Manual laboratorio bioquímica clínica

FACULTAD DE BIOANALISIS

LIC. QUIMICA CLINICA. ELABORADO POR: MIGUEL ANGEL ORTIZ GIL. BIOQUIMICA CLINICA ESPECIALIZADA. MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO. CATEDRATICA: Q.F.B. MARIA CONTRERAS JUREGUI.

DIVULGACION CIENTIFICA DE LA QUIMICA CLINICA.FUENTE: www.quimicaclinicauv.blogspot.com 1

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CONTENIDO: DETERMINACION DE Magnesio DETERMINACION DE CALCIO TOTAL DETERMINACIN CUANTITATIVA DE FSFORO

DETERMINACIN DE SODIO Y CLORUROS EN SUERO (TCNICA DEL IN SELECTIVO)

ESTUDIO DE LQUIDO CEFALORAQUDEO DETERMINACIONES HORMONALES

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PRACTICA NO. 1

MagnesioFUNDAMENTO: Los iones magnesio reaccionan en medio alcalino con el colorante metalocromo calmadita, para formar un cromforo, el cual absorbe luz a 520 nm. El calcio es excluido de la reaccin al formar un complejo con EGTA. ANTECEDENTES Las determinaciones de magnesio son clnicamente importantes. El magnesio, al igual que el potasio, es el catin intracelular ms abundante. El magnesio es una coenzima requerida en el metabolismo de los carbohidratos, lpidos y protenas. Una disminucin en los niveles de magnesio en el organismo, hipomagnesemia, puede causar temblores, irritabilidad muscular y aumento de la presin sangunea y de la frecuencia cardiaca. Los niveles elevados de magnesio, hipermagnesemia, pueden causar problemas respiratorios, coma y paro cardiaco si dichos niveles no se corrigen. El mtodo de eleccin para la determinacin de magnesio es la espectrofotometra de absorcin atmica. Este mtodo no es prctico para los laboratorios clnicos, de manera que en su lugar se utilizan mtodos de fijacin con un colorante que emplean azul de metiltimol, amarillo de titanio, calmagita y azul de xilidilo-1. Este mtodo emplea azul de xilidilo-1 el cual permite el uso de un solo reactivo de manera rpida y precisa. El Magnesio es el quinto mineral para su abundancia en el organismo y el segundo catin celular. El cuerpo contiene un total de 24 gramos; el 60% se localiza en el esqueleto y el 405 restante en los tejidos blandos. La deficiencia se ve en alcohlicos, pacientes afectos de cirrosis heptica, tras tratamiento diurtico y en enfermedades renal. Los sntomas son: FUENTE: www.quimicaclinicauv.blogspot.com 3

- Debilidad muscular - Dficit de Calcio secundario - Confusin, alucinaciones, convulsiones y otro sntomas neurolgicos. El exceso de Magnesio es extremadamente raro. Funciones - Estructural, en huesos y dientes. - Cofactor de ms de 300 enzimas del organismo, las que catalizan las reacciones ATP- dependientes. El Magnesio se liga al ATP, formando un complejo Magnesio- ATP que es el sustrato de enzimas tales como las cinasas. - Interacciona con el Calcio para afectar a la permeabilidad de las membranas excitables y la transmisin neuromuscular. Alimentos fuentes Cereales integrales, frutas secas, lcteos, chocolate, verduras de hoja verdes, pan, soya y banana. Valores normales Los valores normales en adultos miliequivalentes (mEq) por litro. promedio es de 1.25 a 2.5

ESTABILIDAD: Estos reactivos son estables a temperatura ambiente (< 25 C) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Se recomienda no exponer a temperaturas elevadas durante tiempos prolongados. OBSERVACIONES: * Todo el material a usar debe estar escrupulosa- mente limpio, utilizando detergentes no inicos, soluciones de acido clorhdrico al 25 % y agua destilada. * Se recomienda el uso de micropipetas con constriccin, a los fines de obtener una mejor reproducibilidad. * Se recomienda separar pipetas y tubos de fotocolormetro para uso exclusivo de esta determinacin. * No deben utilizarse anticoagulantes precipiten el magnesio (EDTA, oxalato). que complejen o

MUESTRA: Suero, plasma heparinizado, orina o LCR. No debe utilizarse plasma preparado utilizando anticoagulantes como EDTA, citrato u oxalato. FUENTE: www.quimicaclinicauv.blogspot.com 4

La orina de 24 horas podrie contener sedimentos que absorben magnesio. Aadir unas gotas de acido clorhidrico concentrado hasta alcanzar un pH entre 3-4 para disolver el sedimento. Diluir la orina 1+4 con agua bidestilada y multiplicar el resultado por 5. REACTIVOS: COMPONENTES CONECTRACIONES 1.- Reactivo de color Calmagite 0.2 mmol/L EGTA Dimetilsulfxido 2.- Tampon Tampon Dietanolamina 1mol/L, pH 12.50 Surfractantes 3.- Patron Magnesio 1.0mmol/L (2.43mg/dl) PREPARACION DE LAS SOLUCIONES: 1.- REACTIVO DE COLOR Listo para usar. Estable hasta conserva entre +15 y +25C. 2.- TAMPON Listo para usar. Estable hasta conserva entre +15 y +25C. 3.- PATRON Listo para usar. Estable hasta conserva entre +15 y +25C. la fecha de caducidad cuando se

la

fecha

de

caducidad

cuando

se

la

fecha

de

caducidad

cuando

se

REACTIVO DE TRABAJO Mezclar volmenes iguales de reactivo de color 1 y de tampn 2. Usar inmediatamente. PROCEDIMIENTO: Longitud de onda: 520 nm; 546 nm Cubeta: 1 cm de espesor Temperatura: 20-25C Medicin: frente al aire FUENTE: www.quimicaclinicauv.blogspot.com 5

Pipetear en las cubetas: Reactivo Blanco 1.0 ml 10 ul 10 ul 10 ul Patron 1.0 ml Muestra 1.0 ml

React. de trabajo Agua destilada Patron Muestra

Mezclar, incubar durante 3 min a temperatura ambiente, leer la absorbancia del patron (Apatron) y de la muestra (Amuestra) frente al reactivo blanco, antes de 30 minutos. CALCULOS:

Concentracin de magnesio (mmol/L) =

(Amuestra) (Apatron) x 1.0(Amuestra) (Apatron)

Concentracin de magnesio (mg/dl) VALORES NORMALES: ADULTOS SUERO/PLASMA (1.70-2.70mg/dl) CSF (2.40-3.10 mg/dl) ORINA (50-200 mg/24hrs)

=

x 2.43

0.7-1.1

mmol/l

0.98-1.27 mmol/l 2.1-8.22 mmol24 hrs

RESULTADOS: .063 Concentracin de magnesio(mg/dl) =.040 x 2.43 =1.542 mg/dl


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ESQUEMAS:

CONCLUSIONES: Concluyo que el magnesio es el cuarto catin ms abundante en el lquido extracelular y el segundo en el intracelular. El 20% del magnesio srico esta unido a protenas, su absorcin se hace fundamentalmente en yeyuno e leon, y el balance diario se hace a travs de los riones ya que por va fecal se elimina el 1 a 2%. Se ha observado un aparente umbral renal para la excresin de magnesio para valores sricos cercanos a los normales, por lo que una pequea modificacin de los niveles sricos, alterar rpidamente la excresin de magnesio. En la prctica clnica la deficiencia de magnesio es ms comn que el exceso y puede deberse a distintas causas tales como: cetoacidosis diabtica, alteraciones intestinales, hiperparatiroidismo, alcholismo, enfermedades renales. Bibliografa: Nutrar prevencin y salud plena. Minerales. http://www.nutrar.com/detalle.asp?ID=146 12/01/08 Magnesio.


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PRACTICA 2 DETERMINACION DE CALCIO TOTAL INTRODUCCION Ms del 99 % del calcio corporal existe en los huesos y en la dentadura. El 1 % restantes esta presente en la sangre y en el tejido conjuntivo y sirve como cofactor en la coagulacin sangunea, en metabolismo y fisiologa neuromuscular. El calcio en el suero esta presente en tres formas diferentes: 1. 45% unido a protenas 2. 5% en forma no inica 3. 50% en forma ionizada. La ionizada es la fraccin fisiolgicamente importante en trminos de funcin biolgica. activa y la mas

Son muchos de los factores que influyen al nivel del calcio: hipercalcemia (nivel elevado de calcio) que se observa en hiperparotiroidismo, hipervitaminosis, sarcoidosis, mieloma y en ciertos canceres oseos. La hipocalcemia (bajos niveles de calcio) se encuentra en hipoparatiroidismo, raquitismo, nefrosis, nefritis, esteatorrea y pancreatitis. Cualquier disminucin en el nivel de las protenas sanguneas resulta en una disminucin del nivel total de calcio en suero. De igual forma cualquier aumento en el nivel de protenas como el mieloma resulta en un aumento del nivel de calcio. Tambin parece haber una relacin reciproca entre el calcio y el fsforo. Los aumentos de fsforo inorgnico en suero estn asociados con disminucin del calcio en suero. Los primeros procedimientos para la determinacin de calcio en suero involucraban precipitacin del calcio y determinacin subsiguiente del anion del agente precipitado. Ms recientemente, los compuestos de calcio han sido determinados con espectrofotometra de absorcin atmica, que ha sido recomendado como mtodo de referencia para la determinacin de calcio tota. Con el desarrollo de los reactivos quelonios y los indicadores metal cromticos, la absorcin atmica se reemplazo rpidamente por los procedimientos complexo mtricos, los cuales pueden medir el calcio directamente en suero.


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Este macromineral es el mineral con mayor presencia en el organismo y el cuarto componente del cuerpo despus del agua, las protenas y las grasas. El calcio corporal total, se aproxima a los 1200 gramos, lo que es equivalente a decir 1,5 a 2% de nuestro peso corporal. De esto, casi un 99% se concentran en los huesos y dientes el 1% restante se distribuye en el torrente sanguneo, los lquidos intersticiales y las clulas musculares. Tanto su carencia como su exceso son perjudiciales para la salud, ya que participa en la coagulacin, en la correcta permeabilidad de las membranas y a su vez adquiere fundamental importancia como regulador nervioso y neuromuscular, modulando la contraccin muscular (incluida la frecuencia cardaca), la absorcin y secrecin intestinal y la liberacin de hormonas. Los alimentos con mayor contenido de calcio son los productos lcteos, los frutos secos, las sardinas y las anchoas; ya en menor proporcin en legumbres y vegetales verdes oscuros (espinaca, acelga, broccoli). El calcio est vinculado a la presencia de fsforo. La falta o exceso de cualquiera de estos dos macrominerales puede afectar la absorcin del otro. A su vez, la absorcin del calcio se ve dificultada ante consumos de caf, alcohol, falta de Vitamina D, falta de cido clorhdrico en el estmago, falta de ejercicio y el estrs. Un obvio indicador de carencia de calcio es la osteoporosis. Una de las grandes ventajas que presenta el calcio refiere a su invariabilidad en el tiempo desde el momento en que es envasado hasta el momento de consumo, podemos decir que el contenido de calcio de los alimentos no se altera en ninguna etapa. Funciones: Provee rigidez y fortaleza a huesos, dientes y encas. Ayuda en la regularidad de la frecuencia cardaca, y en la transmisin de impulsos nerviosos. Previene enfermedades cardiovasculares, ya que disminuye los niveles de colesterol en sangre. Previene los calambres en la musculatura corporal, debido a que el msculo utiliza el calcio para realizar sus movimientos y contracciones. Es fundamental para que la sangre coagule adecuadamente. Es preventivo ante enfermedades como el cncer. Contribuye a reducir la tensin arterial en personas con hipertensin arterial. Previene la osteoporosis (perdida de masa sea). Es activador de diferentes enzimas. Mantiene la permeabilidad de las membranas celulares. Es un coadyuvante de la actividad neuromuscular. FUENTE: www.quimicaclinicauv.blogspot.com 9

Mantiene la piel sana. Durante el embarazo reduce la incidencia de la preeclampsia (hipertensin gestacional o aumento de la presin arterial con edema y/o protenuria, protenas en orina, que ocurre despus de la 20 semana de gestacin).

Deficiencia de Calcio La ingesta inadecuada, la disminucin de la absorcin a nivel intestinal como la excrecin (en orina) aumentada del calcio conduce a una disminucin total del mismo en nuestro organismo. La carencia de calcio est caracterizada por:

dolores en las articulaciones hormigueos y calambres musculares un ritmo cardaco anormal, palpitaciones convulsiones y deterioro cerebral depresin fragilidad en las uas, uas quebradizas. alteraciones cutneas dientes defectuosos aumento del colesterol sanguneo hipertensin entumecimiento de miembros superiores e inferiores raquitismo osteoporosis

Algunas enfermedades tambin determinan la falta de calcio en el organismo, como son las alergias, la insuficiencia renal, colitis y diarreas, y trastornos hormonales (mal funcionamiento de la glndula paratiroides). En esos casos puede procederse a la administracin de suplementos de calcio, bajo estricta supervisin mdica, y su eficacia es mayor cuando los suplementos son tomados en varias tomas a lo largo del da, y antes de acostarse. Las personas que han padecido clculos renales debern abstenerse de tomar suplementos. Factores que favorecen la absorcin: o Vitamina D: la forma activa de la vitamina D es determinante en la asimilacin de este mineral. Si est presente en las cantidades adecuadas favorece la absorcin del calcio. o Bajo consumo de calcio: la cantidad de calcio absorbido por el organismo ser menor cuando lo consumimos de una sola vez en grandes cantidades. Es preferible tomarlo en dosis menores durante el da as se favorecer la absorcin. No se recomienda tomar ms de 500 mg de calcio de una sola vez. o Bajo nivel sanguneo de calcio: si el nivel de calcio en sangre baja, se activa una hormona, la paratiroidea que estimula la conversin de la vitamina D en el rin a su FUENTE: www.quimicaclinicauv.blogspot.com 10

forma activa favoreciendo la absorcin intestinal de calcio. o Ejercicio moderado: favorece la asimilacin del calcio. o Edad: la absorcin del calcio es de alrededor del 60 % en infantes y nios ya que el organismo necesita el calcio para el desarrollo normal de huesos y dientes. Factores que afectan la absorcin de calcio o La correcta absorcin del calcio es fundamental ya que existen factores que la favorecen y otros que la impiden. o La absorcin de calcio se refiere a la cantidad de calcio que es absorbida desde el tracto digestivo hacia nuestra circulacin sangunea. Factores que impiden la absorcin: o Ejercicio vigoroso: dificulta la absorcin de calcio o Edad: la absorcin de calcio disminuye durante la adultez en un 15-20%. Por ello las recomendaciones diarias aumentan para compensar. o Fsforo (en exceso): Las bebidas gaseosas con alto contenido en fsforo no resultan beneficiosas. Es de gran preocupacin hoy en da que ms all que las gaseosas contengan alto contenido en fsforo, la leche sea reemplazada por las mismas ocasionado la carencia de calcio entre los nios y adolescentes. o Magnesio y fsforo (en exceso): la absorcin de estos dos minerales tambin requieren de vitamina D. por ellos si se consumen en exceso, habr menor cantidad de vitamina D disponible para que el calcio se absorba. o Zinc: consumido en exceso tambin obstaculiza la correcta absorcin de calcio o Alcohol: reduce la absorcin intestinal de calcio. Inhibe ciertas enzimas en el hgado que convierten a la vitamina D en su forma activa reduciendo as la absorcin. o Cafena: el caf tomado en alta cantidades puede aumentar la excrecin de calcio y dismimuir la absorcin. Una taza de caf causa una prdida de calcio de 2-3 mg que es fcilmente compensada agregndole 1 cucharada de leche. El consumo moderado de cafena (1 taza de caf o 2 tazas de te por da) tiene muy pocos efectos negativos siempre y cuando la ingesta de calcio sea la adecuada. o Hierro: Si consumimos calcio junto con hierro, ambos compiten en la absorcin, as que el efecto de ambos se ve muy reducido. Conviene no mezclarlos. o Protenas y sodio: a medida que aumentamos la cantidad de sal y proteinas a nuestra dieta, aumenta la cantidad de calcio que se excreta. o cido oxlico: presente en almendras, soja, cacao, espinacas y acelgas, se une al calcio de esos alimentos, y forman un compuesto muy difcil de ser absorbido por el intestino. La absorcin de calcio de otros alimentos que sean consumidos en la misma comida no se vera afectada. Estos alimentos que contienen cido oxlico resultan 11


perjudiciales, siempre y cuando su consumo se realice en cantidades elevadas.

PRINCIPIO: Clcio + o- cresolftaleina complexona

MEDIO ALCALINO

Clcio- cresolftaleina complexona (color prpura) El calcio reacciona con cpc en un medio alcalino para tomar un color prpura que absorbe a 570nm (550 580nm). la intensidad del color es proporcional a la concentracin del calcio. para evitar la interferencia de otros iones metlicos se agregan estabilizadores e intensificadores de color. REACTIVOS: 1. reactivo colorimetrico: o- cresoftalema complexona 0.14mm, 8 hidroxiquinolona 13.0mm. 2. buffer de calcio diaetilamina 0.63mm cianuro de potasio 2.0 mm , ingredientes no reactivos y estabilizadores. 3. estandar de calcio: carbonato de calcio en acido clorhidrico diluido (10mg/dl). PRECAUCIONES: 1. este reactivo es para diagnostico in vitro unicamente. 2. reactivo (a y b) son irritantes para la piel. evite el contacto. 3. el reactivo (b) contiene veneno y no debe ser pipeteado con la boca. PREPARACION DEL REACTIVO: 1. combine volumenes iguales del reactivo a y b mezcle y deje reposra por 10 min. a temperatura ambiente. 2. los reactivos se deben combinar en recipientes plasticos limpios. el agua y los recipientes de vidrio contienen calcio, reaccionan con el reactivo. el equipo de vidrio se enjuagar en acido clorhidrico diluido antes de usarse. ALMACENAMIENTO DEL REACTIVO: 1. todos los reactivos se deben almacenar refrigerados 2-8 c . 2. el reactivo de trabajo combinado (combinado a y b) es estable por 2 semanas refrigerado, y una semana a temperatura ambiente. mantenga los botes hermeticamente cerrados para prevenir evaporacion. DETERIORO: FUENTE: www.quimicaclinicauv.blogspot.com 12

1. el reactivo debe estar claro. la turbiedad indica deterioro y no debe ser utilizado. 2. el reactivo no da los resultados de control o no llega a la linearidad estipulada. COLECCION Y ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA: (SUERO) 1. el suero no hemolizado es la muestra recomendada. 2. no utilice otro anticuagulante que no sea heparina. 3. separe el suero del coagulo tan pronto como sea posible, ya que las celulas rojas absorben el calcio. 4. no se deben utilizar muestras viejas que contienen precipitado. 5. no se deben utilizar tubos con tapones de corcho. 6. el calcio en suero es estable por 24 horas a temperatura ambiente y a 1 semana refrigerado (2 8 c). (ORINA) 1. colocar orina de 24 horas en un recipiente conteniendo 20 30 ml de 6n hcl. 2. usar 1 2 ml de hcl 6n en orina al azar. limpio y seco

INTERFERENCIAS: 1. las sustancias que contienen complejos de calcio o calcio no deben entrar en contacto con la muestra en prueb. ejemplo: EDTA, citrato, oxalato, fluoruro. 2. los especimenes de pacientes que han recibido bromosulfoftaleina (bsp) o edta no deben ser utilizados. 3. vea las referencias para obtener una lista de sustancias que afectan la determiancion precisa del calcio. MATERIALES REQUERIDOS: 1. los instrumentos precisos de pipeteo. 2. tubos de ensayo/gradilla 3. espectrofotometro 570nm 4. reloj INSTRUCCIONES GENERALES: El reactivo se puede usar en procedimeintos manual como automatico. PROCEMIENTO MANUAL: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. preparar el reactivo. ver preparacion del reactivo. etiquete los tubos blanco, estandar controles, pacientes, etc. pipetee 1.0ml de reactivo de trabajo a cada tubo. agregue 0.02ml de muestra en los tubos respectivos y mezcle. deje por lo menos 1 minuto a temperatura ambiente. ponga en ceros el espectrofotometro con el blanco a 570nm. lea y anote la absorbancia de todos los tubos. el color final es estable por 20 minutos.

VOLUMEN ALTERNO: FUENTE: www.quimicaclinicauv.blogspot.com 13

1. para espectrofotometros que requieran mas de 1 ml. para la lectura, se deben utilizar 3.0ml del reactivo y .05ml de la muestra. orina: 2. use 3ml de reactivo y .05ml de muestra. NOTAS DEL PROCEDIMIENTO: 1. las muestras con valores sobre 20 mg/dl deben ser diluidas 1:1 con solucion salina, corra de nuevo y el resultado multipliquelo por dos. 2. las muestras lipemicas o hemolizadas requieren un blanco de suero. para prepararlo agregue 0.05ml de muestra 0 3.0ml de agua destilada. mezcle y lea contra agua a 570nm. reste la absorbancia y realice los calculos. 3. la contaminacion con calcio del equipo de vidrio afectan la prueba, utilice equipo de cristal lavado con acido o tubos de plastico. CALIBRACION: Utilice el estandar apropiado. CALCULOS: Abs. desconocido / estandar ( conc. del estandar) =_______ CONTROL DE CALIDAD: La validez de la reaccion debe ser monitoreada por el uso de suero control normal y anormal. con concentraciones de calcio conocidas. el valor asignado a la reaccion se debe confirmar con la aplicacion elegida. si no se obtiene el rango de valores apropiado en la prueba, puede ser indicador de deterioro del reactivo, falla en los instrumentos o errores en el rpocedimiento. VALORES ESPERADOS: 8.5 10.5 mg/dl Nios menores de 12 usualmente tienen valores normales elevados que disminuyen con la edad. se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango normal. acuoso de calcio (10mg/dl) o un calibrador

ESQUEMAS Y OBSERVACIONES:


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CALCULOS Y RESULTADOS: CALCIO TOTAL: 8 mg/dl

CONCLUSION: He concluido que el examen de sangre para medir el nivel de calcio en la sangre se hace para examinar o controlar enfermedades de los huesos o trastornos de la regulacin del calcio (enfermedades renales o de la glndula paratiroides). Una deficiencia de calcio en los lquidos corporales produce una hiperexcitabilidad en los nervios y msculos, y su exceso tiene un efecto opuesto. BIBLIOGRAFIA: (1) Breslau, N.A., Brinkley, L., Hill, K.D. & Pak, C.Y.C. (1998) Relationship of animalprotein rich diet to kidney stone formation and calcium metabolism. J. Clin. End. 66:140-146. (2) Linkswiler, H.M., Zemel, M.B., Hegsted, M. & Schuette, S. (1981). Protein induced hypercalcuria. Fed. Proc. 40:880-883. http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003477.html , http://www.zonadiet.com/nutricion/calcio.htm, http://www.ivu.org/ave/calcio.html


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PRACTICA NO. 3. BIOQUIMICA CLINICA ESPECIALIZADA. DETERMINACIN CUANTITATIVA DE FSFOROGENERALIDADES: Efectos del Fsforo sobre la salud Los fosfatos son substancias importantes en el cuerpo de los humanos porque ellas son parte del material de ADN y tienen parte en la distribucin de la energa. El fosfato era tambin aadido a un nmero de alimentos, como quesos, salsas, jamn. Demasiado fosfato puede causar problemas de salud, como es dao a los riones y osteoporosis. La disminucin de fosfato tambin puede ocurrir. Estas son causadas por uso extensivo de medicinas. Demasiado poco fosfato puede causar problemas de salud. El Fsforo en su forma pura tiene un color blanco. El fsforo blanco es la forma ms peligrosa de fsforo que es conocida. Cuando el fsforo blanco ocurre en la naturaleza este puede ser un peligro serio para nuestra salud. El fsforo blanco es extremadamente venenoso y en muchos casos la exposicin a l ser fatal. En la mayora de los casos la gente que muere por fsforo blanco ha sido por tragar accidentalmente veneno de rata. Antes de que la gente muera por exposicin al fsforo blanco ellos a menudo experimentan nuseas, convulciones en el estmago y desfallecimiento. El fsforo blanco puede causar quemaduras en la piel, daar el hgado, corazn y riones. PRINCIPIO DEL METODO Mtodo directo para la determinacin de fsforo inorgnico. El fsforo inorgnico reacciona en medio de cido como molibdato amnico Formando un complejo fosfomolibdico de color amarillo. La intensidad del color formado es proporcional a la concentracin de fsforo inorgnico presente de a muestra ensayada. SIGNIFICADO CLINICO


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El fsforo, es esencial para la formacin de tejido seo y el metabolismo energtico celular. Aproximadamente un 85% se encentra en el hueso y en los dientes. Niveles bajos son atribuidos a las dieta, metstasis de huesos, alteraciones en el hgado, alcoholismo, diarreas y comitos. El diagnostico clnico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clnicos y de laboratorio. REACTIVOS: Molibdico Molibdico amnico 0,40mM cido sulfrico (SO4H2) 210 mM Patrn primario acuoso de Fsforo 5mg/dl

PHOSPHORUS CAL

MATERIAL ADICIONAL Espectrofotmetro analizador para lectura a 340nm. Cubetas de 1,0 cm de paso de luz. Equipamiento habitual de laboratorio

MUESTRAS Suero plasma Libre de hemlisis. El suero o plasma debe separarse lo antes posible de los eritrositos con el fin de evitar la liberacin de fsforo de los hemates. Estabilidad: 7 das a 2-8 C. Orina Recoger la orina en los recipientes 10 mL de cido clorhdrico (CIH) al 10% (v/v) para evitar la precipitacin de fosfatos. Ajustar pH 2 diluir la muestra 1/10 con agua destilada. Mezclar multiplicar el resultado por 10 (factor de dilucin). Estabilidad:10 das a 28 C. PROCEDIMIENTO 1.-Condiciones del ensayo: Longitud de onda: .340nm Cubeta: ..1cm paso de luz Temperatura37/30/25C 2.-Ajustar el espectrofotmetro a cero frente 3.-Pipetear en una cubeta: R(mL) Patrn Blanco 1,0 - - Patrn 1,0 10 Muestra 1,0 - - 17

agua destilada.

(Nola 2,3 )


(LLL)

Muestra

(LLL)

- - -

- - -

10

4.-Mezclar e incubar 5 minutos. 5.-Leer absorbancia (A) del Patrn y la muestra, frete al Blanco del reactivo. CALCULOS Suero: (A) Muestra X 5 (Conc. Patrn)= mg/dL de fsforo en la muestra (A) Patrn Orina 24 h: (A) Muestra X 5 vol.(dL)orina 24h= mg/24 h de fsforo (A) Patrn Factor de conversin: mg/dL X0.323= mmol/L CONTROLO DE CALIDAD. Es conveniente analizar junto con las muestras sueros control valorados: SPINTROL H Normal y Patolgico (Ref. 1002120 y 1002210). Si los valores hallados se encuentran fuera del rango de la tolerancia, revisar el instrumento, los reactivos y el calibrador. Cada laboratorio debe disponer su propio Control de Calidad y establecer correcciones en el caso de que los controles no cumplan con las tolerancias. VALORES DE REFERENCIA Suero o plasma: Nios 4,0-7,0 mg/dL= 1,29-2.26 mmol/L Adultos 2,5-5,0 mg/dL= 0,80-1.61 mmol/L Orina: Adultos 0,4-1,3 g /24h Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores d referencia. RESULTADOS: PACIENTE 1. FOSFORO: 3.8 mg/dL ESQUEMAS Y OBSERVACIONES: FUENTE: www.quimicaclinicauv.blogspot.com 18 st.371 p.347

Se procede a realizar la tcnica para posteriormente hacer la lectura de absorbancia del problema y finalizar con los clculos. CONCLUSIONES: He concluido que el fsforo intervienen en funciones vitales para los seres vivos, por lo que est considerado como un elemento qumico esencial. El fsforo, por ejemplo, como molcula de Pi (fosfato inorgnico), forma parte de las molculas de ADN y ARN, las clulas lo utilizan para almacenar y transportar la energa mediante el adenosn trifosfato. Adems, la adicin y eliminacin de grupos fosfato a las protenas, fosforilacin y desfosforilacin, respectivamente, es el mecanismo principal para regular la actividad de protenas intracelulares, y de ese modo el metabolismo de las clulas eucariotas tales como los espermatozoides. BIBLIOGRAFIA: Enciclopedia mdica en espaol. Fsforo http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/002424.htm en la dieta.


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PRACTICA # 4 DETERMINACIN DE SODIO Y CLORUROS EN SUERO (TCNICA DEL IN SELECTIVO)INTRODUCCION: La medicin de ion selectivo La medicin de ion selectivo es un mtodo para la determinacin de las concentraciones de iones disueltos. Entre los ejemplos de cationes y aniones que pueden medirse directamente en las soluciones se encuentran los del potasio, sodio, flor o cloruro. Mediante procedimientos indirectos, por ejemplo la titulacin, es posible determinar los iones de aluminio, nquel o sulfato. La medicin con electrodos de ion selectivo es un procedimiento potenciomtrico como la medicin de pH. En este campo hay dos clases de medicin: 1. Electrodo de ion selectivo separado y electrodo de referencia 2. Electrodos combinados de ion selectivo con electrodo de referencia incorporado. Dependiendo del tipo de in que se desee medir, la membrana del electrodo de referencia puede consistir en una sal difcilmente soluble de ese in (electrodo de estado slido), en una membrana de PVC modificada con un intercambiador inico o un portador de iones (electrodo de matriz), en una membrana de vidrio (electrodo de vidrio) o en una membrana permeable a los gases (electrodo sensible a los gases). La actividad de los iones a ser medidos determina el potencial del electrodo combinado. Al aumentar la actividad de los aniones la tensin se vuelve ms negativa y se hace ms positiva con los cationes. Un medidor de pH e iones calcula el valor de concentracin de la solucin a partir de la seal del electrodo combinado. FUENTE: www.quimicaclinicauv.blogspot.com 20

Esto tiene mltiples aplicaciones: las concentraciones de fluoruro se determinan segn la norma DIN 38405, el contenido de cloruro en asfalto o las concentraciones de nitrato en los zumos de verduras son otros ejemplos de la aplicacin de las tcnicas de medicin por el mtodo de ion selectivo. REACTIVOS: Al parecer los reactivos se encuentran ionmetro. No se necesita un reactivo adicional. COLECCION Y ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA (SUERO): 7. El suero no hemolizado es la muestra recomendada. 8. No utilice otro anticoagulante que no sea heparina. 9. Se necesita por lo menos 3 ml. de suero para la muestra. 10. No se deben utilizar muestras viejas que contienen precipitado. MATERIALES REQUERIDOS: 5. Los instrumentos para la extraccin del suero. 6. Tubos de ensayo/gradilla CALIBRACION: Utilice el apropiado. CALCULOS: ABS. DESCONOCIDO / ESTANDAR (CONC. DEL ESTANDAR) =__________ CONTROL DE CALIDAD: La validez de la reaccin debe ser monitoreada por el uso de suero control normal y anormal. Con concentraciones de calcio conocidas. El valor asignado a la reaccin se debe confirmar con la aplicacin elegida. Si no se obtiene el rango de valores apropiado en la prueba, puede ser indicador de deterioro del reactivo, falla en los instrumentos o errores en el procedimiento. VALORES ESPERADOS: 8.5 10.5 mg/dl Nios menores de 12 usualmente tienen valores normales elevados que disminuyen con la edad. Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango normal. OBSERVACIONES Y ESQUEMAS: FUENTE: www.quimicaclinicauv.blogspot.com 21 estndar acuoso de calcio (10mg/dl) o un calibrador incluidos en el

Se introduce una pequea cantidad de plasma al ionometro para que este por medio de una serie de mecanismos y electrodos especficos realice la cuantificacin de de sodio y cloro. CONCLUSIONES: He concluido que por medio de esta tcnica se puede cuantificas con mayor rapidez y precisin sodio y cloro en una muestra sangunea, as como tambin facilita la carga de trabajo en un laboratorio donde se tengan que procesar varias muestras a la vez, ya que por mtodos colorimetricos requieren tiempos mas prolongados, que mtodos de ion especifico. BIBLIOGRAFIA: Ionometros. http://wtw.de/media/ES_L_05_ISE_024_029_I.pdf


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PRACTICA # 5 ESTUDIO DE LQUIDO CEFALORAQUDEOINTRODUCCION: LQUIDO CEFALORRAQUDEO El lquido cefalorraqudeo o cerebroespinal, conocido como LCR, es un lquido que baa el cerebro y la mdula espinal. Circula por los ventrculos cerebrales y el canal medular y se almacena en las cisternas cerebrales. El lquido cefalorraqudeo puede enturbiarse por la presencia de leucocitos o la presencia de pigmentos biliares. Numerosas enfermedades alteran su composicin y su estudio es importante y con frecuencia determinante en las infecciones menngeas, carcinomatosis y hemorragias. Tambin es til en el estudio de las enfermedades desmielinizantes del sistema nervioso central o perifrico.

Funcin del LCR El lquido cefalorraqudeo tiene tres funciones vitales importantes: 1. Mantener flotante el encfalo, actuando como colchn o amortiguador, dentro de la slida bveda craneal. Por lo tanto, un golpe en la cabeza moviliza en forma simultnea todo el FUENTE: www.quimicaclinicauv.blogspot.com 23

encfalo, lo que hace que ninguna porcin de ste, sea contorsionada momentneamente por el golpe. 2. Servir de vehculo para transportar los nutrientes al cerebro y eliminar los desechos. 3. Fluir entre el crneo y la medula espinal para compensar los cambios en el volumen de sangre intracraneal, manteniendo una presion. (la cantidad de sangre dentro del cerebro).

Formacin del LCR El LCR es producido en un 70% en los plexos coroideos de los cuatro ventrculos cerebrales, sobre todo los laterales y 30% del ependimo a razn de 0.35ml/minuto o 500 cc/24 horas. El drenaje del lquido cefalorraqudeo se lleva a cabo a travs de las vellosidades aracnoideas, proyeccin de las clulas de la aracnoides sobre los senos vasculares que alberga la duramadre. Estos senos desembocarn directamente en el torrente sanguneo, en la regin ms anterior del cerebro est el espacio subaracnoideo de los lbulos olfatorios; que se contina con un espacio alrededor de los nervios olfatorios (por lo tanto, queda muy cerca de la mucosa olfatoria y el espcio areo de la nariz); desde esta region pasa a ndulos linfticos. Circulacin del LCR La circulacin del lquido cefalorraqudeo comienza en los ventrculos laterales, contina hacia el tercer ventrculo y luego transcurre por el acueducto cerebral hasta el cuarto ventrculo. Desde all fluye, a travs de un conjunto de orificios (uno central y dos laterales), al espacio subaracnoideo, que cubre el sistema nervioso central. Por ltimo, el lquido se incorpora al torrente sanguneo. Todas las superficies ependimarias de los ventrculos y las membranas aracnoideas secretan cantidades adicionales de lquido y una pequea FUENTE: www.quimicaclinicauv.blogspot.com 24

cantidad proviene del propio encfalo, a travs de los espacios perivasculares que rodean los vasos sanguneos que ingresan en el encfalo. El lquido secretado en los ventrculos laterales y en el tercer ventrculo se dirige a lo largo del acueducto de Silvio hasta el cuarto ventrculo, donde se agrega otra pequea cantidad de lquido. Luego abandona el cuarto ventrculo a travs de tres pequeas aberturas laterales, dos agujeros de Luschka laterales y el agujero de Magendie en lnea media, que ingresan en la cisterna magna, un gran depsito de lquido ubicado por detrs del bulbo raqudeo y por debajo del cerebelo. La cisterna magna se contina con el espacio subaracnoideo que rodea todo el encfalo y la mdula espinal. Luego, casi todo el lquido encefalorraqudeo fluye a travs de este espacio hacia el cerebro. Desde los espacios subaracnoideos cerebrales, el lquido fluye en las mltiples vellosidades aracnoideas que se proyectan en el gran seno venoso sagital y otros senos venosos. Por ltimo, se vaca la sangre venosa a travs de las superficies de las vellosidades.

Obtencin de LCR Se puede obtener, por puncin lumbar, por puncin cisternal, o por puncin ventricular. La obtencin de este lquido es importante debido a que es un importante elemento de diagnstico de enfermedades neurolgicas, como ser sndromes menngeos, hemorragias subaracnoideas, tumores cerebro-espinales, etc. Para la puncin lumbar se utiliza una aguja de aproximadamente 10 cm. con mandril. El paciente puede estar sentado o acostado. La puncin se la realiza entre la cuarta y la quinta vertebras lumbares, y tan solo se espera a que comience a gotear este lquido. Adems, mientras el paciente se encuentra punzado, es posible medir la presin de este lquido con la utilizacin de un manmetro. Para la puncin cisternal, lo nico que debe cambiarse es la posicin del paciente, el cual s o s debe estar sentado, y adems con hiperflexin cervical, ya que la aguja se introduce en el espacio accipito-atloideo. FUENTE: www.quimicaclinicauv.blogspot.com 25

Razones por las que se realiza el examen

Este examen se hace para medir las presiones en el lquido cefalorraqudeo y para recoger una muestra de ste con el fin de realizar pruebas adicionales. El LCR se puede utilizar para diagnosticar ciertos trastornos neurolgicos, particularmente infecciones (como meningitis) y dao cerebral o dao a la mdula espinal.Valores normales

Los valores normales varan de un laboratorio a otro, pero tpicamente fluctan de la siguiente manera:

Presin de 50 a 180 mm H20 Apariencia: transparente, sin color Protena total en LCR: 15 a 45 mg/100 mL Gamma globulina: 3 a 12% de la protena total Glucosa en LCR: 50 a 80 mg/100 mL (o aproximadamente 2/3 del nivel de azcar en la sangre) Conteo de clulas del LCR: 0 a 5 Glbulos Blanco, ausencia de Glbulos Rojos. Cloruro: 110 a 125 mEq por litro

Nota: mg/mL = miligramos por mililitro; mEq/L = miliequivalente por litroSignificado de los resultados anormales

Si el LCR luce turbio, eso podra significar que hay una infeccin o una acumulacin de glbulos blancos o protena. Si el LCR luce sanguinolento o rojo, puede ser un signo de sangrado u obstruccin de la mdula espinal. Si es marrn, naranja o amarillo, FUENTE: www.quimicaclinicauv.blogspot.com 26

puede ser un signo de aumento de la protena en el LCR o un sangrado previo (hace ms de 3 das). El aumento de la presin en el LCR puede deberse al aumento de la presin intracraneal (presin en el crneo); mientras que la disminucin en la presin del LCR puede deberse a un tumor de mdula espinal, shock, desmayo o coma diabtico. El aumento de la protena puede deberse a sangre en LCR, diabetes, polineuritis, tumores, lesin y cualquier afeccin inflamatoria o infecciosa; mientras que la disminucin de la protena es un signo de produccin de LCR rpida. El aumento de los niveles de gamma globulina pueden deberse a enfermedades tales como esclerosis mltiple, neurosfilis o sndrome de Guillain-Barr. El aumento de la glucosa es un signo de azcar elevado en la sangre; mientras que la disminucin de la glucosa puede deberse a: hipoglicemia (azcar bajo en la sangre), infeccin bacteriana o mictica (como meningitis), tuberculosis o ciertos tipos de meningitis. El aumento de los glbulos blancos en el LCR puede ser un signo de meningitis, infeccin aguda, inicio de una enfermedad crnica, tumor, absceso, accidente cerebrovascular, enfermedad desmielinizante (como la esclerosis mltiple). La presencia de glbulos rojos en la muestra de LCR puede ser un signo de sangrado en dicho lquido o el resultado de una puncin lumbar traumtica. METODOLOGA: CARACTERSTICAS FSICAS Volumen: Aspecto: Valores de Referencia: Transparente. ANORMALIDADES TURBIDEZ: Cuando menos 200 leucocitos/l causan turbidez ligera. Presencia de Microorganismos. Medios de contraste. Grasa epidural.

Color: Valores de Referencia: Incoloro FUENTE: www.quimicaclinicauv.blogspot.com 27

ANORMALIDADES

Blanco Turbio: Cuenta alta de Leucocitos. Aumento en los Valores de Referencia de Protenas. Xantrocrmico: Incremento en eritrocitos y presencia de xantocroma que se deben con mayor presencia a hemorragia Subaracnoidea. Presencia de Bilirrubina. Presencia de Carotenoides. Lactantes Prematuros. Obscuros: Melanosarcoma menngeo. Aumento de Protenas. Inmadurez hematoenceflica. 7.35

PH: Valores de Referencia: 7.32 ANORMALIDADES

Cambios en el pH sanguneo. Acidosis en Meningitis purulentas. Hemorragias subaracnidea postcirugas cerebrales.

Red de Fibrina: Valores de Referencia: Negativo. ANORMALIDADES Aumento de Protena del LCR (100 mg%). Muestras refrigeradas. Concentraciones de fibringeno causado por punciones traumticas. Ciertos tipos de Meningitis 28


Neurosfilis.

CARACTERSTICAS QUMICAS. PROTENAS TOTALES: Valores de Referencia: 15 45 ml/dl. Metodologa: 1. Medir 0.5 ml. de LCR, aadir 1.5 ml. de Ac. Sulfosaliclico al 3%. Mezclar y pbservar la turbidez, dependiendo del grado de turbidez hacer las diluciones requeridas (1:2, 1:4, a 10, 25, 50 o hasta 100 segn sea necesario. 2. Medir: LCR Solucion Salia cido Sulfosaliclico PROBLEMA (ml) 2.0 6.0 BLANCO (ml) 2.0 6.0

3. Mezclar y dejar reposar por 10 minutos. 4. Efectuar las lecturas contra su blanco a 440 nm (%T). 5. Si se realiz dilucin el resultado se multiplica por ella. Aumenta en: Normalmente en el neonato y en el adulto de edad avanzada. Presencia de sangre. Aumento en la permeabilidad de la barrera hematoceflica: infecciones bacterianas, micticas, TB, meningitis, Hemorragia intracraneal. Obstruccin de la circulacin del LCR como en casos de tumor. Aumento e la sntesis de IgG, enfermedades del colgeno, esclerosis mltiple. FUENTE: www.quimicaclinicauv.blogspot.com Disminuye en: Prdida de LCR por escape como el desgarre por traumatismos, rinorrea, otorrea, en algunos incrementos de la filtracin a travs de la aracnoides. Hipertiroidismo. Mecanismo desconocido.

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GLUCOSA: Valores de Referencia: 50-75 mg/dl. Metodologa: Seguir la tcnica anexa en el reactivo que se utiliza en el laboratorio. Aumenta en: Algunos casos Meningitis asptica viral. Aumento falso hiperglucemia srica Disminuye en: El 50% de los casos con Meningitis bacteriana. El 25% de los pacientes con Meningoencefalitis variable en meningitis. Disminucin variable en meningitis (TB, hongos, virus). Hemorragia subaracnoidea. Algunos casis de neurosfilis. Disminucin falsa secundaria a hipoglucemia.

de con

CLORUROS: Valores de Referencia: 118-128 mEq/l. Metodologa: Seguir la tcnica anexa en el reactivo que se utiliza en el laboratorio. Aumenta en: Aumento en la retencin renal de Cloruros. Nefritis con insuficiencia renal e hipercloremia. Deshidrataciones sin prdida de electrolitos. Disminuye en: Neumonas neumocococicas. Estenosis pilrica y duodenal. Meningitis tuberculosa. Su ascenso a la normalidad puede significar mejora. Neurosfilis.

DESHIDROGENASA LCTICA (DHL): Valores de Referencia: 1-25 U:I/37C. til para identificar enfermedades del SNC Metodologa: Seguir la tcnica anexa en el reactivo que se utiliza en el laboratorio. FUENTE: www.quimicaclinicauv.blogspot.com 30

Aumenta en: Padecimientos que disminuye sanguneo disminucin oxigenacin del convulsiones, respiratoria, intracraneal, hidrocefalia, mltiple, bacteriana. PRUEBAS INMUNOLGICAS. Determinacin de VDRL: RECUENTO CELULAR.

en los el flujo cerebral, de la encfalo, alcalosis hemorragia esclerosis meningitis

Disminuye en: De poca clnica.

importancia

Valores de Referencia: Negativo

Valores de Referencia: Clulas Linfocitos Neutrfilos Clulas Endoteliales Macrfagos Eosinfilos Eritrocitos Metodologa: En una pipeta de Thoma se aspira lquido de Trk hasta la marca y se lleva a la marca 1.1 con LCR. Agitar bien, desechar las primeras gotas y llenar la Cmara de Neubauer, dejar reposar pro 2 minutos. Efectuar el conteo en los 9 cuadros. Nmero de Leucocitos/mm3 entre 9 y multiplicado por 10. = conteo en los 9 cuadros dividido 0-5/l 100% 0% Ocasionales 0% 0% Muy escasos

Para Lquidos con alto conteo Llenar la pipeta hasta 0.5 con LCR y hasta 11 con liq. De Trk. Contar los cuatro cuadros de los extremos Calculo: el No. de eritrocitos contados se multiplica por 50. De 10-200 clulas,

Meningitis viral. 31


principalmente

linfocitos.

De 200-500 clulas, linfocitos o granulocitos.

Ms de 500 clulas, principalmente granulocitos. Presencia inmaduras de Clulas

Neurosfilis tarda. Escerosis mltiple. Tumores. Trobosis cerebral. Meningitis tuberculosa. Coriomeningitis. Infecciones en el SNC. Sfilis meningovascular. Meningitis bacteriana aguda. Leucemia menngea Meningitis carcinomatosa.

EXAMEN MICROSCPICO. TINCION DE GRAM: TINCIN DE ZIEHL NEELSEN: PREPARACIN CON TINTA CHINA: Metodologa: Colocar en un tubo de ensayo de 2-4 ml. de LCR, centrifugar a 1500 rpm durante 15 minutos, decantar y hacer preparacin con tinta china y extensiones en laminillas, dejar secar al aire y al calor. Para la preparacin se coloca una pequea cantidad de sedimento en un portaobjeto, se mezcla cuidadosamente con una gota de tinta china, se coloca un cubreobjetos y se observa al microscopio con objetivo seco dbil y fuerte. En las extensiones de laminillas realizar tinciones de Gram y Ziehl Neelsen. RESULTADOS: Nombre del paciente: Hijo de Gabriela Zavaleta CARACTERSTICAS FSICAS Volumen: aproximadamente 2 ml. Aspecto: Incoloro transparente. Color: Incoloro. CARACTERSTICAS QUIMICAS Glucosa: 64 mg/dl FUENTE: www.quimicaclinicauv.blogspot.com 32 Valores de Referencia: Negativo

Deshidrogenasa Lctica: 30.384 ml/dl ESQUEMAS Y OBSERVACIONES:

Se procede a ejecutar el procedimiento como lo indica la tcnica para glucosa y deshidrogensa lctica para posteriormente realizar la lectura de absorbancia en el espectrofotmetro y por ultimo se realizan los clculos pertinentes para obtener los resultados requeridos. CONCLUSIN: He concluido que es de suma importancia el anlisis de lquidos corporales, es por ello que su anlisis se debe realizar como lo indica la tcnica, para obtener resultados precisos que le faciliten al medico el diagnostico oportuno en un tiempo corto. BIBLIOGRAFIA: Nathan, BR. Cerebrospinal Fluid and Intracranial Pressure. In: Goetz, CG, ed. Textbook of Clinical Neurology, 2nd ed. Philadelphia, Pa:WB Saunders Company; 2003:511-524.


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DETERMINACIONES HORMONALESLos anlisis bsicos para detectar compuestos qumicos en materiales biolgicos son tres: biolgicos, fisicoqumicos y de unin. Los anlisis o tcnicas de unin se han definido como aquellos que utilizan molculas que se enlazan especfica y reversiblemente a las sustancias que interesen detectar o cuantificar. Estas tcnicas se utilizan frecuentemente para cuantificar molculas que estn presentes en fluidos biolgicos, en concentracin de nanogramos por mililitro (10-9 g/mL) o de picogramos por mililitro (10-12 g/mL). En la actualidad, mediante las tcnicas de unin se realizan cotidianamente la deteccin de hormonas que se encuentran en cantidades muy pequeas en fluidos biolgicos. Son varias las tcnicas de unin, algunas de stas son: los inmunoanlisis, el ensayo de enlace competitivo con protena transportadora y el ensayo de unin con receptor. La tcnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanlisis.

Los inmunoensayos (IE).Un IE se define como una tcnica analtica que usa anticuerpos (Ac), para la determinacin selectiva de compuestos presentes en muestras biolgicas. Las principales ventajas de los IE consisten en que son altamente selectivos, tienen bajos lmites de deteccin. Por su alta selectividad los IE pueden ser usados en muestras complejas, como orina o sangre, con poca o ninguna preparacin de la muestra. Estos mtodos son, tambin, relativamente econmicos y una vez puestos a punto fciles de realizar. Todas estas caractersticas hacen que los IE sean los mtodos de eleccin para mltiples aplicaciones endocrinolgicas PRINCIPIO Y CLASIFICACIN El principio de todas estas pruebas consiste en la combinacin de protenas de alta sensibilidad y especificidad (Ac) con los ligandos (antgenos [Ag]) a dosar. Los IE se pueden clasificar de acuerdo a: 1.- El tipo de marca (sustancia que se incorpora a una molcula a fin de poder identificarla) en: FUENTE: www.quimicaclinicauv.blogspot.com 34

Radioinmunomarcados: los dos ms frecuentemente usados son el radioinmunoensayo (RIE) de competicin y los ensayos inmunoradiomtricos (IRMA) que utilizan ispotos radioactivos. Enzimticos: en este caso la marca es una enzima. Ejemplos de estos ensayos son el enzimoinmunoensayo de competicin (EIA), el ensayo inmunoabsorbido a enzimas o enzyme linked immunosobent assay (ELISA), el inmunotest-enzimomonitoreado (EMIT) y los test inmunoenzimomtricos (IEMA) De fluorescencia: basados en marcas fluorescentes, por ejemplo el fluoroinmunoensayo (FIA) y el inmunofluoromtrico (IFMA).

2.- La concentracin de sus reactivos en: IE de competicin: en los cuales los Ac son usados en una concentracin limitada con un antgeno (Ag) marcado. Inmunomtricos: en los cuales los Ac estn marcados y en exceso.

El radioinmunoanlisis (RIA)El RIA, como un ejemplo de los ensayos de unin, tambin se le ha denominado ensayo de saturacin, anlisis de desplazamiento, anlisis de enlace insaturado, anlisis de fraccin no enlazada, radioensayo de dilucin, anlisis competitivo, radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomtrico. Todos los ensayos de unin, se caracterizan por estar constituidos por tres componentes bsicos, la molcula enlazadora (ligador o unidor), la molcula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador). La molcula ligadora debe ser capaz de unirse nicamente con aquella que interesa medir. Es decir debe ser especfica. Adems la unin tiene que ser suficientemente estable, propiedad que se le denomina afinidad. Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de molcula a pesar de existir varias molculas estereoqumicamente semejantes.

CINETICA DEL INMUNOANALISIS.Se tomar como modelo de la cintica de los ensayos de unin al RIA que utiliza anticuerpos que se comportan como si presentaran un sitio de unin. El anlisis consiste en colocar conjuntamente el anticuerpo (Ac), el antgeno (Ag) y trazador (Ag*) en tubos de ensayo bajo condiciones fisicoqumicas controladas, como son: temperatura, volumen, acidez y concentracin, para que el Ac se una con el Ag y con el Ag*. Se forma as el complejo de unin Ag:Ac, como se muestra a continuacin: Ag + 2 Ac + Ag* < > Ag:Ac + Ag*:Ac Formado el complejo, se procede a mantener constantes la cantidad de Ac y Ag*, pero variar la cantidad de Ag FUENTE: www.quimicaclinicauv.blogspot.com 35

REACTIVOSSe necesitan 3 reactivos especficos para realizar un IE. Para el caso del RIE es un Ag marcado, el Ag en concentracin conocida (estndar de referencia) y un Ac especfico capaz de reaccionar contra dicho Ag. Tambin es necesario tener un mtodo de separacin entre la fraccin unida al Ac y el Ag libre marcado. MTODOS DE SEPARACIN DE LA FRACCIN LIBRE DE LA UNIDA El clsico mtodo inmunolgico para separar la fraccin unida al Ac del Ag libre consista en la precipitacin espontnea de los complejos Ag-Ac. No obstante, con el uso generalizado de los RIE de alta sensibilidad se requiere que la concentracin molar de los reactivos sea tan baja que la precipitacin espontnea no se produce y los complejos Ag-Ac permanecen solubles. Se han usado una amplia variedad de mtodos para la separacin: precipitacin de complejo Ac-Ag con un segundo Ac dirigido contra el complejo (Mtodo del doble Ac) o bien con protena A (compuesto en suspensin que se une a la porcin Fc de las inmunoglobulinas), uso de solventes orgnicos o la precipitacin salina para precipitar los complejos, adsorcin de complejos al material de fase slida y adsorcin del Ag libre a material de fase slida tal como celulosa, carbn activado, silicatos, o resinas de intercambio. El mtodo del doble Ac es el de eleccin en el desarrollo de nuevos procedimientos del RIE. No obstante, el costo del segundo Ac puede convertirlo en excesivamente caro cuando miles de muestras deben a ser analizadas. El mtodo acuoso de polietilenglicol para la precipitacin de los complejos puede ser usado luego de que un ensayo haya sido validado con la metodologa del doble Ac. La adsorcin o la formacin de complejos Ac-Ag en una fase slida es un mtodo generalmente aplicado en los kits comerciales ya que brinda una alta sensibilidad, precisin y reproducibilidad; no obstante, presenta la limitacin de su costo.

ENSAYOS INMUNORADIOMTRICOSComo alternativa para los ensayos de saturacin de equilibrio donde se produce una competicin entre el ligando marcado y el no marcado por un limitado nmero de sitios de unin, quedando algo del ligando desconocido sin reaccionar (no unido), existe otra tcnica en la cual todo el Ag desconocido reacciona con un exceso de Ac marcado.


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Esta ltima tcnica se llama inmunomtrica. En teora como todo el Ag desconocido ha formado complejos con el Ac marcado, el Ag es directamente detectable con este mtodo, por eso se obtiene mayor sensibilidad que con los mtodos convencionales de equilibrio. INMUNOENSAYOS ENZIMTICOS Probablemente el desarrollo ms significativo en IE en los ltimos aos ha sido la sustitucin de los radioistopos por enzimas. En diferentes variaciones de esta tcnica tanto el Ag, el Ac primario, o incluso el segundo Ac pueden ser marcados enzimticamente. En los enzimoinmunoensayos (EIE) homogneos, no es necesaria una separacin fsica de la fraccin unida de la libre. Tambin el Ag marcado con la enzima y el Ag no marcado (analito) compiten por un nmero limitado de sitios de unin al Ac. El marcador enzimtico puede estar inactivo o contrariamente tornarse activo cuando se une al Ac. El cambio en la actividad enzimtica, evidenciado por la adicin de un sustrato cromognico y expresado en variaciones de absorbancia a una determinada longitud de onda ( Abs), es funcin del marcador enzimtico unido. Una segunda categora de los EIE esta representada por el ELISA, donde los inmunoreactantes estn inmovilizados en soportes de fase slida y tanto el Ag, el Ac primario, el segundo Ac pueden estar marcados con la enzima. Los EIE tienen la ventaja de poder ser realizados en forma inmediata en un laboratorio convencional qumico, ya que no requieren personal especialmente entrenado, precauciones del manejo de radioactivos ni equipos caros de deteccin. No obstante, los EIE no tienen la misma aplicabilidad para medir molculas grandes como la de las hormonas polipeptdicas. Uno de los principales problemas potenciales el impedimento estrico en los sitios de unin a la enzima cuando molculas grandes se unen a las enzimas. La sensibilidad de los EIE puede no ser suficiente para medir concentraciones extremadamente bajas en las cuales algunas hormonas polipeptdicas circulan; adems la medicin de la actividad enzimtica est sujeta a factores medioambientales (pH, temperatura, etc.) en adicin a la interferencia de estos a la reaccin Ag-Ac.

FLUOROINMUNOENSAYOFUENTE: www.quimicaclinicauv.blogspot.com 37

El fluoroinmunoensayo (FIA) emplea los mismos principios comunes descriptos, usando un marcador fluorescente sobre la molcula marcadora (Ag, Ac, o segundo Ac). Los ensayos pueden ser competitivos o no y despus de la separacin de la fraccin unida de la libre la cuantificacin se realiza con tcnicas fluoromtricas. Se incluyen tambin en esta categora los ensayos inmunofluoromtricos (IFMA) y los IE basados en la polarizacin fluorescente.

BIBLIOGRAFIA: Iovine, E; Selva, A.A. El Laboratorio en la Clnica. 3ra. Ed. Mdica Panamericana, Buenos Aires 1985


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