Lic Stuchi Viviana GLic Stuchi Viviana G

Depto Microbiología IDIM A. LanariDepto Microbiología IDIM A. Lanari

Identificación de Identificación de Levaduras de interés Levaduras de interés

clínicoclínico

Características generalesCaracterísticas generales Hongos unicelularesHongos unicelulares EucariotasEucariotas Son heterótrofosSon heterótrofos 623 especies distribuidos en 60 géneros 623 especies distribuidos en 60 géneros

taxonómicostaxonómicos Amplia distribución en la naturaleza ( en frutas, Amplia distribución en la naturaleza ( en frutas,

granos, miel, alimentos con contenidos en azúcar, granos, miel, alimentos con contenidos en azúcar, suelo, aire, mar ( saprobios), piel, intestino, suelo, aire, mar ( saprobios), piel, intestino, mucosas de mamíferos ( comensal).mucosas de mamíferos ( comensal).

Utiles y perjudiciales para el hombreUtiles y perjudiciales para el hombre No forman parte de la flora humana normal, No forman parte de la flora humana normal,

exepto exepto C albicans, C parapsilosis y Malassezia spC albicans, C parapsilosis y Malassezia sp

Identificar los aislamientos a Identificar los aislamientos a nivel de especienivel de especie

situación actualsituación actualControlar a t= tControlar a t= t11,…t,…tnn, la aparición de , la aparición de

nuevas especies en el nosocomionuevas especies en el nosocomio incidencia, perfil de R a antifúngicos incidencia, perfil de R a antifúngicos Comparar con centros homólogosComparar con centros homólogosRealizar estudios de sensibilidad Realizar estudios de sensibilidad

cuando hay fallas en el ttocuando hay fallas en el ttoConfirmar posibles brotes ( técnicas Confirmar posibles brotes ( técnicas

de BM)de BM)

Criterios básicos para Criterios básicos para identificación de levadurasidentificación de levaduras

Forma de reproducción vegetativaForma de reproducción vegetativa

anamorfo o asexualanamorfo o asexual

teleomorfo o sexualteleomorfo o sexual

Formas de reproducción asexualFormas de reproducción asexual

Brotación Brotación Origen de la pared celular (holoblástica o enteroblástica)Origen de la pared celular (holoblástica o enteroblástica)

Posición en que se producen ( mono –bi—multipolar)Posición en que se producen ( mono –bi—multipolar) Forma en que se producen los brotes sucesivos (simpodial, Forma en que se producen los brotes sucesivos (simpodial,

en cadenas, acrópetas o basípetas)en cadenas, acrópetas o basípetas)

Fisión Fisión

Producción de conidias sobre un corto Producción de conidias sobre un corto cuellocuello

Formación de balistosporasFormación de balistosporas

Micromorfologia Micromorfologia (EXT DE MALTA LIQUIDO)(EXT DE MALTA LIQUIDO) Características de la fase Características de la fase

vegetativavegetativaForma de las células Forma de las células vegetativas o vegetativas o blastoconidiasblastoconidiasFormación de Formación de pseudomicelio: formación pseudomicelio: formación de cadenas de células de cadenas de células elongadas que se elongadas que se originan por gemaciónoriginan por gemaciónFormación de hifas Formación de hifas verdaderas ( micelio)verdaderas ( micelio)Formación de Formación de artroconidiasartroconidias

Características sexualesCaracterísticas sexuales

Formación de ascos/ascosporasFormación de ascos/ascosporas

Agar gorodkowa Agar acetato de sodioAgar harina de maíz(Hansenula anomala, S cerevisiae)

Cultivo en lámina o Cultivo en lámina o microcultivomicrocultivo

Portaobjetos

agar

Trazo con el cultivo de levadura

Morfología, producción de Morfología, producción de clamidosporos, pseudohifas y clamidosporos, pseudohifas y blastoconidias blastoconidias

Medios de cultivo APG, Agar Medios de cultivo APG, Agar Morfología, Agar harina de maíz, Agar Morfología, Agar harina de maíz, Agar leche + Tween 80 al 1%leche + Tween 80 al 1%

Algoritmo para la identificación de Algoritmo para la identificación de levaduraslevaduras

Muestra clínica

Siembra en agar cromogénico Siembra en Sabouraud con ATB

Observación examen directo Levaduras

Reaislamiento en agar Sabouraud con ATB

Levadura cultivo puroObservación aspecto de la colonia

*

Pigmentadas de color rosa o salmón

Urea +

No pigmentada.Color Blanco o crema

Rhodotorula spp Identificación

En agar cromogénico c/atb se visualiza a las 24 hs colonias puras, la siembra del material original permite detectar mas de un tipo de levadura e identificación presuntiva de C albicans, C krusei y C tropicalis

Agar CromogénicoAgar Cromogénico

Otras levaduras Otras levaduras +Cryptococcus, +Cryptococcus, +Trichosporon+Trichosporon

CHROMagar Candida

Levadura no pigmentada

Tubo germinativo(suero bovino)

Negativo Positivo (h/3hs)

Micromorfología(AM+EXT Malta liq )+Agar cromogénico

Candida albicans

Identificación presuntiva Identificación definitiva

Colonias en Chromagar Colonias en Chromagar verde esmeraldaverde esmeralda

Tubo germinativoTubo germinativo : : positivopositivoCrecimiento en extracto de maltaCrecimiento en extracto de malta formación de película : formación de película : negativonegativo pseudohifas o hifas verdaderas : pseudohifas o hifas verdaderas :

positivopositivoCrecimiento a 45°C en SDA Crecimiento a 45°C en SDA Candida albicansCandida albicans : : positivopositivo

Candida dubliniensisCandida dubliniensis : : negativonegativo

Formación de clamidosporosFormación de clamidosporos en en agar harina de maíz . agar harina de maíz . clamidosporos terminales

Candida albicans

clamidosporos en paquetes de 3-5 Candida dubliniensis

Incubar a 25-28°C, 48-72 Observación al MO: 10x, 40x

Colonias en CHROMagar Colonias en CHROMagar azulazul

Tubo germinativo : negativoTubo germinativo : negativo Crecimiento en extracto de maltaCrecimiento en extracto de malta formación de película : positivoformación de película : positivo pseudohifas o hifas verdaderas : positivopseudohifas o hifas verdaderas : positivo Formación de clamidosporos en agar harina de Formación de clamidosporos en agar harina de

maíz : negativomaíz : negativo Asimilación de trehalosa : positivo (+ 3 hs) Asimilación de trehalosa : positivo (+ 3 hs)

Candida tropicalisCandida tropicalis

Colonias en CHROMagar Colonias en CHROMagar rosarosa

Tubo germinativo : negativoTubo germinativo : negativo

Crecimiento en extracto de maltaCrecimiento en extracto de malta formación de película formación de película pseudohifas o hifas verdaderaspseudohifas o hifas verdaderas

Asimilación de trehalosaAsimilación de trehalosa

Asimilación de melibiosaAsimilación de melibiosa

C krusei C glabrata C parapsilosis

Fotos :Guia de identificacion presuntiva de levaduras de interés médico.

Película (Ext de malta)

-+

Pseudohifas o hifas verdaderas

+ -

C guillermondii /C parapsilosisdespués de 7 ds

C glabratadespués de 14 ds

C parapsilosis /C guillermondii / C glabrataC krusei

Trehalosa

+ -

C glabrata (antes de las 3 hs) C krusei/ C guillermondiiC parapsilosis

Melibiosa

+ -

C parapsilosis / C glabrata C guillermondii

Colonias en CHROMagar Colonias en CHROMagar blanco marfilblanco marfil

Tubo germinativo : negativoCrecimiento en extracto de malta formación de película pseudohifas o hifas verdaderas Urea de Christensen: Agar semilla de girasol : positivo ( colonias marrones) Cryptococcus neoformans Asimilación de inositol Asimilación de trehalosa y otros sustratos

+ -

Urea

Cryptococcus sppRhodotorula glutinus

Rhodotorula rubra

C parapsilosis / C catenulata/ C famataC kefyr/ C lusitaneae/ C pintolopesii

C rugosa/ C zeylanoidesHansenula anomala/ P wickerhamii

+ -

Inositol

Cryptococcus spp Rhodotorula spp

Especie de Levadura Micromorfología CHROMagar Trehalosa Urea

Calbicans Pseudomicelio con blastoconidias agrupadas clamidoconidias

Verde Neg Neg

C tropicalis Pseudomicelio largo y ramificado, blastoconidias dispuestas a lo largo

Azul Pos +3hs

Neg

C parapsilosis Pseudomicelio corto ramificado, blastoconidias ovoides

Crema ND Neg Neg

C kruseiCélulas alargadas con blastoconidias terminales

Rosa seca Neg

Pos débil

C glabrataBlastoconidias pequeñas sin pseudomicelio

Rosa, crema, ND Pos 2 hs Neg

C guilliermondiiBlastoconidias pequeñas c/ pseudo micelio rudimentario

ND Neg Neg

Cryptococcus neoformans

Levaduras redondas brotantes

ND Neg Pos

Trichosporon

spp

Blastoartroconidias

Clamidoconidias

intercalares

Azul violáceoND

Neg Pos

ND: no se distingue por color

Marcha mínimaMarcha mínima

Crecimiento a 37°CAusencia de micelio verdadero o pesudomicelioFenoloxidasa (+)Test de ureasa(+)

Identificación presuntiva deCryptococcus neoformans

Cápsula de polisacárido visible Cápsula de polisacárido visible examen directo con tinta chinaexamen directo con tinta china

A: 100X

Identificación ID 32CIdentificación ID 32C

2 ml de H2O estérilInóculo 2 Mc Farland250 ul

135 ul porpocillo

92% de aislamientos comunes92% de aislamientos comunes85% de los aislamientos raros85% de los aislamientos raros

Resultados: biocódigo de 8 dígitos Resultados: biocódigo de 8 dígitos identificación a través de un identificación a través de un

manual de códigosmanual de códigosAPI WEB on lineAPI WEB on line

Pruebas diferenciales para Pruebas diferenciales para identificar levaduras por el identificar levaduras por el

método de referenciamétodo de referencia

1. Prueba de formación de tubogerminativo por Candida albicans.2. Prueba de formación declamidosporas por Candida albicans.3. Agar semillas de girasol paradiferenciación de Cryptococcusneoformans.4. Prueba de la producción de ureasapara Cryptococcus neoformans.5. Crecimiento a 28 ºC y 37 ºC.6. Crecimiento en extracto de malta paraestudio micromorfológico.7. Cultivo en lámina en agar morfología(Difco) para estudio micromorfológico.

8. Crecimiento en agar morfología (Difco)para macromorfología.9. Ensayo de asimilación de Glucosa,Galactosa, L-Sorbosa, Celobiosa,Trehalosa, Sacarosa, Maltosa, Lactosa,Melibiosa, Rafinosa, Melezitosa, D-Xilosa,L-arabinosa, D-ribosa, D-manitol, ácidocítrico, eritritol y m-Inositol.10. Ensayo de asimilación de nitrato depotasio y peptona.11. Ensayo de fermentación de Glucosa,Sacarosa, Galactosa, Maltosa, Trehalosa yLactosa.12. Crecimiento en medio libre de vitaminas.13. Producción de ascosporas.

Características fisiológicas y Características fisiológicas y bioquímicasbioquímicas

Fermentación de compuestos Fermentación de compuestos carbonadoscarbonados(zimograma).(zimograma).

Utilización de azúcares en anaerobiosisUtilización de azúcares en anaerobiosis

Asimilación de compuestos Asimilación de compuestos carbonados y nitrogenados carbonados y nitrogenados (auxonograma)(auxonograma)

Utilización oxidativa (asimilación) de Utilización oxidativa (asimilación) de determinados compuestos C y Ndeterminados compuestos C y N

Marcha identificatoria de levadurasMarcha identificatoria de levaduras

Cepa pura Repique en YM

Extracto de Malta líquidoIncubar: 28°C, 72 hsObservar micromorfología

28°C y 37°C 24 hs Inóculo: 2-3 Mc Farland

5 ml de agua estéril

Medio ureaIncubar: 28°C, 72 hsMedio urea

Incubar: 28°C, 72 hs

Asimilación de azúcaresSembrar 0,5 ml / tubo

. . ..

Fermentación de:Glucosa- Galactosa-Maltosa-Sacarosa-Lactosa-CelobiosaLectura: 3-5-10 y 15 díasTemperatura: 28°CSembrar 0,1 ml /tubo

.

Asimilación de Nitrogenados

.0,5 mlLeer a las 48-72 hs a 28°C

.

C C C20

10

21

13

0

19

2 4

16

3

9 6

C C N17

14

18157 8

1

11

12

5

13 2013

0

1619

0

1620

AgradecimientosAgradecimientos

Departamento MicologíaINEI– ANLIS“Dr. Carlos G.

Malbran

Departamento de Microbiología IDIM A. Lanari