Manual de Practicas de Bioquimica Medica y Aplicada Modelo Viejo

7/21/2019 Manual de Practicas de Bioquimica Medica y Aplicada Modelo Viejo

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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUMICO BIOLGICAS

ACADEMIA DE BIOQUMICA


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MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO DE

BIOQUMICA MDICA


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Documento actualizado por:

M. en I. Edith Enrquez Gallosa

Vo.Bo.:

Dra. Laura Alejandra de la Rosa Carrillo

Coordinador de la Academia de Bioqumica

Autorizado por:

Ph.D. Alejandro Martnez Martnez

Jefe del Departamento de Ciencias Qumico Biolgicas

Cd. Jurez Chihuahaua

Mayo del 2012

Instituto de Ciencias Biomdicas

Universidad Autnoma de Ciudad Jurez

Semestre regular Enero Mayo 20XX

Semestre regular Agosto Noviembre 20XX

Curso de Verano Junio Julio 20XX


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Contenido

PROLOGO ............................................................................................................. i

P R E S E N T A C I N ....................................................................................... ii

REGLAS PARA LOS ALUMNOS QUE ASISTEN A LOS LABORATORIOS DEBIOQUIMICA. ....................................................................................................... v

INSTRUCCIONES PARA EL USO DE ESTE MANUAL ..................................... vii

PRCTICA No. 1 ................................................................................................... i

BIOSEGURIDAD ................................................................................................... i

PRCTICA No.2 .................................................................................................. iv

CARACTERIZACIN DEL ADN .......................................................................... iv

DETERMINACIN Y CUANTIFICACIN DE ADN POR LA TCNICA DE LADIFENILAMINA EN BASE A SU CONTENIDO EN DESOXIRRIBOSA. .............. iv

CUESTIONARIO ............................................................................................. vii

PRCTICA No. 3 ................................................................................................ viii

CUANTIFICACIN DE CIDO RICO SRICO ................................................ viii

CUESTIONARIO .............................................................................................. xi

PRCTICA No. 4 ................................................................................................ xiii

EXTRACCION Y CUANTIFICACIN DE ADN DE LEUCOCITOS ..................... xiii

CUESTIONARIO ............................................................................................. xv

PRACTICA No. 5 ............................................................................................... xvi

SEPARACION DE ADN POR ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA .... xvi

CUESTIONARIO ........................................................................................... xviii

PRCTICA No. 6 ................................................................................................ xx

EFECTO MUTAGENICO DE LA LUZ ULTRAVIOLETA. .................................... xx

CUESTIONARIO ............................................................................................ xxii

PRCTICA No7 ................................................................................................ xxiv

DIGESTIN DE CARBOHIDRATOS ................................................................ xxiv

PRCTICA No.8 .............................................................................................. xxvii

DIGESTIN DE PROTENAS GSTRICAS. ................................................... xxvii

CUESTIONARIO ........................................................................................... xxx

PRACTICA No. 9 ............................................................................................ xxxiiiDETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LIPASA ....................................... xxxiii

(DIGESTION INTESTINAL DE GRASAS) ...................................................... xxxiii

CUESTIONARIO ......................................................................................... xxxvi

PRACTICA No 10 ......................................................................................... xxxviii

EXTRACCION Y SEPARACIN CROMATOGRAFICA DE FOSFOLIPIDOS

...................................................................................................................... xxxviii

INDUCCION Y REPRESION HORMONAL EN EL ............................................. xlii

METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS. .................................................. xlii

CUESTIONARIO ............................................................................................ xlvi

PRACTICA 12 .................................................................................................... xlix

DETERMINACION DE TRANSAMINASAS SERICAS ....................................... xlix

CUESTIONARIO .............................................................................................. lii

CUANTIFICACION DE BILIRRUBINAS SERICAS ............................................. liv


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CUESTIONARIO ............................................................................................. lvii


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PROLOGO

El siguiente manual ha sido actualizado para las carreras de Medicina y

Nutricin, por lo que se espera que el alumno aproveche en su totalidad lainformacin aqu presentada.

Los cursos de Bioqumica Mdica y Aplicada se imparten en el Instituto de

Ciencias Biomdicas como parte del programa integral del Departamento de

Ciencias Qumico Biolgicas y se requiere del curso de Bioqumica General

como materia antecedente.

En este curso se presenta una correlacin de aspectos del metabolismo integral

con las funciones especficas de los rganos y sistemas con un carcter muy

fundamental teniendo en cuenta que dichas funciones se tratarn con mayor

detalle en las nosologas y las clnicas respectivas.

2012


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P R E S E N T A C I N

Uno de los aspectos fundamentales de la enseanza de materias

correspondientes al rea de las Ciencias Bsicas, es que el estudiante debe de

comprender los elementos tericos revisados. Con el fin de reafirmar dichos

conocimientos es necesario que los practique en el Laboratorio y como

consecuencia reciba los refuerzos apropiados y al final de dicho curso este

compenetrado con la materia analizada.

En la Academia de Bioqumica siempre ha existido el inters de que los

alumnos que cursen dichas materias tengan la capacidad de comprender los

fenmenos moleculares tanto a nivel celular como del organismo.

El individuo que se dedique a la investigacin y/o a la enseanza de laBioqumica, debe de estar convencido de que el ensayo de formas ms

eficientes de involucrar al alumno en el estudio de sta interesante rea, es la

nica manera de evolucionar positivamente en la investigacin y en la

excelencia acadmica.

Este manual de prcticas es el resultado del esfuerzo comn de la

Academia de Bioqumica, con el nico fin de fomentar la interrelacin de los

conocimientos tericos con la actividad practica, de una manera ms

organizada, en aras de un mayor aprovechamiento de la enseanza Bioqumica.

En base a este pensamiento, nos comprometimos a elaborar el "Manual de

Prcticas de Laboratorio de Bioqumica Medica" el cual esperamos sea til

durante los cursos de Bioqumica.

En este Manual se pretende dar al alumno una informacin bsica, que lo

motive a desarrollar un diseo experimental predeterminado y a deducir por

medio del anlisis objetivo de los resultados, las posibles implicaciones que se

tengan para demostrar un hecho que fue discutido previamente en la clase

terica.


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Agradecemos la cooperacin y el apoyo recibido por parte de las

autoridades Universitarias para lograr la publicacin de este Manual.

Atentamente Comisin Elaboradora

Academia de Bioqumica

M.C. Hctor Reyes Leal Biol. Hctor Esparza Valencia

Q.F.B. Gilberto Reyes Leal Biol. Daniel Chvez Licn

Q.F.B. Graciela Manjarrez G. Q.B.P Jorge Bayln Monrrez

Q.B.P. J. Angel Araujo Dr. David Reyes Ruvalcaba.

Q.B.P. Oscar Barrozo

1997


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NOMBRE DEL ALUMNO____________________________________

MATRICULA ____________________

HORARIO DE TEORIA ____________________

HORARIO DE LABORATORIO_______________

GRUPO DE LABORATORIO _________________

NUMERO Y/O NOMBRE DEL EQUIPO ______________________


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REGLAS PARA LOS ALUMNOS QUE ASISTEN A LOSLABORATORIOS DE BIOQUIMICA.

1. - Al inscribirse en la materia queda automticamente inscrito en un grupo deLaboratorio. El maestro noest facultado para realizar cambios de grupo y/o

permutas.

2. - La asistencia a los laboratorios es obligatoria y debern presentarse con un

retardo no mayor de 10 min.de la hora de entrada.

3. - Para tener derecho a calificacin final del laboratorio se requiere un 80 % de

asistencias.

4. - Toda falta a la prctica equivale a ceroen su reporte.

5. - Es obligatoriopresentarse con bata blanca de manga larga a las sesiones

de laboratorio.

6. - Durante las sesiones de laboratorio queda estrictamente prohibidofumar e

ingerir alimentos.

7.- En caso de reprobar el laboratorio, automticamentequeda reprobado en la

clase de teora.

8.- La calificacin final de laboratorio corresponde al promedioobtenido en las

prcticas, exmenes y trabajo en el laboratorio.9.- Los reportes de la semana se entregarn obligatoriamente en el horario

establecido por el maestro. La aceptacin extemporneade reportes queda a

consideracin del docente. El Reporte es individual.

10.- Los reportes ya calificados, se devolverna la semana siguiente.

11.- El material que sea daado por el alumno, deber reponerse antes de

finalizar el curso acompaado con la factura de compra. De no ser as no se

condicionar la calificacin del alumno.

12.- Si parte del material es daado o se pierde y se desconoce al

responsable, el material ser repuesto por el grupo asistente a la prctica.

13.- Se realizarn los exmenes de laboratorio pertinentes en las fechas

indicadas en la calendarizacin de la academia.

14.- Es obligacindel alumno entregar el material limpio cada vez que termine


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su prctica.

15.- Se recomienda mantener limpia su mesa de trabajo y guardar el mayor

orden posible.

16.- El alumno se deber comprometer a regresar el material en las mismas

condiciones en que lo recibieron.

17.- Los reportes se calificarn en base a los acuerdos de la academia, teniendo

mayor peso los siguientes apartados:

A) Resultados

B) Discusin

C) Conclusiones

D) Cuestionario

E) BibliografaEl maestro detallar la forma de reportar dentro del encuadre, el da de la

recepcin del grupo. Incluyendo el trabajo experimental y la discusin y

participacin en la prctica.

18.- Es obligacin del alumno investigar sobre el tema de la prctica previa

realizacin de sta, en caso de presentarse sin haber estudiado se considerar

como falta de inters, afectando la calificacin de la participacin de la misma.

19.- De igual manera, para aqul alumno que no se prepare para la discusin de

las prcticas, se ver afectado en la parte de su calificacin de correspondiente

a la misma.


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INSTRUCCIONES PARA EL USO DE ESTE MANUAL

Con la idea de que el alumno pueda manejar de manera ms eficiente

este Manual se hacen las siguientes recomendaciones:1.- Al principio del Manual se incluye un ndice de las prcticas a realizar, que

permite su rpida localizacin.

2.- La secuencia de prcticas, est en funcin de los programas de teora y cabe

aclarar que en la primera sesin se les indicar cuales prcticas se van a

realizar durante el semestre.

3.- Todas las prcticas estn subdivididas en dos partes:

a) Incluye la descripcin metodolgica de la prctica, que a su vez

se subdivide en:

- Ttulo de la prctica

- Objetivo de la prctica

- Prerrequisitos

- Introduccin

- Material y Mtodos

b) Contiene los elementos correspondientes al reporte de la

prctica y se subdivide en:

- Resultados

- Discusin

- Conclusiones

- Cuestionario

- Bibliografa consultada

4.- A continuacin se mencionan algunos aspectos significativos de cada uno de

estos elementos:a) Ttulo de la prctica.- Indica el nombre de la prctica y la de

manera especfica de lo que se va a realizar durante la sesin.

b) Objetivo de la prctica.- Seala lo que se espera que el alumno

logre al trmino de esta.

c) Prerrequisitos.- Comprende una serie de puntos, que el alumno


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debe de conocer su significado con anterioridad a la explicacin de

la prctica, para lo cual se recomienda consultar la bibliografa

recomendada al final de este Manual.

d) Introduccin.- Informacin bsica y muy breve, referente a la

prctica a realizar.

e) Mtodos y Materiales.- Es la descripcin del desarrollo de la

prctica, sealando el equipo, cristalera y soluciones a utilizar en

la prctica.

Es importante que el alumno entienda la secuencia del desarrollo

antes de iniciar el experimento, por lo cual es necesario que se lea

antes de la sesin de explicacin de la prctica, para que pueda

consultar sus dudas con el Docente.f) Resultados.- En esta seccin se anotan los datos obtenidos

durante la sesin de la prctica, de acuerdo a las indicaciones

tanto del Manual como del Profesor.

h) Discusin.- Es una de las partes principales de todo

experimento, ya que consiste en realizar un anlisis comparativo

de los resultados esperados con respecto a los obtenidos, llevando

a cabo la argumentacin necesaria de dichos resultados.

i) Conclusiones.- En base a los resultados obtenidos y a la

discusin desarrollada, concluir cuales son los puntos principales y

que consecuencias a futuro plantean esta prctica.

j) Bibliografa consultada.- En este punto se deben incluir las

referencias bibliogrficas de los libros o artculos consultados, de

acuerdo a los siguientes lineamientos :


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En el caso de revistas:

Nombre(s) del autor(es), (ao), Ttulo del artculo

Nombre de la Revista, Volumen, Pginas consultadas

En el caso de libros:

Nombre(s) del autores), (ao), Nombre del captulo.

Nombre del libro. Editorial. Edicin. Pas. Pginas

consultadas.


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PRCTICA No. 1

BIOSEGURIDAD

OBJETIVO:El alumno determinar la importancia de la aplicacin de la normatividad sobrela seguridad, en niveles de riesgo en cualquier laboratorio para evitar accidentes.

PRERREQUISITOS:1. Diferencias entre regla, reglamento, norma y ley.2. Diferencia entre ley y costumbre.3. Organismos que rigen las normatividades.4. Normas involucradas en la seguridad en los laboratorios.

INTRODUCCIN:Bioseguridad es una palabra compuesta por bio (del latn que significa vida) yseguridad (del latn securitas que significa ausencia de riesgo).El riesgo es la vulnerabilidad ante un dao para personas, cosas y/o el medioambiente. Existe una variedad de riesgos en los que se encuentran los riesgosfsicos, qumicos, biolgicos, ambientales, laborales, financieros, polticos, etcSin embargo en el laboratorio el nivel de bioseguridad depende del grupo deriesgo:


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Grupo deriesgo

Nivel debioseguridad

Tipo delaboratorio

Prcticas delaboratorio

Equipo deseguridad

1 BsicoNivel 1

Enseanazabsica,

investigacin

TMA Ninguno;trabajo en mesa

de laboratorio aldescubierto2 Bsico

Nivel 2Servicios deatencinprimaria;diagnstico,investigacin

TMA y ropaprotectora; seal deriesgo biolgico

Trabajo enmesa aldescubierto yCSB paraposiblesaerosoles

3 ContencinNivel 3

Diagnsticoespecial,investigacin

Prcticas de nivel 2ms ropa especial,acceso controlado

y flujo direccionaldel aire

CSB ademsde otros mediosde contencin

primaria paratodas lasactividades

4 ContencinmximaNivel 4

Unidadespatgenospeligrosos

Prcticas de nivel 3ms cmara deentrada con cierrehermtico, salidacon ducha yeliminacinespecial deresiduos

CSB de clase iiio trajespresurizados

junto con CSBde clase ii,autoclave dedoble puerta (atravs de la

pared), airefiltradoTabla 1 TMA: tcnicas microbiolgicas apropiadas. CSB: cmara de seguridadbiolgica. OMS(2005)

En los laboratorios aparte del equipo, existen soluciones reactivas las cualestambin se manejan y deben llevar un requerimiento para su uso. Cadasustancia que se maneje en los laboratorios debe estar etiquetada y siempredeber haber a la mano la Hoja de Datos de Uso Seguro (MSDS por sus siglasen ingles), misma que refiere los cuidados que se debe tener para el manejo delas sustancias.El Sistema de Comunicacin de Riesgos (Right To Know) muy utilizado en losE.U.A. nos refiere de manera explcita de los riesgos y daos a los cualesestamos expuestos por el manejo de una sustancia y que equipo de proteccinpersonal se debe de utilizar. Aqu en Mxico la Secretaria de Trabajo y PrevisinSocial tambin se preocupa por los riesgos ocupacionales de los diferentescentros de trabajo junto con la Secretaria de Salud, por lo que tambin existensealizaciones para determinar las reas de trabajo, puertas de acceso, ysalidas, reas despejadas, cdigo de tuberas para sustancias que corran en


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ellas, etc. Es por eso que es muy importante tomar en cuenta las barreras y eltipo de ellas.Tambin es importante hacer hincapi en el desecho adecuado de lassustancias que se manejan en los laboratorios los cuales son vigilados por laSEMARNAT ya que estos son dispuestos al medio ambiente, llmese agua (a

los drenajes que a pesar de llegar a una planta de tratamiento de aguaresiduales en algunas ocasiones, estas siguen su curso a canales de irrigaciny/o acequias para riego de cultivos y por ende al subsuelo), cielo abierto (por laemisin de los gases y que contaminan el aire que respiramos) o tierra (con ladisposicin de los residuos slidos que impactan a el medio alterando los ciclosnaturales biolgicos).

MATERIAL: Ocupado para la elaboracin de esta prctica

METODO:Investigue en las diferentes referencias impresas o computarizadas el marco

terico sobre el cual se sustenta la minimizacin de los riesgos para larealizacin del trabajo seguro en cualquier laboratorio

RESULTADOS:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

DISCUSION:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

CONCLUSION:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

BLIBLIOGRAFIA CONSULTADA:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


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PRCTICA No.2

CARACTERIZACIN DEL ADN

DETERMINACIN Y CUANTIFICACIN DE ADN POR LATCNICA DE LA DIFENILAMINA EN BASE A SU CONTENIDO ENDESOXIRRIBOSA.

OBJETIVO GENERAL:Cuantificar ADN por el contenido de desoxirribosa por medio de la tcnica dedifenilamina.

OBJETIVOS ESPECFICOS:Aprender a elaborar e interpretar una curva de calibracinDeterminar y cuantificar la concentracin de desoxirribosa presente de una

solucin tipo por medio de la tcnicaComparar las concentraciones de la pentosa de la solucin tipo, con la delproblema de ADN

PRERREQUISITOS:1. Como est formada una molcula de ADN.2. Principales diferencias entre nucletidos y nuclesidos.3. Principales diferencias entre ADN, ARN y las protenas.

INTRODUCCIN:El DNA es un polmero complejo que est organizado como una hlice doble. Elelemento fundamental es la secuencia de bases purnicas y pirimidnicas. Estasbases estn unidas a la posicin C-1 del azcar desoxirribosa y se conservan

juntas a travs del enlace de los residuos de azcar en sus posiciones 3, y 5por medio de un enlace fosfodister. La alternancia de los grupos fosfato ydesoxirribosa forman el esqueleto de la doble hlice. Estos enlaces 3 - 5 definentambin la orientacin de una tira dada de la molcula de ADN y puesto que lasdos tiras corren en direccin opuesta, se dice que son antiparalelas.

La estructura del ADN est compuesta por nucletidos de purina y pirimidina,

esta estructura se va hidrolizando (rompiendo) a nuclesido de purina ynuclesido de pirimidina ms fosfatos libres, luego se hidrolizan los nuclesidosde purina a bases pricas y pentosas libres, las pirimidinas se quedan comoestn. La difenilamina reacciona con 2 pentosas libres (desoxiribosas). Ensolucin cida, la cadena lineal de una desoxipentosa se convierte en la forma-hidroxilevulinoaldehdo altamente reactiva y que reacciona con la difenilaminapara dar un complejo azul, con una absorcin definida mxima a 595 nm. En el


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ADN nicamente reacciona la desoxirribosa del nucletido de purina, as que elvalor obtenido representa la mitad del total de desoxirribosa presente.

MATERIAL:

GradillaTubos de ensayePipetas serolgicasVaso de precipitadoPinzas para tubo de ensayeCeldas para espectrofotmetro

EQUIPO:Espectrofotmetro

MTODO:

Espectrofotocolorimtrico y ComparativoPROCEDIMIENTO:Preparar una curva de calibracin de la solucin tipo de desoxiribosa de acuerdola tabla abajo expuesta

Tubo Sol. tipo0.001 M

TCA10%

Difenilamina [ADN]mg/ml

Testigo --- 2.0 3.0 0.0

1 0.1 1.9 3.0 0.01252 0.2 1.8 3.0 0.02503 0.4 1.6 3.0 0.05004 0.6 1.4 3.0 0.07505 0.8 1.2 3.0 0.10006 1.0 1.0 3.0 0.1250

Problema X * 3.0 YTabla 2 Curva Tipo de dexosiribosa

La cantidad del problema (X) deber tener de entre 0.1 a 1.0 ml, mientras que deTCA deber de tener de entre 1.9 a 1.0 ml, para que con los 3 ml de difenilaminatenga el tubo problema una cantidad total de 5 ml

Para determinar la concentracin de desoxiribosa en el total de cada tubo, sedeber utilizar la siguiente frmula:

C1V1=C2V2Ejemplo para el tubo #1(0.001 M) (0.1 ml) = C2 (5 ml)


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C2 = (0.001 M) (0.1 ml) / (5 ml)

C2 = 0.00002 M

Igual para cada tubo

Colocar los tubos en bao a ebullicin, estos se sacan a cambio de vire.Enfriar a chorro de agua corriente y leer a 600 (595) nm de longitud de onda.

Nota: la absorbancia del problema se interpola en la curva de calibracin

RESULTADOS:1.- Elaborar la grfica (preferentemente en papel milimtrico) de la curva tipopara la desoxiribosa.

2.- En base a la interpolacin del la muestra problema en la curva tipo dedesoxiribosa, la concentracin de ADN de la muestra problema esde:__________

DISCUSION:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

CONCLUSION:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

BIBLIOGRAFIA:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


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CUESTIONARIO

1.-Cual es la absorcin de luz mxima y mnima de los cidos nucleicos.________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________2.- Describa una tcnica para identificar ARN.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________3.-Describa las propiedades fisicoqumicas de los cidos nucleicos.

________________________________________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________________________________________4.- Esquematice como est formada una molcula de ADN.


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PRCTICA No. 3

CUANTIFICACIN DE CIDO RICO SRICO

OBJETIVO GENERAL:Determinar la concentracin de cido rico srico por medio de la reaccin delcido fosfotngstico.

OBJETIVO ESPECFICO:Comparar los resultados para descartar hiperuricemia y gota.

PRERREQUISITOS:

1. Describir el metabolismo de los nucletidos purcos2. Describir el catabolismo de las bases purnicas3. Enumerar las caractersticas metablicas de la Gota.4. Qu es el monourato de sodio y como se forma

INTRODUCCIN:La sntesis de nucletidos es un proceso celular dinmico y continuo. Serequiere de estos para llevar a cabo diversas actividades metablicas en elorganismo, esto ltimo sin tomar en cuenta su funcin primaria que es la de sermonmeros estructurales de los cidos nucleicos.

La regulacin de esta va es compleja debido a que utiliza mecanismos deretroalimentacin negativa, regulacin alostrica, as como procesos derecuperacin de metabolitos. Con frecuencia se presentan desajustes en estaregulacin, siendo un ejemplo clsico la sobreproduccin de cido rico comoparte de una descompensacin del catabolismo de los nucletidos purnicos. Enla mayora de los organismos este defecto no es perceptible, ya que al ser elcido rico un producto de excrecin, es eliminado en la orina. Sin embargo, enpacientes con insuficiencia renal, la excrecin del cido rico tiende a ser mslenta y por lo tanto su concentracin en sangre aumenta en forma considerable,generando un defecto conocido hiperuricemia. En algunos pacientes la

hiperuricemia es tal, que genera depsitos de monourato sdico en los tejidos delas articulaciones de las extremidades inferiores. Estos depsitos tienden aformar cristales que a menudo lesionan los tejidos provocando dolores muyintensos que son caractersticos de la enfermedad llamada gota.

Para determinar la concentracin de cido rico en sangre se utiliza el mtododel cido fosfotngstico (constituido por cido fosfrico y tungstato de sodio quees el que precipita las protenas con un conservador de sulfato de lit io), que


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hace reaccionar al cido rico con el cido fosfotngstico en un medio alcalinopara formar alantona y azul de tungsteno, ste ltimo genera un color muyestable que se mide en espectrofotmetro a una longitud de onda de 640 nm.

MATERIAL:GradillaTubos de ensayePipetas serolgicasPropipetasCeldas para espectrofotmetro

EQUIPO:Centrfuga clnicaEspectrofotmetro

SUSTANCIAS REACTIVAS:Solucin preparada de cido fosfotngsticoSolucin patrn de cido rico

Agua destiladaSolucin de carbonato de sodio al 3.5%

MTODO:Espectrofotocolorimtrico

PROCEDIMIENTO:Preparar una serie de tubos de acuerdo a la siguiente tabla:

Reactivo Tubo problema Tubo patrn Tubo blancoSuero 0.3 ml --- ---

Sol patrn --- 0.3 ml ---Agua destilada --- --- 0.3 ml

c. fosfotngstico 1.0 ml 1.0 ml 1.0 mlTabla 3 Primera serie de tubos para la determinacin de cido rico srico

Mezclar bien cada tubo y centrifugar el tubo problema a 2,500 rpm durante 10min. y recuperar el sobrenadante. El tubo blanco no es necesario que secentrifugue, atendiendo a las propiedades especficas de la reaccin.


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Prepare otra serie de tubos de acuerdo a la siguiente tabla.

Reactivo T. problema T. patrn T. blancoSobrenadante del

tubo problema0.5 ml --- ---

Sol. preparada deltubo patrn --- 0.5 ml ---

Sol. preparada deltubo blanco

--- --- 0.5 ml

Carbonato desodio al 3.5%

2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml

Tabla 4 Segunda serie de tubos para la determinacin de cido rico srico

Mezclar bien cada tubo y dejar reposar durante 20 min..Leer la absorbancia del problema y del patrn ajustando a cero elespectrofotmetro con el tubo blanco a una longitud de onda de 640 nm.

RESULTADOS:

Clculo:

As. problema X [del patrn] = [cido rico]As. patrn

Concentracin de cido rico = __________________ mg/dl.

Valores normales:

Hombres: 3.57.5 mg/dlMujeres: 2.56.5 mg/dl

DISCUSIN:

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

CONCLUSIN:

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________


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BIBLIOGRAFIA:

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

CUESTIONARIO

1.-Esquematice las bases pricas y pirimdicas:

2.-Describa cuatro (4) alteraciones del metabolismo de las purinas.

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

3.-Mencione cuatro (4) alteraciones del metabolismo de las pirimidinas.

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

4.- Esquematice la degradacin de las bases pricas hasta 2CO2+ 4NH4+


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5.- Defina:

a) Uremia:_______________________________________________________

b) Uricemia:______________________________________________________

c) Uricaciduria:____________________________________________________


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PRCTICA No. 4

EXTRACCION Y CUANTIFICACIN DE ADN DE LEUCOCITOS

OBJETIVO GENERAL:Obtencin el DNA cromosmico de clulas blancas

OBJETIVO ESPECFICO:Determinar que si sea el DNA obtenido por medio de la cuantificacin del mismocon la tcnica de difenilamina ya aprendida

PRERREQUISITOS:1. Conocer la estructura de nuclesidos y nucletidos.2. Indicar las principales diferencias entre ADN y ARN.3. Identificar los efectos fisicoqumicos de los detergentes y de los

quelantes.4. Cul es la fuente del ADN en la sangre?5. Importancia de las endonucleasas de Restriccin.6. A que se le llama solucin fisiolgica y cul es su funcin?7. Funcin de los leucocitos

INTRODUCCIN:Los cidos nucleicos son las molculas que portan la informacin gentica yregulan las funciones celulares por lo cual es importante conocer suscaractersticas fsicas, qumicas y biolgicas. Uno de los principalesdescubrimientos que han llevado al desarrollo de la Ingeniera Gentica son las

enzimas de restriccin las cuales se caracterizan por cortar al ADN ensecuencias especficas.Los leucocitos son clulas nucleadas las cuales se encargan del trabajoinmunolgico, estas pueden ser separadas por una sustancia quelante como loes el EDTA, la cual separa los factores de coagulacin y deja al descubierto alas clulas blancas para poder extraerlas del lquido plsmatico.Los detergentes son sustancias necesarias para poder romper la tensinsuperficial de los lpidos integrantes de las diferentes membranas, sin embargola estructura de ADN es muy sensible a cualquier tipo de cambio es por eso quese debe utilizar una solucin que ayude a mantener estable esa estructura,como puede ser la presencia de solucin salina o similar.

MATERIAL:Tubos EppendorfPuntas para micropipetasMicropipetas de 10 y 200 lPipetas serolgicasTubos vacutainer de tapa morada (con EDTA)Tubos de ensaye


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GradillaMatraz Erlenmeyer de 125 mlCeldas para espectrofotmetro

EQUIPO:

Centrfuga clnicaVortexEspectrofotmetro

SUSTANCIAS REACTIVAS:Muestra sanguneaNaOH 0.2 NSDS al 1%Tritn x-100 al 1%NaCl 0.1 mol/lt

Alcohol etlico al 96%Agua destilada estril

MTODO:Lisis alcalina, separacin por centrifugacin, y espectrofotocolorimtrico

PROCEDIMIENTO:1. Tomar una muestra de 3 a 5 ml de sangre en un tubo Vacutainer con

EDTA.2. Centrifugar 5 minutos a 3000 rpm para separar el plasma de los

elementos formes de la sangre.3. Separar con una pipeta Pasteur o con un gotero plstico graduado la capa

blanca (leucocitos) entre el plasma y los eritrocitos. Llevar las clulasblancas a otro tubo de ensaye y

4. Agregar 10 ml de agua destilada estril. Tapar el tubo e invertir variasveces.

5. Centrifugar 10 minutos a 5000 rpm y descartar el sobrenadante.6. Al sedimento (pequeo botn blanco) se le agregan 10 ml de Tritn X-10

al 1%. Tapar el tubo y agitar suavemente de manera constante duranteunos minutos hasta resuspender perfectamente el sedimento.

7. Centrifugar durante 10 minutos a 5000 rpm8. Agregar 10 ml de de SDS al 1% (agitar suavemente, tener cuidado de que

quede bien resuspendido).9. Vaciar en un matraz y agitar suavemente durante unos minutos ms.10. Agregar 5 ml de NaCl 0.1 mol/lt. Agita y dejar reposar unos minutos11. Agregar 5 ml de etanol fro. Agitar muy suavemente y observar como se

precipitan los filamentos que contienen el DNA12. Colectar los filamentos con una varilla de vidrio muy delgada o por medio

de reconcentracin en un tubo Ependorff conteniendo 0.2 ml de aguadestilada estril

13. Una parte del ADN aislado s14. e guarda en el refrigerador a20C hasta correr la electroforesis


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15. La otra aparte de la muestra se trabaja en cuantificacin por medio de latcnica de la difenilamina

RESULTADOS:En esta sesin se obtuvo una muestra que se correr en la electroforesis, sin

embargo la otra muestra se cuantifico y se obtuvo una cantidad de___________Anotar los datos ms relevantes de la tcnica y la discusin de los datos seorientara hacia la reproducibilidad de los datos.

DISCUSION:Centrar la discusin explicando la funcin de cada uno de los reactivosutilizados.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________CONCLUSION:

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

BIBLIOGRAFIA:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

CUESTIONARIO

1.- Mencione 5 caractersticas que permitan identificar al ADN________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2.- Mencione 3 diferencias del ADN con respecto a las protenas y 3 diferenciascon ARN.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


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PRACTICA No. 5

SEPARACION DE ADN POR ELECTROFORESIS EN GEL DEAGAROSA

OBJETIVO:El alumno conocer la tcnica de electroforesis como una herramienta para laseparacin e identificacin de ADN.

PREREQUISITOS:1. Definir electroforesis.2. Cual es el fundamento de la electroforesis del ADN en geles de agarosa.3. Cuales son las diferencias entre la electroforesis y la cromatografa en

capa fina.

INTRODUCCION:La electroforesis es una tcnica que ha revolucionado los trabajos deinvestigacin sobre los cidos nucleicos, ya que permite analizar fragmentos de

ADN o en su caso obtener la secuencia total del ADN.Se basa en la separacin de compuestos debido a su carga y en este casodebido al peso molecular de los fragmentos de ADN ya que como se sabe el

ADN tiene carga negativa debido a los grupos fosfato.Esta tcnica permite identificar fracciones de ADN y a su vez aislar dichosfragmentos para su estudio posterior.En esta sesin se va a analizar el ADN de la muestra (si trabajo extraccin de unplsmido es igual), que se extrajo en la sesin anterior para identificar su peso

molecular y las caractersticas de la extraccin.

MATERIAL:Tubos EppendorfPuntas para micropipetasMicropipetas de 5 a 200l

EQUIPO:VortexCmara de electroforsis

Fuente de poder con cablesMicrocentrfuga

SUSTANCIAS REACTIVAS:Agarosa tipo II o de alta resolucinAmortiguador Tris boratos 1 xAgua destilada estril (si fuese necesaria)


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Buffer de carga 20 xLeaderSolucin amortiguadora TE

METODO:Electrofortico

PROCEDIMIENTO:1. Re suspender la muestra de ADN en 10 ul de amortiguador TE.2. Dejar la solucin en re suspensin y proceder a preparar el gel de

agarosa.3. Pesar 0.6 g de agarosa y disolver en 60 ml de amortiguador de tris-

boratos 1X.4. Calentar hasta disolver y enfriar al chorro de agua hasta que alcance una

temperatura de un poco mayor que la corporal.5. Vaciar en la cmara de electroforesis y dejar que solidifique.6. Eliminar los peines y aadir 60 ml de amortiguador tris-boratos 1X.7. En el tubo Eppendorf con 10 ul del ADN recin disuelto aadir 10 ul de

agua y 2 ul de amortiguador de carga 20 X.8. Mezclar y centrifugar 2 seg. en la micro centrfuga.9. Tomar los 22 ul y colocarlo en un de los pozos del gel de agarosa.10. Una vez que se hayan colocado todas las muestras aadir 2 ul de

amortiguador de carga en los pozos vacos.11. Tapar la cmara y colocar los cables para realizar la electroforsis a 90

mA durante 1 hora.NOTA: Este paso es de cuidado por lo cual se recomienda que lo realizeel Profesor de Laboratorio para evitar accidentes.

12. Una vez desconectada la fuente de poder aadir 3 gotas de bromuro deetidio sobre el gel mezclar y reposar 10 min.

13. Enjuagar varias veces con agua destilada.14. Desprender el gel y observarlo a travs del transiluminador de luz

ultravioletaNOTA:El transiluminador emite luz ultravioleta la cual es peligrosa parael ser humano especialmente para los ojos, por lo tanto solo observar elgel utilizando una pantalla de acrlico.

RESULTADOS:Esquematize los resultados obtenidos por todos los equipos del laboratorio.


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DISCUSION:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

CONCLUSION:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

CUESTIONARIO1.- Indique cuales son los efectos de la luz ultravioleta sobre los cidosnuclicos.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2.- Explique cul es la funcin del bromuro de etidio.________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

3.- El amortiguador de carga contiene sacarosa al 25 % indique cual es sufuncin.________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4.- Explique el fundamento de la separacin electrofortica del ADN________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5.- Mencione otro procedimiento de separacin de ADN________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


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6.- Que enfoque en el campo mdico tiene este tipo de experimento ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

7.- Defina terapia gnica.________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________


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PRCTICA No. 6

EFECTO MUTAGENICO DE LA LUZ ULTRAVIOLETA.

OBJETIVO:Observar, mediante el conteo de la biomasa de una cepa de Escherichia colisusceptible a la luz ultravioleta, los efectos mutagnicos y la posible capacidadde reparacin del ADN que presenta esta bacteria.

PRERREQUISITOS:1. Replicacin del ADN2. Tipos de errores de copia posibles durante la replicacin.3. Mecanismos de Reparacin del ADN.4. Tipos de Mutaciones.

INTRODUCCION:Todos los organismos vivos contienen ADN. Este tiene la funcin primordial deregular la actividad metablica y funcional de cada organismo. Para que estosuceda, es necesario que la clula garantice la sucesin de su ADN en lasclulas hijas al momento de dividirse. Para esto, cuenta con sistemas quepermiten que el ADN se auto replique justo antes de la divisin. Sin embargo,esta auto replicacin est muy lejos de ser segura, debido a que existen unaserie de elementos que tienden a modificar la secuencia de nucletidos normaldel ADN. A estos elementos se les llama agentes muta gnicos, ya que suefecto principal es provocar errores de copia en el ADN durante la replicacin. Siestos errores no son oportunamente reparados, van a provocar modificacionesen la secuencia del ADN que sern incluidos en los ADN de las posterioresreplicaciones. Si estas modificaciones se expresan genotpica y fenotpicamente,entonces el error de copia se convierte en una mutacin que puede en unmomento dado modificar a tal grado la informacin gentica que hace imposiblela actividad biolgica de la clula y sobreviene la muerte.

Uno de los agentes muta gnicos ms agresivo es la radiacin ultravioleta cuyoefecto sobre el ADN es promover la formacin de dmeros de timina. Estosdmeros son reparables por medio de la enzima fotoreactivante, la cual es unaenzima muy activa en presencia de fotones luminosos. La ausencia de luzimpide por lo tanto la reparacin de este tipo de mutaciones.

MATERIAL:Cajas de Petri con agar nutritivo

Azas de nicromioPapel estao o de aluminioMatraz con extensin


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EQUIPO:Colormetro KlettTrasiluminador de luz ultravioletaIncubadora a 37C

SUSTANCIAS REACTIVAS:Cepa de Echerichia Coli

METODO:Inoculacin, mutacin por exposicin a luz ultravioleta, reparacin por fotoreactivacin a exposicin a luz blanca.

METODO:1. Se siembra una cepa de E. Coli en el matraz Erlenmeyer con los 50 ml.

de caldo nutritivo, colocndolo en la estufa de incubacin a 37C durante

24 horas.2. Se mide la densidad ptica del cultivo antes y despus de las 24 horas deincubacin colocando el medio lquido en el colormetro y midiendo laabsorbancia a 550 nm.

3. Tomando como referencia que la densidad ptica para esta bacteria esde 1 x 108 bacterias por ml. se realiza el clculo para hacer dilucioneshasta obtener 300 bacterias del cultivo lquido en una dcima de ml.

4. Se siembra una dcima de ml en cada caja de Petri previamente provistade medio de agar nutritivo (distribuir equitativamente).

5. Enumerar las cajas del uno al cuatro con marcador de tinta indeleble y seaplica el siguiente tratamiento de luz ultravioleta:a) caja # 1 se utiliza como testigo.b) caja # 2 se somete a 15 segundos de radiacin ultravioleta y seenvuelve inmediatamente en papel estao para evitar contacto con la luzde da.c) caja # 3 se somete a 15 segundos de radiacin ultravioleta y se exponea la luz durante 10 minutos.d) caja # 4 se somete a 30 segundos de radiacin ultravioleta y seenvuelve inmediatamente en papel estao para evitar contacto con la luzde da.e) caja # 5 se somete a 30 segundos de radiacin ultravioleta y se exponea la luz durante 10 minutos.f) caja # 6 se somete a 60 segundos de radiacin ultravioleta y seenvuelve inmediatamente en papel estao para evitar contacto con la luzde da.e) caja # 7 se somete a 60 segundos de radiacin ultravioleta y se exponea la luz durante 10 minutos.

6. Una vez llevado a cabo este tratamiento, se incuban las cajas Petridurante 24 a 48 horas y se cuentan las colonias.


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RESULTADOS:

Caja # 1 2 3 4 5 6 7Cuenta viable

% de sobrevivenciaEfecto mutagnico

DISCUSION:Enfoque su discusin en base al anlisis de los resultados comparando el % desobrevivencia con respecto al % de mutantes por placa.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

CONCLUSION:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

CUESTIONARIO1.- Explique con frmulas qumicas cual es el principal efecto de la luzultravioleta sobre el ADN:

________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2.- Indique cuales son los principales daos que se pueden presentar en unhumano cuando se expone por perodos prolongados a radiaciones ultravioleta:

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

3.- Cual es la funcin qumicamente hablando de la capa de ozono en laatmsfera para protegernos de las radiaciones ultravioleta emitidas por el sol:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


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4.- Explique cul es la razn de que la luz ultravioleta sea capaz de causarmutaciones en los organismos:

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________5.- Explique cmo funcionan los mecanismos de reparacin de mutaciones (2tipos):

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

6.- Complementarios.________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

BIBLIOGRAFIA:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


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PRCTICA No7

DIGESTIN DE CARBOHIDRATOS

OBJETIVO:Determinar el proceso de digestin de los carbohidratos mediante la absorcinde los mismos con el Test de OSullivan (determinacin de DiabetesGestacional) y la prueba Postprandrial (determinacin de Diabetes poralimentacin), por el mtodo enzimtico espectrofotocolorimtrico paradeterminar el buen funcionamiento de los Islotes de Langerhans en el Pncreas,descartando la patologa de la Diabetes Mellitus

PRERREQUISITOS:1._ Clasificacin o tipos de Diabetes

2._ Que es el ayuno y como influye en el metabolismo3._ Clasificacin de ayuno4._ Importancia mdica de la prueba postprandrial5._ Importancia mdica del Test de OSullivan6._ Que es la curva de tolerancia a la glucosa7._ Que es la hemoglobina glucosilada

INTRODUCCIN:La Diabetes Mellitus es un conjunto de trastornos metablicos que se caracterizapor un aumento de niveles de glucosa en sangre: hiperglucemia. La diabetes es

causada por varios transtornos, siendo la ms relevante la baja produccin de lahormona insulina, la cual es secretada por las clulas de los islotes deLangerhan en el pncreas, y que regula la entrada de glucosa a la clulas. Otraes el inadecuado uso de esta hormona debido al exceso y/o deficiencia deingesta alimentaria; y la resistencia a la insulina, que en realidad es laproblemtica que hay de la cantidad insuficiente o dao de los receptores que seencargan de dar entrada a la glucosa a las clulas y que sucede comnmenteen las personas obesas. Sin embargo se habla de factores genticos como otropunto importante en el desarrollo de la patologa DiabetesLa diabetes se puede clasificar en diabetes tipo I o insulino dependiente,diabetes tipo II o resistente a la insulina y diabetes gestacional, que se desarrolla

solo mientras existe embarazo afectando as al metabolismo de la madreEsta patologa puede determinarse por la cuantificacin de glucosa sricamediante anlisis diferentes dependiendo del paciente: Test de OSullivan,prueba posprandrial o curva de tolerancia a la glucosa.


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MATERIAL:Tubos de ensayeGradillaPipetas de 5 mlMicropipetas de 25 microlitros

Celdas para espectrofotometroEQUIPO:Espectrofotmetro

SUSTANCIAS REACTIVAS:Solucin reactiva de glucosa (glucosidasa peroxidasa)Estndar de glucosaSuero

METODO:

Enzimtico espectrotofocolorimtrico1. Se colocan una serie de tubos en los cuales se les agregan 2.5 ml de

Reactivo de Glucosa a cada uno.2. Al primer tubo se le agrega 25 microlitros de agua destilada3. Al segundo tubo se le agrega 25 microlitros de solucin estndar o patrn

de glucosa4. A los siguientes tubos, se les agrega para cada uno de ellos 25 microlitros

de suero sanguneo de una de las muestras correspondientes.5. Se homogenizan todos los tubos y se dejan reposar por 10 minutos

mnimo.6. Se calibra el espectrofotmetro a cero de absorbancia a 500 NM con el

tubo blanco7. Se obtienen los resultados y se sacan los clculos

RESULTADOS:

V.N. 60-100 mg/dl o 70-110 mg/dl de glucosa dependiendo de la tcnicautilizada

CALCULOS: Abs. del problema----------------------- X [patrn] = mg/dl

Abs. del patrn


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DISCUSION:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

CONCLUSION:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

BIBLIOGRAFIA:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________


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PRCTICA No.8

DIGESTIN DE PROTENAS GSTRICAS.

OBJETIVO:Al termino de esta prctica el alumno estar capacitado para describir en formaindependiente los procesos enzimticos que con llevan a la digestin de lasprotenas de la dieta que entran en el tracto gastrointestinal.

PRERREQUISITOS:1. Definir los terminos proenzima, zimogeno, serin-proteasa, arilamidasa2. Describir el proceso enzimatico-hormonal presente en el tracto intestinal.3. Describir los proceso de absorcin intestinal de protenas.

INTRODUCCION:Uno de los procesos enzimticos ms interesantes es el que se desarrolla en eltracto gastrointestinal, cuando es necesario digerir protenas de la dieta. Estasproteinas son digeridas en el tubo digestivo por enzimas proteolticas ypeptidasas que dejan libres sus aminocidos constituyentes. Algunas protenasde cadena corta y pptidos se absorben directamente del intestino, pero lamayor parte de los productos de su digestin circulan en forma de aminocidos.Con excepcin de las peptidasas intestinales, todas las enzimas proteolticasintestinales se activan mediante la conversin de precursores inactivos de gran

tamao, llamados zimgenos, ms pequeas enzimas activas. Uno de losprimeros zimgenos que se activan es el pepsingeno que se produce por lasclulas principales bajo el estmulo de la gastrina. este pepsingeno seautocataliza a pH bajo dando porciones activas llamadas pepsinas que a su vezcatalizan a otros zimgenos.Las enzimas proteolticas se liberan al intestino como respuesta de la actividadhormonal de la colestocinina-pancreozimina cuya funcin se da como respuestade la llegada del quimo al intestino delgado dando por resultado la liberacin dequimotripsingeno, tripsingeno, proelastasa y procarboxipetidasa que sonactivados principalmente por efecto de la tripsina y pepsina principalmente.La absorcin de protenas se dar en funcin a la capacidad proteoltica

intestinal y regularmente esta no es muy activa por lo cual se absorben grancantidad de pptidos pequeos adems de los aminocidos. Sin embargo lasclulas de la mucosa intestinal tienen capacidad peptidoltica para degradardichos pptidos antes de pasar al torrente circulatorio.La intensin de este experimento es la de promover la hidrlisis de una protena

utilizando dos tipos de enzimas intestinales como son la pepsina y la tripsinapara poder comparar la capacidad proteoltica de cada una de ellas analizandopor cromatografa los productos de la digestin de la protena.


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MATERIAL:Tubos de ensayo.Pipetas de 1.0 ml.Gradilla.

Placa de cromatografa en capa finaCapilares

EQUIPO:Incubadora a 37CEquipo para cromatografa en capa fina.

SUSTANCIAS REACTIVAS:Solucin de albumina al 0.5 %Solucin de peptona al 0.5%Solucin de gelatina al 0.5%

Proteinasa K 0.005%Pepsina 0.1%Tripsina 0.1%HCl 0.1%Bicarbonato de sodio 0.1M

METODO:Digestin por incubacin, cromatografico

PROCEDIMIENTO:1. Preparar una solucin de protena (albumina, peptona o gelatina) al 2.0%

en HCl 0.1 N (o por separado) y etiquetarla como "Protena".2. Preparar una solucin de pepsina al 0.1 % en agua destilada.3. Preparar una solucin de tripsina al 0.1 % en agua destilada.4. Preparar una solucin de proteinasa K al 0.005% en agua destilada5. Preparar una serie de tubos de acuerdo al siguiente cuadro:

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9Albumina .2 ml .2 ml .2 mlGelatina .2 ml .2 ml .2 mlPeptona .2 ml .2 ml .2 ml

Pepsina .2 ml .2 ml .2 mlTripsina .2 ml .2 ml .2 mlProteinasaK

.2 ml .2ml .2 ml

HCl .2 ml .2 ml .2 mlBicarbonatode sodio

.2 ml .2 ml .2 ml .2 ml .2 ml .2 ml


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6. Mezclar el contenido de cada tubo e incubar todos los tubos durante 24horas a 37 oC.

7. Enfriar al chorro de agua y proceder a colocar una muestra de cada tubo

en la placa de silica gel previamente activada.8. Utilizando un solvente de butanol-ac. actico-agua (40-10-50) proceder acorrer el cromatograma por 1 hora.

9. Revelar el cromatograma con nihidrina al 2 % en etanol de 96 %.10. Calcular los Rf para cada mancha que quede bien definida.

RESULTADOS:

Rf de la albumina - pepsina________________________________________________________________

Rf de la peptonapepsina________________________________________________________________Rf de la gelatinapepsina

________________________________________________________________Rf de la albuminatripsina

________________________________________________________________Rf de la peptonatripsina

________________________________________________________________Rf de la gelatinatripsina

________________________________________________________________Rf de la albuminaproteinasa K

________________________________________________________________Rf de la peptonaproteinasa K

________________________________________________________________Rf de la gelatinaproteinasa K

________________________________________________________________

DISCUSION:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


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CONCLUSION:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

CUESTIONARIO

1._ Cual es el fundamento de la cromatografa.________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2._ Describa los tipos de anlisis cromatogrficos existentes.________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

3._ Que es Rf y como se calcula.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4._ Cual es la fuente principal ms frecuentemente utilizada en el diagnsticoclinico para la tripsina.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5._ En que parte del organismo se comienza la digestin de las protenas.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


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6._ Cual es la funcin del HCl en el jugo gstrico y cul es su pH.________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

7._ De que se compone el jugo gstrico y en que porcentajes.________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

8._ Cual es la funcin de la pepsina en aparato digestivo________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________9._ Diga cual es la endopepsidasa especfica para enlaces peptdicos deaminocidos bsicos.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

10._ Diferencia entre endopepsidasas y exopepsidasa________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

11._ Describa con un esquema los puntos de rompimiento que se generan pormedio de la tripsina.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

12._Mencione las diferencias funcionales entre la tripsina y la carboxipeptidasa.________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


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13._Mencione los posibles mecanismos de absorcin de aminocidos y pptidosa travs de la mucosa intestinal.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________14._Explique el comportamiento del equilibrio nitrogenado cuando hay unaingesta excesiva de protenas.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

BIBLIOGRAFIA:________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


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PRACTICA No. 9

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LIPASA

(DIGESTION INTESTINAL DE GRASAS)

OBJETIVO:Al trmino de esta prctica, el alumno ser capaz de describir los mecanismosde absorcin intestinal de las grasas, as como, enumerar las diferentescaractersticas que complementan el experimento.

PREREQUISITOS:1. Efecto de los cidos biliares en la absorcin de las grasas.2. Definir emulsificacin y saponificacin.3. Caractersticas, origen y funcin de las lipasas.

INTRODUCCION:Las lipasas y las esterasas catalizan la hidrlisis de enlaces ster que seencuentran en un gran nmero de lpidos saponificables.

CH2- O - CO - R1 CH2- OH| |

R2- O - CH LIPASA CH - OH + 3 R-COOH| ----------> |

CH2- O - CO - R3 PANCREATICA CH2- OH

Estas enzimas estn ampliamente distribuidas en la naturaleza y sonespecialmente importantes en el tracto gastrointestinal, donde participan en ladigestin y absorcin de grasas.Debido a que las grasas no son solubles en agua, las enzimas deben de actuaren la interfase lpido-agua. Consecuentemente, los agentes emulsificantes talescomo las sales biliares producen a menudo una estimulacin marcada de lahidrlisis enzimtica de los lpidos, debido al incremento de la interfase lpido-agua. En la leche homogenizada, los glbulos de grasa estn finamentedivididos y este material sirve como sustrato excelente para las lipasas.En este experimento se emplea como enzima una lipasa muy potente que seencuentra en el pncreas.

MATERIAL:Matraces Erlenmeyer de 125 mlBuretas de 50 mlPipetas de 1, 5 y 10 ml


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EQUIPO:Pinza para buretaSoporte universalIncubadora a 37C

SUSTANCIAS REACTIVAS:LecheLipasa pancreticaLipasa pancretica calentada (hervida por 5 minutos)Bilis (dexosicolato de sodio al 1%)KOH al 0.1 NFenolftalena al 1% en solucin alcohlica

Alcohol de 96

METODO:Incubacin y valoracin acido base (titulacin)

PROCEDIMIENTO:Preparar una serie de 8 matraces Erlenmeyer de 125 ml de acuerdo a lasiguiente tabla:

Matraz T1 1 2 3 4 5 6 T2Leche (ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0Lipasapancreatica

___ 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 ____

Lipasapancreticacalentada

1.5 ___ ___ ____ ___ ___ ___ 1.5

Bilis (dexo-sicolato desodio)

___ ___ ___ ___ 1.5 1.5 1.5 1.5

Tiempo deincubacina 37C

45 15 30 45 15 30 45 45

Tabla 5 Actividad de la Lipasa Pancreatica

Despus de que cada matraz ha cumplido su tiempo de incubacin, retirarlo delbao, adicionar 12.5 ml de alcohol 96 y 3 gotas de fenolftalena (indicador)enseguida titular con KOH 0.1N.

Agitar el matraz durante la titulacin tan rigurosamente como sea posible, ya quela protena precipitada puede enmascarar los cidos grasos.


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Titular cada matraz tan rpido como sea posible (contra un fondo blanco), elcolor se tornara rosa y se debe mantener durante 1 minuto, debido a que ladigestin por la lipasa contina durante la titulacin.

RESULTADOS:

Matraz Gasto de KOH Diferencia Tiempo dede gasto de KOH incubacin

T1 ________ --------- ______

1 ________ 1 - T1 = _______ ______

2 ________ 2 - T1 = _______ ______

3 ________ 3 - T1 = _______ ______

4 ________ 4 - T2 = _______ ______

5 ________ 5 - T2 = _______ ______

6 ________ 6 - T2 = _______ ______

T2 ________ ---------- ______

En una hoja de papel milimtrico anexa, graficar en el eje de las y (ordenadas) ladiferencia de gasto de KOH y en el eje de las x (abcisas) el tiempo deincubacin.

DISCUSION:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


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CONCLUSION:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

CUESTIONARIO

1.- Con que otro nombre se le conoce a la lipasa gstrica y diga cual es sufuncin durante el proceso digestivo.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2._ Diga cuales son las diferencias entre una lipasa y una estereasa.________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

3._ Mencione tres enfermedades en las cuales participen los triacilgliceroles enel transporte y almacenaje de lpidos.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________4._Que diferencias hay entre los triacilgliceroles y los fosfogliceroles,esfingomielina y glucoesfingolpidos.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5._ Indique cuales seran las propiedades de las sales biliares.________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


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6._ Mencione 3 tipos de lipasa y cules son sus diferencias funcionales (referidoa los productos que se obtienen).

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________

7._ Diga cual es el modo de activacin de la lipasa pancretica y las condicionesptimas para su actividad.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

8._ Mencione 3 posibles causas de esteatorrea.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

9._ Cual es la funcin del clofibrato en pacientes hipercolesterolmicos y porqu.________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

10._ Cual es la funcin del desoxicolato de sodio sobre la estructura iniciallipdica.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

BIBLIOGRAFIA:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


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PRACTICA No 10

EXTRACCION Y SEPARACIN CROMATOGRAFICA DEFOSFOLIPIDOS

OBJETIVO:Extraer los fosfolpidos de las grasas neutras de una muestra cualquiera eidentificarlos por medio de una cromatografa de acuerdo a su composicin enbase a la fraccin colina o amino que estos tengan.

PRERREQUISITOS:1. Que es un fosfolpdo?2. Importancia bioqumica de los fosfolpidos3. Importancia mdica y nutriolgica de los fosfolpidos4. Diferencia entre soluciones polares y no polares

5. Qu es la colina y cul es su importancia biomdica?

INTRODUCCION:Estn constituidas bsicamente por tres elementos: carbono (C), hidrgeno (H) yoxgeno (O); en menor grado aparecen tambin en ellos nitrgeno (N), fsforo(P) y azufre (S).Una caracterstica bsica de los lpidos, y de la que derivan sus principalespropiedades biolgicas es la hidrofobicidad.La baja solubilidad de los lipdos se debe a que su estructura qumica esfundamentalmente hidrocarbonada (aliftica, alicclica o aromtica), con gran

cantidad de enlaces C-H y C-C.Los fosfolpidos son aquellos lpidos que estn constituidos por cido fosfricoderivado del glicerofosfrico que estn formados por una molcula de glicerolesterificada en las posiciones 1 y 2 por dos cidos grasos, con la posicin 3esterificada por un cido fosfrico que lleva unidas adems otras estructuras,dependiendo del fosfolpido de que se trate. De forma genrica se denominan"lecitinas", aunque se considera que la lecitina propiamente dicha es lafosfatidilcolina. Los fosfolpidos son los principales constituyentes lipdicos de lasmembranas biolgicas, donde forman estructuras en bicapa, con las zonas nopolares de los constituyentes de cada capa orientadas hacia el interior.Consecuentemente, los fosfolpidos se van a encontrar presentes en la mayora

de los alimentos complejos, en los que exista material celular.


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MATERIAL:Matraz Erlenmeyer de 1 litro (preferentemente)Placa de cromatografia

EQUIPO:Cmara de cromatografa

SUSTANCIAS REACTIVAS:Muestra orgnicaCloroformoMetanol

Acido acticoAguaKCl 0.1 M

METODO;Extraccin, separacin por cromatografa

PROCEDIMIENTO:Preparacin de la muestra:

1. Obtener la yema de un huevo (puede ser cualquier muestra) y mezclarcon 50 ml de cloroformo: metanol (2:1, v/v), agitar durante 20 minutoschocando con las paredes del frasco y filtrar (este tratamiento permiteextraer los fosfolpidos de los lpidos neutros).

2. Agitar el filtrado claro con 20 ml de KCl 0.1 M y centrifugar durante 10minutos a 3000 rpm

3. Desechar la fase acuosa (parte superiora9 y utilizar la fase orgnica parala cromatografa

Preparacin de la placa y aplicacin de la muestra:1. Identificar su placa con una marca con lpiz en la parte superior, hacer

una muesca en cada lado de la placa aproximadamente 1.5 cm de laparte inferior y calentar en el horno por unos minutos a 80C para suactivacin (no es necesaria si es nueva la placa), enseguida aplicar una


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muestra colocando primeo una gota, dejar secar al aire y volver a colocaruna segunda gota sobre la primera, hacer lo mismo con todas lasmuestras que someta a la cromatografa.

Desarrollo del cromatograma:

1. Aadir aproximadamente 50 ml de la mezcla de disolventes cloroformo:metanol: cido actico: agua destilada (65:25:8:4) recin preparada a lacmara de cromatografa y cerrar.

2. Posteriormente a la introduccin de todas las placas en la cmara decromatografa

3. Sellar con grasa y dejar correr los cromatogramas hasta 1 cm antes dellegar a la parte superior

4. Sacar los cromatogramas con cuidado, colocndolos en el horno o a laestufa a 80C

Revelado de los cromatogramas:

Cada placa se revela con diferente reactivoPlaca #1 Impregnar con el reactivo de molibdato y esperar 10 minutospara la aparicin del color azul. Reacciona con todos los fosfolpidosPlaca 2 Revelar con el reactivo de Bismuto (recin preparado), el cual esespecfico para fosfolpidos que contienen colina

Reactivo de trabajo de Bismuto: tomar 4 ml de solucin de Bismuto A, 2 ml decido actico al 20% y 1 ml de solucin de Bismuto B. Colquese en el aspersor.

Placa #3 Revelar con el reactivo de ninhidrina, el cual es especfico paraaminofosfolpidos. Una vez rociada la laca con ninhidrina colocar la placaen la estufa a 80C por unos minutos

RESULTADOS:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

DISCUSION:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

CONCLUSION:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


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BIBLIOGRAFIA:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


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PRACTICA No 11

INDUCCION Y REPRESION HORMONAL EN EL

METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS.

OBJETIVO:Conocer y describir detalladamente cada uno de los eventos del equilibriohomeosttico de la glucosa tomando en cuenta el papel que juegan lashormonas insulina y adrenalina en el control de este equilibrio.

PREREQUISITOS:1. Explicar la diferencia entre induccin y activacin enzimtica.2. Explicar la diferencia entre represin e inhibicin enzimtica.

3. Definir alosterismo y regulacin enzimtica.4. Definir hipoglucemia e hiperglucemia.

INTRODUCCION:La glucosa se considera, en la mayora de los organismos, como la fuente

primaria de energa oxidativa y todo el programa metablico celular estdiseado primordialmente para usar este metabolito como principal materiaprima. Este diseo implica que la absorcin de glucosa exgena sea muyeficiente de tal modo que garantice un aporte suficiente de la misma a todas lasclulas del organismo. Tal efecto obliga al organismo a mantener sistemas muyeficientes de regulacin para evitar una posible sobresaturacin de glucosa

celular. En los mecanismos de control homeosttico de glucosa estn implicadaslas principales vas metablicas de los carbohidratos, de hecho estas vas sonlas que mantienen el equilibrio y son: la gluclisis considerada como la vadegradativa principal de la glucosa; la glucognesis que genera al glucgenocomo principal fuente almacenable de glucosa; la glucogenlisis mecanismo porel glucgeno puede en caso necesario convertirse en glucosa y lagluconeognesis donde se puede formar glucosa cuando las necesidades de lamisma llegan a estados crticos. Todas estas vas presentan sistemas muycomplejos de autorregulacin enzimtica y de regulacin hormonal quedeterminar sincrona, actividad e inhibicin de cualquier cambio en laconcentracin de glucosa intra y extracelular.

Con este experimento nos disponemos a comprobar mediante el uso racional deanimales de laboratorio, las implicaciones que diferentes hormonas delorganismo tienen sobre las vas metablicas que mantienen el controlhomeosttico de la glucosa extracelular.Podemos considerar una hiptesis general donde determinamos: si lashormonas insulina y adrenalina estn directamente relacionadas con laregulacin del control homeosttico de la glucosa, entonces, modificando laconcentracin de tales hormonas en el organismo se genera un desequilibrio en


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la concentracin de glucosa extracelular. Esto nos lleva a dos hiptesis msconcretas que nos indican:Si la insulina tiene un efecto principalmente inductor en la captacin de glucosapor parte de las clulas y de la degradacin glucoltica y el almacenamientoglucognico de la glucosa, entonces, aumentando la concentracin de insulina

circulante, se generar un efecto hipoglicmico a la vez que se mantendr laconcentracin mxima de glucgeno heptico en un animal de laboratorio conuna concentracin de glucosa extracelular mantenida constantemente alta.Si la adrenalina tiene un efecto primario inductor de la movilizacin de laglucosa a travs de membranas celulares por su efecto activador de laglucogenlisis, entonces aumentando la concentracin de esta hormona segenerar un efecto hiperglicemiante primario y adems disminuir notablementela concentracin de glucgeno heptico en un animal de laboratorio donde semantiene la concentracin de glucosa extracelular constantemente alta.

MATERIAL:Celdillas para espectrofotmetroPuntas para micropipetasMicropipetasPipetas serolgicasMortero con pistiloTubos de ensayeGradilla

EQUIPO:Balanza de canastaBalanza de platoCentrifugaEspectrofotmetro

SUSTANCIAS REACTIVAS:AdrenalinaInsulina de accin intermediaInsulina de accin rpidaReactivo de glucosa (glucosa pap)Estndar de glucosaTCA 10%

Alcohol etlico al 96%Agua destilada

METODO:Diseo experimental por induccin y represin de hormonasColorimtrico y espectrofotocolorimetrico enzimtico


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PROCEDIMIENTO:Se requiere un lote de 4 ratas adultas (por sesin), sanas y con un pesopromedio de 400 gr. divididas en 4 grupos con el siguiente tratamiento previo:

GRUPO I: (AZUL) Administracin subcutnea de una dosis de 1.0 unidad de

insulina NPH (de accin intermedia)/ Kg de peso durante cinco 5 das, una horaantes de la hora de clase.

GRUPO AR: (VERDE) Administrar por va subcutnea 1.0 Unidad/Kg. deinsulina rpida, media hora (solo una aplicacin) antes del experimento.

GRUPO A: (ROJO) Administracin intramuscular de una dosis de 0.01 mg/ml/Kgde peso de adrenalina media hora antes del experimento.

GRUPO T: (NEGRO) Lote de ratas testigo sin tratamiento hormonal.

Nota: A los cuatro lotes de ratas se les administrar una dieta rica encarbohidratos, grasas y lpidos en una cantidad de 20 gr de purina por da ysolucin de dextrosa el 5.0%. (se deber refrigerar la solucin que no se estutilizando.)Si desconoce la forma de administrar las dosis de insulina y adrenalina asi comoel manejo de la rata, favor de consultar al Profesor, quien tambin les indicarque experimento va a realizar cada equipo.

COLECCION DE MUESTRAS:

EXTRACCION DE GLUCOGENO:1. Sacrificar a la rata con ter o cloroformo procurando no excitarla

demasiado.2. Extraer rpidamente el hgado y colocarlo en un

Manual de Practicas de Bioquimica Medica y Aplicada Modelo Viejo

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