Manual Prácticas Bioquímica

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Laboratorios bioquimica V semestre universidad de cordoba, para la formacion de los estudiantes de bacteriologia en enfasis biomedico.

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  • 1 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

    MANUAL PRCTICAS BIOQUMICAPRESTACIN DE SERVICIOS

    UNIVERSIDAD DE CRDOBAFACULTAD DE CIENCIAS BSICASDEPARTAMENTO DE QUMICA

    MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

    DEPARTAMENTO DE QUMICA

    MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA PRESTACIN DE SERVICIOS

    UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS BSICAS DEPARTAMENTO DE QUMICA

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    MANUAL PRCTICAS

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    Contenido

    PRACTICA N 1 PROPIEDADES FSICAS Y QUMICAS DE LOS AMINOCIDOS ......... 3

    PRACTICA N 2 ALGUNAS PROPIEDADES DE LAS PROTENAS ................................. 6

    PRACTICA N 3 CATLISIS ENZIMTICA E INORGNICA ............................................ 9

    PRACTICA N 4 PRUEBAS CUALITATIVAS PARA CARBOHIDRATOS ........................ 12

    PRACTICA N 5 ALGUNAS PROPIEDADES FSICAS Y QUMICAS DE LOS LPIDOS . 16

    PRACTICA N 6 VITAMINAS Y MINERALES .................................................................. 20

    PRACTICA N 7 IDENTIFICACIN DE CUERPOS CETNICOS EN ORINA ................. 22

    PRACTICA N 8 PRODUCCIN DE PIRUVATO DURANTE LA FERMENTACIN ..... 24

    PRACTICA N 9 TRANSPORTE DE CARGAS EN SISTEMAS BIOLGICOS ................ 26

    PRACTICA N 10 FORMACIN DE CIDO LCTICO EN LA GLUCLISIS .................. 28

    PRACTICA N 11 OBTENCIN DE PREPARADOS ENZIMTICOS Y COMPROBACIN DE SU ACTIVIDAD EN LA GLUCLISIS. ....................................................................... 30

    PRACTICA N 12 DETERMINACIN DE GLUCGENO EN HGADO Y CORAZN ..... 33

    PRACTICA N 13 CUANTIFICACIN DE LA RESPIRACIN POR EL MTODO COLORIMTRICO. ......................................................................................................... 35

    PRACTICA N 14 EXTRACCIN Y RECONOCIMIENTO DE COLESTEROL DE LA YEMA DE HUEVO ........................................................................................................... 37

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    3 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

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    LABORATORIO DE BIOQUMICA

    PRACTICA N 1

    PROPIEDADES FSICAS Y QUMICAS DE LOS AMINOCIDOS

    OBJETIVOS

    Observar algunas propiedades fsicas de los aminocidos. Reconocer la presencia de aminocidos por la reaccin de estos con la

    Ninhidrina

    Identificar algunos grupos funcionales presentes en aminocidos especficos mediante la formacin de productos coloreados.

    TEORA RELACIONADA

    Las clulas vivas producen macromolculas que son biopolmeros constituidos por unidades monomricas o bases estructurales. Para las protenas, estas unidades son los L aminocidos. Las propiedades biolgicas de estas macromolculas estn determinadas en gran parte por las clases de aminocidos presentes, el orden en el que estn dispuestos en una cadena de polipptidos y por lo tanto la relacin espacial de un aminocido con otro. Los aminocidos contienen grupos funcionales amino y carboxilo. En un aminocido, ambos estn unidos al mismo tomo () de carbono. De los aminocidos presentes en la naturaleza, slo 20 de ellos aparecen en las protenas de todas las formas de vida, vegetal, animal o microbiana. Los aminocidos intervienen en la transmisin de impulsos en el sistema nervioso (Glicina y acido glutmico). Los aminocidos esenciales deben ser suministrados en la alimentacin, ya que nuestros cuerpos no pueden sintetizarlos en cantidades adecuadas para respaldar el crecimiento (nios) o para conservar la salud (adultos). Reaccin de la Ninhidrina: Es un agente oxidante poderoso, reacciona con todos los aminocidos a un pH entre 4 y 8 para dar un compuesto de color prpura. Esta reaccin se efecta tambin con los aminocidos prolina e hidroxiprolina, pero en este caso se obtiene un color amarillo en vez de prpura.

    Reaccin Xantoproteica: Los aminocidos que contienen un ncleo aromtico forman nitroderivados de color amarillo cuando se calientan con cido ntrico concentrado. Las sales de estos derivados son de color rojo naranja. Reaccin de Millon: Los compuestos que contienen el radical hidroxibenceno reaccionan con reactivo de milln formando compuestos rojos. Los nicos aminocidos fenlicos son la Tirosina y sus derivados y solamente ellos dan una reaccin positiva. El reactivo original de Millon es una solucin de nitrato mercrico en cido ntrico 50% v/v.

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    Reaccin del Acido Glioxlico para Triptfano: Grupo indlico del triptfano reacciona con cido glioxlico en presencia del cido sulfrico concentrado dando un color prpura.

    Reaccin de Sakaguchi: El nico aminocido que contiene grupos guanidinos es la Arginina; esta reacciona con naftol y un agente oxidante tal como agua de bromo o hipoclorito en un medio alcalino, dando un color rojo.

    MATERIALES Y REACTIVOS

    10 Tubos de ensayo

    1 Gradilla 1 Pinza para tubos de ensayo. 3 Pipetas de 1, 5 y 10 mL

    1 Gotero. 1 Estufa

    1 Beaker de 500mls

    Papel indicador

    Soluciones al 0.5% de aminocidos: Glicina, Tirosina, Triptfano, Fenilalanina, Arginina.

    Ninhidrina: Disolucin al 0.2% en alcohol o acetona.

    HNO3 al 10% NaOH al 20% o amoniaco. Fenol, disolucin al 0.1%

    Reactivo de Milln.

    Agua de bromo

    - Naftol: 0.2%

    Nitrito de sodio.

    Acido glioxlico Acido sulfrico.

    PROCEDIMIENTO

    1. Examen Fsico: Anote el estado fsico de la sustancia (Aminocidos): Slido, lquido, polvo, solucin, cristal. Si es homognea.

    Color: Ver si es uniforme o si cambia durante el proceso. Olor: Percibir si se trata de olor caracterstico o relacionado con un grupo qumico. 2. Reaccin de la Ninhidrina: Coloque 1 ml de solucin de aminocido (glicina, tirosina y triptfano) en un tubo de ensayo y ajuste el pH cerca de la neutralidad (ya esta ajustado); agregue 5 gotas de solucin de ninhidrina, deje hervir por 3 minutos y anote sus resultados.

    3. Reaccin Xantoproteica: Adicione 1 ml de solucin de cido ntrico a aproximadamente 1 ml de solucin de aminocido (glicina, tirosina, Triptfano, y fenilalanina), calentar por 3min, deje enfriar y observe el cambio de color. Agregue suficiente NaOH al 20% hasta que la solucin sea fuertemente alcalina. El cambio de

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    coloracin de amarillo en solucin cida a naranja brillante en solucin lcali constituye un resultado positivo. 4. Reaccin de Millon: A 0.5 ml de la muestra (Glicina, tirosina, y fenilalanina) adicione 3 gotas del reactivo de millon y caliente en un bao de agua hirviendo por 10 minutos. Deje enfriar a temperatura ambiente agregue 5 gotas de solucin de nitrito de sodio, la aparicin de un color rojo ladrillo indica un resultado positivo. 5. Reaccin del cido Glioxlico para el Triptfano: A 1 ml de la muestra (glicina, tirosina y Triptfano agregue 1 ml de cido glioxlico,. Observe bien el color inicial en cada caso.

    Agregue 1 ml de acido sulfrico por las paredes del tubo, la formacin de un anillo color prpura indica que la reaccin es positiva. 6. Reaccin de Sakaguchi: Mezcle 0.5 ml de lcali fuerte con 1.5 ml de solucin de aminocido (glicina y arginina) y agregue dos gotas de naftol. Mezcle fuertemente y agregue cuatro a cinco gotas de agua de bromo. Note el color formado.

    PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

    1- Escriba la reaccin para cada prueba realizada. 2- De acuerdo con las pruebas realizadas en esta prctica proponga una clasificacin para los aminocidos. 3- Identifique los grupos qumicos que caracterizan a los aminocidos. 4- Explique como se encuentran estructuralmente los aminocidos en el plasma sanguneo o lquido intracelular cuyo pH es de 7.4 y 7.1 respectivamente. 5- Cuales son las explicaciones prcticas de las pruebas realizadas.

    BIBLIOGRAFA

    PLUMER, D.T. Introduccin a la bioqumica prctica. Mxico. MaGraw- Hill Latinoamericana, S.A.

    CONN, E y Stumpf, P.K. Bioqumica F.

    LOPEZ, E y ANZOLA, C. Guas de laboratorio de Bioqumica. Facultad de ciencias. Universidad Nacional de Colombia sede Bogota.

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    LABORATORIO DE BIOQUMICA

    PRACTICA N 2

    ALGUNAS PROPIEDADES DE LAS PROTENAS OBJETIVOS

    Comprobar la desnaturalizacin y coagulacin de protenas.. Realizar ensayos de precipitacin de protenas al mezclarlas con sales de metales

    pesados, o con reactivos cidicos. Verificar la importancia de la reaccin de Biuret para el reconocimiento de

    protenas.

    TEORA RELACIONADA

    Las protenas son un grupo de biomolculas caracterizados por su gran variedad estructural y enorme diversidad de funciones biolgicas. Las protenas de cada ser vivo, animal o vegetal son especficas ya que estn codificadas por su genoma. A pesar de que desempean la misma funcin, las protenas presentan ligeras variaciones estructurales en las diferentes especies. Qumicamente pueden diferenciarse en protenas simples, constituidas nicamente por aminocidos y protenas complejas que contienen material adicional como carbohidratos, lpidos o cidos nucleicos.

    Las protenas pueden variar sus caractersticas de solubilidad mediante alteraciones en el medio acuoso en el que se hallen disueltas. Cuando una protena se disuelve en agua, las fuerzas hidroflicas, electrostticas y los puentes de hidrgeno, participan positivamente, aportando un mayor grado de solubilidad entre ms efectivas sean estas interacciones. Sin embargo factores fsicos como el calor, radiaciones, variaciones en los valores de pH y la presencia de solventes que afecten estas interacciones, pueden producir serias alteraciones en la solubilidad. Algunas veces pueden ocurrir cambios en la estructura nativa de la protena y se considera que en estas condiciones la protena se ha desnaturalizado. El fenmeno fsico observado en este caso, es la formacin de un cogulo o proceso de coagulacin.

    MATERIALES Y REACTIVOS

    10 tubos de ensayo

    1 Pinza para tubo de ensayo 1 Estufa o calentador

    1 Beaker de 400 ml

    1 Gradilla 1 termmetro

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    Reactivo de Biuret

    cido Pcrico saturado

    cido Actico 10%

    Buffer pH 4.7

    Soluciones: Albmina, casena y gelatina

    Acido tnico al 10%

    Sulfato cprico al 2% Ferrocianuro de potasio acuoso. Acetato de plomo al 2 %

    Cloruro de mercurio al 2%

    PROCEDIMIENTO:

    1. Preparacin de soluciones de protenas. Solucin de albmina:

    Se prepara mezclando lentamente una clara de huevo con aproximadamente 100ml de agua, la mezcla se filtra sobre gasa para eliminar la mayor parte de la espuma. Casena: se toma 1 g de casena y se le agrega lentamente 100 ml de NaOH 0.5 M. Con agitacin continua, reposar la mezcla durante 5 min y de haber espuma se filtra sobre gasa. Gelatina: se disuelve 1 g de gelatina en 100ml de solucin salina al 1 %.

    2. Determinacin del punto de coagulacin de una protena y demostracin de la desnaturalizacin:

    Rotule 2 tubos de ensayo grandes con las letras A y B, agregue a cada uno 4.5 ml de solucin de albmina de huevo. Agregue 0.5 ml de Buffer pH 4.7 al tubo A.

    Coloque los tubos en un bao de Mara y aumente la temperatura en forma gradual anotando cualquier cambio en los tubos y la temperatura a que ocurre. Contine calentando hasta la ebullicin del agua y prolongue el calentamiento por 5 minutos mas, separe el tubo A, djelo enfriar y agregue 4 ml de buffer pH 4.7, llvelos al bao de agua caliente hasta ebullicin. Determine si el precipitado que se ha formado, redisuelve despus de enfriar o diluir con agua. El punto isoelctrico de la albmina de huevo esta alrededor de pH 4.7; aqu la coagulacin por calentamiento ocurre mas rpidamente a pH diferente; la desnaturalizacin ocurre primero despus de calentar; entonces se presenta floculacin, cuando el punto isoelectrico se restablece, el calentamiento da origen a que la floculacin se transforme en coagulacin. 3. Precipitacin de Protenas a) Precipitacin con sales metlicas: En una serie de tres tubos se adiciona en cada uno 1 ml de solucin ALBUMINA de huevo; adicione a uno 4 gotas de solucin de cloruro mercrico al 2%, al segundo 4 gotas de una solucin de acetato de plomo al 2%, mas 3 gotas de acido actico y al tercero 4 gotas de sulfato cprico al 2%. , obsrvese cuidadosamente la formacin o no de precipitados. Explique. Repetir el procedimiento con solucin de casena y luego por solucin de gelatina. b) Precipitacin con reactivos acdicos: En tres tubos de ensayo coloque en cada uno 1.5 ml de solucin de casena. Adale al primero 3 gotas de una solucin acuosa saturada de cido pcrico, al segundo igual cantidad de una solucin de cido tnico al

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    10% y al tercero 3 gotas de una solucin acuosa de ferrocianuro de potasio y 1 gota de cido actico al 10%. Observe lo que ocurre. Repetir el procedimiento remplazando la solucin de casena por solucin de albmina. 4. Reacciones colorida: Las protenas pueden formar compuestos coloreados al reaccionar con determinados reactivos, entre los que se encuentra el reactivo de Biuret. Reaccin de Biuret: Es caracterstica del enlace peptdico. A 1.5 ml de la solucin proteica, aada 1 ml de reactivo de Biuret. Deje reposar la mezcla y observe lo que ocurre.

    PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

    1. Consultar en forma clara y breve en que consiste la desnaturalizacin de las protenas. 2. Explique que sucede cuando el cabello se somete a los tintes, de ris y alisado, este proceso es reversible o irreversible. 3. Explique por que las pezuas, los cuernos, las uas, el cabello y las plumas no se disuelven con el agua.. 4. Consultar de qu depende la solubilidad de las protenas. 5. Explique cuando es positiva la reaccin de Biuret, escriba la reaccin 6. Consulte otras tcnicas utilizadas para la cuantificacin de protenas.

    BIBLIOGRAFA:

    PLUMER, D.T. Introduccin a la bioqumica prctica. Mxico. MaGraw- Hill Latinoamericana, S.A.

    CONN, E. y Stumpf, P.K. Bioqumica F.

    LPEZ, E y ANZOLA, C. Guas de laboratorio de Bioqumica. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional sede Bogot.

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    PRACTICA N 3

    CATLISIS ENZIMTICA E INORGNICA

    OBJETIVOS

    Comparar la accin cataltica de la enzima catalasa, con la de un catalizador inorgnico como el bixido de manganeso (MnO2) al descomponer en perxido de hidrgeno (H2O2) a temperatura ambiente.

    Observar el efecto de la temperatura sobre la accin cataltica de una enzima y comparar el mismo efecto de temperatura sobre un catalizador inorgnico.

    Observar la accin de un inhibidor sobre la actividad cataltica de una enzima.

    TEORA RELACIONADA

    Las enzimas son catalizadores biolgicos de estructura proteica y producidos por los mismos organismos que las utilizan para realizar sus propios procesos metablicos. La accin cataltica de una enzima est sometida a la influencia de factores fsicos como son, el calor, las radiaciones o de factores qumicos como cambios en el pH y en la concentracin de la enzima, sustrato y la presencia de inhibidores. En cambio los catalizadores inorgnicos, en algunos casos, no son afectados por factores fsicos como el calor, por tanto, pueden catalizar una determinada reaccin pese a cambios en la temperatura.

    La reaccin que se presenta en la experiencia a realizar se puede describir en la siguiente forma:

    H2O2 H2O + O2Catalasa

    H2O2 H2O + O2MnO2

    MATERIALES Y REACTIVOS

    6 tubos de ensayo

    2 pipetas de 5 y 10 ml

    Beaker de 400ml

    Calentador

    Pinza para tubos de ensayo Gotero Agua destilada Probeta de 100ml

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    Esptula Mortero con mano

    Gradilla

    Perxido de Hidrgeno (H2O2) al 3% Bixido de Manganeso (MnO2) Cianuro de Sodio (NaCN) Papas como fuente de catalasa (traer)

    Sangre como fuente de catalasa (extraerse) Hielo (traer de la casa) Gasa (traer) Cuchilla (traer de la casa)

    PARTE EXPERIMENTAL

    1. Rotular tres tubos de ensayo y agregar a cada uno las siguientes sustancias: Tubo N1 1ml de sangre al 10%

    Tubo N2: 1 ml de extracto de papa. Tubo N3: Una pequea porcin de MnO2

    2. Agregar a cada uno de los tubos 2ml de H2O2 al 3%. Observar la intensidad de la reaccin por el burbujeo del oxgeno y la liberacin de calor. Compare el nivel alcanzado por las burbujas en cada uno de los tubos y registre en orden creciente la actividad cataltica con base en este parmetro.

    3. Prepare 3 tubos de acuerdo al numeral 1 y Colquelos en un bao con agua a ebullicin durante diez minutos, retirarlos y dejar en reposo dentro de un bao de agua a temperatura ambiente durante 10 min. Adicionar a cada tubo 2ml de H2O2 al 3%. Compare el nivel alcanzado por las burbujas en cada uno de los tubos y registre en orden creciente la actividad cataltica con base a este parmetro.

    4. Prepare nuevamente 3 tubos de acuerdo al numeral 1 y colquelos en un bao de hielo durante 10 min. Adicionar a cada tubo 2 ml de H2O2 al 3%. Compare el nivel alcanzado por las burbujas en cada uno de los tubos y registre en orden creciente la actividad cataltica con base en este parmetro. 5. Prepare nuevamente 3 tubos de acuerdo al numeral 1, adicione a cada tubo uno 6 gotas de NaCN y dejar en reposo durante 5 min, luego adicione 2ml de H2O2 al 3% a cada tubo. Compare el nivel alcanzado por las burbujas en cada uno de los tubos y registre en orden creciente la actividad cataltica con base en este parmetro.

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    11 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

    PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

    1. Explique por qu el captopril y el enalopril son ejemplos de inhibidores competitivos de la enzima conversora de la angiotensina. 2. Las granadas son fabricadas por la industria militar con un dispositivo especial de seguridad para que no exploten en el sitio donde son fabricadas, si no durante el combate, Qu tipo de enzimas son fabricadas por ciertos rganos que tienen un comportamiento similar al de las granadas? De ejemplos. 3. Por qu carece de importancia la lipasa gstrica en los procesos digestivos del estmago de los adultos y en cambio es importante en el estmago infantil?

    4. Cul es la importancia mdica de las enzimas? De por lo menos un ejemplo concreto. 5. Defina que son: Zimgenos, Isozimas, Inhibidores acompetitivos. 6. Qu diferencias hay entre inhibidores orgnicos e inorgnicos? 7. Qu funcin cumplen las vitaminas hidrosolubles en las reacciones catalizadas por enzimas?.

    8. Explique como se da el proceso de regulacin de la actividad enzimtica en el organismo?.

    BIBLIOGRAFA:

    PLUMER, D.T. Introduccin a la bioqumica prctica. Mexico. MaGraw- Hill Latinoamericana, S.A. CONN, E y Stumpf, P.K. Bioqumica F. LOPEZ, E y ANZOLA, C. Guas de laboratorio de Bioqumica. Facultad de ciencias. Universidad Nacional de Colombia sede Bogota.

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    12 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

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    LABORATORIO DE BIOQUMICA

    PRACTICA N 4

    PRUEBAS CUALITATIVAS PARA CARBOHIDRATOS

    OBJETIVOS. Reconocer la presencia de carbohidratos en una muestra problema mediante la

    prueba de molish. Diferenciar carbohidratos reductores de no reductores por su comportamiento

    frente al reactivo de Benedict. Realizar ensayos cualitativos para el reconocimiento de carbohidratos especficos.

    TEORA RELACIONADA

    PRUEBA DE MOLISH: El cido sulfrico concentrado hidroliza los enlaces glicosdicos para dar monosacridos que pueden ser luego deshidratados dando furfural y sus derivados. Estos productos se combinan con -naftol sulfonato, originando un complejo prpura. Esta reaccin es general para los carbohidratos pero algunos otros compuestos orgnicos dan tambin furfural con cido sulfrico concentrado. PRUEBA DE BENEDICT: Es una modificacin de la prueba de felhing, introducida por Benedict. En ella se usa nicamente una solucin, lo cual lo hace mucho ms simple con la ventaja adicional de que el reactivo es ms estable que el de felhing. Esta prueba solo la dan los azucares reductores.

    PRUEBA DE BARFOED: reactivo de Barfoed es dbilmente cido y solamente puede ser reducido por monosacridos. Si se deja hervir por largo tiempo existe la posibilidad de hidrolizar los disacridos dando as reacciones falsamente positivas. El precipitado de oxido cuproso es menos denso que en los mtodos previos y se recomienda dejar el tubo en reposo hasta que el precipitado sedimente. PRUEBA BIAL PARA PENTOSAS. Cuando se calientan las pentosas en cido clorhdrico concentrado se forma furfural que se condensa con orcinol en presencia de iones frricos para dar un color verde azuloso.

    PRUEBA DE SELLIWANOFF. Las cetosas deshidratan ms rpidamente que las aldosas dando derivados del furfural que se condensan con resorcinol para formar un complejo rosado; por lo tanto debe evitarse un calentamiento prolongado de la muestra que se est estudiando.

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    13 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

    PRUEBA PARA SACAROSA. La sacarosa es el nico disacrido comn no reductor y por lo tanto no reduce las soluciones alcalinas de cobre. Esta es hidrolizada en solucin cida y luego se ensayan la glucosa y la fructosa resultante.

    PRUEBA PARA POLISACRIDOS. Los polisacridos contienen slo un grupo reductor por varios cientos o ms residuos, as que en la prctica, no son reductores. La hidrlisis cida libera los monosacridos constituyentes que luego son ensayados.

    MATERIALES Y REACTIVOS

    Estufa o calentador

    Pipetas de 5 y de 10ml

    Beakers de 100 y 400ml

    10 tubos de ensayo

    Pinza para tubos de ensayo

    Gradilla

    Gotero

    Papel tornasol

    Soluciones de: glucosa, galactosa, ribosa, arabinosa, sacarosa, lactosa, fructosa, almidn, leche (traer de la casa) Solucin de yodo.

    Reactivo de Molish

    Acido sulfrico concentrado

    Reactivo de Benedict

    Reactivo de Barfoed

    Reactivo de Bial

    Reactivo de Selliwanoff

    Alcohol Amilico

    Acido clorhdrico concentrado

    Hidrxido de sodio 1M

    PROCEDIMIENTO

    Prueba de Molish: Agregue 5 gotas del reactivo de Molish a 1 ml de una muestra que contenga carbohidratos (Leche). Aada cuidadosamente por las paredes del tubo 1ml de cido sulfrico concentrado, hasta que se formen dos capas. Observe cualquier cambio de color en la interfase de los dos lquidos.

    Prueba de Benedict: Tome 3 tubos de ensayo; agregue al primero 0.5 ml de solucin de lactosa, al segundo 0.5 ml de solucin de glucosa y al tercero 0.5 ml de solucin de sacarosa. Adicione 0.5 ml del reactivo de Benedict a cada tubo y colquelos en un bao de agua hirviendo por 3 min. La formacin de un precipitado de color rojo ladrillo indica la presencia de azcar reductor.

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    14 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

    Prueba de Barfoed: Tome 3 tubos de ensayo; adicione al primero 0.5 ml de solucin de galactosa, al segundo 0.5 ml de solucin de ribosa y al tercero 0.5 ml solucin de almidn. Adicione 1 ml del reactivo de Barfoed a cada tubo, hierva por 2 min y deje reposar. La formacin de un precipitado de color rojo ladrillo indica la presencia de monosacridos.

    Prueba Bial : Tome 3 tubos de ensayo; adicione al primero 0.5ml de solucin de ribosa, al segundo 0.5ml de solucin de arabinosa y al tercero 0.5ml de solucin de almidn. Adicione 0.5 ml del reactivo de Bial a cada tubo y caliente hasta que empiece a hervir, dejar enfriar y luego agregue 1 ml de alcohol amilico y agite, la aparicin de una coloracin azul verdosa es prueba positiva es prueba positiva para pentosas. Prueba de Salliwanoff: Tome 3 tubos de ensayo; adicione al primero 0.5ml de solucin de fructosa, al segundo 0.5ml de solucin de arabinosa y al tercero 0.5ml de solucin de glucosa. Adicione 1ml del reactivo de Selliwanoff a cada tubo. Caliente durante 1 min en un bao de agua hirviendo, la aparicin de un color rojo o rosado es prueba positiva para cetosas.

    Prueba para sacarosa: A 2.5 ml de una solucin de sacarosa agregue 3 gotas de cido clorhdrico concentrado, caliente durante 5 minutos en un bao de agua hirviendo, enfri y agregue Hidrxido de Sodio 1M hasta que la solucin sea neutra o ligeramente alcalina (prueba con papel tornasol), divida la solucin hidrolizada en dos porciones y realice por separado las pruebas de Benedict y Selliwanoff.

    1. Prueba para polisacridos: Coloque 1ml de solucin de almidn, aada 1 gotas de solucin de yodo. Observe la produccin de un color azul. Caliente el tubo Qu observa? Deje enfriar y observe nuevamente, Qu ocurre? Explique sus observaciones.

    PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

    1. Escriba cada una de las reacciones en las diferentes pruebas para carbohidratos. 2. Explique los resultados de cada una de las pruebas realizadas? 3. Explique estructuralmente, por que la maltosa es un azcar reductor y por que el almidn no lo sus observaciones 4. Consulte las enfermedades producidas por el mal metabolismo de los carbohidratos. 5. Por qu la celulosa a pesar de estar formada por molculas de glucosa es insoluble en agua. 6. por que la sacarosa es un azcar no reductor?. Consulte las posibles estructuras de las muestras problemas. 7. Consulte el fundamento de otras tcnicas usadas para la determinacin de la glucosa en el laboratorio.

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    15 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

    BIBLIOGRAFA:

    PLUMER, D.T. Introduccin a la bioqumica prctica. Mexico. MaGraw- Hill Latinoamericana, S.A.

    CONN, E y Stumpf, P.K. Bioqumica F.

    LOPEZ, E y ANZOLA, C. Guas de laboratorio de Bioqumica. Facultad de ciencias. Universidad Nacional de Colombia sede Bogot.

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    16 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

    UNIVERSIDAD DE CRDOBA

    LABORATORIO DE BIOQUMICA

    PRACTICA N 5

    ALGUNAS PROPIEDADES FSICAS Y QUMICAS DE LOS LPIDOS

    OBJETIVOS:

    Determinar la solubilidad de los lpidos en solventes orgnicos.

    Realizar la reaccin de saponificacin y determinar algunas propiedades de los jabones.

    Comparar el grado de instauracin de algunos lpidos.

    TEORA RELACIONADA

    Los lpidos, cuyo nombre deriva del griego lipos: (grasa). Son molculas de estructura variada cuya propiedad fundamental que ha permitido su aislamiento y caracterizacin es la de ser insolubles en agua y solubles en disolventes orgnicos tales como el benceno, cloroformo, ter, etc. Constituyen una excepcin a esta regla las esfingomielinas que no son solubles en ter y los fosfolpidos que no son solubles en acetona. Todos los mtodos de obtencin de lpidos utilizan en gran medida estos criterios de solubilidad. Los lpidos ms comunes y abundantes en los alimentos de origen vegetal y animal son los aceites y las grasas, los cuales consumidos en la dieta y conjuntamente con los sintetizados endgenamente tienen mltiples funciones en el organismo:

    Funcin energtica o de reserva: Las grasas neutras (Triacilgliceroles) se almacenan en los adipositos y suministran caloras fcilmente utilizables en perodos de escasez. El panculo adiposo subcutneo es as mismo un eficaz protector contra el fro externo.

    Funciones Estructurales: Todas las membranas biolgicas estn formadas por fosfolpidos, glicolpidos y algunas veces esteroides estructurados en bicapas.

    Funciones catalticas: Algunos lpidos actan en pequeas cantidades como activadores o reguladores del metabolismo; por ejemplo, las vitaminas liposolubles, las hormonas esteroideas o las prostaglandinas.

    MATERIALES Y REACTIVOS

    10 tubos de ensayo

    2 gradillas Pipetas de 5 y 10 ml

    Calentador

    Capsula de porcelana 1 vaso de 250 ml

    Pinza para tubo de ensayo

    Pinza para crisol

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    17 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

    Esptula Gotero

    Escamas de jabn (traer de la casa) Aceite vegetal (traer de la casa) Etanol al 95%

    ter etlico

    Cloroformo Acetona

    Benceno

    Cloruro de calcio (50g/L)

    Cloruro de magnesio (50g/L) Acetato de Plomo (50 g/L) Cloruro de sodio Solucin de yodo Acido sulfrico concentrado

    Hidrxido de sodio al 10%

    Acido oleico

    Acido esterico.

    PROCEDIMIENTO

    1. Solubilidad

    Numere 7 tubos de ensayo y coloque en cada uno 2 ml de aceite vegetal, luego agregue a cada tubo de manera diferente, 1 ml de cada una de las siguientes sustancias: Agua destilada, etanol, etanol caliente, benceno, cloroformo, ter etlico y acetona. Agite cada tubo. Deje en la gradilla por 2 min y observe los resultados.

    a. Cuales son los mejores disolventes para las grasas?

    b. Cuales no disuelven las grasas?

    c. Como explican ustedes los resultados?

    2. Emulsificacin

    En dos tubos de ensayo coloque 2 ml de aceite vegetal. Aada a cada uno 2 ml de agua destilada. A una de los tubos agregue algunas escamas de jabn. Agite bien ambos tubos. Observe lo que ocurre.

    a. Cmo se denomina la mezcla formada? b. Cmo esta constituida dicha mezcla? Deje los tubos en reposo en la gradilla y

    obsrvelos varias veces durante quince minutos.

    c. Cmo es la estabilidad de las mezclas en los dos tubos? d. Explique los resultados?

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    18 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

    3. Saponificacin

    En una capsula de porcelana coloque unos 20 ml de agua y somtalos a ebullicin (mantenga el volumen constante). Cuando estn hirviendo aada 1 ml de cido oleico. Agregue ahora cuidadosamente y gota a agota una solucin de NaOH al 10%, hasta que el medio sea claro. Tenga cuidado de no aadir un exceso de lcali.

    a. En que consiste la solucin formada? b. Escriba la reaccin qumica que ocurre?

    Numere ahora cinco tubos de ensayo y coloque en cada uno dos ml de la solucin anterior realizando las siguientes pruebas: Tubo#1. sature la solucin con NaCl.

    Tubo#2. Agregue cinco gotas de cido sulfrico concentrado.

    Tubo#3. Agregue cinco gotas de solucin de cloruro de calcio. Tubo#4. Agregue cinco gotas de solucin de cloruro de magnesio. Tubo#5: Agregue cinco gotas de solucin de acetato de plomo.

    Observe y anote los resultados. Explique lo que ocurre en cada caso. Explique las reacciones qumicas correspondientes.

    4. Insaturacin.

    Tome 3 tubos de ensayo y agregue; 1ml de aceite vegetal al primero, 1ml de acido oleico al segundo y una pequea cantidad de acido esterico al tercero. Adicione a cada tubo 2 ml de cloroformo y agite bien, deje 2 ml de cloroformo en otro tubo como control. Agregue solucin de yodo gota agota a cada uno de los 4 tubos, agitando despus de cada adicin. La solucin de yodo decolora si hay cidos grasos insaturados. Continu agregando (mximo 15 gotas), hasta que el color del yodo sea estable.

    a. Cuantas gotas de solucin de yodo se necesitaron en cada tubo para que el color permaneciera estable?

    b. Explique los resultados obtenidos? c. Escriba la reaccin qumica general de lo ocurrido.

    d. Consultar teora relacionada de lpidos.

    PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

    1. Qu tipo de compuesto qumico es el jabn? 2. Qu diferencia hay entre jabones y detergentes sintticos? 3. Que producto se prefiere generalmente en el trabajo de lavandera domestica, un

    detergente sinttico o un jabn por qu?

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    19 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

    4. Explique con sus propias palabras y por medio de un dibujo como un detergente puede desprender las manchas de aceite y grasa de las telas?

    5. Que son detergentes biodegradables y no degradables? 6. Explique estructuralmente y con sus propias palabras por que los aceites vegetales son

    lquidos a temperatura ambiente y las grasas son slidas? 7. Cules son los cidos grasos presentes en la mantequilla, margarina, y aceites

    vegetales? 8. Explique qu relacin hay entre los cidos grasos omega 3 y la enfermedad cardiaca?

    9. Cul es el nombre del esteroide que se presenta como un detergente en el cuerpo humano?

    BIBLIOGRAFA

    PLUMER, D.T. Introduccin a la bioqumica prctica. Mexico. MaGraw- Hill Latinoamericana, S.A. CONN, E y Stumpf, P.K. Bioqumica F. LOPEZ, E y ANZOLA, C. Guas de laboratorio de Bioqumica. Facultad de ciencias. Universidad Nacional de Colombia sede Bogota

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    LABORATORIO BIOQUMICA

    PRACTICA N 6

    VITAMINAS Y MINERALES

    OBJETIVOS: Separar algunos constituyentes de la leche Identificar la presencia de vitaminas y minerales en la leche Reconocer la vitamina A presente en la mantequilla.

    TEORA RELACIONADA

    Algunas enzimas requieren para su funcin la presencia de sustancias no proteicas que colaboran en la catlisis. Estas sustancias se llaman en general cofactores. Los cofactores de naturaleza orgnica se suelen denominar coenzimas. Hay coenzimas que no pueden ser sintetizadas integralmente en el organismo, sino que algunos de sus componentes o precursores debe ser incorporado a partir de la dieta. Entre los precursores exgenos necesarios para el normal desarrollo, crecimiento y reproduccin de una gran variedad de seres vivos se encuentra un grupo de biomolculas orgnicas llamadas vitaminas, adems de otras sustancias de carcter inorgnico frecuentemente conocidas como minerales.

    MATERIALES Y REACTIVOS Vaso de precipitados de 400ml Probeta de 50ml Erlenmeyer de 100ml Pipetas de 5 y 10ml Agitador de vidrio Tubos de ensayo (5)

    Gradilla Embudo de vidrio Esptula Vitamina A (traer) Leche (traer)

    Acido actico al 10% Ferrocianuro de potasio al 1% KCL NaOH al 10% Alcohol isobutilico

    Oxalato de amonio al 4% Acido molibdico (SOLUCIN) Acido 1,2,4 aminonaftolsulfonico Cloroformo

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    21 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

    PROCEDIMIENTO

    1. PRECIPITACIN DE LA CASENA

    En un vaso de precipitado de 400ml; agregar 50ml de leche y 50ml de agua destilada, aadir con una pipeta gota a gota y con agitacin constante acido actico al 10% hasta la formacin de un precipitado floclenlo de casena. Dejar decantar y filtrar sobre gasa; descartar la casena que no es de inters en la presente practicay conservar el filtrado para las posteriores pruebas cualitativas de vitamina B1( tiamina) y minerales.

    2. VITAMINA B1. Vierta 2.5ml de filtrado en un tubo de centrifuga; aada una pequea cantidad de KCl, y 0.5ml de ferrocianuro de potasio al 1% y 1ml de NaOH al 10%, mezcle y disuelva totalmente el KCl. Agregar 2.5ml de alcohol isobutilico, agitar cuidadosamente por 2 min y centrifugar por 5 min a 2000 rpm. La formacin de precipitado indica la presencia de vitamina B1

    3. CALCIO

    A 0.5 ml de filtrado adicionar unas gotas de solucin de oxalato de amonio al 4%. Observar el precipitado que se forma.( dejar reposar 10min)

    4. FOSFATOS

    A 0.5 ml de filtrado adicionar 0.5ml de acido molibdico y 0.5ml de acido 1, 2, 4, aminonaftolsulfonico. Observe la coloracin obtenida.

    5. VITAMINA A

    En un tubo de ensayo; disolver una capsula de vitamina A de 100U, luego se disuelve en 1ml de cloroformo y adicionar 5 gotas del reactivo de Carr-Price. En presencia de vitamina A, se produce un intenso color azul que desaparece al poco tiempo.

    PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

    1. Cual es el fundamento qumico de los procedimientos desarrollados en la prctica?

    2. Que importancia presenta la vitamina a, la tiamina, el calcio y los fosfatos en mamferos?

    BIBLIOGRAFA:

    PLUMER, D.T. Introduccin a la bioqumica prctica. Mexico. MaGraw- Hill Latinoamericana, S.A. CONN, E y Stumpf, P.K. Bioqumica F. LOPEZ, E y ANZOLA, C. Guas de laboratorio de Bioqumica. Facultad de ciencias. Universidad Nacional de Colombia sede Bogot

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    22 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

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    LABORATORIO DE BIOQUMICA

    PRACTICA N 7

    IDENTIFICACIN DE CUERPOS CETNICOS EN ORINA

    OBJETIVOS Determinar la presencia de cuerpos cetnicos en orina, mediante pruebas

    cualitativas para cada uno de ellos. Familiarizarse con algunos protocolos empleados en laboratorios clnicos para el

    reconocimiento de cuerpos cetnicos

    TEORA RELACIONADA

    Los cuerpos cetnicos son los cidos acetoactico, la acetona y el cido - hidrxibutirico. En la cetsis, hallamos un aumento de estas sustancias en la sangre y en la orina. Bajo buenas condiciones de salud, los cuerpos cetnicos se forman en el hgado y son completamente metabolizados, de tal manera que solo cantidades insignificantes aparecen en la orina. Por el contrario, en casos de diabetes, inanicin, vmitos con deshidratacin y despus de la exposicin al fro y/o ejercicio vigoroso, los cuerpos cetnicos pueden encontrarse en cantidades apreciables en la orina, lo cual permite su determinacin cualitativa.

    La determinacin de acetona (Mtodo de Imbert), se fundamenta en la formacin de un ferropentacianuro con el derivado isonitrado de la acetona, la determinacin de acido acetoactico (Mtodo de Gerhrdt), se basa en la aparicin de una coloracin rojo-vinosa con el cloruro frrico y en el Mtodo de Hart, el acido - hidrxibutirico es transformado en acetona, la cual se identifica mediante el reactivo de Imbert.

    MATERIALES Y REACTIVOS

    2 tubos de ensayo

    1 gradilla 2 pipetas 1 beaker de 250ml

    1 capsula de porcelana 1 pinza para crisol 1 pinza para tubos de ensayo

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    Agua destilada Orina de diabtico (traer) Acido actico glacial

    Amoniaco

    Cloruro frrico al 10% Perxido de hidrogeno al 10%

    Nitroprusiato de sodio al 5% en CH3COOH al 50%

    PROCEDIMIENTO

    DETERMINACIN DE ACETONA:

    A 5 ml de orina, agregue 0.5ml de nitroprusiato de sodio disuelto al 5% en acido actico al 50%, adicione 0.5ml de amoniaco por las paredes del tubo, la aparicin de un anillo rojo violceo en l contacto de los lquidos, es indicativo de la presencia de acetona.

    DETERMINACIN DE ACIDO ACETOACTICO.

    A 5 ml de orina de adicionan unas gotas de cloruro frrico, en presencia de acido acetoactico se produce una coloracin rojo-vinosa.

    DETERMINACIN DE ACIDO -HIDROXIBUTRICO

    En una capsula de porcelana se mezclan 10ml de agua y 10 ml de orina, se acidifica con unas 5 gotas de acido actico y se calienta en una estufa hasta reducir el volumen a la mitad. Con este calentamiento se eliminan la acetona y el acido acetoactico, al contenido de la capsula se le agregan 10ml de agua y se transfiere en partes iguales a dos tubos de ensayo, uno de estos tubos servir como control, al otro se le adiciona 1ml de peroxido de hidrogeno al 10% y se calienta en bao de Mara por 5 min, se deja enfriar y finalmente se practica la prueba de Imbert a ambos tubos.

    PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

    1. Qu otro tipo de sustancias pueden determinarse en la orina por un metabolismo anormal de lpidos.

    2. Qu es la cetsis y la Cetonuria.

    BIBLIOGRAFA

    PLUMER, D.T. Introduccin a la bioqumica prctica. Mexico. MaGraw- Hill Latinoamericana, S.A.

    CONN, E y Stumpf, P.K. Bioqumica F.

    LOPEZ, E y ANZOLA, C. Guas de laboratorio de Bioqumica. Facultad de ciencias. Universidad Nacional de Colombia sede Bogota

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    24 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

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    PRACTICA N 8

    PRODUCCIN DE PIRUVATO DURANTE LA FERMENTACIN

    OBJETIVOS

    Determinar la presencia de piruvato mediante la fermentacin de levadura. observar la produccin de piruvato, mediante cambios de color.

    TEORA RELACIONADA La produccin de piruvato durante la fermentacin se realiza por una serie de reacciones enzimticas que involucran algunos intermediarios. Este proceso se conoce como fermentacin o gluclisis. La reaccin total podra considerarse como la transferencia de dos pares de tomos de hidrgeno de la glucosa al nad+. Los metabolitos de piruvato y acetaldehdo se encuentran normalmente en bajas concentraciones, por lo tanto para comprobar su existencia es necesario impedir su transformacin. La piruvato descarboxilasa no es activa en soluciones ligeramente alcalinas, de manera que el piruvato se acumula y su presencia se demuestra con la 2,4- dinitrofenilhidracina.

    MATERIALES Y REACTIVOS Tubos de ensayo (4) Tubos de centrfuga (2) Beaker de 400mL Pipetas de 5mL (3) Balanza

    Calentador Pinzas para tubo de ensayo (2) Termmetro Esptula

    Solucin de glucosa 10% Fosfato de sodio dibsico 0,5 M

    Fosfato de potasio monobsico 0,5 M cido tricloroactico 10%

    2,4-dinitrofenilhidracina saturado en HCl 2M

    NaOH 10% Levadura (TRAER)

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    25 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

    PROCEDIMIENTO

    En dos tubos de ensayo A y B aada respectivamente 2.5 ml de solucin de glucosa al 10%. Al tubo A agregue 2.5ml de suspensin de levadura al 10% P/V en solucin de fosfato de sodio dibsico 0,5 M; al tubo B agregue 2.5ml de suspensin de levadura al 10% P/V en solucin de fosfato de potasio monobsico 0,5M. Coloque en bao de mara a 37C durante 1 hora, luego agregue a cada tubo 2 ml de A.T.A al 10%P/V, mezcle vigorosamente y centrifugue durante 10 minutos a 2500 rpm. A 1 ml del sobrenadante agregue 0.5ml de solucin saturada de 2,4- dinitrofenilhidracina en HCl 2M. Mezcle fuertemente, tome 0,5 ml de esta mezcla y agregue 1 ml de NaOH al 10% y 0,5 ml de agua. La formacin de un color rojo indica la presencia de piruvato. Repita esta prueba usando una solucin de glucosa en vez del sobrenadante.

    PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

    1. Cul es la funcin del cido tricloroactico?. 2. Qu conclusiones se podran sacar de los resultados de las muestras A yB? 3. Cul es la reaccin de la 2,4- dinitrofenilhidracina con el pirivato?. 4. Qu funcin cumple el NAD+ en la produccin del piruvato. 5. Consulte la va de la gluclisis y determine los pasos irreversibles de esta va.

    BIBLIOGRAFA

    PLUMER, D.T. Introduccin a la bioqumica prctica. Mexico. MaGraw- Hill Latinoamericana, S.A. CONN, E y Stumpf, P.K. Bioqumica F. LOPEZ, E y ANZOLA, C. Guas de laboratorio de Bioqumica. Facultad de ciencias. Universidad Nacional de Colombia sede Bogota

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    PRACTICA N 9

    TRANSPORTE DE CARGAS EN SISTEMAS BIOLGICOS

    OBJETIVOS

    Obtener un extracto de succinato deshidrogenada a partir de tejido heptico. Identificar cualitativamente la actividad del succinato deshidrogenada mediante el

    uso de un aceptor electrnico. Observar el efecto inhibitorio del malonato sobre la actividad de la enzima

    succinato deshidrogenada.

    TEORA RELACIONADA.

    Las clulas de la gran mayoras de los organismos vivos llevan a cabo un conjunto de reacciones de oxido reduccin mediante la cual la gran cantidad de energa liberada a travs de la degradacin de molculas orgnicas es almacenada en molculas de alto nivel energtico (ATP). La succinato deshidrogenada una enzima clasificada dentro del grupo de las oxidorreductasas cataliza una reaccin muy importante en el metabolismo oxidativo de la clula: la conversin del succinato en fumarato.

    La succinato deshidrogenada remueve 2H+ y 2 electrones del succinato para formar fumarato y la coenzima reducida (FADH2). La enzima esta sujeta a una poderosa inhibicin competitiva por parte de reactivos como el malonato lo cual constituye una manera de inhibir la actividad de la enzima a nivel de laboratorio. Para estudiar el transporte de cargas en la reaccin se empleara un aceptor artificial de electrones (azul de metileno), cuya decoloracin permite diferenciar la actividad enzimatica en los ensayos a realizar en la presente prctica.

    MATERIALES Y REACTIVOS.

    Vasos de precipitado de 25y 400 ml Tubos de centrifuga Mortero con maso

    Termmetro

    Pipetas de 5 ml (2) Pipeta de 1 ml (1) Gradilla para tubos de ensayo Tubos de ensayo (3)

    Buffer fosfato 0.1M pH 7.4 Succinato de sodio 0.1M

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    27 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

    Malonato de sodio 0.1M

    Azul de metileno 0.1%

    Aceite vegetal (traer) Hgado y Hielo (traer de la casa)

    PROCEDIMIENTO

    1. OBTENCIN DEL EXTRACTO ENZIMTICO

    Tomar una muestra de aproximadamente 5g de hgado heptico libre de sangre y colocarlos en un mortero con arena lavada, macere cuidadosamente hasta formar una mezcla suave adicionando poco a poco tres porciones (cada una de 5ml) de buffer fosfato0.1M Y pH 7.4. Transfiera la mezcla a un vaso de 25ml y mantngalo en un bao con hielo durante 15min, mezclando ocasionalme. Pase la mezcla a tubos de centrifuga y centrifugue a 1600rpm durante 10min. Transfiera el sobranadante a un vaso de 25ml y marquelo como extracto enzimtico, mantngalo en bao de hielo hasta su posterior uso.

    2. SEGUIMIENTO DE LA REACCIN

    Preparar una serie de 3 tubos de ensayo debidamente rotulados, adicionar a cada tubo (1,2 y 3) 0.5ml de azul de metileno al 0.1%, luego a los tubos 2 y 3 agregar 1 ml de succinato de sodio 0.1M y solo al tubo 3 agrguele 1ml de malonato de sodio 0.1M. Dejar los tubos en incubacin a 37C durante 10 min. (Manteniendo la temperatura constante). Sin retirarlos del bao, agregar 1.5ml de extracto enzimtico a cada uno de los tubos (1,2y 3), agite bien adicione 2ml de aceite vegetal a cada uno de los tubos. Al cabo de 40 min observe el color de cada tubo, tenga en cuenta que el tubo 1 es el control.

    PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

    1. Escriba la reaccin mediante la cual el succinato se transforma en fumarato. 2. Que papel desempea el aceite vegetal en el experimento. 3. Que efecto tendra un exceso de succinato sobre la reaccin. 4. Que sustancias pueden inhibir la conversin de succinato en fumarato, en adicin

    al malonato. 5. En que rutas esta metablicas esta involucrado el succinato.

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    28 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

    UNIVERSIDAD DE CRDOBA

    LABORATORIO DE BIOQUMICA

    PRACTICA N 10

    FORMACIN DE CIDO LCTICO EN LA GLUCLISIS

    OBJETIVOS

    Producir cido lctico a partir del msculo de rata. Comprobar la formacin de dicho cido mediante pruebas caractersticas.

    TEORA RELACIONADA (CONSULTAR).

    PROCEDIMIENTO

    Sacrifique una rata o curiel y extraiga los msculos de las patas. Desmenuce rpidamente con ayuda de una tijera y macere en un mortero limpio y seco manteniendo a baja temperatura. Pese dos porciones de 1 g del macerado y virtalas en dos tubos de ensayo. Uno de los tubos de ensayo se utilizar como control, agrguele inmediatamente 1 ml de A.T.A al 20%. En ambos tubos de ensayo agregue (5 ml de solucin de glucosa al 0,5 % en bicarbonato de sodio 0,5 M ).agregue 5 gotas de vaselina o aceite vegetal. Seguidamente coloque los tubos en un bao de Mara a 37 C durante 2 horas. Despus de la incubacin en el tubo de ensayo experimental se vierte 0.5 ml de la solucin de A.T.A al 20%, se agita, y los contenidos de ambos tubos se filtran aparte. Para precipitar los carbohidratos se toman de cada uno de los tubos 2.5 ml del filtrado, se les agrega 2 ml de solucin de sulfato de cobre al 20 % y 0.5g de hidrxido de calcio. Las muestras se agitan cuidadosamente y despus durante un periodo de 15 minutos, se repite la operacin alternndola con intervalos de reposo. Seguidamente se filtran. Con cuidado se toman 1 ml del filtrado y se vierten al otro tubo de ensayo, el cual se coloca en un bao de hielo y se le agrega 15 gotas de cido sulfrico. Las muestras se colocan seguidamente en un bao de agua hirviendo por 4 minutos. E inmediatamente se colocan en un bao de hielo. Una vez que se ha enfriado se agrega a cada tubo 8 gotas de una solucin alcohlica de hidroquinona al 0,2 % y se agitan. Observar ambos tubos.

    MATERIALES Y REACTIVOS

    Bistur

    Mortero con mano

    4 tubos de ensayo

    Bao Serolgico

    Pipetas de 5 y 10 mL Balanza

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    29 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

    Beaker 400 mL, 200mL

    Tabla de diseccin

    Embudo

    Papel filtro

    A.T.A 20%

    Solucin de glucosa al 0,5% en bicarbonato de Sodio al 0,5 M Vaselina

    Hidrxido de Calcio

    Hidroquinona 0,2 % cido sulfrico concentrado

    Sulfato de cobre al 20%

    ACTIVIDAD COMPLEMENTARIA.

    1. Qu funcin cumple la solucin de hidroquinona? 2. Escriba la reaccin entre la hidroquinona y el cido lctico. 3. Qu condiciones hay que tener en cuenta para la produccin de cido lctico

    segn reacciones de la gluclisis. 4. En qu tejidos es mayor la produccin de este cido. De que depende la

    produccin de dicho cido? 5. Por qu debe el ratn o rata estar en actividad el da anterior?.

    BIBLIOGRAFA

    PLUMER, D.T. Introduccin a la bioqumica prctica. Mxico. MaGraw- Hill Latinoamericana, S.A. CONN, E. y Stumpf, P.K. Bioqumica F. LPEZ, E y ANZOLA, C. Guas de laboratorio de Bioqumica. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional sede Bogot.

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    30 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

    UNIVERSIDAD DE CRDOBA

    LABORATORIO DE BIOQUMICA

    PRACTICA N 11

    OBTENCIN DE PREPARADOS ENZIMTICOS Y COMPROBACIN DE SU ACTIVIDAD EN LA GLUCLISIS.

    OBJETIVOS

    Obtener preparados de amilasa salival y - d- fructofuranosidasa. Comprobar la actividad de estas dos enzimas en diferentes muestras.

    CONSULTAR TEORA RELACIONADA.

    PROCEDIMIENTO

    1. obtencin del preparado de amilasa salival y comprobacin de su actividad.

    Se enjuaga la boca dos o tres veces con agua para eliminar los restos de comida. Se mide en una probeta 30 ml de agua destilada y con ella se enjuaga la boca por espacio de 3 a 5 min . el lquido recogido se filtra a travs de un algodn y el filtrado se utiliza para los siguientes ensayos. En dos tubos de ensayo se vierten 3 ml de solucin de almidn al 1%, en uno de ellos se agrega 3ml de agua y en el otro 3ml del preparado enzimtico y se introducen en un bao de mara a 40C por 5min. Tomando una gota de cada tubo y combinndola con una gota de lugol en una cpsula de porcelana. Repita esta operacin a los 10, 15, 20,25 y 30 min. Al tubo que contiene la enzima se le agregan 0.5ml de fehling A y 0.5ml de fehling B o en su defecto 1ml de reactivo de benedict. Coloque a calentar hasta que ebulla. Observe.

    2. obtencin del preparado de - d- fructofuranosidasa y comprobacin de su actividad.

    Se trituran 50 g de levadura de cerveza con 3 g de carbonato de calcio hasta formar una pasta homognea que se coloca en un beaker de 200ml. Se aaden 13 ml de cloroformo y se deja por 4 das a temperatura ambiente, alejado de los roedores, despus de los 4 das se filtra y al filtrado se le agrega un volumen igual de etanol, el precipitado se lava con mnimas cantidades de alcohol y ter y se seca al vacio, una solucin al 1% de esta sustancia se utiliza para el experimento. Prepare una solucin de sacarosa al 1%.

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    31 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

    En dos tubos de ensayo se vierten en cada uno 2.5 ml de la solucin de sacarosa al 1% y 2.5 ml de solucin de invertasa, en uno de ellos previamente calentado hasta ebullicin. Ambos tubos de ensayo se colocan en un bao de mara a 30C por 5 min.

    Para determinar el poder reductor se toma 0.5ml de cada tubo de ensayo y se le agregan 0.5ml de fehling A y 0.5ml de fehling B, y se calienta hasta que comience a ebullir. Observar lo que sucede.

    3. Obtencin de un preparado de peroxidasa y comprobacin de su actividad.

    Se trituran 2.5 g de papa y se trasladan para una probeta y se le agrega agua hasta completar 20 ml. Se deja en reposo durante 10 min, y se filtra. Se toman dos tubos de ensayo, en uno se vierte 1 ml de extracto enzimtico y en el otro 1 ml de agua destilada. A cada uno se le agrega 1 ml de solucin de hidroquinonoa al 0,5% y 1ml de solucin de perxido de hidrgeno al 3%.

    MATERIALES Y REACTIVOS

    Beacker de 200 y 500 mL

    Esptula Pipetas de 5 y 10 mL

    Mortero

    Capsula de porcelana (2)

    Frasco lavador

    Probeta de 50 mL

    Embudo

    Bomba de vacio

    Papel filtro

    Sacarosa Lugol Hidroquinona al 0,5% Perxido de hidrgeno al 3%

    Etanol

    Cloroformo Fehling A y B Levadura (debe traerla cada grupo de prctica 4 das antes).

    PREGUNTAS.

    1. Por qu se utiliza lugol en la determinacin de la actividad de amilasa salival. 2. Por que a medida que pasa el tiempo la coloracin de la mezcla de amilasa salival

    va cambiando. 3. Qu funcin cumple el carbonato de calcio en la actividad enzimtica de la enzima

    invertasa. 4. Con que objeto se utiliza el cloroformo en la levadura para la determinacin de la

    actividad de la enzima - d- fructofuranosidasa. 5. Cul es la reaccin que permite la formacin del color en la determinacin de la

    actividad de la peroxidasa.

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    32 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

    BIBLIOGRAFA

    PLUMER, D.T. Introduccin a la bioqumica prctica. Mxico. MaGraw- Hill Latinoamericana, S.A. CONN, E. y Stumpf, P.K. Bioqumica F. LPEZ, E y ANZOLA, C. Guas de laboratorio de Bioqumica. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional sede Bogot.

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    UNIVERSIDAD DE CRDOBA

    LABORATORIO DE BIOQUMICA

    PRACTICA N 12

    DETERMINACIN DE GLUCGENO EN HGADO Y CORAZN

    OBJETIVOS

    Determinar la presencia de glucgeno en diferentes tejidos. Calcular la cantidad de glucgeno presente en un tejido animal.

    TEORA RELACIONADA (CONSULTAR)

    PROCEDIMIENTO

    Pese 20 g de hgado o corazn y triture suavemente, pselo a un vaso de precipitado y agrguele KOH al 10% hasta cubrir y caliente en un bao de agua hirviendo durante 20 minutos, agite de vez en cuando durante el calentamiento; enfre en un bao de hielo, retire los cuerpos slidos y agregue 2 ml de sulfato de sodio saturado y mezcle fuertemente, aada 4 ml de etanol y deje en bao de hielo por 10 minutos. Observe y centrifugue por 3 minutos, descarte el sobrenadante, seque y pese. Una pequea cantidad agregue agua y caliente suavemente hasta disolver, agrguele 1 ml de HCl (1,2M), caliente durante 20 minutos y realice la prueba de Felhing.

    MATERIALES Y REACTIVOS

    Tubos de centrfuga (2)

    Balanza

    Beaker de 400 y 200 mL

    Vidrio de reloj

    Pipetas de 5 y 10mL Agitador Beaker de 300 y 100Ml

    Cuchillo

    KOH al 10 %

    Reactivo de felhing A y B

    Sulfato de sodio saturado

    Etanol al 96%

    HCl 1,2M

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    34 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

    ACTIVIDAD COMPLEMENTARIA

    1. Cul es el porcentaje de glucgeno en Hgado y corazn terico, comprelo con el calculado experimentalmente.

    2. Cul es la funcin del Hidrxido de Potasio, etanol y cido Clorhdrico en la determinacin de glucgeno.

    3. Cul es el porcentaje de error de la cantidad de glucgeno obtenida.

    BIBLIOGRAFA:

    PLUMER, D.T. Introduccin a la bioqumica prctica. Mxico. MaGraw- Hill Latinoamericana, S.A. CONN, E. y Stumpf, P.K. Bioqumica F.

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    UNIVERSIDAD DE CRDOBA

    LABORATORIO DE BIOQUMICA

    PRACTICA N 13

    CUANTIFICACIN DE LA RESPIRACIN POR EL MTODO COLORIMTRICO.

    OBJETIVOS

    Determinar la cantidad de CO2 producido por las semillas mediante la cantidad de NaOH consumida.

    Observar el fenmeno respiratorio de las semillas

    TEORA RELACIONADA

    La fase de hidratacin de las semillas viene acompaada por la dispersin de los coloides celulares e iniciacin de procesos enzimticos a velocidades crecientes, siendo una de las primeras consecuencias observables el incremento de los fenmenos respiratorios. El ATP necesario para llevar a cavo la activacin deriva, de manera preferente, del transporte electrnico respiratorio, provocado por la combustin mitocondrial de sustratos oxidables. Tales sustratos existen en el endospermo bajo forma exclusiva de polisacridos de alto peso molecular (almidn) y lpidos complejos (triglicridos).

    MATERIALES Y REACTIVOS

    2 frascos boca ancha con tapa 2 beaker de 50ml

    1 probeta de 50 ml

    2 pipetas de 5 y 10 ml Algodn Semillas (50g)

    Cloruro de Bario 1M NaOH 0,2 N

    HCl 0,2 N Fenolftaleina al 1% en etanol

    PROCEDIMIENTO

    Cada grupo coloca 25 ml de NaOH 0,2 N, en dos frascos de mayonesa de 250 ml y tapa inmediatamente, pese 5g de semilla, la cual ha estado sumergida durante una hora o ms y las coloca en saco de gasa, el cual est unido a la tapa por un cordel, de modo que la semilla no est en contacto con el NaOH, un frasco debe quedar sin semilla.

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    36 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

    A las 36 horas extraiga las semillas y tape rpido, tome de cada frasco 5 ml y le agrega 2.5 ml de BaCl2 1 M, adicione tres gotas de fenolftaleina y titule con HCL 0,2 N, hasta que desaparezca el color y anote los volmenes gastados. A los ml de titulacin del blanco reste los ml gastados en la titulacin de las semillas y multiplique por 5; obtendr as la cantidad de HCl equivalentes al CO2 desprendido por las semillas

    BIBLIOGRAFA:

    PLUMER, D.T. Introduccin a la bioqumica prctica. Mxico. MaGraw- Hill Latinoamericana, S.A. CONN, E. y Stumpf, P.K. Bioqumica F.

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    LABORATORIO DE BIOQUMICA

    PRACTICA N 14

    EXTRACCIN Y RECONOCIMIENTO DE COLESTEROL DE LA YEMA DE HUEVO

    OBJETIVOS

    Extraer colesterol de la yema del huevo, utilizando acetona como disolvente. Determinar cualitativamente la presencia de colesterol en la yema de huevo

    mediante un mtodo calorimtrico.

    TEORA RELACIONADA

    Los lpidos presentes en la yema son de naturaleza variada, destacando los triacilglicridos, el colesterol y los fosfolpidos. Mediante una extraccin fraccionada se pueden separar los menos polares, solubles en acetona (triacilglicridos y colesterol) de los ms polares (fosfolpidos), que seran solubles en disolventes como la mezcla cloroformo/metanol. Los mtodos analticos para la determinacin del colesterol se dividen en colorimtricos y enzimticos. De los primeros, el ms popular es el de Liebermann-Burchard, en el que la reaccin tiene lugar en un medio cido fuerte (cido sulfrico). La etapa inicial del proceso consiste en la protonacin del grupo hidroxilo del colesterol, seguido de su deshidratacin para formar un in carbonio 3,5-colestadieno. La oxidacin secuencial de este in carbonio allico por el sulfrico produce un compuesto cromforo, el colestahexano-c. sulfnico, que absorbe energa en la zona de la luz visible, a 410 nm.

    MATERIALES Y MATERIALES

    Vaso de precipitado 100 mL Vaso de precipitado 50 mL Pipeta de 5 mL

    Agitador de vidrio Tubos de ensayo (2)

    PROCEDIMIENTO

    1. Extraccin de colesterol de la yema de huevo.

    Cascar un huevo de gallina con precaucin y separar la clara de la yema, teniendo cuidado de no romper sta. Decantar la clara y tomar 1 g de la yema, en un vaso de 50 ml. Aadir sobre la yema 5 ml de acetona fra y agitar con la varilla de vidrio, hasta

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    38 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

    obtener una suspensin homognea. Verter el contenido en un tubo de centrfuga y centrifugar a 2000 RPM durante 10 minutos. Concluida la centrifugacin, retirar el sobrenadante con pipeta. Guardar el sobrenadante, al que llamaremos extracto acetnico A1, y reextraer el sedimento con otros 5 ml de acetona, agitando con la varilla y repitiendo la centrifugacin. El nuevo extracto obtenido se llama extracto acetnico A2.

    2. Reconocimiento de colesterol mediante la prueba de Liebermann-Burchard

    Agregar a cada tubo una cantidad adecuada del reactivo de Liebermann-Burchard. Observar los resultados. Que tubo presenta una coloracin mas intensa?

    PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

    1. Dnde ha encontrado usted ms colesterol, en la fraccin A1 o en la A2? Por qu? 2. Consultar sobre los mtodos enzimticos para la determinacin de colesterol. 3. Cules son los valores de referencia para el contenido de colesterol en sangre

    humana. 4. Qu relacin existe entre el contenido de colesterol y el riesgo de contraer

    enfermedad vascular arteriosclertica.

    Enfermedad Vascular Arteriosclertica

    BIBLIOGRAFA

    PLUMER, D.T. Introduccin a la bioqumica prctica. Mxico. MaGraw- Hill Latinoamericana, S.A. CONN, E. y Stumpf, P.K. Bioqumica F. LPEZ, E y ANZOLA, C. Guas de laboratorio de Bioqumica. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional sede Bogot.

    PRACTICA N 1 PROPIEDADES FSICAS Y QUMICAS DE LOS AMINOCIDOSPRACTICA N 2 ALGUNAS PROPIEDADES DE LAS PROTENASPRACTICA N 3 CATLISIS ENZIMTICA E INORGNICAPRACTICA N 4 PRUEBAS CUALITATIVAS PARA CARBOHIDRATOSPRACTICA N 5 ALGUNAS PROPIEDADES FSICAS Y QUMICAS DE LOS LPIDOSPRACTICA N 6 VITAMINAS Y MINERALESPRACTICA N 7 IDENTIFICACIN DE CUERPOS CETNICOS EN ORINAPRACTICA N 8 PRODUCCIN DE PIRUVATO DURANTE LA FERMENTACINPRACTICA N 9 TRANSPORTE DE CARGAS EN SISTEMAS BIOLGICOSPRACTICA N 10 FORMACIN DE CIDO LCTICO EN LA GLUCLISISPRACTICA N 11 OBTENCIN DE PREPARADOS ENZIMTICOS Y COMPROBACIN DE SU ACTIVIDAD EN LA GLUCLISISPRACTICA N 12 DETERMINACIN DE GLUCGENO EN HGADO Y CORAZNPRACTICA N 13 CUANTIFICACIN DE LA RESPIRACIN POR EL MTODO COLORIMTRICOPRACTICA N 14 EXTRACCIN Y RECONOCIMIENTO DE COLESTEROL DE LA YEMA DE HUEVO