PRUEBAS DE IDENTIFICACION DE LEVADURAS

INTRODUCCION1.- LevadurasLa levadura ms utilizada por el hombre es Saccharomyces cerevisiae de la que se emplean diferentes cepas para la fabricacin de cerveza, vino, sake, pan y alcoholes industriales. Kluyveromyces fragilis es una especie fermentadora de la lactosa que se explota en pequea escala para la produccin de alcohol a partir del suero de la leche. Yarrowia lipolytica es una fuente industrial de cido ctrico. Trichosporum cutaneum desempea un importante papel en los sistemas de digestin aerbica de aguas residuales debido a su enorme capacidad de oxidacin de compuestos orgnicos, includos algunos que son txicos para otras levaduras y hongos, como los derivados fenlicos.

METODO CLASICO DE IDENTIFICACIONLa identificacin suele puede realizarse sobre una cepa pura, previamente aislada en un medio slido.Los criterios de identificacin de las levaduras pueden dividirse en 3 grupos:Caractersticas de reproduccin vegetativa.Caractersticas sexualesCaractersitcas bioqumicas y fisiolgicas.

Caractersticas de Reproduccin VegetativaLa reproduccin vegetativa puede hacerse por gemacin o escisin binaria o a veces una combinacin de las dos.La formacin de la yema comienza con una evaginacin de la clula, despues la yema aumenta de tamao antes de separarse de la clula madre.

La gemacin puede ser:Polar

Bipolar

Nadsonia sp

MultilateralSaccharomyces cerevisiae

Morfologa de las clulas vegetativasEstas caractersticas se estudian sobre preparaciones microscpicas efectuadas en estado fresco a partir de cultivos en medios lquido y sobre medio slido, tras la incubacin a 28C durante 3 das o ms.Crecimiento en medio lquidoCrecimiento en medio slido

Morfologa de las clulas vegetativasCRECIMIENTO EN MEDIO LQUIDOLos cultivos se efectun en medios con extracto de maltaSe anota el aspecto de los cultivos:Formacin de sedimento en el fondo del tubo y aspecto fino grueso.Pelcula en la superficieFormacin de gas.Crecimiento en medio slido

Morfologa de las clulas vegetativasCRECIMIENTO EN MEDIO SLIDOLos cultivos anteriores se les agrega agar 2%.La siembra se hace en estrasLa observacin del cultivo define:El tamao de las colonias.Su forma (contornos ntidos o irregulares, convexas o cncavas).Su aspecto (mate o brillante)Su pigmentacin.

Morfologa de las clulas vegetativasCRECIMIENTO EN MEDIO SLIDOLas clulas pueden ser esfricas, ovoides, alargadas, elpticas, apiculadas (en forma de limn) en forma de botella, triangulares, etc.A veces la forma es caracterstica de un gneroForma de botella MalasseziaTriangular TrigonopsisLa forma y tamao pueden estar sujeto a variacin (Sacharomyces cervisiae).

IDENTIFICACION MEDIANTE CRITERIOS MORFOLOGICOSLos criterios morfolgicos pueden ser, a su vez, macro o microscpicos.

1. Criterios macroscpicosEstos criterios tienen en cuenta el aspecto de las colonias de levaduras al crecer en los diferentes medios de cultivo.La mayora de los organismos levaduriformes crecen fcilmente en un gran nmero de medios de cultivo usados rutinariamente en el laboratorio de Microbiologa (agar sangre, agar chocolate, agar Cled, etc.). Sin embargo, el agar glucosado de Sabouraud (SDA), con o sin antibiticos aadidos, es el medio de aislamiento por excelencia para la identificacin de levadura.

IDENTIFICACION MEDIANTE CRITERIOS MORFOLOGICOSEn el medio SDA las colonias de levaduras suelen ser completas, ligeramente abombadas o planas, de consistencia mantecosa, lisas o rugosas con olor dulzn agradable, volvindose ms pastosas a medida que envejecen.

IDENTIFICACION MEDIANTE CRITERIOS MORFOLOGICOSEn el medio SDA las colonias de levaduras no desarrollan micelio areo, aunque en ocasiones pueden aparecer prolongaciones aracneiformes en la periferia de las colonias. Si se observa un micelio areo definido puede ser un hongo dimrfico o especies de levaduras como Geotrichum, Trichosporon o Blastoschizomyces.

IDENTIFICACION MEDIANTE CRITERIOS MORFOLOGICOSUna colonia de aspecto y consistencia mucoide sugiere la formacin de cpsulas Cryptococcus neoformans.Las colonias de color rojo-anaranjado o naranja por su riqueza en carotenoides.De aspecto cremoso o rugoso, gnero Rhodotorula color que manifiesta esta levadura

IDENTIFICACION MEDIANTE CRITERIOS MORFOLOGICOSLas algas acloroflicas del gnero Prototheca, tras incubacin a 28 C durante 3-4 das, desarrollan unas colonias blancas cremosas muy parecidas a las producidas por el gnero Candida.

CRITERIOS MICROSCPICOSCaractersticas microscpicas son muy tiles para la identificacin de algunas especies de levaduras. Tenemos:

1. PRUEBA DEL TUBO GERMINAL O FILAMENTACIN PRECOZEl tubo germinal es una extensin filamentosa de la levadura, sin estrechamiento en su origen, y su longitud tres o cuatro veces mayor que la clula madreSlo C. albicans es capaz de producir verdaderos tubos germinales

Morfologa microscpica de levadurasSembrar en medios adecuados para la esporulacin y o germinacin de los hongos.Medios adecuados son a base de cereales

RC (rice-cream), CMA (cornmeal)Incorporar Tween 80 para reducir la tensin superficial y famorecer la germinacin, filamentacin y esporulacin de las levaduras.

Morfologa microscpica de levadurasMorfologa microscpica de levaduras

Morfologa microscpica de levaduras1. MICELIO2.BLASTOPORAS3.CLAMIDOPORAS4.ARTROSPORAS

CRITERIOS MICROSCPICOS2. FORMACIN DE HIFAS, BLASTOCONIDIAS, Y ARTROSPORAS

Las especies del gnero Geotrichum tambin producen blastoconidias a partir del ngulo de la artroconidia, pero, en este caso, forman una estructura denominada palo de hockey

CRITERIOS MICROSCPICOS2. FORMACIN DE HIFAS, BLASTOCONIDIAS, CLAMIDOSPORAS Y ARTROSPORAS

C. tropicalis produce pequeas cantidades de blastoconidias, muy esparcidas o en pequeos grupos a lo largo de las hifas. C. parapsilosis, C. kefyr y C. krusei se ordenan a lo largo de una corriente de blastoconidias, que permite su identificacin

CRITERIOS MICROSCPICOSLAS CLAMIDOSPORAS son formas de resistencia, redondas u ovales, de 6-12 m de dimetro y pared gruesa, con aspecto de esporas laterales o terminales.Su produccin es caracterstica y diagnstica de C. albicans

HARINA DE MAIZ,A este medio debe agregarse Tween 80 (polisorbato) a una concentracin final de 0,02% para reducir la tensin superficial y aumentar la formacin de hifas

LECHE DILUIDAFavorece la produccin de clamidosporas. el medio de leche diluida (leche natural 170 ml, agua destilada 1.000 ml, cloranfenicol 0,25 g)..

Esquema de identificacin de levaduras

TINCIONESEl estudio microscpico de los organismos levaduriformes o microorganismos relacionados (gnero Prototheca) se puede llevar a cabo mediante tinciones,Tinciones simples.Tincin de Gram con esta tincin, las levaduras suelen comportarse como Gram positivasMediante estas tinciones tambin se puede observar la formacin de blastosporas, artrosporas, hifas, pseudohifas o endosporas.

CRITERIOS BIOQUMICOS ENZIMTICOSCHROMagar CandidaSirve para identificar las especies del gnero Candida y permite diferenciar C. albicans, C. tropicalis, C. krusei, y C. glabrata en funcin de los colores que desarrollan en este medio.Sembrar las placas e incubar a 30-37 C durante 48 h para que las colonias de levaduras desarrollen completamente el color. C. albicans son lisas y de color verde esmeralda.C. dubliniensis que desarrolla un color verde oscuro y es incapaz de crecer a 45 C C. tropicalis produce colonias azul oscuro con un halo prpura-marrn en el agar que la rodea. C. krusei forma colonias rugosas con el centro rosado y el borde blanco. C. glabrata manifiesta un color violeta morado. Las dems especies desarrollan colores y tonalidades diversas que no permiten su identificacin por este medioC. parapsilosis (roscea-lisa),Prototheca wickerhamii (crema).

CRITERIOS BIOQUMICOS ENZIMTICOSCandiSelectEl medio CandiSelect (Bio-Rad) es un medio selectivo que permite la identificacin de C. albicans mediante la hidrlisis del sustrato cromognico presente lo que origina el desarrollo de un color azul

CRITERIOS BIOQUMICOS ENZIMTICOSSistemas enzimticos comercializadosBactiCard Candida albicansPara detectar la presencia de las enzimas -galactosidasa (MUGAL) y L-prolina aminopeptidasa (PRO). La enzima MUGAL tiene la capacidad de hidrolizar el sustrato 4-metilumbeliferil-N-acetil--D-galactosaminida y producirla liberacin de 4-metilumbeliferona que es una sustancia fluorescente capaz de ser detectada al iluminarse con luz ultravioleta de 365 nm. La enzimaPRO hidroliza al sustrato L-prolina--naftilamida yreacciona con el Color Developer originando un color rojo

CRITERIOS BIOQUMICOS ENZIMTICOSIdentificacin de Cryptococcus neoformans por mtodos enzimticosDeteccin de ureasaUna levadura con reaccin positiva a la prueba de la ureasa es sugestiva de pertenecer al gnero Cryptococcus. Concretamente, las cepas de C. neoformans que son grandes productores de ureasa, comienzan a provocar cambio de color a las 2 h de

CRITERIOS BIOQUMICOS ENZIMTICOSPrueba de la enzima Nitrato-reductasaLa capacidad de C. neoformans de reducir nitratos a nitritos es una prueba de utilidad cuando se pretende identificar esta levadura

CRITERIOS BIOQUMICOS ENZIMTICOSPrueba de la Fenol-OxidasaC. neoformans produce fenol-oxidasa, una enzima necesaria para el metabolismo de la 3,4-dihidroxifenilanina (DOPA) y otros compuestos fenlicos en la sntesis de la melanina. Esto se evidencia por la produccin de un pigmento marrn oscuro o negro alrededor de la colonia de C. neoformans

Fermentacin de azcaresEs la degradacin de los hidratos de carbono con produccin de CO2.Puede haber degradacin de los hidrtaso de carbono con produccin de cido , pero esto no es un indicador de fermentacin.

Fermentacin de azcaresLEYES DE FERMENTACION DE AZUCARES POR LAS LEVADURAS O LEYES DE KLUYVER-DEKKER1. Toda levadura que no fermenta glucosa no fermenta ningn otro azcar.2. Si fermenta glucosa tambin fermente fructuosa y manosa3. No puede fermentar a la vez maltosa y lactosa

Fermentacin de azcaresINTERPRETACINPositivoSi hay presencia de gas en el interior de la campana de DurhamNegativoSi hay ausencia de gas en la campana de Durham

Pruebas de fermentacin y otras caractersticas de cultivo

AUXONOGRAMA ASIMILACIN DE NUTRIENTESEs la capacidad de utilizar ciertos compuestos orgnicos como nica fuente de carbono en crecimiento aerobio.Los compuestos carbonados pueden ser. Azcares, cidos orgnicos, alcoholes.Se denominan pruebas de asimilacin y se usa para valorar la capacidad de levadura de usar estos compuestos en aerobiosis.

Identificacin basada en mtodos deasimilacin de nutrientesAuxonograma convencionalMedios de cultivo base:

1. Medio sin carbono: Sulfato amnico (5 g/l), Fosfato monopotsico (1 g/l), Sulfato de magnesio (0,5 g/l), Agar (20 g/l).2. Medio sin nitrgeno: Glucosa (20 g/l), Fosfato monopotsico (1 g/l), Sulfato de magnesio (0,5 g/l), Agar (20 g/l).Como fuente de carbono se puede ensayar todos los azcares y alcoholes conocidos. Como substrato de nitrgeno se suele emplear peptona, asparagina, urea, sulfato amnico, nitrato de potasio aminocidos diversos.

AuxanogramaMedio YNBCarbohidratos:Glucosa, maltosa, lactosa, sacarosa, rafinosa, trehalosa y galactosa

Asimilacin de azcares

Identificacin basada en mtodos deasimilacin de nutrientesAUXACOLORLa galera Auxacolor es un sistema de identificacin basado en la asimilacin de 13 azcares que permite identificar 26 especies diferentes de levaduras. El crecimiento de la levadura se visualiza por el cambio de un indicador de pH. La galera incorpora, adems, una prueba de resistencia a la actidiona y otra para la deteccin de la actividad fenol-oxidasa de C. neoformans

Identificacin basada en mtodos deasimilacin de nutrientesSistema Uni-Yeast-TekPlaca plstica con compartimentos con agar para la asimilacin diferencial de siete hidratos de carbono.Cubeta central con agar harina de maz-Tween 80 para el crecimiento micelial y produccin de clamidosporas.Agar urea, Agar para reduccin de nitratosCaldo con extracto de carne al 2,6% (con 0,05% de glucosa) para la prueba del tubo germinal.

Identificacin basada en mtodos deasimilacin de nutrientesAPI 20C AUXSe compone de 20 cpulas con sustratos deshidratados para 19 pruebas de asimilacin.Las cpulas se inoculan con las levaduras. Identifica 34 especies La lectura de estas reacciones se con un control de crecimiento.La identificacin se obtiene, a partir de un cdigo numrico, mediante un catlogo analtico o un programa informtico.

Identificacin basada en mtodos deasimilacin de nutrientesLA GALERA ID 32 CSe compone de 32 cpulasPermite identificar 63 especies29 sustratos carbonado 1 control negativoSensibilidad a la cicloheximidaPrueba colorimtrica para la esculina.

Identificacin basada en mtodos deasimilacin de nutrientesSistema Vitek

Son tarjetas plsticas desechables con 30 celdillas:26 pruebas bioqumicas 4 controles. Identificar 36 especies 16 especies del gnero Candida, 6 Cryptococcus, 3 Rhodotorula, 2 Trichosporon, 3 Geotrichum, 2 Prototheca, Hansenula anomala, Pichia ohmeri, Saccharomyces cerevisiae y Yarrowia lipolytica

Identificacin mediante criteriosinmunolgicosBichro-latex albicansEs un mtodo para la identificacin rpida de aislamientos C. albicans por aglutinacin de partculas ltex utilizando un anticuerpo monoclonal especfico de C. albicans La prueba se realiza con dos reactivos:

a) bolas de ltex recubiertas con anticuerpos monoclonales que reaccionan especficamente con el antgeno de C. albicans localizado en su pared celular, y b) un agente disociante que permite la exposicin al antgeno.

Identificacin mediante criteriosinmunolgicosKrusei-colorEs un mtodo para la identificacin de aislamientos de C. krusei por aglutinacin de partculas de ltex, mediante un anticuerpo monoclonal que reacciona especficamente con el antgeno localizado en su pared

Identificacin mediante criteriosinmunolgicosIdentificacin de levaduras lipfilasDebido a su requerimiento de cidos grasos, las levaduras lipfilas no pueden ser identificadas con los sistemas y medios habituales para otras levaduras, por lo que su identificacin merece un comentario diferenciado.Durante mucho aos se ha venido utilizando el binomio Malassezia furfur para designar la fase micelial de las levaduras lipfilas.