Inmunofenotipificación Celular:Leucemias y Linfomas por Citometría de Flujo

T.M. MSC JUAN LUIS CASTILLO N.Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda.

Laboratorio de Citometría de FlujoHospital del Trabajador, Concepción, Chile.

www.oncoinmun.co.cl

¿QUE ES LA QUE ES LA CITO / METRIACITO / METRIADE FLUJODE FLUJO??

La Citometría de Flujo es una tecnología que permite la “medición

simultánea de múltiples características físicas y químicas de

células en suspensión”

0 13 24 71 113223

481 611811 940

10771234

15051861

22722413

27462919

35753518

357636273899

4261

48555034

5384

5818

6243

2901

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

6000

6500

7000

1976

1977

1978

1979

1980

1981

1982

1983

1984

1985

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1991

1992

1993

1994

1995

1996

1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

2004

2005

Papers

Datos Tomados de PubMed usando las palabras: “flow Cytometry”

AÑOS

Citometría de Flujo: Publicaciones / año(09/07/2005 : 09:20 hrs)

¿QUE INFORMACION ENTREGA UN CITOMETRO DE FLUJO SOBRE UNA

CELULA?

1.- Su tamaño.2.- Su granularidad o complejidad

interna.3.- Evaluación de características químicas:

• Fluorocromos

• Anticuerpos conjugados con fluorocromos

FACS: Fluorescence activated cell sorter

¿¿COMO SON DETECTADAS COMO SON DETECTADAS ESTAS CARACTERISTICAS?ESTAS CARACTERISTICAS?

• Usando un sistema óptico-electrónico, se registra como la célula interactúa con un rayo láser.• Se detecta la capacidad de la célula para:

– Desviar la luz incidente (Láser).– Emitir fluorescencia.

•Detección de moléculas específicas (Acs. Conjugados)

Flow Cell

InjectorTip

FluorescenceFluorescencesignalssignals

FocusedFocused laserlaserbeambeam

Sheathfluid

Componentes• Sistema de Fluidos

• Sistema Optico:

• Fuente de luz

• Separación espectral

• Sistema Electrónico:

• Control mecánico, de luz y detectores

• Colección y análisis de pulsos

• Sistema Informático:

• Análisis y presentación de datos

FLUORESCENCIAFLUORESCENCIA

1.- El fluorocromo absorveenergía del láser incidente.

2.- El fluorocromo libera energía absorvida :

– Vibrando y emitiendo color

– emitiendo fotones deuna longitud de onda mayor (Fluorescencia)

O

CCOH

= 488 nmOH

= 530 nm

Fluoresceína

FLUOROCROMOSFLUOROCROMOS FluoresceinFluorescein (FITC)(FITC)

400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Relativ

e Intens

ity

Wavelength

ProteinProtein

ExcitationExcitation EmissonEmisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

PropidiumPropidium IodideIodide

400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Relativ

e Intens

ity

DNADNA

Excitation Emisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

ExcitationExcitation EmissonEmisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

PhycoerytherinPhycoerytherin (PE)(PE)

Protein

PMT

PMT

PMT

PMT

DichroicFilters

BandpassFilters

FlowFlow CytometryCytometry OpticsOptics

Laser

1

2

3

4

Flow cell

ANTICUERPOSANTICUERPOSMONOCLONALESMONOCLONALES

•Grandisponibilidadcomercial•Gran variedad de fluorocromos•Preciosaccesibles•Pedidos vía Internet•Gran Calidad

FORMA DE PRESENTACION DE DATOS

• Histograma• Gráfico de Puntos (Dot Plot)• Gráfico de Contorno (Countour Plot)• Gráfico Isométrico (3D)• Gráfico de Densidad (Density Plot)

Citometría de flujo: mediciones

L

M

G

SCATTER FLUORESCENCIA IMAGEN

“GATE”

Density Dot Plot Contour Plot

Color of dots can give indication Identify subpopulationsof frequency of events with proper contour lines

HISTOGRAMA(Un Parámetro)

0

coun

ts

FL1

Autofluorescenciay/o

control isotipo

M1

ESTADISTICA DE CUADRANTES

(Dos Parámetros)

Autofluorescenciay/o

control isotipo

0FL

2FL1

ESTADISTICA DE CUADRANTES

(Dos Parámetros)

-,+

-,- +,-

+,+

0

FL2

FL1

1 2

3 4

PREPARACIONPREPARACIONDE LA MUESTRADE LA MUESTRA

CITOMETRIA DE FLUJOCITOMETRIA DE FLUJOCITOMETRIA DE FLUJO

OBJETIVO: SUSPENSION CELULAR

Procedimiento St.:• 100 L de sangre total • 10 L del Ac. conjugado • Incubar por 10-15 minutos RT• Añade el lisador• Leer en un citómetro de flujo

CITOMETRIA DE FLUJOCITOMETRIA DE FLUJOCITOMETRIA DE FLUJOPREPARACION DE LA MUESTRAPREPARACION DE LA MUESTRA

PROCESO DE ANALISIS DE PROCESO DE ANALISIS DE UNA MUESTRAUNA MUESTRA

• CALIBRACION•ADQUISICION•ANALISIS

CITOMETRIA DE FLUJO:APLICACIONES

• Hematología• Inmunología• Patología• Transplantes• Farmacología• Biología

• Toxicología• Microbiología• Parasitología• Citogenética• Virología• . . . . . . . . . . .

CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas más Frecuentes

• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas• Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular• Cuantificación de moléculas• Estudio de HLA-B27• Estudio de Células Progenitoras (CD34)• Estudios de Función Plaquetaria• Estudios de Resistencia a Drogas• Estudio de Función Neutrofílica• Estudio de Citokinas Intracelulares

Cytoplasmic Parameters

Nuclear Parameters

Cell Surface Parameters

Extracellular Parameters

Enzymes

EnzymesEnzymes

Proteins

Proteins

Cell Wall

Secreted Proteins

WhatWhat can be can be analyzedanalyzed byby FlowFlow Cytometry?Cytometry?

Cell Surface Molecules

DNA

INMUNOFENOTIPIFICACIONDE LEUCEMIAS

“Los distintos tipos de leucemias son un grupo heterogéneo de patologías resultantes de una

proliferación descontrolada de una o más tipos celulares hematopoyeticos tanto en médula ósea

como sangre periférica”

Hematopoiesis

PLURIPOTENTSTEM CELL

COMMITTEDPROGENITOR

CELL

RECOGNIZABLE BONE MARROW

PRECURSOR CELL

MATUREBLOODCELL

myeloblastmonoblast

pronormoblast red cellneutrophilmonocyte

basophil

platelet

CFU-Baso

CFU-Eos

CFU-GM

BFU-E/CFU-E

eosinophil

pre-T

pre-B

myeloidprogenitor

cell

lymphoidprogenitor

cell

lymphoblast

lymphoblast

T-cell

B-cell& plasma cell

MIXEDPROGENITOR

CELL

CFU-Meg megakaryocytepluripotentstem cell

Hematopoiesis

PLURIPOTENTSTEM CELL

COMMITTEDPROGENITOR

CELL

RECOGNIZABLE BONE MARROW

PRECURSOR CELL

MATUREBLOODCELL

myeloblastmonoblast

pronormoblast red cellneutrophilmonocyte

basophil

platelet

CFU-Baso

CFU-Eos

CFU-GM

BFU-E/CFU-E

eosinophil

pre-T

pre-B

myeloidprogenitor

cell

lymphoidprogenitor

cell

lymphoblast

lymphoblast

T-cell

B-cell& plasma cell

MIXEDPROGENITOR

CELL

CFU-Meg megakaryocytepluripotentstem cell

HEMATOPOYESISSTEM CELL

CFU-MLCFU-GEMMCFU-L

LINFOCITO B LINFOCITO TCFU

ERITROIDEMEGACARIOCITO

CFUBASOFILO

CFUEOSINOFILO

CFU-GM

ERITROCITO PLAQUETAS BASOFILO EOSINOFILO NEUTROFILO MONOCITO

RETENCION DE ANTIGENOS• Células malignas frecuentemente conservan

antígenos asociados con la célula normal a partir de la cual fueron derivados

CD19 CD19

CELULAPRE-B NORMAL

CELULALEUCEMICA

Transformación

Maligna

INMUNOFENOTIPIFICACIONDE LEUCEMIAS

• Evaluación de linfocitosis de etiología no determinada.

• Identificar desordenes linfoproliferativos crónicos de células T y B.

• Diferenciar entre leucemia linfoblástica y leucemia mieloide.

• Subtipificar inmunológicamente leucemias agudas.

Aplicaciones :

INMUNOFENOTIPO DE LEUCEMIAS

• No establece diagnóstico de Leucemia aguda, pero es fundamental para definir línea celular.

• Útil en monitorizar Leucemias Linfoblástica Aguda (LLA) y Leucemia MielobásticaAguda.

• Subclasificación Inmunológica de LLA e Identificación de fenotipos Mieloides (valor pronóstico).

Cytometry (CCC)34:39-42 (1998)

INMUNOFENOTIPO DE LEUCEMIAS

• Modalidad Diagnóstica Primaria en sindromes Linfoproliferativos crónicos (Subclasificación clínica y Pronóstico).

• Valor diagnóstico en Gammapatiasmonoclonales (Enf. Residual).

Cytometry (CCC)34:39-42 (1998)

CLASIFICACION INMUNOFENOTIPICA (LA)

•LLA-B :-BI-pro B: CD79a y/o CD22 Y/o CD19.-BII Común : CD10.-BIII Pre B: clg.-BIV Madura : slg

•LLA-T :-TI-proT: CD7-TII-pre T: CD2 y/o CD5 y/o CD8-TIII-Cortical: CD1a-IIV-Madura: CD1a y CD3mb

•LMA :-LMA-M6 : glicoforina A-LMA-M7 : CD61, CD41, CD42b-LMA-M3 : HLA-DR(-)-LMA-M4 : HLA-DR(+)

• Paciente sexo femenino• 45 años• Sangre periférica• Compromiso general severo• Falla hepática

• Inmunofenotipo normal• Paciente fallece

Características normales

• Paciente sexo masculino• 43 años• Dgto. Leucemia Aguda

Leucemia LinfoblásticaDe Línea B (B-II: Común)

CD10CD19CD34HLA-DR

CD5CD33CD13CD3CD16+56MPOCD14

CD20

Positivo Negativo Positivo Débil

• Paciente sexo femenino• 80 años• Diagnóstico: Proceso

linfoproliferativo crónico

Leucemia Linfoblática de Línea B (B-III - pre B)

CD10CD19CD20CD34CD33HLA-DR

CD5CD13CD3CD16+56MPO

Positivo Negativo Positivo Débil• Paciente sexo masculino• 6 años 5 meses• Medula ósea

Leucemia Linfoblástica de tipo B-II (Común), con expresión mieloide aberrante

CD10CD19CD34CD33CD13HLA-DRTdT

CD20CD5CD3CD8CD16+56MPOCD14

Positivo Negativo Positivo Débil • Paciente sexo masculino• 21 años• Sangre periférica

Leucemia Linfoblástica de Línea T (Pre T)

CD5CD4CD8CD2CD7CD3cTdT

CD3CD10CD19CD20CD34CD33CD13CD16+56HLA-DRMPOCD14

Positivo Negativo Positivo Débil• Paciente sexo masculino• 5 años 8 meses• Medula ósea

LeucemiaAgudaLínea T (T-IV madura)

CD10CD5CD2CD3CD7CD8CD4

CD19CD20CD33CD13CD16+56MPOCD34HLA-DR

Positivo Negativo Positivo Débil • Paciente sexo femenino• 78 años• Sangre periférica • WBC:169.000.

Sugerente de una Leucemia PromielocíticaHipogranular M3 HLA-DR (-)

CD33CD13CD56MPO

CD10CD19CD20CD5CD3CD34

CD14HLA-DR

Positivo Negativo Positivo Débil

Trastorno linfoproliferativo crónico de línea B, con expresión clonal de cadenas livianas de inmunoglobulinas del tipo kappa.

CD19CD20kappaHLA-DR

CD10CD3CD4CD7CD16+56CD34TdTCD13CD33CD14MPOlambda

Positivo Negativo Positivo Débil

• Sexo masculino• 57 años• Sangre periférica• 13 Febrero 2004

Trastorno linfoproliferativo crónico de línea B, con expresión clonal de cadenas livianas de inmunoglobulinas del tipo kappa.

Linfoma del Manto

Leucemizadoetapa IV-B

• Mismo paciente• 59 años• Sangre periférica• 08 de junio 2005

Dgto. y TTO

CD19CD20kappaHLA-DR

CD10CD3CD4CD7CD16+56CD34TdTCD13CD33CD14MPOlambda

Positivo Negativo Positivo Débil

sugerentes de una leucemia mieloide aguda HLA-DR negativo, con expresión de CD7. ¿Promielociítica hipogranular?.

CD33CD34CD7

CD10CD19CD20CD4CD3CD14TdTHLA-DRMPO

CD56CD13

Positivo Negativo Positivo Débil

• Sexo masculino• 30 años• Abril 2005:

Adenopatía cervical sugerente de Linfoma No Hodkin Difuso Mixto.

• 07 de julio 2005• Medula ósea

SSC Bajo

Linfoma de células linfociticas pequeñas de bajo grado de malignidad (línea B con expresión clonal de cadenas livianas del tipo kappa)

• Sexo femenino• 42 años• Julio 2001• Medula ósea

37 % células

CD19CD20kappa

lambdaCD10CD3CD4CD7CD33CD34CD13CD14HLA-DR

Positivo Negativo Positivo Débil

Linfoma de células linfociticas pequeñas de bajo grado de malignidad (línea B con expresión clonal de cadenas livianas del tipo kappa)

CD19CD20kappa

lambdaCD10CD3CD4CD7CD33CD34CD13CD14HLA-DR

Positivo Negativo Positivo Débil

• Misma paciente• 44 años• Octubre 2002• Medula ósea

9.6 % células

• Misma paciente• 45 años• Agosto 2003• Medula ósea

Medula ósea normal

• Misma paciente• 46 años• Abril 2004• Medula ósea

Medula ósea normal

• Citometría de flujo:

• Principios básicos.

• Instrumentación y fluorocromos.

• Presentación de datos.

• Inmunofenotipificación de leucemias y linfomas:

• Utilidad y clasificación.

• Inmunofenotipo normal.

• Casos clínicos reales.

Tópicos Revisados

Inmunofenotipificación Celular:Leucemias y Linfomas por Citometría de Flujo

T.M. MSC JUAN LUIS CASTILLO N.Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda.

Laboratorio de Citometría de FlujoHospital del Trabajador, Concepción, Chile.

www.oncoinmun.co.cl