Guia de Practicas de Bioquimica II Ingenieria Biotecnologica

GUIA DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA II INGENIERIA BIOTECNOLOGICA

PRACTICA N 1

GLICOLISIS

RELACIN DE EXPERIMENTOS1.- Gliclisis anaerbica en un preparado de msculo esqueltico de conejo

a) Determinacin de glucosa basal y despus de 1 hora

b) Determinacin de cido lctico basal y despus de 1 hora.

INTRODUCCIN

La gliclisis es una va metablica que consiste en una secuencia de reacciones citoplasmticas a travs de las cuales 1 mol de glucosa se convierte en 2 moles de piruvato con la concomitante produccin de ATP y la reduccin del NAD+ a NADH + H+ si es que ocurre en presencia de oxgeno. En condiciones de anaerobiosis, es decir en ausencia de oxgeno, stos 2 moles de piruvato se reducen a 2 moles de Lactato a expensas del NADH + H+. En presencia de oxgeno los tejidos pueden posteriormente oxidar el piruvato totalmente hasta CO2 y H2O a nivel mitocondrial.

La gliclisis es una va que ocurre en todas las clulas del organismo, con la finalidad de hacer posible que la glucosa pueda degradarse, proporcionando la energa qumica necesaria para la actividad celular en forma de compuestos fosfricos ricos en energa (ATP). As, por molcula de glucosa que se convierte en 2 de cido lctico, se produce una sntesis neta de 2 molculas de ATP, de tal modo que el proceso global que ocurre en las clulas, podra resumirse como:

Glucosa + 2ADP + 2Pi 2 Lactato + 2 ATP + 2 H2O

Tanto las reacciones as como las enzimas que catalizan las diversas etapas de la gliclisis se encuentran en el citoplasma, no obstante existe una estrecha asociacin con las mitocondrias en donde se lleva a cabo la descarboxilacin oxidativa del Piruvato, las reacciones del ciclo de Krebs y la fosforilacin oxidativa.

En la presente prctica se evaluar a la gliclisis a travs del consumo de glucosa y la produccin de cido lctico en un sistema de ensayo que contiene homogenizado de msculo esqueltico mantenido en condiciones de anaerobiosis a 37 C durante una hora.

EXPERIMENTO 1

Gliclisis anaerbica en un sistema preparado con msculo esqueltico de cobayo

Objetivos

1. Demostrar como la glucosa en ausencia de oxgeno se transforma en cido lctico, utilizando como fuente enzimtica un homogeneizado de msculo de cobayo o en caso contrario de rata.

2. Comprobar el consumo de glucosa durante el proceso

3. Comprobar la produccin de cido lctico en condiciones de anaerobiosis

Procedimiento:a) Degradacin de la glucosa:1. En un Erlenmeyer de 125 ml. limpio y seco, medir 10 ml de una solucin de glucosa al 1%, disuelta en una solucin Krebs Ringer Fosfato (*) conteniendo Nicotinamida 0.03 M, NAD+ 0.2 % y ATP 0.2 %.

2. Incubar la solucin en bao mara a 37 C por 10 minutos.

3. Agregar al Erlenmeyer 50 ml de homogenizado de msculo al 10 % (P/V), 8,1016,18,20,22preparado previamente en solucin Krebs Ringer Fosfato.

4. Mezclar y rpidamente tomar un volumen de aproximadamente 20 ml en una probeta y colocarlo inmediatamente en hielo. Esta muestra constituye la muestra basal a tiempo cero.

5. Despus de haber extrado la muestra basal, aadir al Erlenmeyer con la muestra sobrante, un volumen adecuado de parafina lquida, para crear las condiciones de anaerobiosis. Proseguir entonces con la incubacin a 37 C durante 60 minutos. Esta ser la muestra incubada en donde se habr de producir la gliclisis.

6. Realizar las determinaciones de glucosa y cido lctico, tanto en la muestra basal a tiempo cero, as como en la muestra incubada por 60 minutos a 37C, siguiendo la metodologa para cada una de ellas.

b) Determinacin de glucosa. ( Mtodo de Nelson-Somogy ). La de terminacin de glucosa por este mtodo, recomienda que la muestra a analizar est libre de protenas, ya que de no ser as, stas podran reaccionar con el reactivo de cobre utilizado dando interferencia en la coloracin obtenida.

Desprotenizacin:

a) Para cada muestra, medir en un tubo de ensayo 4 ml de agua destilada y agregar 2 ml. de muestra respectiva.

b) Agregar 2 ml. de ZnSO4 al 5 %, agitar y dejar en reposo por 5 minutos.

c) Aadir 2 ml. de Ba(OH)2 0.3 N. Agitar y dejar en reposo por 5 minutos.

d) Transcurrido el tiempo, proceder a centrifugar o filtrar dichas muestras. El filtrado libre de protenas deber ser incoloro y transparente. La determinacin de glucosa se har en este filtrado.

Procedimiento para cuantificar glucosa:

1. Preparar 4 tubos de Folin, de acuerdo a la siguiente tabla:

REACTIVOS1234

Filtrado de la muestra basal

Filtrado muestra incubada

Solucin Estandar (**)

Agua destilada

Reactivo Cprico-alcalino1 ml

---

---

---

1 ml---

1 ml

---

---

1 ml---

---

1 ml

---

1 ml--

---

---

1 ml

1 ml

(**) Solucin estndar de glucosa conteniendo 50 ug/ml. La absorbancia leda del sistema estndar fue de 0.154 D.O. ( 67 UK).

2. Colocar los tubos en bao mara hirviente por 15 minutos.

3. Enfriar los tubos en agua corriente.

4. Aadir a cada tubo, 1 ml del reactivo arsenomolibdato, disolviendo con suave agitacin el Cu2O producido.

5. Completar con agua destilada a 25 ml y mezclar. Dejar en reposo 5 minutos.

6. Leer en el fotocolormetro con filtro verde y anotar.

7. Hacer los clculos respectivos y expresar la concentracin de glucosa en mg %.

c) Determinacin de Acido Lctico (Mtodo Volumtrico).

El cido lctico se determinar por titulacin con una solucin de KOH 0.02 N, utilizando al rojo de fenol como indicador.

Procedimiento:

1. En cada uno de dos beakers medir aproximadamente 15 ml de las muestras basal e incubada respectivamente y hacerlas hervir por 2 minutos teniendo cuidado de que no se proyecten

2. Enfriar y filtrar a travs de una gasa y luego a travs de papel filtro.

3. Proceder a la titulacin de 3 ml de cada muestra con KOH 0.02 N, agregando 1 gota del indicador rojo de fenol, hasta obtener un color naranja-rosa.

4. Anotar el volumen de soda gastado y calcular la normalidad del cido lctico.

Resultados

Anote sus resultados en la siguiente tabla :

MUESTRA BASALMUESTRA INCUBADA

Glucosa en mg %

Acido lctico en mEq/L

En el siguiente espacio discuta los resultados obtenidos

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

INTERROGANTES

1. Defina a la gliclisis anaerbica y gliclisis aerbica

2. En que clulas o tejidos, la glucosa es degradada anaerbicamente, y en cuales aerbicamente

3. Escriba las reacciones de la gliclisis que requieren de ATP y las que producen ATP

a)

b)

c)

d)

4. Cul es la produccin neta de ATP en la oxidacin anaerbica de un mol de glucosa. Haga los clculos respectivos.

5. Como se define la fosforilacin a nivel de sustrato. Qu enzimas de la gliclisis catalizan estas reacciones?

6. Cul es la produccin neta de ATP por la oxidacin aerbica de 1 mol de glucosa hasta CO2 y H2O. Describa de manera general las etapas en donde se forma ATP.

7. Cul es la importancia de la gliclisis para los eritrocitos y las neuronas

8. Mediante un esquema demuestre la funcin del NAD+ en la gliclisis. Por qu no aparecen NADH y NAD+ en la reaccin neta?

9. A qu se llama enlaces fosfricos ricos en energa. Qu intermediarios de la gliclisis lo presentan? 10. Escriba las reacciones irreversibles de la gliclisis, indicando las enzimas que las catalizan

11. Cmo se regula la gliclisis?

12. A partir del G de la gliclisis y del nmero neto de ATPs producidos, calcule la eficiencia en porcentaje del proceso.

13. Qu inhibidores de la gliclisis conoce Ud.? Indique el lugar y el mecanismo de accin de estas sustancias.

14. Si se aadiese CN y/o dicumarol en el experimento de la presente prctica, se afectara la sntesis de ATP de la gliclisis?

PRACTICA N 2

CICLO DE KREBS

RELACION DE EXPERIMENTOS

1.- Determinacin del consumo de oxgeno (Manometra)2.- Determinacin del consumo de piruvato (Colorimetra)INTRODUCCION

Cuando la glucosa se degrada por la va glicoltica se obtiene como producto final piruvato o lactato. En condiciones aerbicas, la etapa siguiente en la degradacin de la glucosa, es la descarboxilacin oxidativa del piruvato a nivel mitocondrial, para formar acetil CoA, el cual puede oxidarse hasta CO2 y H2O en una va metablica llamada ciclo de Krebs, ciclo de los cidos tricarboxlicos o ciclo del cido ctrico el cual funciona en estrecha relacin con la cadena respiratoria mitocondrial. Es necesario remarcar que el acetil CoA no slo proviene del metabolismo de los carbohidratos, sino que tambin se forma durante la beta oxidacin de los cidos grasos o en la oxidacin de algunos aminocidos.

El ciclo de Krebs se realiza en las mitocondrias y est ntimamente ligado a la cadena respiratoria; este hecho tiene importancia metablica por que los hidrgenos provenientes de las oxidaciones producidas en el ciclo de Krebs, son captados por los transportadores de la cadena respiratoria para llevarlos hasta el oxgeno molecular que se reduce y forma agua. Como consecuencia se produce 2 3 molculas de ATP por cada proceso oxidativo.

Durante el ciclo de Krebs ocurre esencialmente lo siguiente: Un compuesto de 4 tomos de carbono (oxalacetato), se condensa con el acetato (acetil CoA) para dar lugar a un cido tricarboxlico de 6 tomos de carbono (citrato). Un ismero de ste el isocitrato es descarboxilado y oxidado para dar un cetocido de 5 carbonos (alfa ceto glutarato), l cual a su vez es descarboxilado oxidativamente para formar un cido dicarboxlico de 4 carbonos (succinato). A partir del succinato se regenera oxalacetato a travs de reacciones en las que ocurren dos oxidaciones.

En esta prctica se utilizar un homogenizado de hgado como fuente de enzimas, y se demostrar el requerimiento de varios cofactores para un buen funcionamiento

del ciclo. Como en este proceso de oxidacin de Piruvato, el oxgeno es reducido hasta agua, el ciclo de Krebs ser estudiado:

1. Midiendo el consumo de oxgeno mediante el empleo de un mtodo manomtrico.

2. Midiendo los micromoles de Piruvato consumidos, mediante un mtodo colorimtrico

Experimento 1

Determinacin del consumo de oxgeno.

La integracin del ciclo de Krebs y la cadena respiratoria mitocondrial va a originar que el oxgeno sea reducido y convertido en agua, producindose un consumo neto de este gas, consumo que puede ser medido mediante el uso del respirmetro de Warburg.

Fundamento del respirmetro de Warburg.

El frasco de Warburg que contiene el sustrato, cofactores y el homogenizado de hgado, en cuyo medio se quiere medir el consumo de oxgeno, es colocado en bao de agua a temperatura constante. Estando cerrado el frasco y en comunicacin con el manmetro, el consumo de oxgeno determinar una disminucin de la presin del sistema, lo cual se evidencia por un desnivel del lquido manomtrico presentes en las columnas. ( el funcionamiento del respirmetro de Warburg as como los clculos respectivos ya fueron indicados en la practica de Fotosntesis: Bioqumica I ) .

Procedimiento.

Se preparan 6 frascos de Warburg; en la copa central de cada uno de ellos medir 0.4 ml de KOH al 20 % y colocar un fragmento de papel filtro plegado en acorden. Luego en el compartimiento principal de cada frasco medir los siguientes reactivos:

123456

ATP 0.01 M0.4 ml0.4 ml----0.4 ml0.4 ml0.4 ml

MgSO4 0.02 M0.3 ml0.3 ml0.3 ml----0.3 ml0.3 ml

NAD0.1 ml0.1 ml0.1 ml0.1 ml---------

Sustrato * ----0.6 ml0.6 ml0.6 ml0.6 ml0.6 ml

Buffer fosfato 0.1 M pH 7.30.5 ml0.5 ml0.5 ml0.5 ml0.5 ml0.5 ml

H2O0.7 ml0.1 ml0.5 ml0.4 ml0.2 ml----

Fluoroacetato --------------------0.1 ml

Homogenizado de hgado **2.0 ml2.0 ml2.0 ml2.0 ml2.0 ml2.0 ml

* El sustrato contiene 5 volmenes de piruvato de sodio 0.1M y un volumen de fumarato de sodio 0.01M.

** El homogenizado de hgado se obtuvo al homogenizar en frio durante 2 minutos, hgado de rata en ayunas con 9 volmenes de sacarosa 0.25 M de buffer tris 0.02 M pH 7.4.

Preparar adems un frasco termobarmetro( TB) que debe contener 4 ml de agua destilada para corregir o compensar los cambios de presin y temperatura durante el experimento.

Equilibrar los sistemas por 10 minutos sin cerrar la llave de los manmetros, permitiendo el libre intercambio gaseoso con el medio ambiente. Cerrar luego la llave de los manmetros y la llave lateral de los frascos de Warburg y hacer la lectura cada 15 minutos.

Expresin de resultados

Confeccionar una Tabla o Cuadro y anotar las lecturas obtenidas cada 15 minutos para cada sistema.

Convertir las lecturas obtenidas en l de oxgeno consumido en una hora para cada uno de los sistemas.

Interpretar los resultados para cada sistema.

Sistema 1: _____________________________________________________________________________________________________________________________Sistema 2: ________________________________________________________CUADRO DE RESULTADOS: ( Completar el siguiente cuadro, realizando los

clculos respectivos ).

Tiemp

TB1

KO2=0.962

KO2=1.033

KO2=0.944

KO2=1.005

KO2=0.896

KO2=0.88

0

183295297289278274275

10

184

234205250230220250

20

186211120220185170229

30

185182 40

299

190135130200

40

188136206173 100100185

50

188 113

135155 65292 80165

60

186 92 48 50275 65145

Consumo de oxgeno

en l / 60

Consumo de Piruvato

en Moles

Sistema 3: ___________________________________________________________

___________________________________________________________________

Sistema 4: _____________________________________________________________

___________________________________________________________________

Sistema 5: ___________________________________________________________

____________________________________________________________________

Sistema 6: ___________________________________________________________

___________________________________________________________________

2.- Determinacin de los micromoles de piruvato consumidos.

Fundamento.

El piruvato reacciona con la 2,4-dinitrofenil hidrazina, dando lugar a la formacin de una hidrazona que en medio alcalino toma una coloracin pardo oscura, cuya absorbancia se mide en el fotocolormetro.

Procedimiento.

Al finalizar el experimento de la medicin del consumo de oxgeno se abren todas las llaves de los manmetros y frascos Warburg. Luego se trasvasa el contenido del compartimento principal de cada frasco a tubos de prueba numerados del 1al 6.

A parte preparar en tubos de prueba los sistemas 1, 2 y 6 (que estn marcados con ) donde el tubo 1 sirve de blanco; los tubos 2 y 6 sirven de estndares.

Luego con los 8 tubos ( 1 6 despus de haber medido el consumo de oxgeno; y los sistemas basales 1, 2 y 6 ) se procede de la siguiente manera:

Medir en tubos de prueba 2 ml del contenido de cada tubo

Aadir 18 ml de ATCA al 5 % . Mezclar. Dejar en reposo por 5 minutos y filtrar.

En otros tubos medir respectivamente:

0.4 ml de cada filtrado

0.6 ml de agua destilada

1.0 ml de 2,4-dinitro fenil hidrazina, dejar 20 minutos en reposo.

Aadir 10 ml de NaOH al 10 %. Dejar en reposo por 5 minutos

Leer con filtro verde

Tubo 1 : 0.038 Tubo 2 : 0.612 Tubo 6 : 0.605

Absorbancia de los tubos del 1 al 6 :

1: 0.038 2: 0.088 3: 0.471 4: 0.467 5: 0.458 6: 0.589Calcular el Factor de calibracin:

Factor de calibracin: .......................

Calcular los micromoles de piruvato consumidos en cada sistema:

1: ............ 2: ............. 3: .............. 4: .............. 5: .............. 6: ...............

INTERROGANTES:

1.- Qu es el ciclo de Krebs, qu importancia tiene y en qu lugar de la clula ocurre?

2.- Haga el balance energtico del Ciclo de Krebs asociado a la cadena respiratoria mitocondrial para un mol de acetil CoA.

3.- Qu finalidad tiene la preparacin del sistema termobarmetro?

3.- Qu finalidad tiene en la presente prctica, el empleo de KOH en el compartimiento central de cada frasco Warburg ?

4.- Qu es el KO2

5.- Explicar la relacin que existe entre el consumo de oxgeno y el funcionamiento del ciclo de Krebs.

6.- Cul es la razn de que el sustrato contenga fumarato?

7.- Qu inhibidores del ciclo de Krebs conoce Ud.? . Dnde actan?

8.-Indique qu vitaminas o derivados de vitaminas se necesitan para la descarboxilacin oxidativa del alfa ceto glutarato. Qu otro cido relacionado con el metabolismo de la glucosa sufre igual transformacin.

9.- Cmo se regula el flujo metablico del ciclo de Krebs. Qu enzimas regulatorias intervienen en este proceso y como son reguladas?

10.- Cul es el rendimiento neto de ATPs, cuando 1 mol de Piruvato es oxidado hasta CO2 y H2O ?. Cul sera el cambio de energa libre ( G ) total?

PRACTICA N 3

FERMENTACION ALCOHOLICA DE LA GLUCOSA


1. Formacin de Acetaldehido y Etanol a partir de glucosa en presencia de Saccharomyces cerevisiae.

a) Identificacin de acetaldehido

b) Cuantificacin de etanol

2. Cuantificacin del contenido alcohlico en diversas bebidas

INTRODUCCION.

Las fermentaciones son procesos anaerbicos que liberan energa para la formacin de ATP en un proceso conocido como fosforilacin a nivel de sustrato. La energa producida en los procesos de fermentacin y que las clulas aprovechan para las reacciones endergnicas, se acumula en forma de ATP; parte de la cual se emplea en la fosforilacin de las hexosas.

La fermentacin alcohlica es un proceso bioqumico que por accin de las levaduras, 1 mol glucosa es convertida anaerbicamente en 2 moles de etanol. Las clulas de levadura son esenciales para producir las enzimas necesarias que participar en el proceso fermentativo, pero una vez que stas estn presentes ya no sern tan indispensables para que la fermentacin se produzca en forma normal.

En levaduras, la glucosa anaerbicamente es convertida en etanol y dixido de carbono, y las etapas enzimticas son idnticas a las de la fermentacin lctica o gliclisis, a excepcin de la etapa terminal catalizada por la Deshidrogenasa lctica, la cual es reemplazada por dos etapas enzimticas adicionales, donde intervienen la Piruvato Descarboxilasa y la Alcohol Deshidrogenasa.

La reaccin de descarboxilacin del Piruvato, en acetaldehido y dioxido de carbono, es catalizada por la Piruvato Descarboxilasa, enzima que requiere de Pirofosfato de Tiamina (PPT) como coenzima, adems de iones Mg2+. Como producto intermediario se forma cido pirvico activo que por liberacin del CO2 se convierte en acetaldehido activo (PPTAcetaldehido), intermediario que luego se descompone en PPT acetaldehido, ste ltimo se reducir a etanol en la reaccin siguiente ; no obstante, una parte del acetaldehido activo se condensa a acetaldehido libre para formar acetil-metil-carbinol. (Acetona).

La conversin de acetaldehido en etanol es llevada a cabo por la alcohol deshidrogenasa, la cual es una enzima que requiere de NADH + H+ y que cataliza la reaccin de izquierda a derecha cuando esta se lleva a cabo en un medio ligeramente cido ( pH de 5 a 6 ), por el contrario en medio ligeramente alcalino (pH 8) esta se realiza de derecha a izquierda.

Como inductores de la fermentacin alcohlica, no slo actan las levaduras de Saccharomyces cerevisiae, sino tambin las bacterias: pseudomonas, xantomonas y aeromonas.

En la fermentacin alcohlica, adems del etanol y dioxido de carbono se originan productos secundarios como glicerina, cido actico y cido succnico.

EXPERIMENTO 1.

FERMENTACION DE LA GLUCOSA POR Saccharomyces cerevisiae HASTA ACETALDEHIDO Y ETANOL

En 2 matraces ( M-1 y M-2 ) de 50 ml., agregar lo siguiente:

M - 1M 2

1.- Levadura de panificacin fresca

1.0 g1.0 g

2.- Solucin de glucosa al 5 %, recin preparada y a pH 5.5

10.0 ml------

3.- Solucin de glucosa al 5 %, recin preparada y a pH 8.0

------10.0 ml

4.- Mezclar bien y agregar el reactivo sulfito de calcio

------500 mg

5.- Mezclar y agregar rpidamente parafina lquida hasta que

cubra la superficie.5.0 ml5.0 ml

Incubar en bao de agua a 37 C durante 60 minutos

6.- Centrifugar a 3,000 rpm.

10 min.10 min.

Obtener los sobrenadantes por separado para las determinaciones del acetaldehido y etanol

Identificacin del acetaldehido.

Fundamento:

En el sobrenadante de la muestra de incubacin el sulfito de calcio atrapa al acetaldehido, el cual puede observarse por el color azul que se produce al reaccionar con el nitroprusiato de sodio y la piperidina.

Procedimiento.

En 3 tubos de ensayo ( T) debidamente rotulados, agregar lo siguiente:

T - 1T 2T 3

1. Sobrenadante de M 1 1.0 ml------

2. Sobrenadante de M 2 ---1.0 ml---

3. Agua destilada------1.0 ml

4. Solucin de Nitroprusiato de Sodio 0.5 ml0.5 ml0.5 ml

Mezclar y colocar los tubos en bao de agua hirviente por 5 minutos.

5.Observar. Anotar el color y olor caracterstico

del acetaldehido

CUANTIFICACION del Etanol (Mtodo de Shefftel modificado).

Fundamento.

La mezcla oxidante Dicromato-cido sulfrico acta sobre el alcohol etlico transformndolo en cido actico, a la vez que se forma sulfato cromoso con una coloracin que vara del amarillo al verde, en forma proporcional a la concentracin de etanol existente en la muestra, susceptible a ser medido por fotocolorimetra.

Reactivos:

a) Dicromato de potasio.8.524 g.

Agua destilada

1000 ml.

b) Acido sulfrico Q.P.1000 ml

c) Mezcla sulfocrmica: Verter lentamente el cido sulfrico a la solucin de bicromato (Reaccin exotrmica).

Procedimiento:

1. Colocar 0.5 ml de la mezcla sulfocrmica en un frasco de 30 ml. aproximadamente.

2. Colocar exactamente 0.2 ml. de la muestra a analizar en una tira doblada de papel filtro adherida a un tapn de jebe con un alfiler.

3. Finalmente colocar hermticamente en el frasco que contiene la solucin sulfocrmica, cuidando que la tira de papel filtro no toque las paredes del frasco ni el reactivo.

4. Colocar las tapas rosca y llevarlos a Bao Mara hirviente o a estufa a 100 C por 10 minutos.

5. Retirar el tapn con la tira de papel que contiene a la muestra. Enfriar y agregar 12.5 ml de agua destilada.

6. Leer la absorbancia a una longitud de onda de 578 nm.

7. Preparar sistemas estndar del mismo modo que para las muestras problema, slo que en su lugar medir 0.2 ml del estndar respectivo ( 0.5 mg/ml, 1.0 mg/ml y 2 mg/ml ) en la tira de papel filtro.

8. De igual modo preparar un blanco, procediendo exactamente de la misma manera que para la muestra problema, slo que en lugar de esta ltima medir 0.2 ml de agua destilada en la tira de papel filtro.

RESULTADOS.

Calcular los Factores de calibracin respectivos en base a los datos indicados:

Absorbancia

( D.O )Absorbancia netaFactor de

Calibracin.

Blanco0.001-----------------

Estandar 1 ( 0.5 mg/ml )0.005

Estndar 2 ( 1.0 mg/ml )0.009

Estndar 3 ( 2.0 mg/ml )0.018

Anotar los resultados obtenidos del experimento 1 (fermentacin alcohlica de la glucosa ), en el siguiente Cuadro:

T 1T 2T 3

Identificacin de acetaldehido

Coloracin obtenida

Cantidad de etanol (mg % )

Anotar los resultados obtenidos en el experimento 2.

Bebida alcohlicaAbsorbanciaConcentracin en la cantidad de muestraConcentracin en mg %

Blanco0.001

Anizado

Cerveza

Chicha

Pisco

INTERROGANTES Y COMENTARIOS. 1.- Comente o explique los resultados obtenidos en la identificacin del acetaldehido.

2.- Comente o explique los resultados obtenidos en la cuantificacin de etanol del experimento 1.

3.- Esquematice la secuencia de reacciones de la fermentacin alcohlica de la fructosa

4.- Escriba las coenzimas y/o cofactores que necesita la piruvato descarboxilasa y la alcohol deshidrogenasa. 5.- Indique para qu se utilizan los siguientes compuestos o sustancias, en la presente prctica:

Sulfito de calcio:

Solucin sulfocrmica diluida:

6.- Mencione las diferencias entre la fermentacin lctica y fermentacin alcohlica.

7.- De qu otras maneras se puede estudiar la fermentacin alcohlica?

8.- Qu otros compuestos se pueden formar durante la fermentacin alcohlica?

PRACTICA N 4

OXIDACION DE ACIDOS GRASOS Y FORMACION DE CUERPOS CETONICOS

INTRODUCCION:

Como se sabe, la oxidacin de los cidos grasos comprende una serie de reacciones enzimticas que al final conducen a la formacin de Acetil CoA y un acil CoA de 2 tomos de carbono menos; este ltimo compuesto reingresa al ciclo, de tal manera que el cido graso queda convertido finalmente en varios Acetil CoA dependiendo del nmero de carbonos del cido graso. As por ejemplo, para el caso del cido palmtico, oxidacin dar lugar a 8 Acetil CoA y tratndose del cido butrico originar 2 Acetil CoA. Las molculas de Acetil CoA sern ampliamente utilizadas por el organismo y as de primera importancia es el empleo en la produccin de energa, al unirse al oxalacetato y seguir las reacciones del ciclo de Krebs; interviene tambin en la sntesis de cidos grasos, sntesis de colesterol, en procesos de acetilacin. Aqu estudiaremos tambin de forma particular el rol del acetil CoA en la formacin de cuerpos cetnicos, lo que ocurre especialmente en el hgado. Se conocen bajo la nominacin de cuerpos cetnicos a los cidos: Aceto actico, beta hidroxibutrico y a la acetona.

En esta prctica se utilizar un homogenizado de hgado como fuente de enzimas para la oxidacin del butirato y la formacin de cuerpos cetnicos. Se emplear para este efecto, el aparato manomtrico de Warburg para medir el consumo de oxgeno.

OBJETIVOS:

1. Estudiar la oxidacin del cido butrico a travs del consumo de oxgeno utilizando un homogenizado de hgado como fuente enzimtica.

2. Demostrar la necesidad del NAD, iones magnesio y ATP en la oxidacin de los cidos grasos.

3. Determinar cualitativamente la formacin de cuerpos cetnicos en los diferentes sistemas de estudio.

4. Interpretar los resultados sobre el consumo de oxgeno y formacin de cuerpos cetnicos. Procedimiento:

Preparar 4 frascos de Warburg en la siguiente forma:

1. Colocar 0.4 ml de KOH 20% en la copa central de cada frasco y un pedazo apropiado de papel filtro plegado en acordeon, y luego en el compartimiento principal de cada frasco medir lo siguiente:

1234

ATP 0.01M0.4 ml.0.4 ml.-------0.4 ml.

Mg SO4 0.02 M0.3 ml.0.3 ml.0.3 ml.0.3 ml.

NAD 0.1 ml.0.1 ml.0.1 ml.-------

Sustrato -------0.6 ml.0.6 ml.0.6 ml.

Buffer Fosfato 0.1 M; pH 7.40.5 ml.0.5 ml0.5 ml.0.5 ml.

Agua destilada 0.7 ml.0.1 ml.0.5 ml.0.2 ml.

Enzimas 2.0 ml.2.0 ml.2.0 ml.2.0 ml.

NAD 3.0 mg y 43 mg de nicotinamida.

.. Sustrato ( 5 volmenes de butirato de sodio 0.1 M y 1 volumen de Fumarato de sodio 0.01 M.

... Enzimas : Homogenizado de hgado de rata en ayunas con 9 volmenes de sacarosa 0.25 M en buffer

Tris 0.02 M ( pH 7.4 ).

2. Preparar adems, un frasco termobarmetro conteniendo 4 ml. de agua destilada para compensar los cambios de presin y temperatura durante el experimento.

3. Colocar cada frasco en su correspondiente manmetro; sin cerrar la llave de los manmetros, equilibrar durante 10 minutos a 37 C en el aparato de Warburg con agitacin constante. Despus de esta fase inicial, cerrar la llave de los manmetros y proceder a la lectura basal. (Cuadro de Resultados )

4. Continuar las lecturas cada 10 minutos, haciendo las correcciones necesarias de acuerdo a los cambios observados en el termobarmetro. (Cuadro de Resultados )

5. Al final del experimento, calcular el consumo de oxgeno total de cada frasco y trasvasar el contenido de cada compartimiento principal de los frascos a tubos de ensayo enumerados en forma similar.

Identificacin de cuerpos cetnicos:

6. Saturar el contenido de cada frasco con sulfato de amonio slido y dejar en reposo durante 5 minutos. Filtrar despus de decantar los cristales de la sal.

7. A un volumen igual de cada filtrado ( por ejemplo 1.0 ml. ), agregar 3 gotas de NH4OH concentrado y 2 gotas de nitroprusiato de sodio al 5 %. Agitar lateralmente y dejar ambos tubos en reposo durante 5 minutos. La concentracin relativa de cuerpos cetnicos (aceto acetato) en cada tubo ser apreciada por la presencia de un color violeta, cuya intensidad de color ser considerada de 0 a ++++.

INTERPRETACIN DE RESULTADOS:

1.- Interprete y comente los resultados obtenidos en :

Sistema N 1 :

Sistema N 2 :

Sistema N 3 :

Sistema N 4 :

INTERROGANTES:

1.- A travs de un diagrama describa la beta oxidacin del cido butrico

2.- Cul es la razn de que se use fumarato junto al sustrato butirato?

3.- De qu otros modos se podra evaluar la oxidacin de los cidos grasos?

4.- Calcule cuantos ATPs netos se obtienen cuando el butirato se degrada completamente hasta CO2 y H2O y calcule su eficiencia energtica (%).

5.- Donde ocurrir la activacin de este cido graso? , por que?

6.- Hay necesidad de carnitina para la oxidacin de butirato? . por qu?

7.- Explicar la relacin existente entre consumo de oxgeno y oxidacin de cidos grasos.

8.- Un desacoplador de la fosforilacin oxidativa tendra algn efecto sobre la oxidacin de los cidos grasos en la presente prctica?

9.- Cul es el fundamento de la determinacin cualitativa de los cuerpos cetnicos?

10.- Qu finalidad tiene en la presente prctica el empleo de KOH en el compartimiento central del frasco Warburg?

11.- Escriba la reaccin de sntesis de cada uno de los cuerpos cetnicos

12.- Como los cuerpos cetnicos pueden cumplir un rol energtico?

13.- Qu entiende por cetosis. Cules son los llamados cuerpos cetnicos. En qu condiciones se acumulan en el organismo

14.- Qu hormonas estimulan la capacidad de transformar la glucosa en cidos grasos?

15.- Qu hormonas intervienen en la movilizacin de cidos grasos desde los depsitos?

16.- Cual es la principal razn de utilizar acido butrico y no otro acido graso en la

presente practica? Cuadro de Resultados. Complete los datos del siguiente cuadro

TIEMPO

( Minutos) TB1

KO2 = 0.982

KO2 = 1.123

KO2 = 0.954

KO2 = 0.94

0

180298300295280

10 182 260 231 270 258

20 181 229 175 250 230

30 179 220 114 233 221

40 181 197 42 215 208

50 180 168 298 -----

214 198 191

60 180 149 140 162 153

Consumo de Oxgeno

en l.

Cuerpos Cetnicos

+++++++++

PRACTICA No 5DEGRADACIN DE AMINOCIDOS: TRANSAMINACIN


1. Transaminacin utilizando un extracto enzimtico de hgado de paloma

INTRODUCCION

La transaminacin es el proceso que consiste en la transferencia reversible del grupo amino desde un aminocido hasta un cetocido , dando como resultado conversin del primero en un cetocido y el segundo en un nuevo aminocido Esta reaccin es de gran importancia en el metabolismo de los aminocidos y es catalizada por enzimas llamadas TRANSAMINASAS o Aminotransferasas, presentes en la mayora de tejidos animales. El cofactor de estas enzimas es el piridoxal fosfato y para casi todas las transaminasas el alfa-cetoglutarato es el aceptor del grupo amino, formndose por tanto cido glutmico.

R-CH-COO- R-C-COO- L-aminocido + alfa-cetoglutarato alfa-cetocido + L-glutmico El inters clnico est centrado especialmente en dos transaminasas: L-alanina: alfa-cetoglutarato aminotransferasa (Transaminasa glutmico Pirvica o TGP) y L-aspartato: alfa-cetoglutarato aminotransferasa (Transaminasa Glutmico Oxalactica o TGO). Estas enzima tienen una accin eminentemente intracelular, por lo que la actividad srica en condiciones normales es baja o nula. Un aumento de actividad ser evidencia de un deterioro de los tejidos en que se encuentran de los cuales resultan particularmente importantes corazn e hgado.

Se ha observado que luego de un infarto de miocardio se produce en suero un marcado aumento de la actividad de TGO, debido a la liberacin al torrente sanguneo de esta enzima tan abundante en el miocardio. En este caso no existir aumento e la actividad srica de TGP o ser mnimo.

En hepatitis vrales u otras formas de enfermedad heptica que involucren necrosis de tejido, habr tambin un incremento considerable de la actividad srica de transaminasas, incluso antes de la aparicin de sntomas clnicos como la ictericia. En este caso TGP ser la enzima predominante debido a su gran concentracin en el tejido heptico. Una elevada actividad de transaminasas puede detectarse tambin en otras condiciones como: traumas accidentales o quirrgicos, pancreatitis aguda, distrofias musculares, etc.

TRANSAMINACION EN PRESENCIA DE UN PREPARADO DE HIGADO DE PALOMA

Objetivo:

Aplicacin de la tcnica de cromatografa en capa fina para estudiar la transaminacin en presencia de un preparado de hgado de paloma como fuente enzimtica, utilizando alanina y aspartato como substratos.

Procedimientos:

Preparacin de la fuente enzimtica (Polvos acetnicos): Los hgados recientemente extrados de 4 pichones son homogeneizados en 10 volmenes de acetona fra durante un minuto, luego de filtrar y lavar varias veces, el residuo obtenido es secado a temperatura ambiente obtenindose as polvos secos, fciles de conservar.

El da de la prctica se muelen en un mortero 700 mg de polvos acetnicos con 7 ml de agua destilada y luego se centrifuga el preparado a 2000 r.p.m. por 10 minutos. Se decanta el sobrenadante y se completa el volumen a 35 ml con agua destilada.

La acetona por su accin deshidratante facilita la extraccin de enzimas de los tejidos. En esta forma la acetona reduce la desnaturalizacin de las (enzimas) protenas y concomitantemente produce la desintegracin de las estructuras celulares y la disrupcin de los enlaces lipoproteicos.

Preparacin del experimento de la transaminacin.

En cuatro tubos de prueba (13 x 100 mm), previamente lavados con HNO3 concentrado, medir lo siguiente:

REACTIVOSSISTEMAS

IIIIIIIV

Alanina 0.05 M0,2 ml---

Glutamato 0.05 M-0,2 ml--

Aspartato 0.05 M--0,2 ml0,2 ml

alfa-cetoglutarato 0.1 M0,2 ml-0,2 ml0,2 ml

Piruvato 0.1 M-0,2 ml--

Extracto enzimtico0,2 ml0,2 ml0,2 ml-

Extracto enzimtico hervido---0,2 ml

Mezclar el contenido de cada sistema y luego incubar en bao mara a 37 oC durante una hora

Identificacin de los productos de la reaccin por cromatografa en capa fina: Cada grupo dispondr de una placa de vidrio con Silica Gel, de 200 x 200 mm, en la que se han marcado los puntos de origen a 15 mm del borde inferior, con una distancia entre ellos de 25 mm y en el siguiente orden: Uno para cada uno de los cuatro tubos de experimento y tres para los tres estndares de: Alanina, Glutamato y Aspartato. Estos sistemas estndares debern ser preparados de la siguiente manera:

Medir 0.2 ml del Aminocido (Alanina, Glutamato o Aspartato) que previamente se encuentra a concentracin 0.05 M y agregar 0.8 ml de agua.

PUNTOS DE ORIGEN

Muesta o

Sistema No1234Estandar EstandarEstndar

AlaninaGlutmic.Asprtico

Rf x 100

Aplicar utilizando tubos capilares de vidrio y en el punto de origen que les corresponde, 10 ul de cada sistema incubado y 2 ul de las soluciones estndar de aminocidos en alcuotas de no ms de 1 ul cada vez, dejando secar cada rea despus de cada aplicacin. Al final, colocar la placa en la cmara cromatogrfica conteniendo como solvente 75 volmenes de fenol y 25 de agua.

La cromatografa termina cuando el solvente alcanza la lnea marcada a 10 cm de los puntos de origen. Entonces sacar la placa, secarla en la estufa a 110 C por 3 minutos, y revelar el cromatograma rociando una solucin de ninhidrina al 0.1% en n-butanol saturado con agua y luego dejarla secar. La representacin esquemtica de los resultados obtenidos luego de revelar el cromatograma se muestra en la pgina siguiente.

Expresin de Resultados: Calcular los Rf x 100 de cada mancha, completar la tabla anterior e interpretar el cromatograma con los resultados obtenidos. Haga un comentario de cada uno de los sistemas preparados:

Rf

Rf

Mancha N 1 ................

Mancha N 5 ................

Mancha N 2 ................

Mancha N 6 ................

Mancha N 3 ................

Mancha N 7 ................

Mancha N 4 ................

Haga la identificacin de cada una de las manchas sealando a qu aminocido corresponde en base a sus valores de Rf. Tenga en cuenta que los valores de Rf para los aminocidos: Alanina, ac. glutmico y ac. Asprtico son de 58, 26 y 11.2 respectivamente, para el solvente usado en la presente cromatografa.

Aminocido

Aminocido

Mancha N 1 ................

Mancha N 5 ................

Mancha N 2 ................

Mancha N 6 ................

Mancha N 3 ................

Mancha N 7 ................

Mancha N 4 ................

INTERROGANTES BIOQUIMICAS

1. Que es Rf

2. Cuales son las reacciones catalizadas por TGO y TGP

3. Que papel desempea el piridoxal fosfato en las reacciones de transaminacin?. Cul es el grupo funcional del cofactor?. Explique su mecanismo

4. Cul es el objeto del sistema 2

5. Explique el mecanismo que permite la separacin de sustancias por cromatografa en capa fina

6. Se desprende amoniaco libre en el medio durante una reaccin de transaminacin?. Fundamente su respuesta

7. Pronostique el efecto de una deficiencia de vitamina B6 sobre la degradacin de los aminocidos. La degradacin de los 20 aminocidos sera afectada?.

8. Cul ser la distribucin celular de la TGO y TGP?

9. Si en el experimento de transaminacin que Ud. realiza colocar cido pirvico uniformemente marcado con C14, Qu aminocidos espera encontrar marcados preferentemente?. Fundamente.

10. Si se administra glucosa con C14 a un animal, los carbonos marcados se incorporaran en una protena. Seale algunas secuencias de reacciones que permitan explicar este fenmeno.

11. Participan las reacciones de transaminacin en la biosntesis de aminocidos?

12. Que pensara de un ensayo en el cual una muestra biolgica como el suero se mezclara con aspartato, alfa-cetoglutarato, NADH y un exceso de malato deshidrogenasa?. Que ideara para determinar la actividad de TGP por un mtodo similar?.

13. Si se utilizara leucina y -ceto glutarato para estudiar la transaminacin; qu productos se podra identificar?. Qu nombre propondra para la enzima involucrada?

14. Es factible la identificacin de cetocidos mediante cromatografa?. De qu manera?

EXPERIMENTO 2

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE ALANINA AMINO TRANSFERASA (TGP) EN SUERO SANGUINEO

Objetivos

Estudio de la transaminacin en sueros normales y patolgicos

Aplicacin del mtodo colorimtrico de Reitman y Frankel para la determinacin de la actividad de la TGP srica.

Mtodos.Determinar la cantidad de piruvato formado luego de reaccionar Alanina y - ceto Glutarato en presencia de la TGP del suero utilizando la reaccin con la 2,4 dinitro fenilhidrazina en medio alcalino.Procedimiento:En dos tubos de ensayo rotulados como B (Blanco) y D (Desconocido), colocar:

REACTIVOSBD

Sustrato TGP (Alanina y ceto glutarato en Tampon Fosfato pH 7.4)0.25 ml0.25 ml

Colocar en Bao mara a 37 C por 2 minutos y aluego agregar:

Suero sanguineo------50 l

Agua destilada50 l------

Mezclar por agitacin suave. Incubar exactamente por 30 minutos y luego agregar:

Reactivo 2.4 DNFH ( 2,4 Dinito fenilhidrazina)0.25 ml0.25 ml

Mezclar. Dejar durante 10 minutos a 37 C. Luego agregar:

NaOH 0.4 M2.5 ml2.5 ml

Mezclar por inversin y retirar del bao. Despus de 2 minutos leer en el fotocolormetro con filtro verde (500-550 nm), llevando previamente el aparato a cero D.O. con agua destilada.Construccin de la curva de calibracin.Para poder convertir la absorbancia de la muestra en unidades de actividad enzimtica es necesario construir la curva de calibracin respectiva.

As, usando los datos de la siguiente Tabla, haga en papel milimetrado la curva correspondiente y pguela en el espacio sealado. Coloque en el eje vertical (Y) las absorbancias netas y en el eje horizontal (X) las actividades en unidades/litro de suero. Actividad TGP en U/L01328466690

Absorbancia (DO)0.1650.2400.3000.3600.4100.455

Valores Normales.

Actividad TGP srica : 6 30 U/L

Actividad TGO srica : 8 40 U/L

Expresin de Resultados:

1.- Complete la siguiente Tabla:

SISTEMASBD

Absorbancia bruta

Absorbancia neta

Actividad de TGP (U/L)

2.- Haga un breve comentario del experimento realizado y del valor de actividad transaminsica obtenida.

Interrogantes Bioqumicas.1.- Escriba las reacciones catalizadas por la TGP y TGO.

2.- Qu papel desempea el piridoxal fosfato en las reacciones de transaminacin. Explique su mecanismo de accin.

3.- Se desprende amoniaco libre en el medio durante las reacciones de transaminacin? Fundamente su respuesta.

4.- De qu manera es de utilidad la determinacin de la actividad TGP en el diagnstico de la deficiencia de piridoxina? Si en un paciente se encuentra disminuida la actividad TGP del suero, es suficiente este dato para diagnosticarlo como deficiente en piridoxina?. Por qu?

5.- Se hace referencia de que en el hepatocito TGP es una enzima, exclusivamente citoslica. Est Ud. de acuerdo con esta afirmacin? Cul sera la distribucin intracelular de la TGO? Fundamente su respuesta.

6.- Si en el experimento de transaminacin que Ud. ha realizado, colocara cido pirvico uniformemente marcado con C-14. Qu aminocidos esperara encontrar marcados preferentemente? Fundamente su respuesta.

7.- Si se administra glucosa C-14 a un animal de laboratorio, los carbonos marcados se incorporarn en una protena? Seale la secuencia de reacciones que permita explicar este proceso.

8.- Participan las reacciones transaminacin en la biosntesis de aminocidos? Cite algunos ejemplos.

9.- Qu otro mtodo, adems del que se us en esta prctica, podra emplear para detectar los productos de la reaccin de transaminacin.

10.- Qu pensara de un ensayo en el cual una muestra de suero es mezclada con aspartato, alfa ceto glutarato, NADH y un exceso de malato deshidrogenasa? Cul sera su fundamento? La actividad de qu enzima se estara midiendo?

PRACTICA N 6

GLUCOGENO HEPATICO


1. Determinacin de glucgeno heptico en animal alimentado

2. Determinacin de glucgeno heptico en animal en ayunas

3. Determinacin de glucgeno heptico en animal tratado con adrenalina

4. Determinacin de glucgeno heptico en animal tratado con aloxano

INTRODUCCION

El glucgeno es una forma de almacenamiento de glucosa fcilmente movilizable. Al igual que la amilopectina del almidn, es un polisacrido ramificado, constituido por unidades de D-glucosa unidas mediante enlaces alfa (1-4) , y ramificaciones ligadas por enlaces alfa (1-6). Las ramificaciones estn separadas unas de otras por lo menos cuatro residuos en las porciones ms centrales de la molcula hacindola ms compacta.

El glucgeno, polisacrido de reserva, se encuentra en los tejidos animales, pero abunda especialmente en el hgado y en el msculo. Aparece en las clulas como partculas discretas, las cuales evidentemente son agregados de molculas con un peso molecular que varia alrededor de 2 X 107. La cantidad de glucgeno varia ampliamente, no solamente entre diferentes tejidos, sino tambin dentro de un mismo tejido, dependiendo del suministro de glucosa y de la demanda metablica de energa. El hgado y el msculo contienen los ms grandes depsitos de glucgeno, por lo que nosotros nos ocuparemos de su metabolismo en estos rganos.

En general la dieta afectar ms el contenido de glucgeno del hgado que el del msculo, mientras que el ejercicio fsico afectar ms el contenido de glucgeno muscular que el del hgado. Adems los depsitos de glucgeno heptico y muscular tendrn diferentes roles. El glucgeno muscular esta presente para servir como una reserva de combustible para la sntesis de ATP dentro del msculo, mientras que el glucgeno heptico funcionar como una reserva de glucosa para el mantenimiento de la concentracin de glucosa en sangre (glicemia).

Un valor tpico para el contenido de glucgeno heptico en una persona bien alimentada es alrededor de 6,5g/100g de tejido; hay mucho menos despus del ayuno y mucho ms despus de una dieta rica en carbohidratos. El msculo esqueltico tpicamente tiene 1,4g/100g de tejido, el cual no cambia mucho despus del ayuno nocturno o con una dieta rica en carbohidratos.

El glucgeno heptico puede formarse a expensas de glucosa y otros monosacridos (glucognesis), como tambin de residuos provenientes del metabolismo intermediario de los hidratos de carbono, protenas y lpidos (gluconeognesis). Las vas de sntesis de glucgeno (glucognesis) y de degradacin hasta glucosa (glucogenolisis), son independientes, lo que determina que los mecanismos regulatorios del metabolismo del glucgeno acten independientemente.

La glucgeno sinteasa y la glucgeno fosforilasa son las enzimas regulatorias de sntesis y degradacin de glucgeno respectivamente. Ellas son reguladas recprocamente; cuando una es estimulada, la otra es inhibida, nunca estn completamente activas simultneamente.

Sntesis de glucgeno favorecida

Degradacin de glucgeno favorecida

Regulacin recproca de la glucgeno sinteasa y la glucgeno fosforilasa por fosforilacin y defosforilacin. Los grupos seril fosforilados se muestran como -O-P

OBJETIVOS:

1. Realizar la determinacin de glucgeno heptico

2. Cuantificar los niveles de glucgeno heptico en diferentes estados nutricionales y hormonales:

Animal alimentado normalmente (ad libitum)

Animal en ayunas

Animal tratado con adrenalina

Animal Diabtico (tratado con aloxano)

PROCEDIMIENTO:

1. PREPARACION DE LOS ANIMALES EXPERIEMNTALES

a) Rata A: Que recibir su alimentacin habitual sin restriccin alguna.

b) Rata B: Que permanecer en ayunas por lo menos 24 horas antes del experimento.

c) Rata C : Estando el animal bien alimentado, pesarlo y proceder a inyectarle 0,025 mg de adrenalina por cada 100 g de peso, con dos horas de anticipacin a la prctica. Utilizar una solucin de adrenalina que contenga 0,25 mg / ml.

d) Rata D: 24 horas antes del experimento se inyectar por va subcutnea una solucin de aloxano ( 50 mg / ml ) a razn de 200 mg / Kg de peso.

2. EXTRACCIN DEL GLUCGENO

Mtodo: Mtodo de krisman

Fundamento:

Se trata un trozo de tejido heptico con una base fuerte (KOH) en caliente, siendo degradadas las protenas y otros constituyentes; quedando preservado el glucgeno, el cual es precipitado con etanol y se le hace reaccionar con el yodo para hacer su determinacin colorimtrica. Se aumenta la sensibilidad de esta reaccin con la presencia del cloruro de calcio.

Reactivos:

1. Solucin iodo-iodurada: Pesar 0,26 g de yodo y 2,6 g de yoduro de potasio. Disolver en 10 ml de agua destilada

2. Cloruro de calcio saturado a temperatura ambiente. Pesar 97,7 g de cloruro de calcio, disolver en 100 ml de agua. Filtrar antes de usar

3. Reactivo de yodo: Mezclar 130 ml de la solucin de cloruro de calcio con 0,5 ml de la solucin iodo-iodurada. Guardar en frasco oscuro a 0 C, durante siete das mximo.

Procedimiento:1. En un tubo de centrfuga medir 0,9 ml de KOH al 33 % y colocarlo en un bao mara hirviente

2. Sacrificar los animales por decapitacin y tan rpido como sea posible extraer el hgado y pesar 100 mg de l. Colocar inmediatamente el trozo de hgado en la solucin de KOH que se encuentra en el bao hirviente y dejarlo all por 20 minutos, agitando de vez en cuando para permitir la disgregacin del tejido.

3. Retirar el tubo del bao y enfriar. Aadir 1,3 ml de etanol al 96% mezclar y calentar la solucin hasta la ebullicin teniendo cuidado que no se proyecte. Enfriar inmediatamente en bao de hielo por 5 minutos, para permitir la precipitacin del glucgeno

4. Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos y decantar el sobrenadante. Colocar el tubo boca abajo sobre un papel filtro

5. Neutralizar el exceso de lcali aadiendo 0,2 ml de cloruro de amonio saturado y mezclar cuidadosamente con una varilla de vidrio permitiendo que la solucin aadida entre en contacto con toda la pared interna del tubo 6. Preparar un blanco para lo cual se mide 0,4 ml de agua destilada y 2,6 ml del reactivo de yodo; proceder enseguida igual que las muestras problema.

7. Colocar el tubo en bao mara hirviente durante 15 minutos y enfriar. Aadir 0,2 ml de agua destilada y 2,6 del reactivo de yodo. Si la cantidad de glucgeno precipitado es grande, hacer en esta etapa una dilucin apropiada.

8. Medir la absorbancia utilizando filtro verde

9. Para preparar las soluciones estndar se pueden medir 0,4 ml de soluciones que contengan 0,06 mg, 0,18 mg 0,24 mg de glucgeno. A cada una de estas tres soluciones estndar, aadir 2,6 ml del reactivo de iodo , mezclar y proceder de la misma forma que la sealada para la muestra de hgado.

Resultados.

1. Anotar el aspecto y tamao del hgado de los animales de experimentacin

Rata A: ........................................... Rata C: ................................................

Rata B: ............................................ Rata D: ................................................

2. Observar la cantidad de precipitado despus de centrifugar.

Absorbancia brutaAbsorbancia netaConcentracin de Glucgeno (mg)Factor de calibracin

BLANCO0.118

ESTANDAR 10.192

ESTANDAR 20.338

ESTANDAR 30.416

3. Calcular el factor de calibracin: ..........................

4. Graficar la curva de calibracin con los datos anteriores. Utilizando papel milimetrado

5. Calcular la concentracin de glucgeno en cada una de las muestras Expresar los resultados en mg de glucgeno por 100 mg, 200 mg y en el peso total del tejido heptico

Peso del hgado (mg)Ab BrutaAb NetaCONCENTRACION en mg

/ 200 mg

Hgado/ 100 mg

Hgado/ Hgado

Total

Rata A

(Alimentado )5.351.20

Rata B

(ayunas)4.500.50

Rata C

(trat. con adrenalina)4.320.44

Rata D

(trat. con aloxano)3.980.38

6. Calcular el porcentaje de disminucin del glucgeno en 100 mg de hgado con relacin al animal alimentado

mg de glucgeno/

100 mg de hgadoPorcentaje de disminucin en relacin al animal alimentado

RATA A

RATA B

RATA C

RATA D

7. Haga la interpretacin de los resultados para cada rata:

Rata A:

Rata B:

Rata C:

Rata D

INTEROGANTES

1. Qu ventaja tiene la fosforlisis del glucgeno en comparacin con la hidrlisis.

2. Qu diferencia hay entre la accin glucogenollitica de la adrenalina y glucagon en el hgado y en el msculo.

3. Represente esquemticamente el mecanismo de accin de la adrenalina sobre la regulacin en el metabolismo del glucgeno.

3. Si se administra leucina marcada con C-14 ser factible ala identificacin posterior de glucgeno marcado con C-14.

4. Cmo se explica que el animal diabtico tenga menores niveles de glucgeno heptico que su contraparte normal.

5. Represente esquemticamente el mecanismo de accin de la insulina sobre el metabolismo del glucgeno.

PRACTICA No 7

METABOLISMO DE LIPIDOS: HIGADO GRASO EXPERIMENTAL


1. Produccin de un hgado graso en rata

2. Determinacin de cidos grasos en el hgado de una:

Rata control

Rata a la cual se ha administrado Etionina

Rata a la cual se ha administrado Etionina + Metionina

INTRODUCCION

El rol que cumple el hgado en el metabolismo lipdico es sumamente importante. En este sentido podemos decir que los siguientes procesos se realizan en la:

Oxidacin de los cidos grasos

Sntesis de cidos grasos y colesterol

Sntesis de lipoproteinas plasmticas :Lipoproteinas de muy baja densidad (VLDL); lipoproteinas de alta densidad (HDL)

Sntesis de cidos biliares

Se encarga casi exclusivamente de la sntesis de cuerpos cetnicos

En ocasiones puede ocurrir alteraciones de estos procesos en el hgado, lo que determina un anormal aumento en su contenido graso, esta situacin se denomina hgado graso o esteatosis heptica. Esta entidad merece una especial atencin del mdico ya que resulta ser con frecuencia el antesala de la cirrosis heptica.

Desde un punto de vista general podemos considerar hasta cuatro situaciones importantes que pueden ocasionar hgado graso.

Aumento en la cantidad de cidos grasos que llegan al hgado; sea procedentes de la alimentacin o de otros tejidos

Menor oxidacin de los cidos grasos en el hgado

Mayor sntesis de cidos grasos en el hgado

Disminucin en la salida lipdica del hgado generalmente debido a un defecto en la sntesis de lipoproteinas plasmticas.

Nota: Las lneas discontinuas indican que el evento no se est realizando.

Experimentalmente se puede inducir el hgado graso mediante la administracin de diversos agentes, como el tetracloruro de carbono, puromicina, cido ortico, etionina, etc. En esta prctica estudiaremos el hgado graso inducido por la etionina, tomando como parmetro el contenido de cidos grasos del hgado, ya que a pesar que el hgado graso puede ser inducid de diversas formas, es comn denominador el aumento de triglicridos

Etionina es un compuesto estructuralmente relacionado al aminocido esencial metionina y por lo tanto tiene un comportamiento de antagonista competitivo, en la sntesis de protenas y de fosfatidil colina, de esta manera bloquea la sntesis de lipoproteinas y finalmente la salida de lpidos del hgado.

COOH COOH

CH CH2 CH2 S CH3 CH CH2 CH2 S CH2 CH3

NH2 NH2 Metionina Etionina

Objetivos:

1.- Conocer el mecanismo bioqumico por el cual etionina induce esteatosis heptica

2.- Conocer el fundamento de la determinacin de los cidos grasos en el hgado

3.- Estudiar el efecto de la metionina sobre el hgado graso producido por metionina

4.- Indicar algunas alternativas de tratamiento en pacientes que sufren esteatosis heptica

Metodologa.

El da anterior a la prctica se inyecta va intraperitoneal a un lote de tres ratas hembras, las siguientes soluciones:

1.- Rata control: Solucin salina isotnica 3 ml. Inyectar la misma cantidad a las 2:30, 5 horas y 7 horas despus de la primera inyeccin.

2.- Rata tratada con Etionina: Se inyectar intraperitonealmente 3 ml de una solucin de DL-Etionina (16,7 mg/ml). Inyectar la misma cantidad alas 2,5 horas; 5 horas y 7 horas despus de la primera inyeccin.

3.- Rata tratada con Etionina + Metionina: Recibe el mismo tratamiento que la rata con etionina, pero adems se le inyecta 3 ml de L-metionina ( 20 mg/ml ) una hora antes de la primera inyeccin de etionina y una hora despus de cada inyeccin de etionina.

En este experimento se usarn ratas hembras, debido a que el incremento de grasa heptica es mucho ms pronunciada en hembras que en machos.

DETERMINACION DE LOS ACIDOS GRASOS

- Transcurridas 24 horas de iniciado el tratamiento de los animales se les sacrifica y se les retira rpidamente del hgado un trozo de 2,5 g, el que se fragmenta con la ayuda de tijeras y se deposita en un Erlenmeyer de 250 ml.

- Se le aade luego 10 ml de hidrxido de potasio al 33% y 40 ml de etanol al 96% con alcohol isoamlico al 0,4%.

- Se calienta la preparacin en bao mara hirviente durante 20 minutos, teniendo cuidado que no se proyecte el contenido.

- Aadir 17 ml de HCl al 25%, mezclar y dejar en reposo algunos minutos

- Aadir luego con pipeta volumtrica 25 ml de ter de petrleo.

- Tapar cuidadosamente el recipiente y agitar fuertemente durante un minuto. Dejar en reposo por 10 minutos para conseguir una adecuada separacin de las fases ter de petrleo y etanol-cido. Para esta ltima etapa se puede utilizar una probeta en lugar del Erlenmeyer, con la ventaja de mirar mejor la separacin de las dos fases.

- Retirar 5 ml de la capa etrea (superior), y colocarlos en un Erlenmeyer y aadir 1 ml de solucin de etanol-alcohol isoamlico y dos gotas de azul de timol.

- Finalmente titular con NaOH 0.1 N hasta obtener un color azul verdoso que debe permanecer estable por lo menos 3 minutos.

Para efecto de los clculos asuma que el PM promedio de los cidos grasos que se estn titulando es de 284.

Complete la siguiente tabla:

Caractersticas del hgado

Peso totalColorConsistencia

Rata control6.8 gr

Rata con etionina7.3 gr

Rata con Etionina + Metionina7.2 gr

Anote el contenido de cidos grasos en miliequivalentes en el volumen de titulacin y en miligramos por gramo de tejido heptico hmedo.

Contenido de cidos grasos

NaOH 0,1 N

ml gastadosmEq / 5 mlmEq / 25 mlmg de A.G. por gramo

de hgado

Rata Control

1.3

Rata con etionina (E)3.6

Rata con E + Metionina2.0

INTERROGANTES1.- Haga una interpretacin adecuada de los esquemas mostrados

2.- Porque la administracin de adenina revierte en cierta forma los efectos de la etionina

3.- Cite por lo menos cinco alteraciones bioqumicas que se producen en los animales tratados con etionina

4.- Porqu la deficiencia de cido pantotnico puede determinar hgado graso

5.- Qu conocimientos tiene, en relacin al hgado graso inducido por etanol

PRACTICA N 8

HIPERBILIRRUBINEMIAS


1.- Determinacin de la bilirrubina directa e indirecta en el suero sanguneo

2.- Identificacin de pigmentos biliares en la orina (Reaccin de Gmelin)

INTRODUCCION

Se denominan hiperbilirrubinemias a las enfermedades que cursan con aumento en la concentracin de bilirrubina en el suero sanguneo. Este aumento puede ser a predominio de la bilirrubina directa (conjugada); en cuyo caso se hablara de hiperbilirrubinemias a predominio indirecto o a predominio directo. Sin embargo resulta ms apropiado agrupar las hiperbilirrubinemias en atencin al mecanismo de su produccin y desde este punto de vista, se describen cuatro categoras:

I.- Hiperbilirrubinemias por sobreproduccin de bilirrubina

II.- Hiperbilirrubinemias por menor captacin heptica de bilirrubina

III.- Hiperbilirrubinemias por alteracin en la conjugacin heptica de la bilirrubina

IV.- Hiperbilirrubinemias por alteraciones en la excrecin de bilirrubina

Para la tipificacin de las hiperbilirrubinemias se han descrito diversos anlisis de laboratorio. Entre estos podemos destacar :

a) Determinacin de bilirrubina directa e indirecta en el suero sanguneo

b) Identificacin de pigmentos biliares (bilirrubina) en la orina

c) Excrecin urinaria de urobilingeno

d) Medida de la actividad transaminsica (TGP y TGO) en suero

e) Medida de la actividad glucoronil transfersica del hgado

f) Medida de la actividad fosfatsica alcalina del suero

g) Prueba de la bromosulfotaleina

De todas estas determinaciones slo se practicarn las dos primeras en la presente prctica y se usarn como muestra el suero sanguneo y la orina de un paciente ictrico y de una persona aparentemente normal. EXPERIMENTO 1

DETERMINACION DE LA BILIRRUBINA DIRECTA E INDIRECTA EN EL SUERO (Mtodo: Malloy Evelyn.) Fundamento del mtodo.

Objetivos:

1.- Determinar las bilirrubinas en el suero de un paciente con ictericia.

2.- Determinar las bilirrubinas en el suero de un sujeto aparentemente normal

3.- Comparar el resultado obtenido en ambas determinaciones

Procedimiento

1.- En 4 tubos de prueba rotularlos como I, II, III y IV, medir lo siguiente:

IIIIIIIV

Suero diluido (1/10)2,02,02,02,0

Agua destilada2,52,5------

Metanol------2,52,5

Reactivo de Erhlich0,5---0,5---

Reactivo blanco---0,5---0,5

2.- Mezclar y dejar en reposo por 20 minutos

3.- Leer en el fotocolormetro utilizando filtro verde

4.- Con anterioridad a la practica se prepar un sistema estndar, midiendo 2,5 ml de una solucin de bilirrubina (0.004 mg/ml), se aadi luego 2.5 ml de metanol y 0.5 ml del reactivo de Erhlich. Se midi la absorbancia en las condiciones sealadas para el suero (2 y 3) y se obtuvo una lectura de 0.224.

5.- Utilizar el procedimiento descrito tanto para el suero del paciente ictrico y el suero normal

Expresin de los resultados

1.- Estimar el factor de calibracin porcentual

Absorbancia del Estndar

: .................

Concentracin del Estndar : ................. Factor de calibracin

: .................

Factor de calibracin porcentual: ................

2.- Completar la siguiente tabla: ABSORBANCIASCONC. BILIRRUBINAS

IIIIIIIVBTBDBI

Suero Normal

Suero A

Suero B0.0520.0340.4300.046

Suero C0.1940.0580.2920.052

3.- Completar la siguiente tabla indicando si los valores de la concentracin de bilirrubina directa (BD) y de la bilirrubina indirecta (BI), estn aumentados (A), normales (N) o disminuidos (D).

Bilirrubina directa (BD)Bilirrubina indirecta (BI)

MUESTRA A

MUESTRA B

MUESTRA C

EXPERIMENTO 2IDENTIFICACIN DE PIGMENTOS BILIARES EN LA ORINA

Objetivos

1.- Realizar la reaccin de Gmelin en una orina colrica

2.- Realizar la reaccin de Gmelin en una orina normal y comparar el resultado obtenido con el correspondiente a la orina colrica

Mtodo

Identificar la presencia de bilirrubina en la orina utilizando la accin oxidante del cido conteniendo trazas de cido nitroso (reaccin de Gmelin).

Procedimiento

1.- En un tubo de prueba medir 2 ml de orina

2.- Con una pipeta hacer llegar hasta el fondo del tubo, 2 ml de cido ntrico-nitroso, tratando que se formen dos capas

3.- Observar los cambios de coloracin que ocurren entre ambas capas

4.- Hacer la reaccin utilizando la orina patolgica y una orina normal

Expresin de los resultados

Anote sus resultados en el espacio en blanco

1.- Orina normal 2.- Orina patolgica

INTERROGANTES 1.- Qu Contiene el reactivo de Erhlich

2.- Porqu no se prepara un tubo blanco para la determinacin de bilirrubinas por el

mtodo de Malloy Evelyn. Tenga en cuenta que los tubos 2 y 4 no corresponden a

los blancos que Ud. esta acostumbrado a preparar.

3.- Qu bilirrubina es la que se determina en el tubo N 3 y por qu?4.- Dan positiva los bilatrienos (biliverdina) la reaccin de Gmelin. Fundamente su

respuesta. 5.- El urobilingeno da positiva la reaccin de Gmelin?

6.- Qu tipo de bilirrubina es la que se encuentra en la orina en cantidades trazas en una persona normal?

7.- A qu se llama ictericia?

8.- Cumplen rol fisiolgico los pigmentos biliares?

9.- Seale las causas ms comunes de un aumento de bilirrubina tipo directa.

PRACTICA-TALLER N 9ALTERACIONES EN EL METABOLISMO DE LOS NUCLEOTIDOS

Caso Clnico 1

N.S.T.es un empleado de 47 aos de edad que asisti al servicio de emergencia de un hospital, quejndose de un dolor muy intenso en el primer dedo del pi derecho y que haba comenzado 6 horas antes de la consulta.

No haba sufrido ningn trauma en ese dedo, pero al examen clnico apareca rojo e hinchado. Estaba con mayor temperatura y extremadamente doloroso a cualquier presin. El Paciente no poda flexionar ni extender las articulaciones de dicho dedo y el movimiento pasivo de las mismas le causaba un intenso dolor. El resto del examen clnico fue completamente normal.

Los exmenes de laboratorio resultaron normales, con excepcin de una excrecin urinaria de cido rico de 1.21 g / 24 hrs (V.N. 0.3 a 0.6 g / 24 hrs.) y una concentracin de cido rico en el suero de 0.64 mmoles / L. Se obtuvo mediante aspiracin con una aguja, una muestra de lquido de la articulacin comprometida y la observacin bajo microscopa de luz polarizada revel la presencia de cristales semejantes a agujas y que se encontraban tambin fagocitados por leucocitos. Este material fue informado como cristales de urato de sodio.

En Vista de lo anterior, nuestro paciente fue diagnosticado como gotoso y una vez mejorado el cuadro agudo, se le indic para su tratamiento Alopurinol por va oral a la dosis de 150 mg dos veces al da. A los pocos das de iniciado el tratamiento el cido rico srico comenz a bajar y luego de varias semanas dichos valores ya estaban muy cerca de lo normal.

El Paciente fue controlado durante los meses siguientes, no volviendo a presentar un episodio similar de artritis gotosa e igualmente no se constat manifestaciones sugerentes de la presencia de clculos renales de cido rico.

Caso Clnico 2

Nuestro paciente es ahora una nia de 22 meses de edad, nica hija de un matrimonio entre primos hermanos. Desde su nacimiento present una severa deficiencia de linfocitos T, que se manifest por infecciones respiratorias frecuentes, candidiasis y marcada linfopenia, menos de 500 linfocitos por microlitro de sangre. Se considera linfopenia en nios cuando el nmero de linfocitos es menor a 3000 por microlitro de sangre; normalmente los linfocitos T son cerca del 50 % del nmero total de linfocitos.

La administracin de vacuna contra la difteria, tos convulsiva y ttano produjo una mnima respuesta en la nia.

Se practic la determinacin de la actividad de las isoenzimas de Adenosina Desaminasa (ADA) en un lisado de hemates de la paciente, hacindose el mismo estudio en ambos padres y en dos controles normales. Los resultados se muestran en la figura adjunta y corresponden a la separacin electrofortica de las dos isoenzimas ms importante de la ADA y su tincin para determinar su actividad. La determinacin espectrofotomtrica de la actividad total de la ADA demostr ausencia de actividad en los hemate de la nia ; en tanto que el padre y la madre tenan actividades de ADA que correspondan al 50 % y 60 % de lo normal respectivamente..

En la nia deficiente de ADA, se detrminaron los niveles de desoxinucletidos de adenina en los eritrocitos, obtenindose los resultados que se muestran en la tabla siguiente.

dATP ( nmoles/ml)dADP (nmoles/ml)dAMP (nmoles/ml)

PACIENTE904985

NORMALNSDNSDNSD

NSD: No se detecto

Bases Moleculares y Correlato Clnico-Bioqumico.

Si bien se ha descrito varias enfermedades asociadas a alteraciones en el metabolismo de los nucletidos pricos y pirimidnicos, las alteraciones que predominan en humanos son aquellas que resultan de un alterado catabolismo de los nucletidos pricos.

La Tabla 2. Muestra las diferentes enfermedades asociadas a alteraciones en el metabolismo de nucletidos pricos y pirimidnicos

1.- ALTERACIONES EN EL CATABOLISMO DE LAS PURINAS

EnfermedadEnzima afectada

GotaPRPP Sinteasa, PRPP Amidotransferasa

HGPRT (parcialmente)

Sndrome de Lesch-NyhanHGPRT (completamente)

Inmunodeficiencia Severa Combinada (SCID)Adenosina Desaminasa ADA

XantinuriaXantino Oxidada

InmunodeficienciaPurinonuclesido Fosforilasa (PNP)

Enfermedad de Von GierkeGlucosa 6 Fosfatasa

2.- ALTERACIONES EN EL CATABOLISMO DE LAS PIRIMIDINAS

Aciduria Ortica Tipo IOrotatofosforribosiltransferasa y OMP Descarboxilasa

Aciduria Ortica Tipo IIOMP Descarboxilasa

Aciduria Ortica Moderada sin el componente hematolgicoOrnitina carbamil transferasa (enzima del Ciclo de la rea).

GOTA.

Es el transtorno ms frecuente del metabolismo de los nucletidos y se caracteriza por una excesiva produccin de cido rico, que a causa de su escasa solubilidad en el agua tiende a precipitar como cristales de urato de sodio, de manera especial en el lquido sinovial de las articulaciones. Las clulas fagocticas intentan digerir este material, pero su tamao y la indigestibilidad de los cristales causa ms bien la destruccin de estas clulas y la liberacin de sus enzimas lisosomales al espacio articular. Estas enzimas a su vez determina una reaccin inflamatoria aguda de la capsula articular (sinovitis) determinando las tpicas manifestaciones de la artritis gotosa.

La manifestacin bioqumica caracterstica de la gota es el aumento de cido rico en sangre (hiperuricemia) y casi siempre esta acompaada con aumento en su excrecin urinaria (uricosuria). Los valores normales para el cido rico en sangre son de 3.5 a 7.0 mg % en varones y de 2.6 a 6.0 mg % en mujeres y debe tenerse en cuenta que estos valores aumentan con la altitud. La excrecin urinaria vara normalmente entre 0.3 a 0.6 g/da.

Se acostumbra clasificar a la gota en primaria y secundaria. La primera corresponde al transtorno producido por alteracin gentica, la secundaria es consecuencia de otras alteraciones, como la leucemia, la policitemia, el uso de antimetabolitos para disminuir la sntesis de cidos nucleicos, etc.

La frecuencia con la que se presenta al gota es relativamente alta, cerca del 3% en los EEUU y en otros pases parece ser muy similar. La incidencia familiar es del 70 al 80% y es mucho ms frecuente en varones que en mujeres (proporcin 3 a 1).

Se han descrito diversas situaciones que pueden explicar la mayor produccin de cido rico en un paciente gotoso. Destaquemos las siguientes:

Aumento en la actividad de la fosforribosil Pirofosfato Sinteasa (PRPP sinteasa).

Resistencia de la PRPP sinteasa a su inhibicin por retoalimentacin. Sera el caso en que sus metabolitos reguladores, como el GMP. AMP e IMP que normalmente se unen a la enzima y la inactivan, por algn cambio en la estructura de la misma, no se pueden unir y por lo tanto sigue aumentando la sntesis de nucletidos pricos.

Aumento en la afinidad de la enzima por la Ribosa 5P. Al cambiar la estructura de la enzima su afinidad por el sustrato aumenta (menor KM) y por lo tanto aumenta la sntesis de PRPP.

Aumento en la afinidad de la PRPP amidotransferasa por el PRPP motivado por una alteracin en la estructura de la enzima.

Perdida de la inhibicin por retroalimentacin de la PRPP amidotransferasa. Los nucletidos que normalmente la inhiben (AMP, ADP, ATP, GMP, GDP y GTP) no pueden hacerlo.

Deficiencia pacial en la actividad de la enzima Hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa ( HGPRT) que impide la reutilizacin de hipoxantina y guanina determinando su destino hacia la mayor formacin de cido rico.

En el tratamiento de la gota se usa un anlogo de hipoxantina que es el Alopurinol. Recordemos que la Xantino Oxidasa cataliza la conversin de hipoxantina en xantina y posteriormente de la xantina en cido rico (ver figura). Estando en el medio el alopurinol, la xantino oxidasa lo hidroxila y lo convierte en aloxantina (oxipurinol). Este compuesto permanece unido al complejo Mo-S de la enzima y lo inhibe, no permitiendo la formacin de ms cido rico.

Tambin se ha descrito que el alopurinol puede reaccionar con el PRPP formando el nucletido correspondiente y utilizando PRPP y determinando que bajen sus niveles y disminuya la sntesis de purinas.

Sindrome de Lesch-Nyhan.

El sndrome de Lesch-Nyhan resulta de una alteracin a nivel del gen que codifica para la enzimahipoxantina-guanina fosforribosil transferasa, que est localizado a nivel del cromosoma X (Xq26-q27.2) determinando una enfermedad que se transmite bajo la modalidad ligada al sexo. Los pacientes tiene severas manifestaciones de gota, ya que hay un gran aumento en la formacin de cido rico y adems desarrollan conductas sumamente agresivas que los lleva a su propia automutilacin, frecuentemente se muerden las extremidades distales de los dedos y los labios. Junto a lo anterior, los pacientes muestran movimientos involuntarios y retardo mental. El pronstico es malo y generalmente estos pacientes mueren antes de alcanzar los 20 aos de edad.

La severidad de esta alteracin hace ver la importancia de la va de sntesis de nucletidos pricos por la va de recuperacin y parece ser que sta sntesis a nivel extraheptico es sumamente importante y se vera completamente afectada en estos pacientes, contribuyendo a explicar la severidad de su cuadro.

Deficiencia de Adenosina Desaminasa.

En esta enfermedad tambin denominada Inmunodeficiencia Severa Combinada8SCID), hay una marcada deficiencia de la enzima Adenosina Desaminasa que normalmente cataliza la remocin del grupo amino de la desoxiadenosina y de la adenosina, durante el catabolismo de las purinas. Las clulas que ms sufren la deficiencia de esta enzima son los linfocitos T y tambin los linfocitos B. Estas clulas acumulan grandes cantidades de desoxiadenosina que al ser fosforilada rinde grandes cantidades ( 50 veces ms de lo normal) de dATP. La alta concentracin de ste nucletido inhibe a la Ribonucletidoreductasa evitando la formacin de otros dNTP y por lo tanto inhibiendo la sntesis de ADN. Como los linfocitos tienen que proliferar en respuesta a los invasores que llegan al organismo, la respuesta inmune fracasa y los nios portadores de esta enfermedad no pueden superar el menor proceso infeccioso y frecuentemente mueren antes de los 2 aos de edad.

BIBLIOGRAFIA.

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ROTT K. and AGUDELO C. (2003). Gout. JAMA 289: 2857-2860

CUESTIONARIO

1.- Expresar la concentracin del cido rico del paciente del caso clnico 1, en mg% (PM del cido: 168).

2.- La concentracin intracelular del PRPP es normalmente es de 10-5 a 10-6 mol/L. La determinacin de la KM de la fosforribosil pirofosfato amidotransferasa para PRPP en un paciente gotoso dio un valor de 2 x 10-5 M, en comparacin con un control normal cuyo valor result 3 x 10-4 M. Utilizando estos datos proponga el mecanismo que explicara la hiperuricemia del paciente.

3.- Para determinar si una persona con gota ha desarrollado su enfermedad por una sobreproduccin de cido rico o a causa de una disminucin en su capacidad de excretarlo, se hace con frecuencia la prueba de la administracin oral de un aminocido radioactivo. Qu aminocido sera el ms apropiado y como se procesara dicha prueba?

4.- Qu alimentos por su alto contenido en purinas deben ser excluidos de la dieta del paciente gotoso? Es suficiente este tipo de tratamiento para normalizar los valores sricos de cido rico en los pacientes gotosos?

5.- Explicar la hiperuricemia de los pacientes con el sndrome de Lesch-Nyhan. Proponga alguna explicacin sobre la causa de las alteraciones neurolgicas que estos pacientes presentan.

6.- Explicar la hiperuricemia que se encuentra frecuentemente asociada: a) A la deficiencia de glucosa 6 fosfatasa (Enfermedad de Von Gierke) y b) A la hiperactividad de la glutatin reductasa.

7.- Como acta el alopurinol en el tratamiento de la gota? Por qu se seala que el alopurinol es un inhibidor suicida?

8.- Cul es el mecanismo de accin de la colchicina en el tratamiento de la gota? En que momento se le usa?

9.- Cmo se explica que los cristales de cido rico en el lquido articular de los gotosos corresponda a urato monosdico, en cambio en la orina de los mismos pacientes los cristales sean frecuentemente de cido rico solamente. Podra encontrarse en estos pacientes, cristales de urato disdico en algn lugar del organismo?

10,. Por qu mecanismo (s) el alcoholismo puede determinar hiperuricemia?

11.- Que explicacin puede dar a los resultados mostrados en el electroforetograma de las isoenzimas de ADA en el caso clnico 2?. Teniendo en cuente que en los hemates hay una gran cantidad de protenas, cmo se puede mediante la tcnica utilizada,detectar solamente las dos isoenzimas ms importantes de la Adenosina Desaminasa?

12.- Como se explica la linfopenia del paciente del caso clnico 2 y los continuos cuadros de infeccin respiratoria que present?

13.- Que evidencia (s) existe (n) que los altos niveles de dATP en los pacientes con deficiencia de ADA sean los que inhiban a la Ribonucletidoreductasa y determinen menor sntesis de ADN y con ello el dao a los linfocitos?

15.- De qu manera se ven afectadas las reacciones de metilacin en que interviene S- Adenosil Metionina (SAM), en los pacientes con deficiencia de ADA. Utilice en su explicacin el siguiente esquema.

PRACTICA N 10INTEGRACION Y REGULACION DEL METABOLISMO


1. Produccin de Diabetes Experimental

2. Determinacin de glucosa en sangre

3. Determinacin de glucosa en orina

4. Determinacin de cuerpos cetnicos en orina

INTRODUCCION.

El metabolismo intermediario de cada clase de sustrato por lo general es considerado por separado; sin embargo, estos procesos ocurren en nuestro organismo en forma concertada, donde las diferentes vas metablicas se hallan enlazadas, formando una verdadera red metablica controlada rigurosamente por diferentes mecanismos regulatorios.

Esta integracin exquisitamente regulado, es la que permite a cada clula llevar a cabo sus funciones bioqumicas y sin duda, de esta intima y armoniosa organizacin depender la funcin integrada de todas las clulas que conforman un organismo, caso contrario sobrevendr una enfermedad.

Un aspecto muy interesante en la regulacin del metabolismo celular corresponde a la participacin de las hormonas que son sintetizadas en tejidos especficos (Glndulas) secretadas a al sangre y luego transportadas hasta alcanzar sus clulas blanco, donde previa interaccin con sus receptores ejercern sus efectos regulatorios fundamentalmente a travs de :

Activacin o desactivacin de enzimas ya existentes en las clulas blanco, a travs de segundos mensajeros

Induccin de la sntesis de enzimas o alguna otra protena. En esta prctica centraremos nuestra atencin en algunas acciones metablicas de la insulina usando como modelo experimental el estado diabtico.

La diabetes Mellitus es una enfermedad producida por la carencia absoluta o relativa de insulina en el organismo, se conoce dos tipos de esta enfermedad: La diabetes tipo I o insulino dependiente y la diabetes tipo II o insulino no dependiente. Hay varias

diferencias en cuanto a la etiologa y alteraciones metablicas entre los dos tipos mencionados; pero lo que caracteriza a cada uno de ellas y les da el nombre es el hecho de que en la diabetes tipo I, la causa primaria es un defecto o destruccin de las clulas beta del pncreas, productores de insulina, y el paciente solo se alivia con la administracin de insulina. En tanto que en la diabetes tipo II la causa primaria es un defecto en la respuesta a la insulina, aqu el paciente alivia sus sntomas por administracin de antidiabticos que estimulan la secrecin de insulina por las clulas beta del pncreas y raramente hacen cetosis. Adems la diabetes tipo II aparece en pocas tardas de la vida (Despus de lo cuarenta aos ) y la herencia juega un rol importante. En cambio en la Diabetes tipo I La cetosis es comn y aparece en etapas tempranas de la vida niez o juventud. La tabla I resume las caractersticas ms importantes de ambos tipos de diabetes.

TABLA I. Caractersticas distintivas entre la diabetes mellitus insulino dependiente (Tipo I) y la diabetes mellitus no dependiente de insulina (Tipo II).

CARACTERSTICASTIPO ITIPO II

Edad de inicio

Cetosis

Peso corporal

Prevalencia

Presencia de anticuerpos contra islotes

Complicaciones

Secrecin de insulina

Tratamiento con insulina

Resistencia a la insulinaMenos de 30 aos

Comn

No obeso

0,2- 0,3%

SI

Frecuentes

Casi nula o nula

Siempre necesaria

OcasionalMas de 40 aos

Raro

Obeso (80%)

2-4%

NO

Frecuentes

Normal o casi normal

No es necesario

Usual

Hay muchas sustancias que pueden producir los sntomas diabticos cuando son administrados al organismo debido a que pueden producir un deterioro o destruccin de las clulas beta del pncreas, con la consiguiente ausencia parcial o total de insulina.

Una de las sustancias que produce diabetes es el aloxano (2,4,5,6 tetraoxipirimidina o pirimina tetrona). Causa un dao permanente de las clulas beta de los islotes de Langerhans, producindose un cuadro de diabetes mellitus humana. Esta sustancia tambin es txica y hepatotxica pero a dosis mayores.

La estreptozotocina es otra sustancia que causa diabetes, es un antibitico de amplio espectro obtenido de Streptomyces achromogenes produce necrosis de las clulas beta y su accin es ms selectiva sobre dichas clulas que el aloxano razn por la cual ahora se el usa mas en diabetes experimental.

Otras sustancias con capacidad de producir diabetes por afectar a las clulas beta de los islotes de Langerhans son el cido dehidroascrbico, la 8-hidroxiquimolina, la ditizona y otras quimolinas; pero su accin diabetognica es menos pronunciada y menos especfica que el aloxano y estreptozotocina.

EXPERIEMNTO 1

DETERMINACIN DE LA GLICEMIA

Objetivo :

Determinar la concentracin de glucosa en sangre de un paciente , utilizando el mtodo colorimtrico ( Nelson y Somogy).

NOTA: EL uso de este mtodo requiere la desproteinizacin de la muestra sangunea a fin de evitar interferencia en las reacciones que deben depender nicamente de la glucosa)

Fundamento: El filtrado libre de protenas se calienta en presencia de una solucin cprico-alcalino (Cu++) obtenindose la reduccin del cobre a CuO, el cual acta luego sobre el arseno-molibdato producindose un complejo de molibdeno reducido de color azul, cuya intensidad se mide en el fotocolormetro

Procedimiento:

Desproteinizado: En un tubo de ensayo medir :

3,0 ml de NaCl 0,9 %

0,2 ml de sangre

0,4 ml de Sulfato de Zinc al 5%

0,4 ml de hidrxido de Bario al 0,3%

Mezclar bien y dejar en reposo por 5 minutos, luego filtrar o centrifugar para recuperar el filtrado libre de protenas

Determinacin de glucosa : En tubo de Folin Wo medir lo siguiente :

1 ml de filtrado libre de protenas

1 ml de reactivo cprico alcalino

mezclar y calentar en bao mara hirviente por 15 minutos

Enfriar en agua corriente y luego aadir:1 ml de reactivo arseno-molibdato

Mezclar suavemente; aadir agua destilada hasta la marca de 25 ml, mezclar por inversin, dejar en reposo por 5 minutos y leer en el fotocolormetro con filtro verde.

Preparar un blanco usando 1 ml de agua destilada en lugar del filtrado.

Preparar un estndar de glucosa que contenga 50 g/ml. Medir 1 ml de sta solucin y colocarla en un tubo de Folin Wo y proceder como para el caso de la muestra. La lectura en el fotocolormetro fue de 67 UK (D. O : 0,134).

Resultados

1. Estimar el Factor de calibracin porcentual

Absorbancia blanco __________________

Absorbancia bruta del estndar __________________

Absorbancia neta del estndar __________________

Concentracin del estndar __________________

Factor de calibracin __________________

Factor de calibracin % __________________

2. Completar los espacios en blanco

Lectura Bruta Lectura Neta

Tubo blanco ____________ ____________

Tubo Muestra (N) ____________ ____________

Tubo Muestra (P) ____________ ____________

Concentracin de Glucosa en la muestra (N) es de ___________mg/100 ml

Escriba en el espacio en blanco si el valor obtenido es Normal, Alto o Bajo _________

Concentracin de Glucosa en la muestra (P) es de ___________mg/100 ml

Escriba en el espacio en blanco si el valor obtenido es Normal, Alto o Bajo _________

EXPERIMENTO 2

DETERMINACION DE GLUCOSA EN ORINAObjetivo :

Determinar la concentracin de glucosa en orina utilizando la prueba de Benedict

Fundamento :

Esta reaccin redox ocurre ms rpidamente en medio alcalino; as cuando se calienta una suspensin de hidrxido cprico en medio alcalino y en presencia de una sustancia reductora, como

Guia de Practicas de Bioquimica II Ingenieria Biotecnologica

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