.Bioqumica Clnica.McGraw-Hill, 1998 Guadalajara, J.F.Cardiologa. 5'. Ed.,Mndez Editores,1990 Devlin,T.M.(Editor)Textbookof Biochemistrywithclinicalcorrelations,s'"edition.Wiley-Liss, 2002 51 RESULTADOS,DISCUSION Y CONCLUSIONES 52 COLESTEROL-LBDY COLESTEROL-LADS RICOS OBJETIVOS 1.Elalumnodeterminarlaconcentracindecolesteroi-LBDycolesteroi-LADenuna muestradesuero sanguneo despus de ayuno de 12horas. 2.Elalumno explicarlarelevancia clnicadel colesterol asociado a LBDy a LAD GENERALIDADES LBD.Laslipoprotenasdebajadensidadtransportanenlasangrelamayorcantidaddel colesterolliberado por elhgado y lollevanhacialos tejidos perifricos,aunque despus sumayor parteregresaaltejidoheptico.LasclulasquecaptanLBDposeenreceptoresmembranales capacesdereconocera dichaslipoprotenassiempreycuandostascontenganapoprotenaB-100.UnavezincorporadaslasLBDporendocitosis,elcolesterolquedalibreyseintegraal metabolismo celular,pudiendo almacenarsepreviaesterificacin catalizadapor laenzima acilCoA colesterol aciltransferasa {ACAT). Elhgadosegreganormalmentelipoprotenasdemuybajadensidad(LMBD),lascualesse conviertenenlipoprotenasdedensidadintermedia(LDI)alperderunabuenapartedesus triacilglicerolesporefectodelaenzimalipoprotenalipasa{LPL)enloscapilaresdelostejidos perifricos. Aproximadamentelamitad delasLDIdelplasmasoncaptadaspor el hgado, y lasque no,seconviertenenLBDporaccindelalipasaheptica.Losindividuosquepadecen hipercolesterolemiafamiliartienenreceptoresparaLBDconalteracionesestructuralesy funcionalesgenticamentedeterminadas.Losindividuosnormalesqueingierendietasconalto contenido decolesterol tienen ensuhgadounexcesode colesterol,lo cualhaceque disminuya el nmerodereceptoresparaLBDenlasuperficiecelular,conelconsecuenteaumentodela concentracinplasmtica del colesterolLBD. Laregulacin delmetabolismo delasLBDy por tanto delcolesterol, depende de suconcentracin plasmtica,yaquesisepresentaunareduccindelasLBDdelplasmaypor tantodelcolesterol heptico, seactivalaHMGCoA reductasa,enzimareguladoradelasntesishepticadecolesterol. ConlamayorproduccindecolesterolserestituyelaconcentracinplasmticadeLBDy colesterol.Porelcontrario,siaumentalaconcentracinplasmticadelasLBDseincrementala captacinhepticadelcolesterolyesteinhibealaHMGCoAreductasaconlaconsiguiente disminucindelasntesisdecolesterolheptico.Adicionalmente,disminuyelasntesisde receptoresparaLBD,locualse traduce enmenor nmero dereceptores enlasuperficie celular,lo 53 queasuvezreducelacaptacinhepticadelasLBDplasmticas.Enlaspersonassanaseste mecanismomantienedentrodelosintervalosnormaleslaconcentracindeLBDcirculantes ysu colesterol. Elaumento delaconcentracinplasmticadecolesteroi-LBD esunodelos factores deriesgoms importantesparageneraraterosclerosis.Porelcontrario,laterapiaquereducesus concentraciones sanguneas reduce tambin laprobabilidad deaparicin de afecciones coronarias. Seconsiderancifrasnormalespor debajode160 mg/dL,aunquesondeseablescifrasmenores a 130 mg/dl. LAD.Laslipoprotenas de alta densidad seforman enelhgado y enelintestino. Recinsecretadas selesdenominaLADnacientes y sonunaespeciedevesculasplanas.Enlacirculacinadquieren apoprotenaA y apoprotenaC provenientes delasLMBDy delosquilomicrones.LasLADreciben fosfolpidos y colesterolnoesterificado a partir de lasuperficie celular enlos tejidos perifricos y a partir deotras lipoprotenas.Endichaslipoprotenas ocurrelaesterificacindelcolesterolyaque contienenlaenzimalecitina colesterolaciltransferasa(LCAT).A estosedebequenormalmente 2/3 del colesterol sanguneo seencuentre esterificado. LasLADllevanalhgadoelcolesterolesterificado,locualconstituyeensuconjuntounproceso queseconocecomotransporte inverso decolesterol,elcualesunmecanismoimportantepara evitarlahipercolesterolemiay laaterosclerosis.TodosaquellosfactoresquedisminuyenlasLAD (tabaquismo,obesidad,vidasedentaria,andrgenos,beta-bloqueadores,hipertriacilglicerolemia, anablicosesteroides,diabetesmellitus,etc.)sonpromotoresdelaaterosclerosis.Seconsidera conveniente una concentracin de colesteroi-LAD mayor a 55 y 65mg/dL parahombres y mujeres, respectivamente y como factor deriesgoaterognicoelevado,unaconcentracinmenor a 35y a 45mg/dL en hombres y mujeres, respectivamente. Elcolesterol,lasLBDY LADdebencuantificarseensujetos sanosdespus delos20aos deedad, porlomenoscada5aosyconmuchamayorraznsipresentanunoomsfactoresderiesgo aterognico. 54 IMPORTANCIA CLNICA SEREGISTRAINCREMENTODELACONCENTRACINDELBDENLASSIGUIENTESSITUACIONESO PATOLOGAS: Dietasricasencolesterol.Elconsumorutinariodealimentoscomohuevo,lecheentera,queso, vsceras,camarones ycarnesrojas,estimulaelaumento de estaslipoprotenas enlasangre.Enel casodelhuevo,ciertosestudiossugierenquesuingestanoinfluyesignificativamentesobrela colesterolemia, supuestamente por lapresencia deuninhibidor (lecitina) de laabsorcinintestinal del colesterol,presente endicho producto. Hipercolesterolemiafamiliar.Esunpadecimientodeorigengenticocausadopordisminucino falta de receptores hepticos paralasLBD o mutaciones de laapoprotena B-100 Dietasricas encarbohidratos.Enelhgado elexcesodecarbohidratos de ladieta setransforma en grasaycolesterol,loscualesseenvanalacirculacinenformadeLMBD,dandolugar parcialmente a laformacin deLBDpor intermedio delasLDI. Tabaquismo.Elefecto seobservaensujetos que fumanmsde20cigarrillos alday seatribuye a unaaccinoxidantedealgunoscomponentesdelhumodeltabacosobrelasLBD,alterandoel metabolismo de stas. Aterosclerosis. Sellama ateroesclerosis a lapresencia deplacas enlantima arterial envasos como laaorta,lascoronarias,lacerebral,lacartidainterna,lailaca,lafemoralylasmesentricas. Aquellasconundimetromenora300.tmnosonafectadas.Nosetratadeunaenfermedad sistmica,sinoqueafectaciertos sitios congranpredileccin.Enestos sitios elendotelio vascular presentamayorpermeabilidada diversoscomponentesdelplasma,entreloscualesdestacanlas LBDylosmonocitos,quetiendenaacumularseenelespaciosubendotelial.Enesteespaciolos monocitos setransforman enmacrfagos,loscuales,aligualque lasclulasendoteliales ylasdel msculoliso,formanradicaleslibres.Estospropicianlaperoxidacindeloscidosgrasos insaturados delasLBD.Losmacrfagos fagocitana lasLBDoxidadasysetransformanenclulas espumosas.Lanecrosisdelasclulasespumosasprovocaunprocesoinflamatorio quepromueve lasntesisdecolgenaylaproliferacindeclulasdemsculoliso,lascualesmigranhaciael espaciosubendotelialydanlugaralaformacindeunaplacaenelendoteliovascularquees llamadaestragrasa.Silahipercolesterolemiapersiste,elprocesomencionadoseperpetayla placasiguecreciendo.Confrecuencia,enetapastardaslaplacaarterialsefisura,conloquese activalageneracin deun trombo sobre laplaca,precipitndose as laoclusin vascular. 55 VARIACIONESDELACONCENTRACINDELAD Comidagrasa.Despusdeingerir comidasricasengrasasuconcentracinpuededisminuir entre lO y 20%. Ejercicio.Elejercicio fsicorutinarioproduce suaumento PROCEDIMIENTO PARA CUANTIFICAR COLESTEROL-LBD(Randox) Fundamento: constade 2 fases,aclaramiento y reaccin FASEDEACLARAMIENTO Losquilomicrones,lasLMBDylasLADsedestruyenmediantedetergentesespecficos,liberando sussteresdecolesteroly sucolesterollibre.LasLBDquedanintactasconestetratamiento.Los steres de colesterol sehidrolizan enzimticamente, produciendo colesterol y cidos grasos libres. Posteriormente elcolesterollibre seoxida enzimticamente paraproducir colestanonay perxido dehidrgeno y finalmente esteltimo sereduce, produciendo agua y liberando oxgeno. COLESTEROLESTERASA steres decolesterol -- colesterol+ cido graso COLESTEROLOXIDASA Colesterol+ 02 ---+colestenona + H202 CATAlASA H202 2 H20+ 02 FASEDEREACCIN Elpropsito delafasede aclaramientoeseliminar todo elcolesterolasociadoa laslipoprotenas antesmencionadas.Unavezcubiertoesto,serepiteelprocedimientohastalaproduccinde perxidodehidrgenoparaposteriormentehacerquereaccioneenzimticamenteconciertas sustanciasparagenerarquinoneimina,quetienecolor.Laintensidaddelcolorproducidoes proporcional a laconcentracin de colesteroi-LBD PEROXIDASA H202 + 4-AA + HDAOS---.quinoneimina +4 H202 56 CLCULO Pipetear entubos de ensayo: Patrn 10 11L Suero Reactivo175011L75011L Mezclare incubarS minutosa 37"e y medirlaabsorbanciaA1 dela muestra y delpatrna 578 nm frente a aguadestilada Despusagregar: Reactivo R20.25 mL0.25 mL Mezclare incubarS minutosa 372Cy medirlaabsorbancia(A2)dela muestray delpatrna 578 nm frentea aguadestilada [(Az- Adm"'""/(A,- A,)pwolx concentracin delpatrn= ___ mg/dL colesteroi-LBD VALORESDEREFERENCIA SINRIESGORIESGOMODERADORIESGOAlTO ADULTOS< 130 mg/dL130-1S9 mg/dl2160 mg/dl PROCEDIMIENTO PARA CUANTIFICAR COLESTEROL-LAD(Randox) Elfundamentoylatcnicasonigualesalosdelcolesteroi-LBD,exceptoqueenlafasede aclaramiento seutiliza undetergente adecuadoparadestruir quilomicrones, LMBD y LBD. CLCULO [(A2- A1)m"""'/(A2- A1)p,,,l x concentracin del patrn= ___ mg/dL colesteroi-LAD 57 VALORESDEREFERENCIA BIBLIOGRAFA HOMBRES MUJERES SINRIESGO >55 mg/dl >65 mg/dl RIESGOMODERADO 35-55 mg/dl 35-55 mg/dl Balcells, A.LaClnicay el Laboratorio.Ed.Marn, 1989 RIESGOALTO