Citometria de flujo
-
Upload
arturo-zapata -
Category
Documents
-
view
245 -
download
2
Transcript of Citometria de flujo
CITOMETRIA DE FLUJO
FSC
90º2- 4º
Columna
de muestra
Meeting point
Láser
Amplificación
digitalización
Representación
y Analisis
Flujo
Figura 1) 4.
• Dispersión:
*FSC: Tamaño
*SSC: Complejidad.
• Fluorescencia:
• Uniones AG-AC
• Marcaje con fluorocromos.
• Poblaciones celulares
detectadas simultáneamente.
PARÁMETROS
FLUOROCROMOS
• Absorben luz a una Emiten a otra.
• Espectros de excitación y de emisión.
• Uso Tipo de láser y su long.de onda.
• Corto estado de excitación.
• Fotoestables.
• Alto rendimiento cuántico.
FLUOROCROMO DESCRIPCION
FITC Isotiocianato de Fluoresceína
PE Ficoeritrina
PerCP Proteína Clorofila Peridinina
TRITC Isotiocianato de tetrametil rodamina 540---570
PEC Ficoeritrina cianina
RT Rojo Texas 596----615nm
PC Ficocianina 620---650nm
APC Aloficocianina 650-----660nm
TRICOLOR TRICOLOR 540--------570nm
ALEXA-FLUOR FLUOROCROMO : Molecular Probes
Sistema de flujo
Dispersión de la luz
Fluorescencia
Separación y detección de la luz
Amplificación
Corrección de errores: solapamiento espectral y
formación de dobletes
Digitalización y almacenamiento de la información
SISTEMA DE ABSORCION DE MUESTRA
MUESTRA
AIRE
FLUJO
MUESTRA
CÁMARA
DE FLUJO
FSC
90º
Fluido envolvente
Columna
de muestra
Luz dispersada lateralmente
y luz fluorescente, a = 90º
Luz incidente
Luz dispersada hacia delante, a=2- 4º
Luz dispersada a 90 grados
(Side SCattered light )
Detector FSC
Detector de 90º SSC
Laser
DETECCION DE LUZ DISPERSADA HACIA DELANTE (FORWARD SCATTERED
LIGHT, FSC)
FSC
SSC
El detector de FSC convierte luz dispersada hacia delante en un
pulso de voltaje proporcional al tamaño de la célula/particula
DETECCION DE LUZ DISPERSADA LATERALMENTE (SIDE
SCATTERED LIGHT, SSC)
FSC
SSC
El detector de SSC convierte la luz dispersada lateralmente en un pulso
de voltaje proporcional a l contenido en orgánulos membranosos
(granularidad)
Laser
DETECTORES DE FLUORESCENCIA
Fre
q
Fluorescencia
Detector
Detector de fluorescencia
(PMT3, PMT4 etc.)
Fluorescencia
FSC
FL-1
FL-2
FLUORESCENCIA
• Proceso por el que una molécula absorbe luz, aumenta su energía y
vuelve al estado basal emitiendo un fotón.
• Parte de la energía se pierde en las transiciones entre los distintos
estados por tanto el fotón emitido tiene menos energía (mayor longitud de
onda) que el que fue absorbido.
t (ms)
1<2
1
2
CITOMETROS FLUJO
• Citómetros con 1 láser: 2 D (dispersión) y 3 Fl(fluorescencia)
• Citómetros de 2 láser: 2D y 4 Fl
TIPOS DE LASER
• Láser Violeta 405 nm
• Láser Azul 488 nm (Argón)
• Láser Verde 543 nm
• Láser Rojo 633-635 nm (He-Ne)
• Múltiples marcajes.
• Analizar un elevado numero de
partículas en un corto periodo de
tiempo.
• Cuantificación de la actividad
antigénica.
• Mayor sensibilidad y objetividad.
• Análisis de poblaciones celulares
• Almacenamiento de la información
para análisis posteriores.
VENTAJAS