Manual bioquímica ii_actualizado

sore

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE HIDALGO

INSTITUTO DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ÁREA ACADÉMICA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

LICENCIATURA DE INGENIERÍA EN ALIMENTOS

MANUAL DE PRÁCTICAS

Bioquímica II

ELABORÓ: Rodolfo Gómez Ramírez

SEMESTRE: 4º Octubre, 2010.

LICENCIATURA EN INGENIERÍA EN ALIMENTOSMANUAL DE PRÁCTICAS

Bioquímica II Semestre: 4º

FECHA ELABORACIÓN:

Agosto, 2011

ELABORARON:

NOMBRE FIRMA

Rodolfo Gómez Ramírez

VO. BO. ACADEMIA DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA:

NOMBRE FIRMA

Ing. Javier José Álvarez Gayosso

Dra. Martha Gayosso Canales

M. en C. Rodolfo Gómez Ramírez

Lic. Dalia Erika Islas Pérez

Dr. Guillermo Arlando López Huape

M.T.I Marco Antonio Ortiz Ruíz

Dra. Adriana Inés Rodríguez Hernández

Dra. Gabriela Sánchez Olguín

VO. BO. COORDINACIÓN DE LA LICENCIATURA EN INGENIERÍA EN ALIMENTOS:

Dr. Norberto Chavarría Hernández

FECHA DE PRÓXIMA REVISIÓN:

Junio, 2012.



ÍNDICE

Pág.

Introducción. 1

Medidas de seguridad en el Laboratorio, Taller y/o Clínicas 2

Lineamientos de uso de Laboratorios, Talleres y/o clínicas 4

Práctica No. 1: Reacciones bioquímicas de óxido-reducción 13

Práctica No. 2: Reacciones del transporte de electrones 19

Práctica No. 3: Hidrólisis bioquímica de polisacáridos 24

Práctica No. 4: Hidrólisis bioquímica de triacilglicéridos 27

INTRODUCCIÓN

En la asignatura de bioquímica II se aborda el estudio del metabolismo, la fotosíntesis,

así como de los diferentes ciclos y rutas bioquímicos involucrados. El estudio in vivo de

dichas reacciones implica procedimientos complicados que solamente se pueden llevar

a cabo en laboratorios altamente especializados. No obstante, en la actualidad se han

desarrollado procedimientos in vitro que involucran el uso de enzimas y reactivos

purificados, mediante estos procedimientos se simula lo que ocurre dentro del

organismo animal o vegetal. En este manual se describen procedimientos sencillos

pero que ilustran de manera eficaz algunas de las reacciones bioquímicas más

importantes.

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MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO, TALLER Y/O CLÍNICAS DE LA

UAEH

Normas generales para el trabajo seguro en el laboratorio

Debe familiarizarse con la ubicación y uso de los elementos de seguridad con que

cuenta el laboratorio (duchas, lava ojos, matafuegos, etc.).

Utilice siempre los elementos de protección personal (guardapolvo, guantes,

pinzas, etc.).

Como norma higiénica básica, el personal deberá lavarse las manos al entrar y

salir del laboratorio y siempre que haya habido contacto con algún producto

químico.

Portar, en todo momento las batas y ropa de trabajo abrochadas y los cabellos

recogidos, evitando colgantes o mangas anchas que pudieran engancharse en los

montajes y material del laboratorio.

Usar bata de manga larga con todos los botones abrochados, ya que esto ofrece

protección frente a salpicaduras o derrames de sustancias químicas.

No llevar pantalón corto, falda, sandalias, zapatos abiertos, es decir zonas

descubiertas de piel que queden expuestas a posibles salpicaduras.

No se debe trabajar separado de la mesa o de la repisa.

No se debe realizar trabajo en solitario en el laboratorio, especialmente fuera de

horas habituales, por la noche, o si se trata de operaciones con riesgo.

Debe estar prohibido fumar e ingerir alimentos (incluyendo gomas de mascar) o

bebidas en el laboratorio, ya que pueden contaminarse con las sustancias

químicas.

Las personas que usan lentes de contacto deberán sustituirlas por gafas de

seguridad graduadas o que permitan llevar las gafas graduadas debajo de ellas,

ya que el efecto de los productos químicos es mucho mayor si se introducen entre

el lente y la cornea.

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Mantener las mesas de trabajo limpias y sin productos, libros, cajas o accesorios

innecesarios para el trabajo que se está realizando, ya que pueden entorpecer las

prácticas y así provocar un accidente.

Circular con precaución por el laboratorio, sin interrumpir a los que están

trabajando.

Para trabajar dentro del laboratorio deben llevar gafas de seguridad normalizadas

ya que protegen a los ojos de alguna salpicadura con productos químicos.

Evitar las visitas porque distraen.

Conocer donde están las salidas de emergencia.

Conocer dónde está el equipo de seguridad como extintores, botiquín, etc.

Registrar todos los sucesos del experimento, aún los accidentes que hayan

ocurrido.

No guardar lápices afilados, objetos cortantes o punzantes en las bolsas de la

bata.

No calentar sistemas cerrados.

Está prohibido: Tener o consumir bebidas alcohólicas en el laboratorio; fumar;

correr dentro del laboratorio, salvo en casos de extrema urgencia; Provocar

alborotos y bromas.

Nunca utilice materiales, equipos y/o reactivos de los cuales desconoce su

peligrosidad.

Utilice la campana de seguridad para toda actividad que involucre el uso de

sustancias inflamables y/o de elevada toxicidad.

Nunca trabaje en una zona con ventilación deficiente.

Participe en todos los entrenamientos de seguridad

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LINEAMIENTOS DE USO DE LABORATORIOS, TALLERES Y/O CLÍNICAS DE LA UAEH

DE LOS USUARIOS (ALUMNO):

I. Respetar la Normatividad Universitaria vigente.

II. Los alumnos sólo podrán trabajar y permanecer en el laboratorio bajo la supervisión

directa del profesor, de acuerdo al Artículo 20 del Reglamento de Laboratorios. En

ningún caso el auxiliar o responsable de laboratorio, podrá suplir al maestro en su

función.

III. Para asistir a sesiones de laboratorio, es requisito indispensable presentarse con bata

reglamentaria (blanca y de manga larga), Taller bata de color y de manga larga portada

adecuadamente, manual de prácticas correspondiente y con los materiales que no son

específicos de los laboratorios

IV. La entrada al laboratorio será a la hora exacta de acuerdo a lo Programado.

V. El laboratorio no proporcionará manuales de prácticas a los usuarios, ya éstos serán

suministrados por el catedrático de la materia correspondiente.

VI. Todo usuario trabajará con el equipo de seguridad que se requiera, (bata blanca,

filipina, careta, mascarilla, cubre boca, cubre pelo, guantes de hule látex, zapato de piso,

guantes quirúrgicos, guantes industriales y/o de asbesto.

VII. El usuario tendrá cuidado de no contaminar los reactivos o tomar alguno

directamente con la mano. Existen muchos reactivos de los cuales se preparan

soluciones diluidas, que son altamente corrosivos. En este sentido, el contacto con ellos

deber ser reducido al mínimo con las manos, la nariz o la boca. Usar en todos los casos

una perilla o propipeta para auxiliarte al tomar la cantidad deseada de reactivo. Manual

de Ecología, Seguridad e Higiene.

VIII. Por ningún motivo pipeteará las soluciones con la boca, no debes “PIPETEAR”

directamente del frasco que contiene al reactivo. Con esto, se evitará que los reactivos se

contaminen y que los resultados de tu práctica (y la de los demás) se vean afectados.

Para ello, toma sólo la cantidad necesaria en un vaso de precipitados y NO

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DEVUELVAS EL RESTANTE al frasco de origen. Manual de Higiene, Seguridad y

Ecología.

Si necesitas preparar una solución de un reactivo que desprende gases (como los ácidos

o el amoniaco) HAZLO EN LA CAMPANA y no en las mesas de laboratorio. Activa los

extractores. Manual de Higiene, Seguridad y Ecología.

IX. En caso de que alguna sustancia corrosiva te caiga en la piel o en los ojos, LAVA

INMEDIATAMENTE la parte afectada al chorro del agua durante al menos 5 minutos y

AVISA A TU PROFESOR. Si el derrame fue en una gran área de la piel y

X. de la ropa, usa las regaderas que están ubicadas en el laboratorio. Manual de

Procedimientos Departamento Control del Medio Ambiente DLA-MO-7.2-01.6

XI. Cuando peses en la balanza cualquier producto químico hazlo en un pesafiltro o en

un recipiente adecuado, NUNCA en un trozo de papel. Además, procura no tirar el

producto alrededor de la balanza ya que puedes dañarla. Si esto sucede límpialo

inmediatamente con una brocha y/o con un trozo de tela limpio. Manual de Higiene,

Seguridad y Ecología.

XII. Las sustancias que se manejan comúnmente en el laboratorio son altamente

contaminantes. Como UNIVERSITARIOS tenemos gran compromiso con el cuidado del

medio ambiente y en consecuencia debemos desecharlas de manera adecuada

conforme a las indicaciones que te indique tu catedrático. NO DESECHES TUS

SOLUCIONES, RESIDUOS O PRODUCTOS DIRECTAMENTE EN LA TARJA, utiliza los

contenedores correspondientes al tipo de sustancia en particular. Manual de Higiene,

Seguridad y Ecología.

XIII. Todo frasco, bolsa, caja o contenedor, deberán ser etiquetados. Por lo tanto

cualquier sustancia con recipiente no etiquetado será desechada. Manual de

Procedimientos Departamento Control del Medio Ambiente DLA-MO-7.2-01.6

XV. Todo usuario de laboratorio o taller, debe conocer la ubicación de los extintores, las

puertas de emergencia, y la circulación del lugar en caso de emergencia.

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XVI. El usuario solicitará el equipo, herramienta, material y reactivos de acuerdo a las

especificaciones del manual de prácticas, mediante el vale de laboratorio, Formato DLA-

009, y su identificación oficial de la U.A.E.H.

XVII. Que el usuario que reciba el material sea el mismo que solicite durante el desarrollo

y el que haga entrega al final de la práctica.

XVIII. Los usuarios deberán revisar el equipo y material que se les proporcione,

verificando que esté limpio, ordenado, completo y funcionando, el cual deberá ser

devuelto en las mismas condiciones.

XIX. Al devolver el equipo y material, el usuario deberá solicitar el vale de laboratorio

Formato DLA-009 y su identificación oficial de la U.A.E.H.

XX. Cuando el material quede bajo la responsabilidad del usuario, el vale de laboratorio

Formato DLA-009 y su identificación oficial de la U.A.E.H., será retenido por el auxiliar

hasta la devolución del material.

XXI. En caso de pérdida, ruptura o desperfecto del equipo o material de laboratorio, el

usuario solicitará al auxiliar el vale de adeudo Formato DLA-010 el cual debe anotar el

nombre y núm. de cuenta de todos los integrantes del equipo y ser respaldado con su

identificación oficial de la U.A.E.H., se deberá reponer en un plazo no mayor a 15 días

hábiles., para lo cual se retendrá el vale de adeudo y su identificación oficial de la

U.A.E.H.

XXII. Si el material adeudado no es repuesto en el plazo fijado, el o los usuarios

responsables, no podrán continuar con la realización de las prácticas correspondientes.

Control de adeudo Formato DLA-011.

XXIII. En caso de no cumplir con la reposición del material en el plazo establecido, el

integrante del equipo o grupo, según sea el caso, serán dados de alta, en la aplicación

del sistema de control de adeudos en laboratorios implementado en la U.A.E.H.

XXIV. La acreditación de cada una de las prácticas que se realicen, estará sujeta a la

evaluación que aplique el catedrático.

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XXV. El usuario que realice práctica de recuperación deberá cumplir con lo estipulado en

el punto III.

XXVI. Los alumnos que por indisciplina o negligencia pongan en peligro su integridad, la

de sus compañeros, la del material o la de las instalaciones, serán sujetos a la sanción

correspondiente prevista en el Reglamento de Laboratorios Artículo 36 y 38. Por la

naturaleza de las cosas que existen en el laboratorio debes mantenerte alerta y sin

distracciones (no corras, no se permiten equipos de sonido personales). TAMPOCO SE

ACEPTAN VISITAS a las horas de laboratorio.

XXVII. El usuario que incurra en alguna falta académica será sancionado de acuerdo a la

Normatividad Universitaria vigente.

XXVIII. Queda estrictamente prohibido realizar cualquier tipo de actividad ajena al

desarrollo de las tareas propias del laboratorio.

XXIX. Todo usuario deberá entrar y salir por los accesos autorizados, en orden y

cuidando su integridad y la de sus compañeros. (Manual de Higiene, Seguridad y

Ecología, Capitulo 1).

XXX. Los usuarios deben reportar cualquier anomalía o maltrato por parte del catedrático

y del personal de laboratorio, al jefe de los mismos o en su caso a la Dirección de la

escuela.

XXXI. Al concluir la práctica, deben dejar limpia el área de trabajo, así como el

material y equipos utilizados. NO TIRES PAPELES Y/O BASURA A LAS TARJAS.

XXXII. Al concluir la licenciatura, maestría o doctorado y realicen su trámite de titulación

al solicitar su constancia de no adeudo de material, herramienta y/o equipo de

laboratorios, clínicas y talleres, se realizara una donación en especie a las, clínicas,

laboratorios y talleres correspondientes de acuerdo al Formato DLA-043, la cantidad de la

donación será entre tres y cuatro salarios mínimos vigente en el estado de Hidalgo para

ello es necesario entregar la nota y escribir en el formato el material donado,

posteriormente el documento que se extienda se entregará a la Dirección de Laboratorios

y Talleres donde se elabora y entrega la constancia de no adeudo.

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DEL USUARIO (CATEDRÁTICO/INVESTIGADOR):

I. El catedrático/investigador es Responsable del desarrollo y del cumplimiento de los

objetivos establecidos en su manual de prácticas o guías o proyecto de investigación

(tesis).

II. El catedrático/investigador que incurra en alguna falta académica será reportado a la

Dirección de la Escuela, así mismo se elaborará el Reporte de Acción (oportunidad de

mejora, acción preventiva o acción correctiva).

III. El catedrático llenará y entregará las Programaciones correspondientes según

aplique: Prácticas Formato DLA-001, lo entregara al personal de laboratorio y/o taller los

primeros días del inicio del semestre, con tres copias. Proyecto de investigación Formato

DLA-003, lo entregara al personal de laboratorio una hora antes de hacer uso del

laboratorio y/o taller.

IV. Para asistir a sesiones de laboratorio, es requisito indispensable presentarse con bata

reglamentaria (blanca y de manga larga) y equipo de seguridad.

V. La entrada al laboratorio será a la hora exacta de acuerdo a lo Programado, el

catedrático que no inicie la práctica durante los primeros 10 minutos ésta será

suspendida y tendrá que ser reprogramada.

VI. Antes de realizar cualquier sesión práctica o experimento, el catedrático deberá

informar a los alumnos las características del material y equipo a emplear, así como las

propiedades físicas, químicas y toxicas de las sustancias empleadas.

VII. El catedrático deberá exigir el uso de bata reglamentaria (blanca y de manga larga)

personalizada y portada adecuadamente, manual de prácticas correspondiente y con los

materiales que no son específicos de los laboratorios.

VIII. El catedrático deberá anotar los datos indicados en el libro de registro de prácticas

(bitácora) de acuerdo a lo estipulado. Formato DLA-013

IX. El catedrático programará en coordinación con el Responsable de laboratorios la

recuperación de prácticas. Formato DLA-035.1

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X. El catedrático es corresponsable de la reposición del material de adeudo de los

alumnos de su grupo.

XI. El catedrático tiene la responsabilidad de que los desechos químico-biológicos sean

depositados en los contenedores correspondientes. Manual de Procedimientos

Departamento Control del Medio Ambiente DLA-MO-7.2-01.6

XII. El catedrático es responsable de supervisar a los alumnos desde el inicio, durante y

al finalizar la práctica. Al inicio de esta verificar que realice la práctica programada,

solicite lo necesario y cumpla con las medidas de seguridad, durante que hagan buen

uso de los materiales, equipos y que no haya desperdicio de reactivos y al finalizar que

dejen limpia el área de trabajo, bancos en el lugar y QUE NO DEJEN PAPELES Y/O

BASURA EN LAS TARJAS.

XIII. El catedrático deberá ser el primero y último en salir de los laboratorios, (NO

ABANDONAR EL LABORATORIO HASTA QUE HAYA CONCLUIDO SU SESIÓN, NO

DEBE DE CALIFICAR EXAMENES, NO REVISAR TAREAS, NO REVISAR TRABAJOS,

NO REALIZAR ACTIVIDADES EN LAPTOPS, ETC. Recuerda que en la enseñanza

experimental es necesario valorar las actitudes y la motivación en el trabajo grupal, ya

que es en el laboratorio donde el alumno forma su actitud hacia el trabajo en equipo, lo

cual se verá reflejado en su ejercicio profesional (Valdez, 2001).

DEL AUXILIAR DE LABORATORIOS:

I. El auxiliar de laboratorio está obligado a proporcionar el equipo, material y reactivos a

los alumnos. Formato DLA-001 y Formato DLA-003

II. Auxiliar a los alumnos durante el desarrollo de la práctica, así como vigilar el buen uso

de los materiales y equipo.

III. Vigilar el cumplimiento del Reglamento y Lineamientos de uso de Laboratorios, así

como el Manual de Higiene Seguridad y Ecología.

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IV. En ausencia del Responsable del Laboratorios, puede suspender la práctica en caso

de incumplimiento del Reglamento y Lineamientos de uso del Laboratorio.

V. El auxiliar debe permanecer en su área de trabajo y realizar las actividades inherentes

a su área.

VI. Apoyará en las actividades académicas que encomiende la Dirección y el

Responsable de laboratorios de la escuela, siempre y cuando no tenga prácticas

asignadas.

VII. Registrará en los formatos de limpieza DLA-025, DLA-026, DLA-027, DLA-028, DLA-

029, DLA-030 al DLA-031, las actividades realizadas por el personal de intendencia.

VIII. En caso de pérdida, ruptura desperfecto o extravió de algún material, equipo e

infraestructura, notificará de manera inmediata al Responsable del laboratorios. Formato

DLA-017

IX. Es responsable de la custodia del material, equipo, sustancias e instalaciones, por lo

que en caso de pérdida o desperfecto de algún bien se tendrá que deslindar

responsabilidades de acuerdo con la Normatividad Universitaria.

X. Preparará previamente el material, equipo y reactivos necesarios para elaborar las

prácticas que ya están programadas correspondientes a los planes y programas de

estudio vigentes. Formato DLA-041

XI. Será responsable de mantener el material y equipo en óptimas condiciones, así como

el cubículo de laboratorio. Mantener vigente el inventario de equipo, material y reactivos.

XII. Será responsable de reportar desperfectos o fallas en los equipos de laboratorio y

solicitar el mantenimiento y/o acción necesaria para su funcionamiento al responsable de

laboratorios.

XIII. Elaborará y entregará el reporte mensual de actividades de su laboratorio al

responsable de laboratorios.

XIV Será responsable de verificar que el usuario registre en el vale de laboratorio y

adeudo los datos correctos de acuerdo a la identificación oficial de la UAEH.

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XIV. Vigilará que el catedrático se registre debidamente en la bitácora de uso al

concluir su práctica.

DEL RESPONSABLE DE LABORATORIOS:

I. Es el responsable del buen funcionamiento, mantenimiento y participar con la

Dirección en las propuestas para actualización y desarrollo de los laboratorios.

II. Supervisará permanentemente los laboratorios, asesorará a catedráticos, alumnos y

personal de los mismos con la finalidad de lograr las metas planteadas.

III. Recepcionará las programaciones Formato DLA-01, DLA-03, Servicio a Tesistas,

alumnos y Profesores. Elaborará la calendarización, horario y control de prácticas

Formato DLA-005 o DLA-006

IV. Vigilar el cumplimiento del Reglamento y Lineamientos de uso de Laboratorios así

como el Manual de Higiene Seguridad y Ecología.

V. Tiene la autoridad de suspender la práctica en caso de demora por parte del

catedrático y/o alumnos o bien, incumplimiento del Reglamento y Lineamientos de uso

del Laboratorio.

VI. Elaborará y entregará a la Dirección el reporte mensual Formato DLA-016practicas,

Formato DLA-016inv.

VII. Elaborará y entregará relación de alumnos que tienen adeudos a la instancia

correspondiente. Reposición de adeudos Formato DLA-018

VIII. Ingresará en la Captura en la “Aplicación Sistema de Control de Adeudos en

Laboratorios”, a los alumnos que no realizaron la reposición de material en el tiempo

establecido. Formato DLA-018

IX. Apoyará en las actividades académicas que encomiende la Dirección de la escuela.

X. Elabora requerimiento semestral de material, equipo, reactivos y agua destilada

necesarios para las prácticas correspondientes a los planes y programas de estudio

vigentes, a la instancia correspondiente. Formato DLA-042.

Nota: Los lineamientos de Uso de Laboratorios, Clínicas y/o Talleres de Institutos, Escuelas Superiores y Bachilleratos derivan del “Reglamento de Laboratorios, Manual de Seguridad, Higiene y Ecología y Documentos Institucionales.

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NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Reacciones bioquímicas de óxido-reducción

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No. DE PRÁCTICA: 1 No. DE SESIONES: 1

No. DE INTEGRANTES MÁXIMO POR EQUIPO: 5

INTRODUCCIÓN:

Las enzimas que catalizan oxidaciones celulares canalizan los electrones desde

centenares de sustratos diferentes hacia unos cuantos tipos de transportadores

universales de electrones. La reducción de estos transportadores en los procesos

catabólicos permite la conservación de la energía libre que se produce en la oxidación de

los sustratos. Las moléculas de NAD+, NADP+, FMN y FAD son coenzimas hidrosolubles

que experimentan oxidación y reducción reversibles en muchas reacciones de

transferencia de electrones del metabolismo. Los nucleótidos NAD+, NADP+ se trasladan

fácilmente de una enzima a otra, mientras que los nucleótidos de flavina, FMN y FAD

suelen estar muy fuertemente unidos a las enzimas llamadas flavoproteínas, en las que

actúan como grupo prostético. Las quinonas liposolubles como la ubiquinona y la

plastoquinona actúan como transportadores de electrones y donadores de protones en el

medio no acuoso de las membranas. Las oxidorreductasas pueden transferir

directamente el hidrógeno separado de diferentes sustratos al oxígeno molecular,

obteniéndose como resultado peróxido de hidrógeno. Este compuesto constituye un

tóxico poderoso para las células, razón por la cual tienen necesidad de eliminarlo,

disponiendo para ello de otras oxidorreductasas entre las cuales se encuentran las

peroxidasas.

Hidroquinona + Peróxido Quinona + Agua

13

Estas enzimas catalizan la oxidación de fenoles y otra gran cantidad de sustancias

mediante la reducción del peróxido a agua, como ocurre con la hidroquinona, uno

de sus posibles sustratos:



La quinona obtenida es un compuesto de color pardo cuya concentración es

directamente proporcional a la absorbancia medida a 400 nm, la cual puede utilizarse

como medida de su concentración. Además, la variación de la absorbancia con el

tiempo se puede tomar como medida de la velocidad de la reacción.

En los vegetales la peroxidasa, con sus diferentes formas isoenzimáticas, parece estar

relacionada con la oxidación de numerosos compuestos, proceso que tiene lugar con

mayor intensidad durante la maduración de los frutos. Estas isoenzimas se encuentran

en el interior de vacuolas celulares

OBJETIVO GENERAL:

Evaluar las reacciones de óxido-reducción catalizadas por enzimas.

OBJETIVOS ESPECIFICOS:

Aplicar técnicas específicas de extracción de enzimas catalizadoras de reacciones de

óxido reducción.

Evaluar la actividad de enzimas catalizadoras de reacciones de óxido reducción.

PARTE EXPERIMENTAL O METODOLOGÍA:

Extracción de la catalasa

Moler una papa en la licuadora con 80 ml de agua destilada.

Filtrar el extracto primero a través de una gasa y posteriormente a través de papel filtro.

Se ajusta el volumen del filtrado a 100 ml con agua destilada.

Realizar estas operaciones lo más rápido posible y una vez que ya se hayan preparado el

resto de las soluciones.

Vaciar el filtrado en un EM y colocarlo en agua con hielo hasta su utilización.

Actividad de la catalasa

14



Colocar en un tubo de ensayo 100 µl de extracto enzimático y 900 µl de H2O2 500 mM

preparado en buffer de fosfatos 200 mM pH 7,0, manteniendo esta mezcla 40 °C.

Luego de 5 min de reacción se adicionan 250 µl de H2SO4 (1:3) para desnaturalizar la

enzima y detener la descomposición del H2O2.

Se titula el H2O2 no descompuesto con la solución de KMnO4.

Puesto que dentro del extracto enzimático pueden existir otros componentes diferentes a

la catalasa que descompongan el H2O2 se prepara un blanco, preparado de la misma

manera que las mezclas de reacción aunque con la incorporación del H2SO4 (1:3) previo

a la adición del extracto enzimático.

Una unidad de actividad de la catalasa (UCAT) se define como los µmol de H2O2

descompuesto/min.

Extracción de la peroxidasa:

Para extraer peroxidasas se pela y se corta un rábano en trozos pequeños, se muele en

la licuadora con 80 ml de agua destilada, se filtra recibiendo el filtrado en un EM y se

ajusta el volumen a 100 ml. Se mantiene en agua con hielo hasta su utilización.

Actividad de la Peroxidasa

La actividad la peroxidasa se evalúa por la medida del incremento de la absorbancia a

470 nm cada 5 s durante 120 s.

En un tubo de ensayo se colocan 100 µL de extracto enzimático y 1.9 ml de la mezcla de

guayacol/ H2O2, mezclar rápidamente y colocar en la celda del espectrofotómetro. Tomar

inmediatamente la lectura contra un blanco de agua destilada y repetir la lectura a los 60

y a los 120 segundos.

Se trabaja un blanco de reactivos, el cual se prepara igual que la mezcla de reacción, con

la diferencia de que el extracto enzimático se hierve previamente en un baño maría a 92

°C durante 20 min asegurando la desnaturalización de la enzima.

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Una unidad de actividad de peroxidasa (UPOD) se define como el cambio en una unidad de absorbancia por min.

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS:

MATERIAL/UTENSILIOSCANTIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS.

1 Matraz Kitazato 250 o 500 ml

1 Embudo Buchner

2 Matraz Erlenmeyer 250 ml

2 Papel filtro

2 Tubos de centrífuga Hermle refrigerada

De fondo redondo, con tapón de rosca,

de 50 ml.

1 Probeta Graduada, de 50 ml.1 Embudo Chico, de cristal o de

plástico, de cuello corto

2 Vaso de precipitados Capacidad de 250 ml1 Matraz aforado Capacidad de 25 ml1 Matraz aforado Capacidad de 50 ml1 Matraz aforado Capacidad de 100 ml3 Vaso de precipitados Capacidad de 50 ml1 Vaso de precipitados Capacidad de 100 ml1 Micropipeta Capacidad de 50 μl1 Micropipeta Capacidad de 100 μl1 Micropipeta Capacidad de 1000 μl1 Gradilla Para tubos de 13 x

100mm2 Trozos manta de cielo 25 x 25 cm aprox.1 Piceta Capacidad de 100 ml5 Celdas para

espectrofotómetroDe plástico o de vidrio, de 3 ml

1 Bureta De 25 ml1 Soporte universal1 Pinza para bureta

REACTIVOS/INSUMOSCANTIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS.

1 Papa Fresca, sin daño aparente.

1 Rábano Fresco, sin daño

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aparente.H2O2 0.05 M

Buffer de fosfatos 200 mM pH 7,0

Mezcla de guayacol/ H2O2 (40mM/20mM)

en buffer de fosfatos de pH 5.5

una vez preparada, realizar una dilución

1:10Soln de KMnO4 10 mM una vez preparado,

realizar una dilución 1:50

100 ml Buffer de fosfatos 0.2 M, pH 5.525 ml Buffer de calibración pH 4.025 ml Buffer de calibración pH 7.0

EQUIPOCANTIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS.

1 pH metro1 Centrífuga refrigerada1 Balanza analítica Sensibilidad de

0.0001 g

CUESTIONARIO:

1. Investigar sobre las características de las enzimas evaluadas: PM, estructura, pH

óptimo, temperatura óptima.

2. Investigar cual es la importancia de las enzimas catalasa y peroxidasa.

REPORTE DE LA PRÁCTICA:

Discutir la diferencia entre la función de las enzimas peroxidasa y catalasa.

Discutir cómo expresaría la actividad específica de las enzimas evaluadas y cuál es la diferencia con la actividad enzimática reportada en la práctica.

- Baquero, L. E. D., J. A. R. Castro y C. E. C. Narváez. 2005. Catalasa, peroxidasa y

polifenoloxidasa en pitaya amarilla (Acanthocereus pitajaya): Maduración y senescencia.

Acta Biológica Colombiana, Vol. 10 No. 2, 2005 59

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BIBLIOGRAFÍA:



- Stryer, L., J. M. Berg y J. L. Tymoczko. 2003. Bioquímica, 5a edición. Editorial Reverté, S. A. Barcelona, Esp.

NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Reacciones del transporte de electrones



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- Nelson, L. D. y M. M. Cox. 2000. Lehninger Principios de Bioquímica. Ediciones Omega,

S. A., Barcelona, Esp.



INTRODUCCIÓN:

El problema del papel de la luz en la fotosíntesis ha conducido en los últimos años a la

postulación de un modelo del que se conocen varios de sus componentes. De acuerdo a

este modelo, la luz proporciona la energía necesaria para que los electrones de la

clorofila a 680 del fotosistema II sean transportados a través de una serie de

acarreadores (Q, plastiquinona, citrocromo b, plastocianina y citocromo f, hasta la

clorofila a 700 del fotosistema I, quien a su vez al ser excitado por la luz, ocasiona un

nuevo transporte de los electrones hasta el NADP para formar NADPH + H+. Los

electrones perdidos por la clorofila del fotosistema II son recuperados mediante la ruptura

del agua (fotólisis)

En resumen, durante la fase luminosa de la fotosíntesis se produce un transporte de

electrones desde la molécula de agua hasta el NADP, siendo la luz quien proporciona la

energía necesaria para llevar a cabo este proceso. Ahora bien, ¿Cómo podemos detectar

este proceso de electrones?

En Inglaterra, en 1939, Robert Hill se planteo las misma pregunta y para contestarla

razonó aproximadamente de la siguiente forma:”Durante el transporte de electrones estos

son donados y recibidos por sustancias naturales encargadas de hacerlo. Ahora, si

nosotros introducimos artificialmente una sustancia que recibe electrones y que al

hacerlo, cambie de color, podemos detectar este transporte”. Así con sustancias como el

azul de metileno, se puede comprobar que en presencia de cloroplastos asilados y en

presencia de luz, el azul de metileno cambiaba de azul a incoloro, lo que indicaba que

había recibido un electrón. Cuando no había luz no había excitación de los electrones

de la clorofila y el azul de metileno no cambiaba.

Un efecto semejante al del azul de metileno se consigue con otro colorante llamado

DCPIP (Diclorofenolindolfenol). El DCPIP es azul, cuando recibe un electrón se vuelve

incoloro. ¿Pero qué tiene que ver lo anterior con algunos herbicidas? Pues, como se

podrá comprender la presencia de sustancias que interrumpan el transporte de

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electrones impedirán (dependiendo del caso): la formación de ATP, la formación de

NADPH+H+ la ruptura de la molécula de agua, etc., ocasionando trastornos que llevaran

a la planta, tarde o temprano, a la muerte. De esta manera se han diseñado sustancias

que al asperjarse sobre la planta, interrumpen el flujo de electrones en cualquiera de las

siguientes formas.

Inhibidores del transporte de electrones.

En este caso el compuesto actúa mediante la inactivación de uno o más acarreadores.

De los herbicidas de este tipo, uno de los más conocidos es el Diurón.

Agentes que impiden la formación de ATP.

Dentro de este grupo los compuestos pueden actuar separando el transporte de

electrones de la fosforilación (es decir, continúa el transporte de electrones pero no se

forma ATP y la energía se desperdicia en forma de calor) impidiendo directamente la

formación de ATP, o un tercer caso, haciendo ambas cosas a la vez. Dentro de los

compuestos que actúan de la manera anterior tenemos: perfluidone, dinoseb, V-

fenilcarbamatos, acylanilidas, imidazoles y benzimidoles sustituidos, benzonitrilos

sustituidos y pyriclor, entre otros.

Aceptores de electrones.

Estos compuestos compiten con algunos compuestos de la cadena transportadora de

electrones y los reciben en su lugar

OBJETIVO GENERAL:

Estudiar las reacciones del transporte de electrones.


Evaluar el efecto de sustancias inhibidoras sobre el flujo de electrones en el proceso de la fotosíntesis.

20



Aplicar un procedimiento de extracción de cloroplastos.


AISLAMIENTO DE LOS CLOROPLASTOS

1. Muela en un mortero 5 g de hojas con 30 ml de sacarosa 0.5 M

2. Filtre con la gasa para quitar los restos grandes

3. centrifugue la solución a 2500 rpm durante 10 minutos y deseche el sobrenadante

(los cloroplastos están en el fondo)

Suspenda el precipitado o residuo con los cloroplastos con 10 ml de buffer fosfato frío. Coloque los tubos con los cloroplastos y hielo hasta que los use en el siguiente paso (si tiene 2 tubos más de cloroplastos reúna todo en uno solo)

Reducción del DCPIP y efectos del herbicida

a. Numere los tubos de ensayo (del 1 a 3) y los reactivos conforme se muestra en el cuadro N°1:

b. El tubo 1 se cubre con papel aluminio

c. Los tubos 2 y 3 se dejan a la luz

d. Coloque los tres tubos en un vaso de precipitado con agua suficiente para cubrirlos (sin que penetre el agua o floten) y acerque todo a la lámpara encendida. Espere 15 ó 20 minutos y compare las coloraciones de los tubos.

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SOLUCION No. De tubo

1 2 3

Cloroplastos aisladosDCPIPDiurónBuffer fosfato frío

2

305

2

305

2

332

TOTAL 10 10 10




1 Matraz Kitazato 250 o 500 ml

1 Embudo Buchner


2 Papel filtro

4 Tubos de centrífuga Hermle refrigerada

De fondo redondo, con tapón de rosca,

de 50 ml.6 Tubos de ensayo 15 x 150 mm1 Probeta Graduada, de 50 ml.1 Embudo Chico, de cristal o de

plástico, de cuello corto

2 Vaso de precipitados Capacidad de 250 ml3 Vaso de precipitados Capacidad de 50 ml1 Vaso de precipitados Capacidad de 100 ml4 pipetas de 5 ml Graduadas2 pipetas de 2ml Graduadas

1 vaso de precipitado de 250 ml

1 Gradilla Para tubos de 15 x 150mm

2 Trozos manta de cielo 25 x 25 cm aprox.1 Piceta Capacidad de 100 ml1 Mortero con pistilo Capacidad de 100 ml

REACTIVOS/INSUMOSCANTIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS.

10 ml2,6-Dicloro

fenolindolfenol (DCPIP)

2.2 x 10-4 M (0.007 g/100ml agua

20 ml Buffer fosfato pH 6.5 (frio)30 ml Sacarosa 0.5 M (frio)5 g Hojas de espinaca Fresca

10 ml Solución de Diurón 0.312 g/100 ml de agua.

(nombre comercial Karmex)

50 cm Papel aluminioEQUIPO

CANTIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS.1 pH metro

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1 Centrífuga refrigerada Hermle1 Balanza analítica Sensibilidad de

0.0001 g

CUESTIONARIO:

1. Mencione cual es la molécula donadora de electrones necesarios para la

transformación de la energía luminosa en energía química.

2. Mencione cuál es la molécula portadora de ‘poder reductor’ obtenida en la fotosíntesis.

3. Mencione cual es la molécula portadora de energía obtenida en la fotosíntesis


Elabore un diagrama del flujo de electrones de los foto-sistemas I y II y señale los sitios donde actúan los inhibidores

BIBLIOGRAFÍA:

- Devlin, R.m.1975. Fisiología vegetal. Ed Omega. Barcelona. España

- Hall, D.O y K.K. Rao.1978. Fotosíntesis. Ed Omega. Barcelona. España

Róvalo, Merino y Rojas M. 1977. Experimentos de Laboratorio de Fisiología Vegetal.

ITESM, Monterrey, México.


NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Hidrólisis bioquímica de polisacáridos


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INTRODUCCIÓN:

Para la mayoría de los humanos, el almidón es la principal fuente de glúcidos en la dieta.

La digestión del almidón comienza en la boca, dónde la alfa-amilasa de la saliva hidroliza

las uniones glucosídicas internas del almidón produciendo polisacáridos más pequeños y

oligosacáridos. En el estómago, la alfa-amilasa salival es inactivada por el pH bajo, aquí

entra en acción una alfa-amilasa producida por el páncreas. La alfa-amilasa pancreática

produce principalmente maltosa y otros oligosacáridos llamados dextrinas, fragmentos de

amilopectina que contienen puntos de ramificación por enlaces alfa-(1 6). Se le puede

dar seguimiento a la reacción catalizada por la alfa-amilasa, evaluando los cambios en la

concentración de almidón, la cual deberá disminuir conforme avance la reacción.

OBJETIVO GENERAL:

Estudiar las reacciones bioquímicas de hidrólisis de los polisacáridos.


Evaluar el efecto de la enzima alfa-amilasa sobre el almidón.


En 4 tubos de ensayo numerados del 1 al 4 colocar: 2 ml de solución de almidón al 2 % y 1 ml de solución fisiológica.

En el tubo 1 se deja a temperatura ambiente y los otros 3 se colocan en un baño a 37 ºC. A todos los tubos se les agregan 100 U de alfa amilasa. Registrar el tiempo.

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Cada 2 minutos colocar 0,5 ml de uno de los tubos en otro que contiene una gota de lugol y agregarle 2 ml de HCl 0,01 N.

Registrar el color obtenido a cada tiempo, mediante la lectura de la muestra al espectrofotómetro a 575 nm, utilizando un blanco de reactivos sin solución enzimática.


20 Tubos de ensayo 13 x 100 mm

5 Celdas para

espectrofotómetro

De plástico o de vidrio, de 3 ml.

1 Termómetro De 0 a 100°C

1 Probeta Graduada, de 50 ml.2 Vaso de precipitados Capacidad de 250 ml3 Vaso de precipitados Capacidad de 50 ml1 Vaso de precipitados Capacidad de 100 ml4 pipetas de 5 ml Graduadas2 pipetas de 2ml Graduadas


1 Gradilla Para tubos de 15 x 150mm

1 Piceta Capacidad de 100 mlREACTIVOS/INSUMOS

CANTIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS.

400 UEnzima alfa-amilasa comercial

10 ml Soln. de almidón Al 2%10 ml Soln. de Yodo-Lugol Soln acuosa al 5%

de I2 y al 10% de KI Disolver El KI y

enseguida adicionar lentamente el I2, filtrar

y guardar em um frasco de vidrio color ámbar. Es estable um

mês.50 ml Soln. de HCl 0,01 N


1 Espectrofotómetro25



1 Balanza analítica Sensibilidad de 0.0001 g

1 Baño de incubación Con termostato

CUESTIONARIO:

1. Realiza una tabla comparativa con las características de las enzimas alfa-amilasa

salival y pancreática, incluyendo: PM, pH óptimo, temperatura óptima, # de aminoácidos,

estructura.

2. Investigue cuál es la reacción que se da entre el yodo y el almidón que determina la coloración observada.


Discutir si se observó la disminución de la concentración de almidón con respecto al avance de la reacción. Discutir cual es la función de la solución de yodo-lugol y del ácido en la reacción.

BIBLIOGRAFÍA:

Nelson, L. D. y M. M. Cox. 2000. Lehninger Principios de Bioquímica. Ediciones Omega,


Stryer, L., J. M. Berg y J. L. Tymoczko. 2003. Bioquímica, 5a edición. Editorial Reverté, S.

A. Barcelona, Esp.

Whistler, R. L. y J. N. BeMiller. 1999.Carbohydrate Chemistry for Food Scientists. Eagan Press, St. Paul, Minnesota, USA.

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NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Hidrólisis bioquímica de triacilglicéridos



INTRODUCCIÓN:

Las lipasas (EC 3.1.1.3.) son enzimas versátiles que catalizan la hidrólisis de los enlaces

éster, tal como lo que se encuentran en los triacilglicéridos, formados por el glicerol y los

ácidos grasos.

Estas enzimas hidrolíticas se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza y

están presentes en los procesos metabólicos degradativos de algunas plantas y

animales. Ellas son producidas por un gran número de microorganismos a partir de los

cuales se obtienen usualmente para fines comerciales, un ejemplo típico lo son las

lipasas producidas por los hongos Aspergillus niger y A. Fumigatus. El interés por estas

enzimas se ha acrecentado en los últimos años debido a sus diversas propiedades

catalíticas. Ello ha causado que se conviertan en catalizadores valiosos en diferentes

aplicaciones industriales, tales como: aditivos en la formulación de detergentes, en la

industria alimentaria para la elaboración de productos dietéticos con bajo nivel de grasas

y colesterol, en la industria del papel con el objetivo de eliminar la cera de la pulpa del

papel, en la industria farmacéutica en la obtención de moléculas bioactivas, así como en

procesos de síntesis química para la obtención de compuestos ópticamente puros,

modificación de grasas y otros lípidos por hidrólisis y esterificación.

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La acción de la lipasa es favorecida por la presencia de sales biliares cuyo efecto

emulsionante aumenta la superficie de contacto de los lípidos con la enzima. Los ácidos

grasos libres que se producen por la hidrólisis de los triglicéridos en presencia de lipasa

pueden determinarse por la cantidad de álcali que es necesario agregar para neutralizar la

acidez debida a la presencia de los mismos.

OBJETIVO GENERAL:

Estudiar las reacciones bioquímicas de hidrólisis de lípidos.


Evaluar el efecto de la lipasa sobre los triacilglicéridos.


Colocar en tres EM de 125 ml del 1 al 3, 20 ml de agua y 10 ml de aceite; colocarlos en el

baño a 37 ºC.

A los EM 2 y 3 agregarles la cantidad de lipasa para obtener una concentración de 0,5 mg

de enzima por cada 10 ml del medio de reacción.

Luego de 30 minutos de incubación a 37 °C, retirar los EM. Agregar a cada uno 2 gotas de

azul de bromotimol (indicador de pH). Titular la acidez agregando de a 50 l una solución

valorada de NaOH 0,04 M hasta que el color vire al azul.

La cantidad de miliequivalentes empleadas para neutralizar la solución es igual a la producción de ácidos grasos a partir de triglicéridos degradados por la lipasa pancreática.



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1 Bureta 25 ml

1 Soporte universal

1 Pinza para bureta

1 Termómetro De 0 a 100°C

1 Probeta Graduada, de 50 ml.2 Vaso de precipitados Capacidad de 250 ml3 Vaso de precipitados Capacidad de 50 ml1 Vaso de precipitados Capacidad de 100 ml4 pipetas de 5 ml Graduadas2 pipetas de 2ml Graduadas


1 Piceta Capacidad de 100 mlREACTIVOS/INSUMOS

CANTIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS.

5 gLipasa pancreática o

fúngica50 ml Solución valorada de

NaOH

0.04 M

60 ml Aceite comestible5 ml Soln. Azul de

bromotimol

0.01 %


1 Balanza analítica Sensibilidad de 0.0001 g

1 Baño de incubación Con termostato

CUESTIONARIO:

Investigar las propiedades de las lipasas de diferentes fuentes (pancreática, fúngica,

bacteriana), incluyendo PM estructura, pH óptimo, temperatura óptima, sustratos que

utiliza y cofactores enzimáticos.

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Discutir cual es el fundamento de la técnica utilizada y si efectivamente se logró detectar la acción de la lipasa.

BIBLIOGRAFÍA:

- Coca, J., O. Hern·ndez, R. Berrio, S. MartÌnez, E Díaz y J. C. Dustet. 2001. Producción

y caracterización de las lipasas de Aspergillus niger y A. fumigatus Biotecnología

Aplicada, 18:216-220.




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Manual bioquímica ii_actualizado

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