CARACTERIZACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS MARINAS …
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1 CARACTERIZACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS MARINAS COMO AGENTES DE CONTROL BIOLÓGICO DE HONGOS FITOPATÓGENOS EN POSCOSECHA DE FRUTAS TROPICALES RESIDENCIA PROFESIONAL Ingeniería Bioquímica P R E S E N T A Eric Daniel Gutiérrez Pérez Asesor interno: ING. MARGARITA MARCELIN MADRIGAL Asesor externo: DR. LUIS GUILLERMO HERNÁNDEZ MONTIEL La Paz, B.C.S Enero-Junio de 2013 INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TUXTLA GUTIÉRREZ
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CARACTERIZACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS
MARINAS COMO AGENTES DE CONTROL BIOLÓGICO DE
HONGOS FITOPATÓGENOS EN POSCOSECHA DE FRUTAS
TROPICALES
RESIDENCIA PROFESIONAL
Ingeniería Bioquímica
P R E S E N T A
Eric Daniel Gutiérrez Pérez
Asesor interno: ING. MARGARITA MARCELIN MADRIGAL
Asesor externo: DR. LUIS GUILLERMO HERNÁNDEZ MONTIEL
La Paz, B.C.S Enero-Junio de 2013
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE
TUXTLA GUTIÉRREZ
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Contenido del Informe Técnico
Tema Pag.
I. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 6
II. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................... 8
III. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 9
4.1 General ................................................................................................................................ 9
4.2 Específicos .......................................................................................................................... 9
IV. CARACTERIZACIÓN DEL ÁREA DONDE SE DESARROLLO EL PROYECTO 10
5.1 Historia del CIBNOR ........................................................................................................ 10
5.2 Misión ................................................................................................................................. 12
5.3 Visión ................................................................................................................................. 12
5.4 Objetivos Estratégicos .................................................................................................... 12
5.5 Agricultura en zonas áridas ............................................................................................ 13
5.5.1 Misión ......................................................................................................................... 13
5.5.2 Visión .......................................................................................................................... 13
5.5.3 Objetivos .................................................................................................................... 13
5.6 Ubicación ........................................................................................................................... 14
5.6.1 Dirección Física ........................................................................................................ 14
5.6.2 Unidad de Enlace, La Paz ....................................................................................... 14
5.7 Instalaciones ..................................................................................................................... 15
V. PROBLEMAS A RESOLVER ........................................................................................... 16
VI. ALCANCES Y LIMITACIONES ................................................................................... 16
VII. FUNDAMENTO TEÓRICO ........................................................................................... 17
8.1 El cultivo de papaya (Carica papaya L.)....................................................................... 17
8.2 Enfermedades fúngicas en papaya............................................................................... 19
8.3 Antracnosis en papaya.................................................................................................... 20
8.4 Proceso de infección ....................................................................................................... 21
8.5 Criterios de calidad de frutos de papaya (CODEX STAN 183-1993) ...................... 21
8.6 Control de antracnosis .................................................................................................... 23
8.7 Control biológico .............................................................................................................. 24
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8.8 Identificación de una enfermedad desconocida - postulados de koch .................... 26
8.9 Identificación molecular .................................................................................................. 26
8.9.1 Extracción de ADN ................................................................................................... 26
8.9.2 PCR (Polymerase Chain Reaction) ....................................................................... 28
8.9.3 Electroforesis ............................................................................................................. 29
VIII. PROCEDIMIENTO Y DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS. .. 32
9.1 Muestreo de frutos de papaya enfermos ..................................................................... 32
9.2 Aislamiento de levaduras epifitas de frutos de papaya ............................................. 32
9.2.1 Caracterización de la levadura epífita de papaya ............................................... 32
9.3 Aislamiento de C. gloeosporioides ................................................................................ 32
9.3.1 Caracterización de hongos aislados ...................................................................... 32
9.3.2. Postulados de koch ................................................................................................. 33
9.3.3 Prueba de patogenicidad ........................................................................................ 33
9.4 Conservación de las cepas de Colletotrichum gloeosporioides y Levadura epífita
de papaya. ............................................................................................................................... 33
9.5 Procedencia de cepas antagonistas ............................................................................. 33
9.5.1 Caracterización de las cepas antagonistas .......................................................... 34
9.6 Prueba de antagonismo in vitro (medio sólido) ........................................................... 34
9.7 Prueba de antagonismo in vitro (medio líquido) ......................................................... 34
9.8 Micrografías MEB (microscopio electrónico de barrido) ............................................ 34
9.9 Extracción de ADN de hongos ....................................................................................... 35
9.9.1 Electroforesis de las extracciones de ADN .......................................................... 35
10 Identificación molecular de hongos por PCR ............................................................... 35
10.1 Electroforesis de los productos de PCR ................................................................ 35
10.2 Cuantificación de la concentración de DNA doble cadena de los productos de
PCR ...................................................................................................................................... 35
IX. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................... 36
X. CONCLUSIÓN Y RECOMENDACIONES ...................................................................... 59
XI. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................... 60
XII. ANEXO I ........................................................................................................................... 65
Aislamiento de levaduras epifitas de frutos de papaya .................................................... 65
Aislamiento de C. gloeosporioides ...................................................................................... 65
5
Postulados de koch ............................................................................................................ 65
Prueba de patogenicidad .................................................................................................. 66
Conservación de las cepas de Colletotrichum gloeosporioides y Levadura epífita de
papaya. ..................................................................................................................................... 66
Prueba de antagonismo in vitro (medio sólido) ................................................................. 67
Prueba de antagonismo in vitro (medio líquido) ................................................................ 67
Micrografías MEB (microscopio electrónico de barrido) ................................................... 68
Extracción de ADN de hongos ............................................................................................. 69
Electroforesis de las extracciones de ADN .................................................................... 69
Identificación molecular de hongos por PCR ..................................................................... 70
Electroforesis de los productos de PCR ......................................................................... 71
Cuantificación de la concentración de DNA doble cadena de los productos de PCR
............................................................................................................................................... 71
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I. INTRODUCCIÓN
Los Estados Unidos Mexicanos cuenta con gran diversidad de zonas climáticas lo
cual permite la producción de frutos de importancia económica como los frutos
tropicales. La producción de papaya (Carica papaya) en México es una de las
actividades de mayor importancia por su participación en los mercados de
exportación, dentro de los productos de exportación agrícola (frutas y hortalizas)
la papaya ocupa el lugar 26 en cuanto frutos exportados en importancia
económica para México con un valor de 69516 mil dólares (FAOSTAT, 2013) .
Los principales productores de papaya a nivel mundial de forma descendente en
2011 fueron India, Brasil, Indonesia, República Dominicana, Nigeria y México.
México ocupó el primer lugar en exportación de papaya en 2010 siendo su
principal comprador Estados Unidos de América con 119,733.00 toneladas con
valor de 68,990.00 mil dólares (FAOSTAT, 2013). En México se producen las
papayas de variedad Amarilla, Criolla, Hawaiana, Maradol y Roja, la papaya
Maradol es la que más se produce a nivel nacional con 611,653.84 toneladas y el
principal estado productor de ésta variedad es Chiapas que en 2011 produjo
140,721.5 toneladas (SIAP, 2012)
Las principales enfermedades poscosecha en papaya son la antracnosis y la
mancha chocolate (ambos originados por la infección latente de Colletotrichum) y
la pudrición del pedúnculo causada por Mycosphaerella (Ascochyta), Phomopsis, y
Botryodiplodia. La pudrición de la superficie del fruto es causada por Alternaria,
Phytophthra, Rhizopus, Stemphylium, y Mycosphaerella que pueden reducir la
vida poscosecha y la apariencia del fruto (Eckert & Ogawa, 1985; Durán & Mora,
1987; Mulkay, Paumier, Aranguren, & Herrera, 2010). Colletotrichum
gloeosporioides causa la enfermedad conocida como antracnosis, que es
responsable de pérdidas económicas importantes, en México esta enfermedad
ocasiona pérdidas que varían del 15 al 50% en poscosecha de frutos de papaya
(López Navarrete, 2010). C. gloeosporioides se encuentra en frutos de papaya
inmaduros y maduros, en porcentajes de 40 y 89% respectivamente, demostrando
su presencia en distintas etapas de desarrollo del fruto (Hernández Albíter, 2004).
En algunos lugares como Hawái una técnica que ha resultado efectiva para
disminuir las perdidas poscosecha de papaya por antracnosis y otras
enfermedades fungicas consiste en, aplicar un tratamiento hidrotérmico
poscosecha, sin embargo por sí solo no proporciona un control satisfactorio de la
pudrición del fruto y se presentan varios problemas asociados con este tratamiento
como, retardo en el desarrollo de color, marchitación en el almacenamiento etc.
(Eckert & Ogawa, 1985; Páez Redondo, 2003; López Navarrete, 2010; Hernández
Albíter, 2004). Comúnmente se utilizan compuestos sintéticos para controlar
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enfermedades poscosecha, entre los que más se utilizan están el Mancozeb,
Prochloraz, Bórax, Captán, Diclorán, Difenil fenilfenato sódico, Benomyl,
Tiabendazol, Metiotiofanato, azufre elemental, Vinclozolín, Bióxido de azufre,
ácido benzoico, entre otros (Eckert & Ogawa, 1985; Páez Redondo, 2003; Solano
& Arauz, 1995; López Navarrete, 2010; Hernández Albíter, 2004).
Los fungicidas que presentan mejor control de la antracnosis son: Thiabendazol
(Eckert & Ogawa, 1985), Prochloraz (Santamaría Basulto, Díaz Plaza, Gutiérrez
Alonso, Santamaría Fernández , & Larqué Saavedra, 2011) y el mancozeb
(Solano & Arauz, 1995). Sin embargo cada vez son mayores las restricciones de
orden higiénico-sanitarias sobre el uso de compuestos químicos, debido a sus
efectos tóxicos y de residuos que impactan en la salud humana, contaminación del
medio ambiente y la inducción del desarrollo de patógenos resistentes. Este
panorama hace necesaria la búsqueda de alternativas biológicas para combatir los
problemas fitopatológicos en cultivos hortícolas (Carrillo Fasio, y otros, 2005;
Baños Guevara, Zavaleta Mejía, Colinas León, Luna Romero, & Gutiérrez Alonso,
2004). En los últimos años, el control biológico ha sido sujeto de estudio y ha
demostrado ser efectivo en el control de enfermedades poscosecha. Las
levaduras son más utilizadas que las bacterias para controlar enfermedades
poscosecha, las cuales empleadas como antagonistas han demostrado efecto
antifúngico sobre diferentes patógenos.
Debido al gran problema que representa Colletotrichum gloeosporioides para las
plantaciones papaya en pre y poscosecha, se evaluará el efecto antagónico de
levaduras y bacterias de muestras marinas así como una levadura Debaryomyces
hansenii y una levadura epífita de papaya como agentes de control biológico de la
antracnosis.
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II. JUSTIFICACIÓN
Los Estados Unidos Mexicanos ocupan el primer lugar en la exportación de frutos
de papaya, sin embargo, existen grandes pérdidas de producción a nivel
internacional como exportador por la antracnosis que es ocasionada por el hongo
Colletotrichum gloeosporioides, se tienen reportes que dichos porcentajes de
pérdidas a nivel mundial pueden ir del 1% hasta el 93% dependiendo del manejo
poscosecha y las condiciones para la comercialización. Las estrategias de acción
implementadas para el control de este patógeno pueden ocasionar daños al fruto
en el caso de tratamientos hidrotérmicos se presentan varios problemas como
retardo en el desarrollo de color, marchitación en el almacenamiento y daño por
calor incipiente acompañado por un aumento de pudrición por Stemphylium y
Rhizopus, y el uso de fungicidas como el caso de benzimidazoles (Thiabendazol)
ocasiona efectos negativos en el hombre como por ejemplo daños en el sistema
nervioso, alergias entre otros, además de los residuos que persisten en el fruto
ocasionan contaminación del medio ambiente y la inducción del desarrollo de
patógenos resistentes. Cada vez son mayores las restricciones de orden higiénico-
sanitarias sobre el uso de compuestos químicos en el país y más aún en los frutos
destinados a exportación, por lo que es necesario buscar métodos de control
poscosecha de fiopatógenos. Actualmente se ha implementado principalmente el
uso de levaduras como agentes el control biológico ya que han demostrado
reducir los niveles de infección producidas por hongos aunque sus mecanismos de
acción no han sido del todo descritas hasta el momento. Por lo que se evaluará el
efecto antagónico de microorganismos de origen marino (levaduras y bacterias)
así como levaduras epifitas de fruto de papaya y Debaryomyces hansenii como
alternativa de control sobre el patógeno Colletotrichum gloeosporioides.
,
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III. OBJETIVOS
4.1 General
Evaluar la capacidad antagónica de las levaduras y bacterias de origen marino,
levaduras epífitas de papaya y la levadura Debaryomyces hansenii hacia el hongo
patógeno Colletotrichum gloeosporioides para su control en poscosecha de frutos
de papaya maradol (Carica papaya).
4.2 Específicos
Caracterización e identificación de Colletotrichum gloeosporioides aislado de papaya Maradol por medio de técnicas moleculares.
Caracterización e identificación de bacterias y levaduras de origen marino así como la levadura epifita de papaya Maradol por medio de técnicas moleculares.
Evaluación in vitro de la capacidad antagónica de distintas levaduras y bacterias de origen marino, levadura Debaryomyces hanseii y levadura epífita de papaya maradol hacia el hongo Colletotrichum gloeosporioides mediante competencia por espacio, nutrimentos, parasitismo o producción de enzimas hidrolíticas y además producción de metabolitos secundarios con efecto antibiótico o lítico en el caso de las bacterias marinas.
Cuantificación de la protección poscosecha de frutos de papaya maradol inoculados con los antagonistas hacia la antracnosis ocasionada por Colletotrichum gloeosporioides bajo condiciones ambientales.
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IV. CARACTERIZACIÓN DEL ÁREA DONDE SE DESARROLLO
EL PROYECTO
5.1 Historia del CIBNOR
El CIBNOR (antes CIB) fué creado en 1975 por el Gobierno del Estado de Baja California Sur y el CONACYT, para promover el desarrollo Científico y Tecnológico en la región del Estado. A partir de entonces, se han adherido diversas Instituciones de reconocido prestigio tales como: la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), la Universidad Autónoma de Baja California Sur (UABCS ) y el Instituto Politécnico Nacional (IPN). Actualmente, el Centro forma parte del Sistema de Centros CONACyT.
El inicio del entonces CIB fue muy difícil, dado el aislamiento geográfico de la entidad y sobre todo, la carencia de condiciones para atraer investigadores ya consolidados. Como resultado, el Centro se forma con jóvenes recién egresados de sus respectivas licenciaturas y una gran cantidad de estudiantes contratados como técnicos. A pocos años, se inició la superación académica del personal a través de estudios de posgrado en el extranjero, apoyados por la institución, y los estudiantes empezaron a obtener su licenciatura.
Uno de los grandes logros de este período fue la adquisición del predio llamado "El Comitán", a 20 kilómetros al norte de la ciudad de La Paz, con 217 hectáreas de superficie de terreno natural, e inicio de la construcción donde actualmente se alberga la sede del CIBNOR.
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Los inicios o primera etapa del CIBNOR estuvo a cargo como Director, el Dr. Félix Córdoba Alva, de 1975 a 1984.
En 1984 fue nombrado Director General el Dr. Daniel Lluch Belda, quien consolidó la existencia del Centro, a pesar de que el país pasaba por una etapa marcada austeridad económica.
El CIBNOR creció de una manera importante tanto en infraestructura física como en la formación de recursos humanos; se reincorporó al Centro en su mayoría, el personal que se encontraba realizando estudios de posgrado en México y en el extranjero. Asimismo, otros investigadores visualizaron al CIBNOR como un área de oportunidad para su desarrollo profesional.
En los 13 años de la administración del Dr. Lluch, el personal del Centro creció de 20 personas a 296, los investigadores con posgrado de 9 a más de 40, y se fundaron las unidades foráneas de Guaymas y Hermosillo, en el Estado de Sonora. En 1994 se inició también el Programa de Posgrado, con estudios a nivel doctoral.
En 1997, el Dr. Mario Martínez García, fue nombrado el Director General del CIBNOR, perdurando al cargo hasta 2007. Estos años caracterizaron el crecimiento de la institución, contando con una plantilla conformada por investigadores de alta calidad, dedicados y concientes de la importancia de su labor; existen grupos de apoyo a la investigación altamente calificados; se ha fortalecido la vinculación con el sector productivo del país y se han incrementado de manera notable las relaciones interinstitucionales con centros de investigación y universidades tanto a nivel nacional como internacional.
A partir de marzo del 2007, el Dr. Sergio Hernández Vázquez, inicia una nueva administración en el Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C. (CIBNOR), con un periodo que comprende del 1º de marzo del 2007 al 28 de febrero del 2012.
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Inició la nueva gestión, con una reestructuración interna de la institución, que le permite renovar su estructura y su visión. Estas modificaciones en las formas de trabajo, responden a la realidad cambiante de la época y a la dinámica científica, social y económica del País.
Hoy en día, el CIBNOR es una institución que se ha consolidado como una institución con reconocimiento nacional e internacional, que la ubican entre las mejores del país.
5.2 Misión
El Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C., es un centro de investigación perteneciente al Sistema de Centros Públicos CONACYT, cuya misión es coadyuvar al bienestar de la sociedad mediante la realización de investigación científica, innovación tecnológica y formación de recursos humanos, en el manejo sustentable de los recursos naturales.
5.3 Visión
Ser un centro de referencia, calidad y excelencia, que coadyuve activamente al desarrollo nacional en el área de los recursos naturales.
5.4 Objetivos Estratégicos
a. Contribuir a la solución de problemas del sector productivo, social y gubernamental, afines a las áreas científicas y tecnológicas del Centro.
b. Contribuir al conocimiento de los recursos naturales, así como del efecto producido por variables naturales y antropogénicas sobre los mismos.
c. Formar recursos humanos en las áreas de nuestra especialidad, con excelente formación académica y con habilidades para integrarse a los sectores que contribuyen al desarrollo nacional.
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5.5 Agricultura en zonas áridas
5.5.1 Misión
La misión del Programa de Agricultura en Zonas Áridas está enfocada a demostrar el valor que representa para la agricultura las condiciones extremas en zonas áridas, como la alta irradiación solar, los recursos suelo y agua salobre, y los periodos recurrentes de sequía, para la producción de plantas útiles económica y ambientalmente, a fin de transferir los resultados a la región.
5.5.2 Visión
Su visión contempla el desarrollar sistemas de manejo sustentables para el riego de cultivos de especies clave en el desarrollo de la agricultura del Noroeste de México, incluyendo especies hortícolas, forrajes, frutales, halófitas, plantas del desierto y orgánicos, con potencial de comercialización en el mercado regional, nacional, e internacional. Así mismo, proveer de recursos vegetales tolerantes a la salinidad y sequía, en las cuales se pueda aprovechar el agua salobre para contribuir al desarrollo socio-económico en zonas áridas y semi-áridas de la región y de México afectadas por esa condición.
5.5.3 Objetivos
Desarrollo de estrategias agrobiotecnológicas encaminadas a dilucidar los mecanismos bioquímicos, moleculares y ultraestructurales que confieren resistencia a condiciones extremas de salinidad y sequía en especies vegetales nativas de la región.
Adquirir, evaluar, propagar, y distribuir plantas con potencial en la agricultura de ambientes desfavorables de zonas áridas.
Desarrollar sistemas de producción y manejo que aseguren empresas agrícolas sustentables en zonas áridas, incluyendo opciones que sean ambientalmente afines a ecosistemas bajo irrigación con el aprovechamiento de aguas con alto contenido de sales.
Desarrollar estrategias de diagnóstico, manejo y control de enfermedades y plagas que conlleven al aseguramiento del estatus fitosanitario del Estado para continuar como entidad libre de plagas y enfermedades cuarentenarias.
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Consolidar una fortaleza para la adquisición, almacenamiento, actualización, y diseminación de información y conocimiento sobre agricultura de ambientes desfavorables de zonas áridas, incluyendo lo referente a irrigación salina, para compartir con instituciones de educación superior e investigación a nivel regional, nacional, e internacional mediante sistemas de comunicación en red.
Fortalecer la práctica regular de entrenamiento de personal técnico y profesional de la región en materia de agricultura de ambientes desfavorables de zonas áridas, así como lo de irrigación salina, y en el desarrollo de tecnologías de transferencia y programas de extensionismo.
5.6 Ubicación
5.6.1 Dirección Física
Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C. Km. 1 Carretera a San Juan de La Costa "EL COMITAN" Apdo. Postal 128. La Paz, BCS 23097, México
El CIBNOR cuenta con una oficina de enlace, convenientemente situada en la ciudad de La Paz, con el propósito de facilitar la recepción de documentación y proporcionar un mejor servicio.
5.6.2 Unidad de Enlace, La Paz (Domicilio Fiscal)
Instituto Politécnico Nacional 195, Playa Palo de Santa Rita Sur, La Paz, Baja California Sur. C.P. 23096 A.P. 128
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5.7 Instalaciones
Las Instalaciones principales del CIBNOR se encuentran a aproximadamente 17 kms. al norte de la Cd. de La Paz. Consta de un terreno de 214 hectáreas, con un frente de playa de alrededor de 300 metros.
Las oficinas que se alojaban en los edificios J, K, N, han sido reubicadas en oficinas móviles, de acuerdo a lo siguiente:
Camper 1: Dirección General Camper 2: Dirección de Gestión Institucional Camper 3: Dirección de Planeación y Desarrollo Institucional Camper 4: Órgano Interno de Control Camper 5: Subdirección Jurídica Camper 6: Departamento de Extensión y Divulgación Científica
Adicionalmente a las Instalaciones principales, el Centro cuenta con un edificio, ubicado en la entrada de la Cd. de La Paz, que alberga oficinas con funciones de enlace y alojamientos para investigadores visitantes.
CROQUIS GENERAL DEL CIBNOR, S.C.
(Centro de Invesigaciones Biológicas del Noreste S.C., 2012)
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V. PROBLEMAS A RESOLVER
Debido a la gran pérdida económica que representa la antracnosis (causada por
Colletotrichum gloeosporioides) para las plantaciones papaya en pre y poscosecha
en México, el proyecto busca evaluar el efecto antagónico de levaduras y
bacterias de muestras marinas así como una levadura Debaryomyces hansenii y
una levadura epífita de papaya, para usarse como agentes de control biológico de
la antracnosis.
VI. ALCANCES Y LIMITACIONES
Se caracterizaron (macro y microscópicamente) las cepas de bacterias y
levaduras obtenidas de la colección de microorganismos del CIBNOR. Se aisló e
identifico morfológicamente el hongo Colletotrichum gloeosporioides y junto con
las bacterias y levaduras se realizaron las pruebas de antagonismo en medios de
cultivo líquidos y sólidos. Se tomaron micrografías en el MEB del antagonismo en
medio líquido con levaduras y se logró la extracción de ADN de los 12 hongos
aislados de frutos de papaya además de obtenerse los productos de PCR de cada
uno para la identificación molecular.
Las principales limitantes son:
-La mayoría de las bacterias proporcionadas de la colección de microorganismos
del CIBNOR no fueron viables por lo que no se utilizaron en los antagonismos.
-Las bacterias recuperadas de la colección que fueron viables presentaban
dificultad para desarrollarse en los medios líquidos y sólidos por lo que en este
último no se evaluó el antagonismo.
-Se contaminó el patógeno con el que se realizaban los experimentos por lo que
no se pudo realizar la prueba de antagonismo in vivo con todos los antagonistas.
- No se consiguió la extracción de ADN ni los productos de PCR correspondientes
de todos los antagonistas para la identificación molecular, esto se pudo deber a
que muchas cepas ya no eran viables y a que no estaba estandarizada la técnica
para estos microorganismos además el uso de Gel Red en las electroforesis
presento anomalías.
-Por los retrasos en los antagonismos in vitro no se realizó la prueba de
producción de enzimas por API-ZYM.
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VII. FUNDAMENTO TEÓRICO
8.1 El cultivo de papaya (Carica papaya L.)
Su origen es de las tierras bajas de américa central y del sur de México,
posiblemente se produjo al oeste en el Caribe. Se desarrolla en las regiones
tropicales y subtropicales del mundo; en cultivos protegidos in regiones tropicales
frescas. Es el cultivo de mayor importancia comercial de las zonas tropicales y
subtropicales en el mundo y exportada en general a áreas donde no es posible su
producción. El papayo es una hierba arborescente de 2-10m de altura de vida
corta aunque puede vivir hasta 20 años, de tallo sencillo. Las hojas son
palmeadas-lobuladas de 25-75cm de diámetro de corta vida de 6-8 meses. Hay
tres tipos de árbol, con flores masculinas, femeninas y hermafroditas, los frutos
son producidos únicamente de las dos últimas. Los papayos se desarrollan y
producen los mejores frutos en áreas cálidas o calientes (21-32°C) y requieren
zonas con una pluviometría de 1800mm anuales. Con los cuidados adecuados se
produce la floración 4 meses después de la plantación y el fruto de 7-11 meses
después de la plantación (COVECA, 2010; Crane, 2006).
Clasificación taxonómica: Reino: Plantae. División: Spermatophyta. Subdivisión: Magnoliophytina. Clase: Magnoliatae. Orden: Violales. Familia: Caricaceae. Género: Carica. Especie: Carica papaya (Castro Landín, Morales, & Aranguren González, 2000)
La papaya es una fruta que posee sabor agradable y un alto valor nutritivo al ser
una fuente excelente de vitamina C, alto contenido de fibra y folato. Los frutos
están compuestos normalmente de 5 carpelos (exocarpo, Mesocarpio, placenta,
haz dorsal vascular y el canal del estigma) (Fig.1) unidos que dan lugar a la
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cavidad central que contiene las semillas. Esta cavidad puede ser de forma
estrellada a redonda. La placenta es parietal con las semillas relacionada in cinco
hileras (o barcas). Las semillas son de color gris obscuro a negro. Los frutos de
papaya de árboles femeninos son esféricos y aquellos de árboles hermafroditas
pueden presentar diversas formas dependiendo de los factores que afecten a la
morfología de la flor durante la ontogénesis. Los frutos son periformes (forma de
pera), esférica y cilíndrica, los frutos de forma periforme son las que comúnmente
se comercian más. Los frutos pueden tener un peso entre 200g a 10kg, una pulpa
con espesor de 1.5 a 4 cm y de entre 7-35 cm o más de largo. La pulpa va de
grisácea-blanca en frutos inmaduros a anaranjado-amarillo pálido, rosa salmón o
rojo dependiendo del cultivo cuando madura. El contenido de solidos solubles
alcanza del 5 al 19%. Los frutos son climatéricos y empiezan a desarrollar el color
de piel amarillo al final del estigma. El ritmo de respiración a 20°C es 9-18 mg CO2
Kg-1 h-1 en el cambio de color y 70-90 mg CO2 Kg-1 h-1 cuando madura (Paull,
Nishijima, Reyes, & Cavaletto, 1997; ProPapaya, 2012).
Hay numerosa variedades de papaya, las variedades más importantes en U.S incluyen la “Red Lady”, “Maradol” y variedades tipo Solo. (Crane, 2006). En México se cultivan las variedades Amarilla, Criolla, Hawaiana, Maradol y roja (COVECA, 2010). La papaya Maradol (Fig.2) se caracteriza por su alta
Fig. 1. Sección transversal y longitudinal a través de un fruto de papaya maduro mostrando la dirección del desarrollo de la coloración amarilla, la tez de la pulpa y el reblandecimiento. P, pedunculo; EX, exocarpio (piel); ME, mesocarpio (pulpa); PL, placenta; DB, haz dorsal vascular; SC, canal del estigma y SS, cicatriz dorsal del estigma.
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productividad y calidad de frutos. Las plantas son de porte bajo y pueden adaptarse a una gran variedad de suelos. Su potencial genético de producción por hectárea puede llegar a las 250 toneladas por hectárea. La proporción de plantas hermafroditas es de 66%, mientras que de femeninas, 34%. Los frutos de esta variedad son muy apreciados en todos los mercados por su consistencia y sabor; la piel de la fruta es lisa y delgada, alcanza un color amarillo-naranja cuando madura. El fruto es periforme, ovalado y/o alargado, puede llegar a pesar entre 1 y 3 kg. Su pulpa es de color rojo-zapote intenso. Posee una dulzura de 13º Brix., y sus sólidos solubles totales están alrededor del 18% (ProPapaya, 2012; Muñozcano Ruiz & Martínez Alvarado, 2009). Resulta muy sensible a enfermedades poscosecha como la antracnosis (ProPapaya, 2012).
8.2 Enfermedades fúngicas en papaya
Dentro de las enfermedades causadas por hongos está el ahorcamiento de tallo o damping-off; causado por el complejo fúngico de Phytophthora, Pythium y Fusarium (Hine, Holtzmann, & Raabe, 1965; Crane, 2006; Muñozcano Ruiz & Martínez Alvarado, 2009). El moho arenosos (Oidium caricae) es una enfermedad que se desarrolla bajo la superficie de las hojas absorbiendo sus nutrientes y estructuras causando la muerte de las áreas infectadas y la caída de las hojas (Crane, 2006; Hine, Holtzmann, & Raabe, 1965); Colletotrichum gloeosporioides ataca los peciolos de las hojas causado su muerte; Cercospora papayae infecta las hojas volviéndolas amarillas y secándolas (Hine, Holtzmann, & Raabe, 1965). Durante la floración se debe tener especial cuidado con la antracnosis, debido a que puede provocar el aborto de flores (Muñozcano Ruiz & Martínez Alvarado, 2009) entre otras enfermedades. Las principales enfermedades poscosecha son la antracnosis y la mancha chocolate (ambos originados por la infección latente de Colletotrichum) y la pudrición del pedúnculo causada por Mycosphaerella (Ascochyta), Phomopsis, y Botryodiplodia. La pudrición de la superficie del fruto es causada por Alternaria, Phytophthra, Rhizopus, Stemphylium, y Mycosphaerella que pueden reducir la vida poscosecha y la apariencia del fruto (Eckert & Ogawa, 1985; Durán & Mora, 1987; Mulkay, Paumier, Aranguren, & Herrera, 2010; Crane,
Fig. 2 Fruta de papaya Maradol.
20
2006; Hine, Holtzmann, & Raabe, 1965; Paull, Nishijima, Reyes, & Cavaletto, 1997).
8.3 Antracnosis en papaya
Colletotrichum gloeosporioides es el agente causal de la antracnosis que generalmente produce pudrición en hojas, flores y frutos (Mendoza, Moreno, Weil, & Elango, 2007), y es un patógeno de infección latente. Las infecciones latentes en el contexto de enfermedades poscosecha involucra la inhibición del desarrollo del patógeno a través de condiciones fisiológicas impuestas por el hospedero hasta que se lleva a cabo el estado de maduración, principalmente el período climatérico, donde ocurre cambios en la superficie del fruto los cuales proporcionan condiciones adecuadas para permitir una infección (Casarrubias Carrillo, Cárdenas Soriano, Nieto Ángel , & Gutiérrez Alonso, 2002; Mulkay, 2010). En los primeros síntomas usualmente aparecen áreas obscuras, pequeñas y redondas en porciones de los frutos maduros. Conforme los frutos maduran estas manchas se agrandan rápidamente formando lesiones circulares ligeramente hundidas. Debido a las recolecciones continuas de los frutos parcialmente maduros, las lesiones en los cultivos raramente son mayores de ¾ de pulgada de diámetro. Sin embargo las lesiones aumentan conforme los frutos maduran y pueden alcanzar un tamaño mayor de 2 pulgadas de diámetro. Mientras la lesión aumenta los márgenes toman un color obscuro mientras la porción central de la lesión se torna color café o negro. Conforme se desarrolla el hongo éste produce frecuentemente grandes masas de esporas en la porción central de la lesión ocasionando que ésta zona se vuelva de un color naranja o rosa luminoso. Las esporas a veces son producidas en anillos concéntricos, dando a la lesión una apariencia de ojos de toro. Además de producir la lesión en la superficie, el hongo también avanza al interior del fruto, produciendo la pudrición que afecta los tejidos del fruto, volviéndolos blandos y un poco obscuros. Aunque la enfermedad usualmente aparece en porciones maduras de los frutos, raramente las porciones verdes (inmaduras organolépticamente) de los frutos llegan a infectarse debido a que tan pronto el hongo penetra el fruto el flujo de látex que sale del fruto los pega en montículos. El hongo causante de la antracnosis también ataca lo peciolos inferiores de las hojas hasta causarles la muerte y son desprendidos de la planta, aunque no se le dé importancia a la caída de las hojas, la infección de los peciolos es importante ya que pueden actuar como una fuente potencial de inoculo para la infección de los frutos (Hine, Holtzmann, & Raabe, 1965). Este daño que el hongo ocasiona al fruto evita su comercialización por el mal aspecto que produce aunque las lesiones sean pequeñas. En México esta enfermedad ocasiona pérdidas que varían del 15 al 50% en poscosecha de frutos de papaya (López Navarrete, 2010). C. gloeosporioides se encuentra en frutos de papaya inmaduros y maduros, en porcentajes de 40 y 89% respectivamente, demostrando su presencia en distintas etapas de desarrollo del fruto (Hernández Albíter, 2004).
21
8.4 Proceso de infección
Las esporas generadas por este patógeno se dispersan por la salpicadura del agua de lluvia, sin embargo esto solo las desplaza a distancias relativamente cortas, la dispersión de esporas se da fácilmente por corrientes de aire. Se ha visto que en condiciones de humedad y viento las esporas pueden desplazarse por largas distancias comparadas con el desplazamiento de la lluvia (Lenné, Sonoda, & Parbery, 1984; Páez Redondo, 2003). Estudios histológicos de la patogénesis por Colletotrichum en aguacate y naranja indicaron que existen dos patrones de penetración del hongo, en uno se presenta el crecimiento del tubo germinativo que penetra de manera directa la epidermis del hospedante, y en el otro que es el más frecuente, el tubo germinativo forma un apresorio y después una punta infectiva que es la que penetra la pared periclinal de las células epidérmicas (Casarrubias Carrillo, Cárdenas Soriano, Nieto Ángel , & Gutiérrez Alonso, 2002). Las esporas que se encuentran en el fruto germinan en pocas horas y forman apresorios, de los cuales algunos germinan formando una hifa infectiva y por fuerza mecánica usando la enzima cutinasa ésta penetra la cutícula y se desarrolla de forma limitada en la capa epidérmica del fruto. Sin embargo la mayoría de los apresorios no germinan inmediatamente pero permanecen firmemente en la superficie del hospedero en el estado latente del patógeno hasta que se proporcionen las condiciones adecuadas para la infección (Eckert & Ogawa, 1985). En el campo está establecido que la temperatura óptima para la germinación de las esporas del hongo oscila entre 22 y 32°C con óptima de 25°C (Páez Redondo, 2003).
8.5 Criterios de calidad de frutos de papaya (CODEX STAN 183-1993)
Esta norma se aplica a las variedades comerciales de papayas obtenidas de Carica papaya L., de la familia de las Caricaceae, que habrán de suministrarse frescas al consumidor, después de su acondicionamiento y envasado. Se excluyen las papayas destinadas a elaboración industrial.
REQUISITOS MÍNIMOS
En todas las categorías, a reserva de las disposiciones especiales para cada categoría y las tolerancias permitidas, las papayas deberán: - estar enteras; - estar sanas, y exentas de podredumbre o deterioro que hagan que no sean aptas para el consumo; - estar limpias, y prácticamente exentas de cualquier materia extraña visible; - estar prácticamente exentas de plagas que afecten al aspecto general del producto; - estar prácticamente exentas de daños causados por plagas; - estar exentas de humedad externa anormal, salvo la condensación consiguiente a su remoción de una cámara frigorífica;
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- estar exentas de cualquier olor y/o sabor extraños; - ser de consistencia firme; - tener un aspecto fresco; - estar exentas de daños causados por bajas y/o altas temperaturas. Cuando tengan pedúnculo, su longitud no deberá ser superior a 1 cm. Las papayas deberán haberse recolectado cuidadosamente y haber alcanzado un grado apropiado de desarrollo y madurez, teniendo en cuenta las características de la variedad y/o tipo comercial y la zona en que se producen. El desarrollo y condición de las papayas deberán ser tales que les permitan: - soportar el transporte y la manipulación; y - llegar en estado satisfactorio al lugar de destino.
CLASIFICACIÓN
Las papayas se clasifican en tres categorías, según se definen a continuación: 1-Categoría “Extra” Las papayas de esta categoría deberán ser de calidad superior y características de la variedad y/o tipo comercial. No deberán tener defectos, salvo defectos superficiales muy leves siempre y cuando no afecten al aspecto general del producto, su calidad, estado de conservación y presentación en el envase. 2-Categoría I Las papayas de esta categoría deberán ser de buena calidad y características de la variedad y/o tipo comercial. Podrán permitirse, sin embargo, los siguientes defectos leves, siempre y cuando no afecten al aspecto general del producto, su calidad, estado de conservación y presentación en el envase: - defectos leves de forma; - defectos leves de la piel (como magulladuras mecánicas, quemaduras de sol y/o manchas de látex); la superficie total afectada no deberá superar el 10%. En ningún caso los defectos deberán afectar a la pulpa del fruto. 3-Categoría II Esta categoría comprende las papayas que no pueden clasificarse en las categorías superiores, pero satisfacen los requisitos mínimos especificados en la Sección 2.1. Podrán permitirse, sin embargo, los siguientes defectos, siempre y cuando las papayas conserven sus características esenciales en lo que respecta a su calidad, estado de conservación y presentación: - defectos de forma; - defectos de coloración; - defectos de la piel (como magulladuras mecánicas, quemaduras de sol y manchas de látex); la superficie total afectada no deberá superar el 15%; - ligeras marcas causadas por plagas. En ningún caso los defectos deberán afectar a la pulpa del fruto (FAO-OMS, 2013)
23
8.6 Control de antracnosis
Se han implementado varias medidas de control para este patógeno dentro de las
cuales tenemos métodos químicos y físicos.
El control de la antracnosis empleando químicos (fungicidas) en la medida más
recurrida de los productores por la agresividad del patógeno hacia los cultivos de
papaya y se aplican durante la floración y el desarrollo del fruto. Dentro de los
fungicidas empleados en frutos poscosecha se encuentran prochloraz
(Santamaría Basulto, Díaz Plaza , Gutiérrez Alonso, Santamaría Fernández, &
Larqué Saavedra, 2011), mancozeb, captan, clorotalonil (Solano & Arauz, 1995),
tiabendazol (Eckert & Ogawa, 1985), oxicloruro de cobre, benomyl, orthocide,
carbendazin (Páez Redondo, 2003) entre otros. Los fungicidas que reportan ser
más efectivos en el control de la antracnosis son el tiabendazol (4 g /litro) aplicado
en los frutos poscosecha protege adecuadamente los frutos, siendo eficaz en la
reducción de la pudrición del pedúnculo y la antracnosis, Prochloraz (112mg/L)
presenta nivel satisfactorio de inhibición de desarrollo de C. gloeosporioides y C.
dematium en poscosecha (Santamaría Basulto, Díaz Plaza, Gutiérrez Alonso,
Santamaría Fernández , & Larqué Saavedra, 2011) y el mancozeb (4 g ia/L) es
efectivo contra la antracnosis aplicado en la precosecha (Solano & Arauz, 1995). ,
sin embargo éstos no han sido suficientes para evitar altos daños poscosecha.
Para que los productos ingresen al mercado de los Estados Unidos debe
asegurarse que cumplan con la legislación de químicos establecida por la EPA
(Agencia para la protección del medio ambiente de los EE.UU.), dentro de los
químicos ya mencionados los que están aprobados por la EPA son mancozeb,
benomyl, clorotalonil y tiabendazol (IICA Nicaragua, 2006). Sin embargo el uso de
estos compuestos no evita grandes pérdidas de frutos poscosecha, además el
abuso en el empleo de éstos puede ocasionar el desarrollo de cepas resistentes,
contamina el ambiente por los residuos que se acumulan en los suelos que a la
vez son desplazados por las lluvias hacia los mantos acuíferos, es importante
mencionar por ejemplo que los benzimidazoles (tiabendazol, benomyl) ocasionan
efectos negativos tanto en el hombre como en animales, como afecciones del
sistema nervioso central, hígado, alergias e irritaciones de la piel, problemas en
los ojos y cáncer, como uno de los principales efectos crónicos (Hernández
Albíter, 2004).
Dentro de los métodos físicos se encuentra el tratamiento hidrotérmico de frutos
poscosecha que consiste en sumergir los frutos en agua a 49°C por 20min (Paull,
Nishijima, Reyes, & Cavaletto, 1997), el cual por sí solo no proporciona un control
satisfactorio de la pudrición del fruto y se presentan varios problemas asociados
con este tratamiento como, retardo en el desarrollo de color, marchitación en el
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almacenamiento y daño por calor incipiente acompañado por un aumento de
pudrición por Stemphylium y Rhizopus (Eckert & Ogawa, 1985; Páez Redondo,
2003; López Navarrete, 2010; Hernández Albíter, 2004). Otro método físico
empleado es el uso de radiaciones gamma en los frutos en dosis de 0.75kGy a
1kGy (Cia, Pascholati, Benato, Camili, & Santos, 2007) aun que presenta grandes
resultados en el control de la antracnosis ésta tecnología no es económicamente
accesible para los productores.
Como parte del manejo orgánico para el control de Colletotrichum gloeosporioides
en cultivos de aguacate se han implementado extractos de ajo, yodo y cobre
(sulfato de cobre) (Reyes Alemán, 2003). Se han formulado ceras con carbonato
de amonio (3%) ó bicarbonato de sodio (2%) (Sivakumar , Hewarathgamagae,
Wilson Wijeratnam, & Wijesundera, 2002), aplicándose en frutos de papaya, sin
embargo su efectividad es bajo comparado con el uso agroquímicos comerciales.
Se han realizado estudios en los que se emplea el uso de aceites esenciales de
plantas para el control de la antracnosis en poscosecha de papaya, como aceites
esenciales de tomillo (thymus vulgaris), limón Mexicano (Citrus aurantifolia)
(Bosquez Molina, Ronquillo de Jesús, Bautista Baños, Verde Calvo, & Morales
López, 2010), ajo (Allium sativum), eucalipto (Eucalyptus globulus) (Baños
Guevara, Zavaleta Mejía, Colinas León, Luna Romero, & Gutiérrez Alonso, 2004),
canela (Cinnamomum zeylanicum) combinado con goma arábiga que se obtiene
del árbol de Acacia (Maqbool, Ali, Alderson, Tengku Muda Mohamed, Siddiqui, &
Zahid, 2011), los cuales han mostrado tener un buen control sobre el desarrollo de
la enfermedad, sin embargo la composición de estos aceites depende del genotipo
y biotipo de plantas como de las condiciones ambientales del crecimiento de las
plantas y del proceso de extracción de los aceites ya que su efecto de control no
se atribuye a un solo compuesto.
8.7 Control biológico
El control biológico emerge como una estrategia efectiva para combatir la
descomposición de los frutos. El control biológico es especialmente factible debido
a que los frutos cosechados pueden someterse a tratamientos con antagonistas y
muchas enfermedades poscosecha infectan a través de heridas que se producen
en los frutos después de la cosecha (Zhang, Zheng, & Yu, 2007). Se pueden
promover y administrar antagonistas naturales (epífitos del hospedero) que ya
existen en la superficie de frutos y vegetales, o podemos introducir antagonistas
artificialmente para combatir patógenos en poscosecha (Wilson & Wisniewski,
1989). Los microorganismos antagonistas que han utilizado como agentes de
25
control biológico incluyen bacterias, levaduras y hongos que tienen la capacidad
de ejercer un efecto de control sobre diferentes patógenos de interés y se han
empleado para controlar diversas enfermedades de frutos y vegetales. Las
levaduras son más utilizadas que las bacterias para controlar enfermedades
poscosecha, las cuales empleadas como antagonistas han demostrado efecto
antifúngico sobre diferentes patógenos; los mecanismos de acción que presentan
son la producción de enzimas líticas, antibiosis, parasitismo, competencia por
nutrientes y espacio e inducción de resistencia. Las bacterias presentan un
antagonismo basado principalmente en la producción metabolitos secundarios con
efecto antibiótico o lítico, competencia por espacio y nutrientes (Hernández
Lauzardo, Bautista Baños , Velázquez del Valle, & Hernández Rodríguez, 2007);
Los mecanismos de acción de los hongos son el parasitismo, competencia por
espacio y nutrientes (Fernández Larrea Vega, 2001). Estos agentes de control
biológico deben tener características como; estabilidad genética, eficacia a bajas
concentraciones, control contra un amplio rango de patógenos, requerimientos
nutricionales simples, sobrevivencia bajo condiciones ambientales adversas,
resistencia a fungicidas, compatibilidad con otros tratamientos químicos y físicos,
ausencia de patogenicidad sobre el hospedero y no producir metabolitos
potencialmente tóxicos a humanos (Zhang, Zheng, & Yu, 2007; Hernández
Lauzardo, Bautista Baños , Velázquez del Valle, & Hernández Rodríguez, 2007)
Se han realizado estudios en los cuales se evaluó el potencial antagónico de
bacterias y levaduras epífitas de frutos de papaya como agentes de control
biológico de la antracnosis, los microorganismos que presentaron mayor control
sobre la antracnosis fueron las levaduras, sin embargo se señala que las pruebas
realizadas in vitro no es concluyente para dictaminar cual es el mejor antagonista
ya que se ha observado que algunas levaduras controlan al hongo in vitro pero no
in vivo, algunos son mejores controlando la enfermedad in vivo pero no presentan
una zona de inhibición fuerte contra el hongo in vitro, mientras que otros controlan
al hongo y la enfermedad in vitro y in vivo (de Capdeville, Teixeira Souza Jr.,
Pereira Santos , de Paula Miranda, Rodrigues Caetano, & Goncalves Torres,
2007).
Se ha reportado que Debaryomyces hansenni aislada de las profundidades del
mar puede ser utilizada para el control biológico de infecciones poscosecha por P.
italicum en Limón Mexicano lime debido a que ésta levadura presenta producción
de enzimas líticas de paredes celulares, inducción de resistencia del hospedero y
su mecanismo más importante es la competencia por espacio y nutrientes. D.
hansenii es capaz de consumir rápidamente las fuentes de carbono disponibles de
frutos dañados, retrasando de éste modo el crecimiento del hongo por disminución
26
o limitación de nutrientes (Hernández Montiel, Ochoa, Troyo Diéguez, & Larralde
Corona, 2010).
8.8 Identificación de una enfermedad desconocida - postulados de koch
Cuando un patógeno se encuentra en una planta enferma, puede ser fácilmente
identificado utilizando manuales especializados; en caso de que se tenga la
certeza de que el patógeno es la causa de la enfermedad, podrá considerarse
entonces que ha concluido el diagnostico. Sin embargo, en caso de que sea
probable que el patógeno represente la causa de la enfermedad, pero que no
existan registros anteriores que apoyen esa suposición, tendrán que considerarse
los siguientes puntos para comprobar la hipótesis de que el patógeno es la causa
de la enfermedad:
1- El patógeno debe encontrarse asociado con la enfermedad en todas las
plantas que se examinan
2- El patógeno debe aislarse y desarrollarse en un cultivo puro en medios
nutritivos y se deben describir sus características (parasito no obligado), o
bien debe permitirse que se desarrolle sobre una planta hospedante
susceptible (parásito obligado) y registrar su presencia y los efectos que
produzca.
3- El patógeno que se desarrolle en un cultivo puro debe ser inoculado en
plantas sanas de la misma variedad o especie en que apareció la
enfermedad y debe producir la misma enfermedad en las plantas
inoculadas.
4- El patógeno debe aislarse unas vez más en cultivo puro y sus
características deben corresponder a las anotadas en el segundo punto.
(Agrios, 2005)
8.9 Identificación molecular
8.9.1 Extracción de ADN
Las etapas del procedimiento que se realizan son las siguientes: • Desintegración del tejido y solubilización y homogenización de los componentes celulares
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• Precipitación de los ácidos nucleicos y disolución en un buffer adecuado -Homogenización de la muestra El método para desintegrar el tejido debe estar adaptado a las características de éste. Para grandes volúmenes de tejidos blandos, suelen usarse licuadoras esencialmente iguales a las licuadoras domésticas. Para volúmenes menores, en general es suficiente un homogeneizador, el cual consiste en un tubo de vidrio de paredes gruesas y un pistón (de vidrio o de teflón). La rotación del pistón dentro del tubo (propulsión manual o por un motor), disgrega la muestra. Tejidos más resistentes, como por ejemplo hueso o diente, necesitan tratamientos mecánicos especiales. Aquellos tejidos con células cuya pared celular es resistente, como por ejemplo vegetales, hongos o bacterias, requieren también condiciones drásticas. Uno de los métodos más utilizados consiste en congelar la muestra en nitrógeno líquido y, manteniéndola congelada, pulverizarla con un mortero. Así, además de desintegrar la muestra, se logra que ésta se mantenga a muy baja temperatura durante el tratamiento, con lo cual se evita la acción de nucleasas endógenas que pudieran degradar el material de interés. Como puede deducirse de los párrafos anteriores, se han descrito diversos métodos particulares a cada tipo de muestra. Por ejemplo, en el caso particular de células bacterianas, se emplea típicamente la enzima lisozima, que cataliza la degradación de la pared celular. Para facilitar a la solubilización de los componentes celulares, y a la ruptura de membranas y complejos proteicos, la solución de lisis contendrá un detergente iónico (dodecil sulfato de sodio, SDS). Este detergente dispersa los componentes de las membranas y desnaturaliza las proteínas. La solución de lisis contiene además el agente quelante de cationes divalentes EDTA. Esto impide la acción de las ADNasas (dependientes de Mg++), aunque no tiene efectos sobre la mayor parte de las ribonucleasas Es importante comprender que durante la homogenización de la muestra, así como en otros pasos siguientes de la purificación de ácidos nucleicos, las moléculas de gran tamaño (como por ejemplo las moléculas de ADN genómico presentes en los cromosomas, cuyo tamaño es del orden de millones de pares de bases) es fragmentado mecánicamente en forma parcial, por lo que se obtienen fragmentos de tamaño mucho menor (típicamente entre 20 y 200 kb). El grado de fragmentación dependerá, obviamente, de los métodos utilizados para la homogeneización y purificación. Los métodos más vigorosos por lo general permiten mayores rendimientos, al maximizar el número de células lisadas, pero por la misma razón llevan a una mayor fragmentación del ADN. -Extracción de proteínas y lípidos Los ácidos nucleicos son muy solubles en agua debido al fuerte carácter hidrofílico de sus grupos fosfato. Dentro de una mezcla de solventes no miscibles, uno acuoso y otro orgánico no polar, los ácidos nucleicos tenderán a permanecer en la fase acuosa, en tanto que los lípidos y gran parte de las proteínas
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desnaturalizadas se encontrarán en la fase orgánica. En la preparación de ácidos nucleicos, los solventes que se usan más frecuentemente para la extracción de proteínas y lípidos son el fenol y el cloroformo. -Precipitación de ácidos nucleicos La precipitación de los ácidos nucleicos permite su purificación y concentración. Se basa en la simultánea neutralización de las cargas negativas (mediante el añadido de sales), y deshidratación de la molécula (mediada por el agregado de alcoholes, típicamente etanol o isopropanol), lo cual lleva a su precipitación. La precipitación es un fenómeno reversible (mediante la disolución en soluciones acuosas) y no debe ser confundido ni con la desnaturalización (potencialmente reversible) ni con la degradación (irreversible) de los mismos. (Zárate Segura, Jiménez Sierra, Badillo Corona, Garibay Orijel, & Oliver Salvador,
2009)
8.9.2 PCR (Polymerase Chain Reaction)
Sabemos que el objetivo de la reacción en cadena de la polimerasa es obtener muchas copias de un fragmento de DNA, para después poder visualizar este fragmento y utilizarlo en otras aplicaciones si es necesario. Para alcanzar este resultado, es necesario añadir a la reacción:
El DNA a partir del cual queremos obtener una copia de un fragmento, es decir, el DNA que queremos amplificar. Este DNA se conoce como DNA molde.
Una enzima capaz de generar una copia de DNA a partir del DNA molde: una DNA polimerasa. La reacción se lleva a cabo en un tampón apropiado para el funcionamiento de la enzima polimerasa. Además, como cofactores de la polimerasa se añaden cationes divalentes, generalmente en forma de cloruro de magnesio (MgCl2).
Iniciadores de la reacción: Las enzimas DNA polimerasas únicamente son capaces de añadir nucleótidos al extremo 3’ libre de una doble cadena de DNA. Son necesarios por tanto moléculas cortas (entre 10 y 30 bases) de DNA de cadena sencilla. Estas moléculas son los cebadores o primers de la reacción. Como se explicará más adelante (apartado 4.2) son los cebadores los que van a delimitar el fragmento a amplificar.
Nucleótidos libres: las enzimas DNA polimerasas van a crear una cadena complementaria a la cadena molde mediante la incorporación de nucleótidos al extremo 3’ libre del cebador que se ha unido a la cadena molde. Los nucleótidos se añaden en forma de desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTPs).
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Estos cuatro componentes son los elementos básicos que es necesario incorporar a la reacción para que se complete una PCR.
Base teórica de la PCR
El proceso que tiene lugar durante la PCR se puede resumir de la siguiente forma: partiendo de un DNA molde, una enzima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir de la zona de doble cadena originada por la unión de los cebadores al molde. Ahora bien, los cambios de temperatura constituyen la base para que se completen los pasos necesarios. El proceso se lleva a cabo en tres fases: desnaturalización, hibridación y elongación. En primer lugar es necesario que el DNA se desnaturalice, es decir, que las dos cadenas de DNA se separen. Esta primera fase se conoce como desnaturalización y se lleva a cabo elevando la temperatura a alrededor de 94ºC. El siguiente paso consiste en un descenso de la temperatura para permitir que los cebadores se unan por complementariedad al DNA molde. Esta segunda fase se conoce como hibridación. Temperaturas habituales en esta fase oscilan entre 35 y 60ºC. Por último, en la fase de elongación o extensión, la enzima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir del extremo 3’ libre de la región en que han hibridado los cebadores. La temperatura a la que se lleva a cabo esta fase depende de la enzima polimerasa empleada; si se utiliza Taq polimerasa la temperatura de elongación suele ser de 72ºC. Estas tres fases constituyen un ciclo de la PCR. Tras un ciclo de PCR únicamente se ha obtenido una copia de un pequeño fragmento del DNA molde. En este primer ciclo, los fragmentos generados no tienen el mismo tamaño: la copia de cada una de la cadenas se inicia, a partir del extremo 3’, en el punto en el que el cebador hibrida con el DNA molde y termina en el momento en el que la enzima polimerasa no es capaz de añadir más nucleótidos (es decir, que la nueva cadena formada no tiene un tamaño definido). (Pérez Castro, 2013)
8.9.3 Electroforesis
Una vez que se ha realizado la extracción de ADN es necesario revisar la integridad y la cantidad del mismo, esto se efectúa mediante la separación por electroforesis en geles de agarosa o de poliacrilamida. La agarosa es más
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comúnmente utilizada puesto que no es tóxica. A los valores de pH en los cuales usualmente se trabaja con ácidos nucleicos, los grupos fosfato confieren carga neta negativa a estas moléculas. En la electroforesis en geles de agarosa, las moléculas de ADN lineales migran según su tamaño y se pueden visualizar mediante tinción. Los geles son teñidos con diferentes colorantes para visualizar el ADN. Los más comunes son: el bromuro de etidio, el nitrato de plata, y recientemente el SYBER SAFE, Gel Red, Syber Green, Syber Gold, etc. Los geles de agarosa se preparan fundiendo agarosa en presencia del buffer adecuado hasta que se logre una solución transparente. La solución fundida es puesta en un molde donde gelifica. El gel forma una matriz cuya densidad está determinada por la concentración de agarosa. Cuando se aplica un campo eléctrico a través del gel, el ADN migra hacia el ánodo. La velocidad de migración está determinada por varios parámetros, algunos de los cuales son detallados a continuación. a) Tamaño del ADN: Las moléculas de ADN lineal de doble hebra migran a través del gel a velocidades que son inversamente proporcionales al log del número de pares de bases. Dado que la carga del ADN está dada por los grupos fosfato y que por cada par de bases hay dos grupos fosfato, la relación carga/masa es la misma para moléculas de ADN de diferente tamaño. Pero, debido a la fricción que impone la malla del gel de agarosa, las moléculas de mayor tamaño serán retardadas respecto a las de menor tamaño. b) Concentración de la agarosa: Un fragmento de ADN lineal migra a diferentes velocidades dentro de geles con diferentes concentraciones de agarosa. La tabla siguiente muestra concentraciones de agarosa usadas para resolver fragmentos de ADN en los intervalos indicados.
c) Conformación del ADN El ADN circular cerrado de doble hebra superenrollado (forma I), el circular relajado con un corte en una de las hebras (forma II) y la forma lineal (forma III)
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que tengan idéntico peso molecular y misma secuencia van a migrar a distinta velocidad en los geles de agarosa. Las movilidades relativas de las tres formas dependen primariamente de la concentración de agarosa, pero también están influidas por otros factores como la corriente eléctrica aplicada, la fuerza iónica del buffer y de la cantidad del colorante presente (fundamentalmente en el caso de la forma I). d) Corriente aplicada A bajo voltaje, la velocidad de migración de los fragmentos lineales es proporcional al voltaje aplicado. Sin embargo a medida que la fuerza del campo eléctrico aumenta, la movilidad de los fragmentos de ADN de alto peso molecular se incrementa menos. Por lo tanto el intervalo efectivo de separación en los geles de agarosa disminuye a medida que el voltaje es incrementado. (Zárate Segura, Jiménez Sierra, Badillo Corona, Garibay Orijel, & Oliver Salvador, 2009)
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VIII. PROCEDIMIENTO Y DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES
REALIZADAS.
9.1 Muestreo de frutos de papaya enfermos
El muestreo se realizó en una plantación de papaya en el ejido de Pescadero, La
Paz, Baja California Sur. En centros comerciales de Soriana y Walmart de la paz,
Baja california sur. Se colectaron frutos con signos de antracnosis.
9.2 Aislamiento de levaduras epifitas de frutos de papaya
De frutos de papaya sanos obtenidos del centro comercial Walmart con madures
organoléptica, se aisló una levadura epífita de papaya tomando una muestra de
tejido de este fruto y sembrándolo en un medio de cultivo enriquecido, con
bactericida (ANEXO I)
9.2.1 Caracterización de la levadura epífita de papaya
La levadura se caracterizó morfológicamente y microscópicamente según las
descripciones de (García Cortés, 2004)
9.3 Aislamiento de C. gloeosporioides
De frutos de papaya con signos de antracnosis se aisló el hongo tomando
muestras de tejido de la parte infectada y se sembró en un medio de cultivo
enriquecido, con bactericida (ANEXO I)
9.3.1 Caracterización de hongos aislados
Los hongos aislados de frutos se caracterizaron a nivel macroscópico según las
claves para Colletotrichum gloeosporioides propuestas por (Weir, Johnston, &
Damm, 2012) y por medio de frotis se compararon sus estructuras microscópicas
con las descritas por (López Navarrete, 2010) para Colletotrichum spp.
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9.3.2. Postulados de koch
Con los hongos aislados se infectaron frutos de papaya sanos para comprobar la
capacidad de infección de las cepas y comparar la herida que producen con la
antracnosis. Tras transcurrir 7 días después de la infección se reaislaron los
hongos del fruto que se infectó. (ANEXO I)
9.3.3 Prueba de patogenicidad
Con los hongos identificados como Colletotrichum spp. se infectaron frutos sanos
de papaya y por cada cepa se medió la incidencia y el diámetro de lesión (con un
vernier digital) que ocasionan (ANEXO I)
9.3.3.1 Análisis estadístico
Los datos se procesaros en un análisis de varianza (ANOVA) de una vía. Se
utilizará el paquete estadístico STADISTICA (Versión 6.0, StatSoft, Tulsa, OK).
Para la separación de medias se realizó la prueba de Fisher de diferencia mínima
significativa (LSD) con un nivel de significancia del 5% (P<0.05).
9.4 Conservación de las cepas de Colletotrichum gloeosporioides y
Levadura epífita de papaya.
Se sembraron en tubos de ensayo con medio de conservación PDA (tubo
inclinado) las 12 cepas de hongos aislados y la levadura epífita de papaya.
(ANEXO I)
9.5 Procedencia de cepas antagonistas
Las cepas de levaduras y bacterias marinas, así como bacterias terrestres serán
obtenidas de la colección de microorganismos del laboratorio de Fitopatología del
Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste. Formando un total de 50
34
microorganismos sin caracterizar, 46 de origen marino y 4 terrestres más una
levadura Debaryomyces hansenni (L1).
9.5.1 Caracterización de las cepas antagonistas
Las levaduras se caracterizaron morfológicamente y microscópicamente según las
descripciones de (García Cortés, 2004). Y las bacterias se caracterizaron
morfológicamente y microscópicamente siguiendo las descripciones de (Pírez &
Mota, 2009).
9.6 Prueba de antagonismo in vitro (medio sólido)
En placas de petri con medio PDA se inocularon el hongo patógeno identificado
como Colletotrichum gloeosporioides y las cepas de levaduras y después de 7
días de incubación se medió el crecimiento radial del micelio con un vernier digital
para ver el efecto de inhibición. (ANEXO I)
9.7 Prueba de antagonismo in vitro (medio líquido)
En un tubo eppendorft se colocan 500µL de solución salina con una concentración
de 104 esporas/mL de Colletotrichum gloeosporioides más 500µL de medio de
cultivo con bacterias a 108 células/mL y para la prueba con levaduras la
concentración fue 106 células/mL. A las 24 y 48 hrs de montar el experimento se
contó en el microscopio óptico compuesto el número de esporas germinadas de
un total de 30 esporas por triplicado. (ANEXO I)
9.8 Micrografías MEB (microscopio electrónico de barrido)
De los antagonismos de medios líquidos se tomó una alícuota y se lava con agua
y alcohol en un filtro. El filtro con la muestra se secó y se le da un baño con iones
de oro para luego tomar micrografías en el MEB. (ANEXO I)
35
9.9 Extracción de ADN de hongos
De las 12 cepas de hongos aislados se extrajo el ADN según el protocolo de (Lee,
Choi, & Min, 2000) (ANEXO I)
9.9.1 Electroforesis de las extracciones de ADN
De los ADNs obtenidos de los 12 hongos aislados se realizó una electroforesis
utilizando una cámara de electroforesis y una fuente de poder, posteriormente se
observó el gel en el fotodocumentador para observar la presencia de ADN en
nuestras muestras. (ANEXO I)
10 Identificación molecular de hongos por PCR
Con las muestras de ADN de los 12 hongos aislados se llevó a cabo por la técnica
de reacción en cadena de la polimerasa según el protocolo de (Ochoa, Hernández
M., Latisnere, León, & Larralde, 2007) (ANEXO I)
10.1 Electroforesis de los productos de PCR
De los productos de PCR de los 12 hongos aislados se realizó una electroforesis
utilizando una cámara de electroforesis y una fuente de poder, posteriormente se
observó el gel en el fotodocumentador para observar la amplificación del
fragmento deseado en nuestras muestras. (ANEXO I)
10.2 Cuantificación de la concentración de DNA doble cadena de los
productos de PCR
Se cuantificó la concentración de ADN en los productos de PCR utilizando un
nanofotómetro. (ANEXO I)
36
IX. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se aislaron 12 cepas de hongos (Tabla 1) de frutos de papaya con signos de
antracnosis (Fig.13) y fueron identificadas como especies de Colletrotrichum por
sus características morfológicas.
Fig. 13 Frutos de papaya colectados en campo son signos des antracnosis.
Tabla 1 Caracterización morfológica de hongos aislados de frutos de papaya con signos de antracnosis en medio PDA.
CEPA MORFOLOGIA FOTOGRAFÍA MICROGRAFÍA
40X
M2CEP1 (1)/
Colonia circular, micelio plano filamentoso, esporulación de color naranja, con centro café obscuro. Reverso con pigmento naranjas, anillos concéntricos poco marcados. Hifa septada, conidio cilíndrico con extremos redondeados.
37
M2CEP2 (5)/
Colonia de forma circular con centro de aspecto acuosa, micelio plano filamentoso de color blanco-grisáceo, esporulación de color naranja. Reverso con pigmentaciones naranjas y un anillo concéntrico color café obscuro. Hifa septada, conidio cilíndrico con extremos redondeados.
M2CEP1 (2)
Colonia circular con suave coloración naranja en el centro, micelio color blanco, poco micelio aéreo en el centro y bordes. Reverso con coloración naranja en el centro, micelio blanco. Hifa septada, conidio largo, encorvadas con extremos punteados.
M2CEP1 (1)
Colonia circular con anillos concéntricos, color naranja claro, micelio velloso. Reverso con coloración naranja. Hifa septada, conidio cilíndrico con extremos redondeados.
M2CEP2 (4)/
Colonia circular, con esporulación color naranja intenso y pigmentos color negro en el centro, micelio filamentoso color blanco. Reverso con pigmentos naranjas y pigmentos color negro en el centro. Hifa septada, conidio cilíndrico con extremos redondeados.
38
1PATOGEN4
Colonia circular, micelio aéreo, blanco, velloso, con anillos concéntricos y hundimiento en el centro. Reverso con coloración naranja obscuro. Hifa septada, conidio corto, encorvadas con extremos punteados.
1PATOGEN3
Colonia circular con halos con pigmentos naranjas, micelio aéreo aterciopelado color blanco con bordes color verde obscuro. Reverso color verde obscuro con halos claros. Hifa septada, conidio cilíndrico con extremos redondeados.
1PATOGEN5 (8)/
Colonia irregular de forma cuadrada, color verde olivo con bordes blancos, micelio aéreo aterciopelado en el centro. Reverso color verde olivo con bordes blancos. Hifa septada, conidio corto cilíndrico con extremos redondeados.
AEPC2 (3)/
Colonia circular,con micelio algodonoso color blanco, con esporulación color naranja en el centro. Reverso color naranja en el centro con 2 anillos concéntricos y micelio color naranja claro. Hifa septada, conidio cilíndrico con extremos redondeados.
39
AEPC1 (2)/
Colonia circular, micelio algodonoso color blanco-grisáceo, con esporulación naranja en el centro. Reverso color café obscuro en el centro y bordes blancos. Hifa septada, conidio corto cilíndrico con extremos redondeados.
AEPC2 (7)/
Colonia circular, micelio algodonoso en la parte central y plano en los bordes, con esporulación color naranja en el centro y pigmentos verdes esparcidos en el micelio. Reverso color naranja claro con puntos obscuros. Hifa septada, conidio cilíndrico con extremos redondeados.
AEPC1 (6)/
Colonia circular, micelio velloso color blanco-grisáceo, con esporulación naranja en el centro y color verde obscuro en la parte central. Reverso color verde obscuro en el centro, bordes blancos y anillos concéntricos poco marcados. Hifa septada, conidio cilíndrico con extremos redondeados.
Los postulados de Koch (Fig.14) demostraron que de las 12 cepas aisladas solo 6
cepas son patogénicas y provocan una lesión en el fruto igual a la antracnosis
provocada por Colletotrichum gloeosporioides. Las cepas M2CEP2 (4)/, AEPC2
(3)/, AEPC1 (2)/, AEPC2 (7)/, AEPC1 (6)/ y 1PATOGEN3 se seleccionaron para la
prueba de patogenicidad. El análisis de varianza (Fig.15) mostro que las cepas
más patogénicas son AEPC2 (7)/, AEPC1 (6)/, AEPC1 (2)/. Por lo que se
seleccionó la cepa AEPC2 (7)/ para los ensayos de antagonismo.
40
Tabla 2 Resultados de la prueba de patogenicidad (Incidencia y lesión).
Cepa Diámetro de lesión Desv. Estándar Incidencia (%)
Control 0 0 0
1patogen3 26.68333333 2.759245066 100
M2CEP2 4/ 10.09666667 1.227124009 100
AEPC1 6/ 32.72 0.398873414 100
AEPC2 7/ 33.44333333 2.388395556 100
AEPC2 3/ 30.50666667 1.033650489 100
AEPC1 2/ 32.31 4.583961169 100
a b
Fig.14 Infección de frutos sanos de papaya con cepas caracterizadas como especies de Colletotrichum. a) fruto1, b) fruto2; La cepa FF1(9)/ está caracterizada como una especie de Colletotrichum aislado de frutos de mango para comprobar su patogenicidad.
Fig. 15 Grado de patogenicidad de cepas de Colletotrichum.
41
Se caracterizaron morfológicamente 39 bacterias (Tabla 3 y 4) y 7 levaduras de
origen marino (Tabla 5 y 6), 4 bacterias terrestres (Tabla 7) y una levadura epífita
de papaya (ECP4) ( Tabla 5 y 6).
Tabla 3 Morfología colonial de cepas bacterianas de origen marino en medio PDA
CEPA MORFOLOGIA MACROSCOPICA
FOTOGRAFÍA Superficie Forma Borde Color Otros
1R.1bF Plana Circular Redondeado Beige Centro blanco,
borde transparente
2R.1bF Convexa Circular Lobulado Amarillo Aspecto cremoso
3R.1bF Convexa Circular Redondeado Rosa Aspecto seco
1R.1cB Planoconvexa circular redondeado Roja Col. Opacas
1R.2aF Plana Circular Redondeado y
claro Beige
Aspecto cremoso ,centro opaco
1R.3aF Planoconvexa Irregular Lobulado Beige Translucida,
brillante
1R.E3sup Planoconvexa Irregular Lobulado Beige Opaca, swaming
42
2RR.E3sup Planoconvexa Irregular Lobulado Beige Translucida
1R.4aF50
ppm Plana Circular Redondeado Beige Centro opaco
1R.4bF5o
ppm Plana Irregular Ondulado Beige
Centro opaco amarillento
2R.4bF5o
ppm Planoconvexa Circular Lobulado Rojo Aspecto cremosa
2R.4cF Plana Circular Redondeado Beige Centro amarillento
:3R.4cF Planoconvexa Circular Lobulado Rojo Aspecto opaco
1R.5bF Plana Circular Lobulada Beige Centro blanquecino
1R.5cB Planoconvexa Circular Redondeado Blanco Aspecto cremoso
43
1R.6aB Convexa Circular Redondeado Rosa Aspecto opaco
1R.6bF Convexa Circular Redondeado Rojo Aspecto opaco
2R.6bF Convexa Circular Redondeado Rojo Aspecto seco
1R.E7supF Convexa Irregular Lobulado Amarillo Aspecto cremoso, centro obscurecido
2R.E7supF Convexa Circular Redondeado Rosa Aspecto seco
(1)1R.E7 7mF
Convexa Circular Redondeado Rosa Aspecto seco
(2)1R.E7 7mF
Plana Circular ondulado Beige :Centro amarillento
1R.E7 14mF
Planoconvexa Circular Redondeado Rojo Aspecto opaco
44
1R.E8 5mF Plana Circular Redondeado Beige Centro con coloración
blanquecina
2R.E8 5mF Planoconvexa Circular Redondeado Blanco Aspecto cremoso
1R.E9aF Plana Irregular Ondulado Beige Centro
blanquecino, translucidas
1R.E9bF Convexa Circular Redondeado Rosa Colonias opacas
1R.E9cF Plana Circular Redondeada Beige Centro
blanquecino, translucidas
2R.E9cF Convexa Circular Redondeada Rosa Aspecto cremoso
1R.10aF Plana Irregular Ondulado Beige Centro
blanquecino, borde claro
2R.10aF Plana Irregular Ondulado Beige Borde claro
45
3R.10aF Plana Irregular Ondulado Beige Borde claro
4R.10aF Convexa Circular Redondeado Rosa
intenso Aspecto cremoso
1R.10bF Plana Circular Redondeada Beige Centro
blanquecino, translucida
2R.10bF Plana Circular Redondeada Beige Centro
blanquecino, translucida
3R.10bF Plana Circular Redondeada Beige Centro
blanquecino, translucida
1R.10cF Plana Circular Redondeado Beige Translucida
1R.11aB Plana Irregular Ondulado Beige Translucida, opaco
1R.11bB Plana Irregular Ondulado Beige
amarillento Opaco
46
Tabla 4 Morfología microscópica de cepas bacterianas de origen marino.
CEPA MORFOLOGÍA CELULAR
MICROGRAFÍA Células Agrupamiento
1R.1bF Coco
2R.1bF Coco
3R.1bF Diplococo
1R.1cB Diplococo
1R.2aF Coco
1R.3aF Bacilo
1R.E3sup Bacilo
47
2RR.E3sup Bacilo
1R.4aF50 ppm Coco
1R.4bF5o ppm Coco
2R.4bF5o ppm Diplococo
2R.4cF Coco
3R.4cF Diplococo
1R.5bF Coco
48
1R.5cB Coco
1R.6aB Diplococo
1R.6bF Diplococo
2R.6bF Diplococo
1R.E7supF Diplococo
2R.E7supF Diplococo
(1)1R.E7 7mF Coco
49
(2)1R.E7 7mF Diplococo
1R.E7 14mF Diplococo
1R.E8 5mF Coco
2R.E8 5mF Estafilococo
1R.E9aF Coco
1R.E9bF Diplococo
1R.E9cF Coco
50
2R.E9cF Diplococo
1R.10aF Diplococo
2R.10aF Coco
3R.10aF Diplococo
4R.10aF Diplococo
1R.10bF Diplococo
2R.10bF Bacilo
51
3R.10bF Coco
1R.10cF Coco
1R.11aB Coco
1R.11bB Coco
Tabla 5. Morfología colonial de las cepas de levaduras de origen marino y una levadura epífita de papaya en medio PDA
CEPA MORFOLOGIA MACROSCOPICA
FOTOGRAFÍA Superficie Forma Borde Color Otros
3R.3Bf convexa Circular Redondead
o Blanco
Aspecto cremoso
1R.4Cf Planoconvex
a Ovoide Espiculado
Rosa pálido
Aspecto cremoso
52
1R.11Ab
Convexa Circular Redondead
o
Naranja
pálido
Aspecto cremoso
1R.11cB
Convexa Circular Redondead
o Rojo claro
Aspecto acuoso
2R.11cB
Convexa - - Rosa claro
Aspecto acuoso (hidroliz
a el medio)
2R.3bF Convexa - - Rosa claro
Aspecto acuoso (hidroliz
a el medio)
2R.4cB Elevada Puntiform
e Filamentoso Rosa
Aspecto seco
ECP4 (Epífita
de papaya)
Convexa Circular Redondead
o Blanco
Aspecto cremoso
53
Tabla 6. Morfología microscópica de cepas de levaduras de origen marino y una levadura epífita de papaya.
CEPA
MORFOLOGÍA MICROSCOPICA MICROGRAFÍA
Forma
3R.3bF Pseudohifas
1R.4cF Ovoide
1R.11aB Esférica
1R.11cB Esférica
2R.11cB Ovoide
2R.3bF Esférica
2R.4cB - Se contaminó
54
ECP4 (Epífita de papaya)
Esférica
Tabla 7 Morfología microscópica de cepas bacterianas de origen terrestre.
CEPA MORFOLOGÍA CELULAR
MICROGRAFÍA Células Agrupamiento
K1 Coco
K2 Coco
RBI Coco-bacilo
RBII Coco
Todas las Levaduras presentaron un efecto antagónico sobre el crecimiento del
patógeno AEPC2 (7)/ (Tabla 8) en los ensayos in vitro (medio sólido), la levadura
que presentó mayor antagonismo fue la cepa 1R.11cB (Fig. 16) que es de origen
marino, se observa en la placa un halo de inhibición de crecimiento haciendo que
el patógeno se desarrolle hacia los costados. Todas las levaduras presentaron el
halo en diferentes proporciones lo que indica que poseen por lo menos un
mecanismo antagónico, con esta prueba podemos sugerir que existe inhibición por
55
competencia de espacio y nutrientes por parte de las levaduras. No se pudo
evaluar el efecto antagónico de la cepa 2R.11cB debido ya que hidroliza el medio
de cultivo y se extiende por toda la placa.
NOTA: No se realizaron antagonismos en medio solido con bacterias por
contaminación del patógeno.
Tabla 8 Antagonismo en medio sólido. Inhibición del crecimiento de AEPC2 (7)/ por Levaduras en medio PDA.
TRATAMIENTO CRECIMIENTO RADIAL DEL PATÓGENO (mm)
% DE INHIBICION
CONTROL 45 0
3R.3bF 25.47333333 43.39259259
ECP4 22.23666667 50.58518519
1R.11aB 20.84333333 53.68148148
L1 19.23 57.26666667
1R.4cF 18.03333333 59.92592593
2R.3bF 17.74333333 60.57037037
1R.11cB 16.52666667 63.27407407
1R
.11cB
Fig. 16 inhibición del crecimiento ejercido por la levadura 1R.11cB hacia el patógeno AEPC2 (7)/ en medio PDA.
56
Las pruebas de antagonismo in vitro (medio liquido) se realizó con todas las
levaduras (8), con 4 cepas de bacterias terrestres y con 7 bacterias marinas
únicamente, debido a que muchas cepas marinas estuvieron mucho tiempo en
conservación y ya no eran viables, solo 16 cepas de bacterias marinas se
encontraron viables pero presentaron dificultad para desarrollarse en los medios
de cultivo.
En el antagonismo en medio líquido todos los tratamientos presentaron inhibición
en la germinación de esporas a las 24hr mas no así a las 48hr. Las bacterias
presentaron la mayor inhibición de germinación (Tabla 9) excepto la cepa
2RR.E3sup donde germinaron el 85.56% de las esporas lo que sugieren que su
principal mecanismo antagónico se debe a la competencia por nutrientes y de
espacio. Las levaduras presentaron inhibición (Tabla 10) de la germinación
significativamente menor en comparación con las bacterias esto se debe en cierta
medida a que la reproducción de las bacterias es más rápida.
Tabla 9 Porcentaje de germinación de esporas en el antagonismo en medio líquido CST con Bacterias
TRATAMIENTO % GERMINACIÓN DE ESPORAS 24 HR.
% GERMINACIÓN DE ESPORAS 48 HR.
CONTROL 87.78 100.00
1R.3aF 1.11 3.33
2R.4bF50ppm 0.00 0.00
1R.E9BF 2.22 3.33
2R.E7supF 2.22 0.00
4R.10aF 0.00 0.00
2R.6bF 0.00 0.00
2RR.E3sup 55.56 85.56
Tabla 10 Porcentaje de germinación de esporas en el antagonismo en medio líquido PDB con Levaduras
TRATAMIENTO % GERMINACIÓN DE ESPORAS 24 HR.
% GERMINACIÓN DE ESPORAS 48 HR.
CONTROL 87.78 100.00
EPC4 6.67 100.00
L1 14.44 100.00
1R.4cF 45.56 60.00
1R.11aB 25.56 95.56
1R.11cB 55.56 90.00
2R.11cB 7.78 73.33
2R.3bF 33.33 83.33
3R.3bF 38.89 42.22
57
Fig. 17 Micrografías del MEB de muestras de antagonismo en medios líquidos PDB con levaduras. Tratamientos A)Control, B)3R.3bF, C)ECP4, D)2R.11cB.ES (espora); M(micelio); DM(micelio dañado); LM(levaduras unidas al micelio).
Aunque las levaduras no fueron tan efectivas en el control de la germinación,
algunas de ellas presentaron mecanismos antagónicos diferentes causando daños
en el micelio de las esporas germinadas posiblemente por la producción de
enzimas líticas y adhiriéndose al micelio provocando una limitación en la absorción
de nutrientes, lo que posiblemente es una parasitosis (Fig. 17).
Se cuantificó la cantidad de ADN de doble cadena de los productos de PCR de
cada hongo aislado (Tabla 11).
Tabla 11 Concentración de ADN de los productos de PCR obtenidos de 12 cepas de Colletotrichum aisladas de frutos de papaya.
Producto de PCR de: Concentración de ADN (ng/µL)
M2CEP1 (1)/ 188 M2CEP2 (5)/ 180
ESD
D
MD
ES
M
ES
ES
ES
M LM
ES
M
LM
ES
ES
M
MD A)
D)
B)
C)
58
M2CEP1 (2) 173 M2CEP1 (1) 173 M2CEP2 (4)/ 205 1PATOGEN4 175 1PATOGEN3 222
1PATOGEN5 (8)/ 153 AEPC2 (3)/ 193 AEPC1 (2)/ 173 AEPC2 (7)/ 180 AEPC1 (6)/ 178
Como se reportaba en la revisión de literatura las levaduras no mostraron el
mismo antagonismo en medio líquido y sólido, a pesar de no mostrar resultados
tan buenos como las bacterias marinas esto no significa que sean
microorganismos poco aptos como agentes de control biológico ya que la
información proporcionada por las micrografías del microscopio electrónico de
barrido indican mecanismos de parasitismo y producción de enzimas líticas.
59
X. CONCLUSIÓN Y RECOMENDACIONES
-La antracnosis es una enfermedad altamente patogénica ya que por los
resultados de las pruebas de patogenicidad las heridas son notables a partir de 3
días después de la inoculación.
-En los ensayos in vitro (medio sólido), la levadura que presentó mayor
antagonismo fue la cepa 1R.11cB, y en los ensayos in vitro (medio líquido) la
levadura que presento mayor antagonismo fue la cepa 3R.3bF ambas de origen
marino, este comportamiento corresponde a lo descrito en la revisión de literatura.
-Todos los microrganismos evaluados en los antagonismos en medios líquidos
presentaron competencia por espacio y nutrientes como mecanismo antagónico.
-Las bacterias presentan mejor inhibición en la germinación de esporas en la
prueba en medio líquido.
-Algunas levaduras presentan aparentemente mecanismos antagónicos de
parasitismo y producción de enzimas líticas como las cepas 3R.3bF, ECP4 (epifita
de papaya), 2R.11cB.
-La levadura epífita de papaya muestra potencial como agente de control
biológico.
Hace falta realizar pruebas in vivo utilizando a las bacterias y levaduras, así como
evaluar la producción de enzimas de las levaduras por la prueba API- ZYM para
tener un panorama más amplio de su capacidad como antagonistas de
Colletotrichum gloeosporioides y considerarlos como agentes de control biológico
de la antracnosis. Sin mencionar el hecho de que, de no ser buenos en el control
de la antracnosis no significa que no tengan buenos resultados controlando otras
enfermedades.
60
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65
XII. ANEXO I
Aislamiento de levaduras epifitas de frutos de papaya
De frutos sanos se tomaron 3 segmentos de exocarpio de 2mm X 2mm del fruto, a
las muestras se les aplicó un lavado con bactericida (BactrolMR 2X, 0.5gL-1) por 2
minutos, posteriormente se aplicó un segundo lavado con agua destilada estéril
por 20seg, los segmento de tejido se colocan sobre sanitas estériles para remover
el exceso de agua y por último se depositaron las muestras de tejido en cajas de
Petri con medio Papa Dextrosa Agar (Bioxon®, 39gL-1) con bactericida (BactrolMR
2X, 0.5gL-1). Las placas se incubaron a 28°C durante 3 días. Se realizaron
resiembras hasta obtener cultivos puros en cajas Petri con medio Papa Dextrosa
Agar (Bioxon®, 39gL-1).
Aislamiento de C. gloeosporioides
De la parte infectada del fruto se tomaron 3 segmentos de exocarpio de 2mm X
2mm por lesión en el fruto, a las muestras se les aplicó un lavado con bactericida
(BactrolMR 2X, 0.5gL-1) por 2 minutos, posteriormente se aplicó un segundo lavado
con agua destilada estéril por 20seg, los segmento de tejido se colocan sobre
sanitas estériles para remover el exceso de agua y por último se depositaron las
muestras de tejido en cajas de Petri con medio Papa Dextrosa Agar (Bioxon®,
39gL-1) con bactericida (BactrolMR 2X, 0.5gL-1). Las placas se incubaron a 28°C
durante 7 días. Se realizaron resiembras hasta obtener cultivos puros en cajas
Petri con medio Papa Dextrosa Agar (Bioxon®, 39gL-1).
Postulados de koch
Se comprobó la capacidad de infección de las cepas de hongos inoculándolos en
frutos de papaya sanos y maduros organolépticamente. Los frutos de papaya se
sumergieron en una solución de hipoclorito de sodio (Clorox 1%) durante 2 min, se
lavaron dos veces con agua destilada estéril para remover los residuos de la
solución de cloro y se secaron con sanitas estériles. Posteriormente con el
escarpelo estéril, se les realizaron 3 heridas equidistantes de 3mm por cada cepa
y 2 más para el control, con un sacabocado estéril se tomó 3 taquetes (5mm de
66
diámetro por 4mm de altura) con micelio de cada hongo y se depositan sobre las
heridas, como control se utilizaron taquetes de medio de cultivo PDA (Bioxon®,
39gL-1) estéril. Los frutos una vez inoculados se almacenaron en recipientes de
plástico estériles y se incubaron a temperatura ambiente (24-28°C) por 7 días.
Transcurriendo los 7 días de incubación se observaron los frutos para ver si
desarrollaron la lesión característica de la antracnosis y se reaislaron los hongos
siguiendo la metodología descrita en el punto 9.2 para observar si el hongo
inoculado es el causante de la enfermedad de la antracnosis y cumplir con los
postulados.
Prueba de patogenicidad
Se compraron frutos de papaya sanos y maduros organolépticamente. Los frutos
de papaya se sumergieron en una solución de hipoclorito de sodio (Clorox 1%)
durante 2 min, se lavaron dos veces con agua destilada estéril para remover los
residuos de la solución de cloro y se secaron con sanitas estériles. Posteriormente
con el escarpelo estéril, se les realizaron 3 heridas equidistantes de 3mm por cada
cepa y 3 más para el control, con un sacabocado estéril se tomó 3 taquetes (5mm
de diámetro por 4mm de altura) con micelio de cada hongo y se depositan sobre
las heridas, como control se utilizaron taquetes de medio de cultivo PDA (Bioxon®,
39gL-1) estéril. Los frutos una vez inoculados se almacenaron en recipientes de
plástico estériles y se incubaron a temperatura ambiente (24-28°C) por 7 días.
Posterior mente se determinó la incidencia de la enfermedad y el tamaño de lesión
en mm (utilizando un vernier digital).
Conservación de las cepas de Colletotrichum gloeosporioides y Levadura
epífita de papaya.
En tubos de ensayo de 13x100mm (PYREX) con rosca se colocan 8.5mL de
medio PDA (Bioxon®, 39gL-1) y se coloca el tubo inclinadamente sin cerrar la tapa
completamente, una vez que solidifique el medio se incuba a 25°C por 24hrs.
Posteriormente con el sacabocado estéril se toma un taquete (5mm de diámetro
por 4mm de altura) con muestra del hongo y se coloca dentro del tubo poniendo la
superficie del taquete que contiene micelio, en contacto con el medio del tubo y se
cierra el tubo. Para la levadura con un asa estéril se toma inóculo y se estría sobre
el medio de PDA del tubo, y se cierra el tubo. Los tubos se rotulan y se colocan en
67
incubación a 25°C por 4 días, posteriormente se colocan los tubos en refrigeración
a 4°C.
Prueba de antagonismo in vitro (medio sólido)
En placas de Petri conteniendo medio PDA se inoculó en el centro de la placa un
taquete del hongo fitopatógeno con 7 días de crecimiento y en cuatro extremos de
la caja a 2.5cm del centro se estría inoculo de las cepas antagonistas (4mm de
longitud). Las estrías deben ser de antagonistas diferentes y la prueba se realizó
por triplicado, se utilizó como control una placa con medio PDA inoculada
únicamente con un taque del hongo fitopatógeno. Se incubaron las placas a 25°C
por 7 días y posterior mente se midió el crecimiento del micelio con un vernier
digital hacia las estrías para observar la inhibición del crecimiento del hongo.
Prueba de antagonismo in vitro (medio líquido)
Se pusieron a crecer los antagonistas en medios líquidos en tubos falcon de
50mL, en medio Caldo de Papa Dextrosa (BD DifcoTM, 24gL-1) las levaduras y en
medio Caldo Soya Tripticaseina (Bioxon®, 30gL-1) las bacterias, se incubaron a
25°C en una incubadora con agitación por 5 días.
De medio de cultivo solido se colectaron esporas del hongo fitopatógeno con 7
días de crecimiento. Con un asa estéril se tomó micelio del hongo (3 asadas) y se
colocaron en un tubo falcon de 50mL con Solución salina (NaCl, 0.85%) se tapó y
agito el tubo para desprender y homogenizar las esporas en la solución, se realizó
un recuento (ejemplo Fig. 18) de esporas colocando una alícuota de 2µL en la
cámara de neubauer y se utilizó la fórmula:
𝑁𝑢𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠,𝑒𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠 𝑜 𝑙𝑒𝑣𝑎𝑑𝑢𝑟𝑎𝑠
5𝑋25𝑋104 = 𝑥 𝑜𝑟𝑔𝑎𝑛𝑖𝑠𝑚𝑜𝑠/𝑚𝐿
Fig.18 Ejemplo de recuento en cámara Neubauer
68
Se ajusta la concentración de esporas a 104 esporas/mL.
A los 5 días de haber inoculado los antagonistas en medio líquido, se toma una
alícuota de 2µL de medio con antagonista (por duplicado) y se hace el recuento de
microorganismos en la cámara de neubauer y se ajusta la concentración de
bacterias a 108 células/mL, y para las levaduras 106 células/mL. Si en el conteo la
cantidad de levaduras o bacterias es mayor al deseado se realizan diluciones
utilizando el medio de cultivo líquido estéril correspondiente a cada organismo.
Para las esporas la dilución se realiza con solución salina (NaCl, 0.85%).
Una vez ajustada la concentración de antagonistas y de esporas, en tubos
eppendorft de 1.5mL se colocan 500µL de muestra con antagonista y 500µL de
solución salina con esporas por cada antagonista y como control en un tubo
eppendorft de 1.5mL se colocan 500µL de medio de cultivo líquido estéril (el medio
de cultivo dependerá del microorganismo que se trabaje) y 500µL de solución
salina con esporas. Se monitorea la germinación de las esporas (una espora
germinada es aquella cuyo tamaño de hifa es igual al tamaño de la espora) por 24
y 48hrs. Para el conteo en el experimento de antagonismo se toma una alícuota
de 15 µL de muestra y se coloca en un portaobjetos, se coloca el cubreobjetos y
se observa al microscopio. En las laminillas se cuentan 30 esporas, contando
esporas germinadas y no germinadas, y por cada muestra se toman 3
micrografías de esporas germinadas. Por cada antagonismo se toman 3 alícuotas.
Micrografías MEB (microscopio electrónico de barrido)
De los antagonismos de medios líquidos se toman 80µL de muestra y se coloca en
un filtro estéril de 2µm tipo pirinola, se rotula y se realiza una serie de lavados con
alcohol (96%) y agua destilada estéril (filtrada en filtro de 2µm tipo pirinola)
formando un volumen de 3mL por cada lavado. Con una jeringa se toma el
volumen correspondiente y se pasa por la pirinola de manera suave y lenta para
lavar el medio de cultivo que tiene la muestra. Los lavados mL agua : mL alcohol
respectivamente son los siguientes 3:0; 3:0; 2.5:0.5; 2:1; 1.5:1.5; 1:2; 0.5:2.5; 0:3;
0:3. Se saca el filtro de la pirinola y se coloca en un porta muestras (con la cara
que contiene la muestra hacía arriba) de aluminio con adhesivo, rotulamos el porta
muestra y se coloca en el desecador por 24hrs.
Trascurridas las 24hrs la muestra se coloca la muestra en el sputter coater, se
hace vacío hasta 50mT y para el recubrimiento con iones de oro el equipo se
69
coloca en las condiciones de 30-35mA por 35seg. Se coloca la muestra en el
MEB y se toman las micrografías.
Extracción de ADN de hongos
Los hongos aislados se ponen a crecer en Caldo de Papa Dextrosa (BD DifcoTM,
24gL-1), se incuban a 25°C por 5 días. Una vez crecidos los microorganismos en
los medios líquidos se toma una alícuota de 1mL recuperando una biomasa similar
a las de 40µL y se coloca en un tubo eppendorft estéril de 1.5mL, las muestras se
centrifugan a 12000rpm por 10min, se decantó el medio de cada muestra
quedando la pastilla celular y se agregó 500µL de agua Milli-Q y se almacenaron
en el refrigerados por 24hrs. Se colocaron en el vortex a máxima potencia
(2500rpm) durante 1min, se centrifugo a 1400 rpm por 5 min, se decantó el agua
de la muestra y se le agregó 500µL de buffer de lisis (Triton x-100 2%, SDS 1%,
NaCl 100mM, Triza HCl 10mM pH 8, EDTA 1mM), se agregan 2µL de Quitinasa
(2.5u/mL), se agregaron 0.3 gramos de Ballotini (microperlas de vidrio), y se
incuba 1hr a 25°C con resuspenciones cada 15min, se agregó 4µL de Proteinasa
K (2mg/mL) y se incuba 1hr a 65°C con resuspenciones cada 15 min, añadimos
100µL solución salina (NaCl, 5M) y se lleva a vortex a máxima potencia por 1min,
se agregan 550µL de Fenol Cloroformo Isoamílico y se lleva a vortex a 2200rpm
por 20seg, se centrifugan las muestras en frio (4°C) a 13200rpm por 8min, una vez
centrifugada la muestra se separan dos fases, se recupera la fase acuosa (300µL )
y se transfiere a otro tubo eppendorft estéril, se agrega 1mL de alcohol absoluto,
se tapa el tubo se agita suavemente y se almacena a 4°C por 24hrs, se
descongelan las muestras y se centrifugan en frio (4°C) a 13200rpm por 10min, se
decanta el alcohol, se agrega 1mL de alcohol al 75% al pellet de ADN y lo
resuspendemos, centrifugar la muestra en frio (4°C) a 13200rpm por 10min,
decantar el alcohol, colocar la muestra en la centrifuga de vacío por 10min,
resuspender el DNA en 40µL de agua Milli-Q.
Electroforesis de las extracciones de ADN
Se prepara un gel de agarosa (0.8%), 70mL buffer TAE 1X, se calienta la solución
hasta que esté transparente, se coloca la solución en el castle (molde para el gel)
con los peines según el número de muestras a procesar, se espera 30min a que
solidifique, se retira el peine y con se coloca el gel en la cámara de electroforesis.
Se toma una alícuota de 3 µL de muestra de la extracción de ADN, se mezcla con
70
1µL de Gel Red y se coloca en el pozo del gel, como control positivo se utilizó
ADN de Trichodemerma, y se utilizó el 123 bp Ladder que también se mezcló con
el colorante Gel Red. Las muestras en el gel deben quedar del lado negativo de la
cámara de electroforesis, se tapa la cámara de electroforesis, se programa a 90V,
400mA por 30 min.
Identificación molecular de hongos por PCR
La determinación de la especie de las cepas del hongo fitopatógeno se llevó a
cabo por la técnica molecular de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
utilizando los iniciadores ITS1 (5´-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´) e ITS4 (5´-
TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´) de la región ITS1-5.8s-ITS2 del DNA ribosoma.
En tubos de PCR de 0.2mL se coloca 1µL de ADN extraído (un tubo por muestra
de hongo), se agrega el Master Mix (Agua 15.05µL, PCR Rxn Buffer(-MgCl2) 1X,
MgCl2 1.5mM, ITS1 1µL, ITS4 1µL, dNTPs 0.2mM, Taq.Polimerasa 0.2µL). Las
condiciones para la PCR en el termociclador se muestran en la Fig.19.
Fig.19 Condiciones del termociclador para PCR de hongos (ITS1-ITS4).
71
Electroforesis de los productos de PCR
Se prepara un gel de agarosa (0.8%), 70mL buffer TAE 1X, se calienta la solución
hasta que esté transparente, se coloca la solución en el castle (molde para el gel)
con los peines según el número de muestras a procesar, se espera 30min a que
solidifique, se retira el peine y con se coloca el gel en la cámara de electroforesis.
Se toma una alícuota de 3 µL del producto de PCR, se mezcla con 1µL de Gel
Red y se coloca en el pozo del gel, como control positivo se utilizó el producto de
PCR de Trichodemerma, y se utilizó el 123 bp Ladder. Las muestras en el gel
deben quedar del lado negativo de la cámara de electroforesis, se tapa la cámara
de electroforesis, se programa a 90V, 400mA por 30 min.
Cuantificación de la concentración de DNA doble cadena de los productos
de PCR
Para cuantificar la concentración de ADN en los productos de PCR se utiliza el
nanofotómetro. Se saca la columna del nanofotómetro y se limpian con toallas los
espejos por donde atraviesa el haz de luz, se coloca la columna en el equipo, se
enciende el equipo, se selecciona cuantificación de ADN, cuantificación de ADN
de doble cadena; se limpia con la toalla el lente de “Factor 50” se coloca 1µL del
producto de PCR en la columna, se coloca el lente y se corre la lectura.
