Citometria de Flujo IESJJ 2012

67
LA CITOMETRIA DE FLUJO José Enrique O’Connor Centro de Citometría y Citómica Dpto. de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Medicina [email protected]

Transcript of Citometria de Flujo IESJJ 2012

Page 1: Citometria de Flujo IESJJ 2012

LA CITOMETRIA DE FLUJO José Enrique O’Connor

Centro de Citometría y Citómica

Dpto. de Bioquímica y Biología Molecular

Facultad de Medicina

[email protected]

Page 2: Citometria de Flujo IESJJ 2012

LA CELULA COMO UNIDAD FUNCIONAL DEL ORGANISMO

DIAGNOSTICO MORFOLOGICO

DIAGNOSTICO FUNCIONAL

Page 3: Citometria de Flujo IESJJ 2012

LA CELULA COMO UNIDAD INTEGRADORA DEL ORGANISMO

DIAGNOSTICO BIOQUIMICO

DIAGNOSTICO GENOMICO

Page 4: Citometria de Flujo IESJJ 2012

LA CELULA COMO UNIDAD INTEGRADORA DEL ORGANISMO

Se necesita una técnica de diagnóstico e investigación que permita:

• Integrar el nivel celular y molecular • Resolver la heterogeneidad celular de los tejidos • Detectar células muy infrecuentes

Page 5: Citometria de Flujo IESJJ 2012

LA CELULA COMO UNIDAD DE ESTUDIO Y DIAGNOSTICO

CITOMETRIA DE FLUJO!!!!

Page 6: Citometria de Flujo IESJJ 2012

• Concepto de citometría de flujo

• Funcionamiento de un citómetro de flujo

• Fluorescencia y marcadores fluorescentes

• Parámetros analizables por citometría de flujo

• Aplicaciones de la citometria de flujo

• La citometría del futuro

ASPECTOS BASICOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Page 7: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Método analítico por el que se mide la emisión de múltiples fluorescencias y

la dispersión de luz de células o partículas microscópicas, alineadas

mediante una corriente líquida laminar, cuando son presentadas de una en

una y a gran velocidad frente a una o múltiples fuentes de iluminación.

CONCEPTO DE CITOMETRIA DE FLUJO

Page 8: Citometria de Flujo IESJJ 2012

• Proteínas extracelulares • Secuencias de ADN o ARN libres • Complejos inmunes circulantes

CONCEPTO DE CITOMETRIA DE FLUJO

• Viriones individuales • Liposomas • Cromosomas aislados • Orgánulos aislados • Núcleos aislados

• Bacterias • Hongos unicelulares • Células humanas y animales • Protoplastos vegetales

• Hibridomas y fusiones celulares • Esferoides • Cuerpos embrioides • Larvas y embriones • Organismos pluricelulares

Page 9: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Método analítico que mide la emisión simultánea de múltiples fluorescencias y dispersión de luz

CITOMETRIA DE FLUJO

Alineadas de forma secuencial por un flujo laminar y presentadas de una en una a gran velocidad en un punto óptimo de iluminación

Células o partículas biológicas individuales en suspensión

CONCEPTO DE CITOMETRIA DE FLUJO

Page 10: Citometria de Flujo IESJJ 2012

• Concepto de citometría de flujo

• Funcionamiento de un citómetro de flujo

• Fluorescencia y marcadores fluorescentes

• Parámetros analizables por citometría de flujo

• Aplicaciones de la citometria de flujo

• La citometría del futuro

ASPECTOS BASICOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Page 11: Citometria de Flujo IESJJ 2012

• Partículas en suspensión individual que

• fluyen secuencialmente a través de

• un volumen iluminado donde

• dispersan luz y emiten fluorescencia

• que es dirigida y filtrada

• y convertida a valores digitales

• que se almacenan en un ordenador

Sistema de Fluidos

Sistema

Optico

Sistema Electrónico

FUNCIONAMIENTO DE UN CITOMETRO DE FLUJO

Page 12: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Inyección de la muestra y cámara de flujo

SISTEMA DE FLUIDOS

Page 13: Citometria de Flujo IESJJ 2012

La base de la aplicación más común de la Citometría de Flujo es el uso de luz láser enfocada para iluminar células alineadas mediante un sistema de fluidos capaz de enfoque hidrodinámico

Cámara de Flujo

Fluorescencia

Laser enfocado

Líquido envolvente

SISTEMA DE FLUIDOS

Page 14: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Enfoque Hidrodinámico

SISTEMA DE FLUIDOS

Page 15: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Emisión de fluorescencia y bancada óptica: Epics XL

Lámparas: • Xenon, Mercurio Láser: • Refrigerados por aire:

•Ar, He-Ne • Refrigerados por agua:

•Ar, Kr, He-Cd • Diodos

Filtros: • Bloqueo • Dicroicos • Paso de Banda

SISTEMA OPTICO

Page 16: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Detección y Amplificación de señal: Transformación de señal luminosa en pulso eléctrico

SISTEMA ELECTRONICO

Page 17: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Eliminación de señales no deseadas: Discriminador

SISTEMA ELECTRONICO

Page 18: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Conversión Analógica-Digital

SISTEMA ELECTRONICO

Page 19: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Clasificación de las señales: Histograma de frecuencias

SISTEMA ELECTRONICO

Page 20: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Representación Logarítmica

Representación Lineal

Histogramas Dot-plots

SISTEMA INFORMATICO

Page 21: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Acotamiento de subpoblaciones de interés

SISTEMA INFORMATICO

Page 22: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Análisis Cinético

SISTEMA INFORMATICO

Page 23: Citometria de Flujo IESJJ 2012

• Concepto de citometría de flujo

• Funcionamiento de un citómetro de flujo

• Fluorescencia y marcadores fluorescentes

• Parámetros analizables por citometría de flujo

• Aplicaciones de la citometria de flujo

• La citometría del futuro

ASPECTOS BASICOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Page 24: Citometria de Flujo IESJJ 2012

FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES

LA LUZ ES ENERGIA

Page 25: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Un fotón de energía hnEX es absorbido por la molécula fluorescente, creando un estado excitado (S’1)

Un fotón de energía hnEM es emitido para devolver la molécula fluorescente a su estado basal (S0)

El estado excitado tiene una duración de 1–10 × 10-9 segundos

FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES

FLUORESCENCIA

1

2

3

Page 26: Citometria de Flujo IESJJ 2012

FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES

LA LUZ ES COLOR

Page 27: Citometria de Flujo IESJJ 2012

FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES

EL COLOR ES INFORMACION

Page 28: Citometria de Flujo IESJJ 2012

FLUOROCROMOS, FLUOROFOROS Y MARCADORES FLUORESCENTES

FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES

FLUOROFORO

FLUOROCROMO

`PROPIEDAD BIOLOGICA

FLUOROCROMO

`PROPIEDAD BIOLOGICA

Page 29: Citometria de Flujo IESJJ 2012

CLASIFICACIÓN FUNCIONAL DE MARCADORES FLUORESCENTES

• MOLECULAS CON REACTIVIDAD QUIMICA

• MOLECULAS CON ESPECIFICIDAD ESTRUCTURAL

• INDICADORES Y QUELANTES DE IONES

• SUSTRATOS DE ENZIMAS Y TRANSPORTADORES

• MACROMOLECULAS Y POLIMEROS SINTETICOS

• FLUOROCROMOS INTRACELULARES NATURALES

FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES

Page 30: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Excitación

Emisión

Longitud de onda

FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES

Page 31: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Ener

gía

Fluo

resc

encia

Estado Excitado

Molécula Dadora

PE

Molécula Aceptora Texas Red/Cy5/Cy7

Estado Basal

Transferencia de energía entre moléculas vecinas

FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES

TRANSFERENCIA DE ENERGIA DE FLUORESCENCIA (FRET)

Page 32: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Wavelength

Absorbance

DONOR

Absorbance

Fluorescence Fluorescence ACCEPTOR

Molecule 1 Molecule 2

FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES

TRANSFERENCIA DE ENERGIA DE FLUORESCENCIA (FRET)

Page 33: Citometria de Flujo IESJJ 2012

488 nm Argon

R-Phycoerythrin

The Visible Spectrum

Cy 5 675 nm

575 nm

760 nm

Cy 5.5

Cy 7

Fluorocromos en tándem Ficoeritrina + Cianinas

675 nm

FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES

FLUOROCROMOS EN TANDEM: FICOERITRINA +CIANINAS

Page 34: Citometria de Flujo IESJJ 2012

FITC 520

PE 575

ECD 615

PC5 665

LASER 488

<390 400-450 450-500 500-570 570-590 590-620

620-750 >750

ultra- violeta azul verde amarillo naranja rojo infrarrojo violeta

LASER 630

APC 660

PC7 670

PE-AF610 615

APC-AF750 785

FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES

FLUOROCROMOS EN TANDEM PARA ROJO LEJANO

Page 35: Citometria de Flujo IESJJ 2012

• Concepto de citometría de flujo

• Funcionamiento de un citómetro de flujo

• Fluorescencia y marcadores fluorescentes

• Parámetros analizables por citometría de flujo

• Aplicaciones de la citometria de flujo

• La citometría del futuro

ASPECTOS BASICOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Page 36: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Parámetros Citoplasmáticos

Parámetros Nucleares

Parámetros de Superficie

Parámetros Extracelulares

Moléculas de superficie

Enzimas

Enzimas

Enzimas

Proteinas

Proteinas

Pared celular

Proteinas secretadas

Moléculas de superficie

PARAMETROS ANALIZABLES POR CITOMETRIA DE FLUJO

Page 37: Citometria de Flujo IESJJ 2012

• Concepto de citometría de flujo

• Funcionamiento de un citómetro de flujo

• Fluorescencia y marcadores fluorescentes

• Parámetros analizables por citometría de flujo

• Aplicaciones clínicas de la citometria de flujo

• La citometría del futuro

ASPECTOS BASICOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Page 38: Citometria de Flujo IESJJ 2012

INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES

APLICACIONES CLINICAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Page 39: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Determinar la presencia y cuantificar la expresión de proteínas (antígenos) o de regiones de las mismas (epitopos) en la superficie de las células de la sangre, tejidos linfoides, líquidos biológicos o cultivos celulares, usando combinaciones adecuadas de anticuerpos fluorescentes.

INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: OBJETIVO

Page 40: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Se realiza mediante el marcaje de antígenos de la membrana plasmática con anticuerpos mono- o policlonales conjugados con fluorocromos. El proceso de preparación de la muestra es mínimo en la mayoría de las determinaciones (sangre entera) o puede requerir etapas de:

• Concentración celular: líquidos biológicos (LCR, orina, etc.) • Dispersión celular: lavado broncoalveolar, esputo inducido • Disgregación mecánica: tejidos linfoides, tejidos mucosos • Disgregación enzimática: tejidos sólidos, cultivos en monocapa • Estimulación celular controlada: estudios de activación

INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: METODOLOGIA

Page 41: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Las combinaciones de anticuerpos monoclonales y técnicas de análisis permiten identificar subpoblaciones específicas de células y determinar:

• Linaje celular

• Grado de maduración

• Grado de activación

• Clonalidad de cadenas ligeras de inmunoglobulinas y del receptor TCR

• Expresión de proteínas de fusión en translocaciones cromosómicas

INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: INFORMACION

Page 42: Citometria de Flujo IESJJ 2012

• Diagnóstico y pronóstico de leucemias, linfomas, síndromes linfoproliferativos y síndromes mielodisplásicos

• Detección de Enfermedad Mínima Residual

• Recuento absoluto de células CD34+ viables circulantes o en preparaciones celulares para el auto- o alotransplante de precursores hematopoyéticos

• Diagnóstico de Hemoglobinuria Paroxística Nocturna

• Detección de fenotipo MDR (resistencia a fármacos) mediado por la glicoproteína-P

INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: HEMATOLOGIA

Page 43: Citometria de Flujo IESJJ 2012

• Determinación de porcentaje y recuento absoluto de subpoblaciones linfocitarias T, B y NK en el seguimiento de inmunodeficiencias y otras alteraciones de la respuesta inmunitaria

• Recuento absoluto de CD4+ y cociente CD4/CD8 en pacientes con VIH

• Detección de leucocitos activados en sangre periférica o en preparaciones celulares estimuladas

• Detección de aloanticuerpos y autoanticuerpos circulantes o unidos a células

• Diagnóstico de deficiencias en moléculas de adhesión

• Identificación de basófilos circulantes y detección de la desgranulación provocada por alergenos.

INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: INMUNOLOGIA

Page 44: Citometria de Flujo IESJJ 2012

• Diagnóstico de deficiencias congénitas de glicoproteínas plaquetarias

• Detección ex vivo de plaquetas activadas circulantes in vivo

• Determinación de la reactividad plaquetaria ex vivo

• Cuantificación de receptores gpIIb/IIIa ocupados en la terapia antiagregante plaquetaria con antagonistas de gpIIb/IIIa

INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: HEMOSTASIA

Page 45: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Determinar la presencia y cuantificar la expresión de proteínas (antígenos) o de regiones de las mismas (epitopos) en la cara interna de la membrana plasmática, citoplasma, vesículas o núcleo de las células de sangre, tejidos linfoides, líquidos biológicos o cultivos celulares, utilizando combinaciones de anticuerpos fluorescentes.

DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES : OBJETIVO

Page 46: Citometria de Flujo IESJJ 2012

El proceso de preparación de la muestra requiere etapas de fijación y permeabilización para hacer accesibles los epitopos intracelulares. El proceso de preparación de la muestra es menor en la mayoría de las determinaciones (sangre entera) o puede requerir etapas de: • Concentración celular: líquidos biológicos (LCR, orina, etc.) • Dispersión celular: lavado broncoalveolar, esputo inducido • Disgregación mecánica: tejidos linfoides, tejidos mucosos • Disgregación enzimática: tejidos sólidos, cultivos en monocapa • Estimulación celular controlada: estudios de activación • Bloqueo de la exportación de proteínas: proteínas de secreción (citoquinas)

DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES: METODOS

Page 47: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Las combinaciones de anticuerpos monoclonales y técnicas de análisis

permiten identificar:

• Linaje celular

• Grado de maduración

• Grado de activación

• Expresión de enzimas intracelulares

• Activación de enzimas intracelulares

• Expresión de proteínas reguladoras del ciclo celular

• Expresión de antígenos relacionados con la apoptosis

• Expresión de proteínas de fusión en translocaciones cromosómicas.

DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES: INFORMACION

Page 48: Citometria de Flujo IESJJ 2012

• Diagnóstico y pronóstico de leucemias, linfomas y síndromes linfoproliferativos

• Detección de Enfermedad Mínima Residual

• Detección de leucocitos activados en sangre o preparaciones celulares estimuladas

• Identificación de células productoras de citociinas

• Estudio de la polarización TH1/TH2/TH17 en linfocitos TH activados

• Identificación de células Tregs

DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES: APLICACIONES

Page 49: Citometria de Flujo IESJJ 2012

• Identificación de células en fase de proliferación

• Identificación de células tumorales en muestras complejas

• Identificación y cuantificación de células tumorales circulantes en sangre y líquidos biológicos

• Estudio de la regulación del ciclo celular

• Identificación de células en apoptosis temprana o tardía

• Análisis de los mecanismos reguladores y ejecutores de la apoptosis

DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES: APLICACIONES

Page 50: Citometria de Flujo IESJJ 2012

• Diagnóstico de deficiencias en moléculas de adhesión leucocitarias

• Diagnóstico de anomalías congénitas en el citoesqueleto

• Diagnóstico de deficiencias congénitas de almacenamiento en plaquetas

• Identificación y cuantificación de eritrocitos con hemoglobina fetal en el adulto

DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES: APLICACIONES

Page 51: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Determinar la presencia y cuantificar los niveles de ácidos nucleicos (ADN y ARN) en células enteras, células permeabilizadas o suspensiones de núcleos aislados a partir de sangre periférica, tejidos linfoides, líquidos biológicos, biopsias y otras muestras de tejidos sólidos y cultivos celulares, utilizando fluorocromos que se unen a los ácidos nucleicos.

ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS : OBJETIVO

Page 52: Citometria de Flujo IESJJ 2012

La determinación de la ploidía o el ciclo celular, requieren el acceso estequiométrico del fluorocromo al núcleo celular, por lo que utilizan células fijadas y/o permeabilizadas, o suspensiones de núcleos aislados. Según la aplicación, el proceso de preparación de la muestra puede ser mínimo o requerir etapas de fijación y permeabilización. Los fluorocromos permeables de ácidos nucleicos penetran en células en fresco y permiten distinguir las células nucleadas en sangre entera u otras muestras hematológicas o detectar los ácidos nucleicos residuales en eritrocitos y plaquetas inmaduras. Los fluorocromos impermeables de ácidos nucleicos se usan para detectar cambios en la permeabilidad de membrana asociados con apoptosis y necrosis.

ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS: METODOLOGIA

Page 53: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Las técnicas de análisis basadas en el uso de fluorocromos específicos de ácidos nucleicos en células permeabilizadas permiten:

• Determinar la ploidía celular

• Detectar la presencia de células en proliferación

• Calcular la distribución en las fases del ciclo celular

• Identificar células nucleadas en sangre (leucocitos, eritroblastos)

• Estimar el grado de maduración de precursores de eritrocitos y plaquetas

• Identificar y cuantificar células vivas, apoptóticas y necróticas

ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS: INFORMACION

Page 54: Citometria de Flujo IESJJ 2012

• Pronóstico de leucemias, linfomas y síndromes linfoproliferativos.

• Cálculo de la ploidía en tumores sólidos y neoplasias hematológicas.

• Identificación de células en fases de proliferación en tumores sólidos y hematológicos.

• Determinación del ciclo celular en cultivos celulares in vitro.

• Determinación de la activación de linfocitos por mitógenos in vitro.

• Análisis de la proliferación de células tumorales en muestras complejas.

• Identificación y cuantificación de células tumorales circulantes

• Estudio de la regulación del ciclo celular

• Identificación de células en apoptosis temprana o tardía.

• Análisis de los mecanismos reguladores y ejecutores de la apoptosis.

• Determinación de la viabilidad celular.

• Cuantificación de la actividad citotóxica de células NK y linfocitos CD8 activados.

• Identificación de reticulocitos y cálculo del Indice de Madurez Reticulocitaria (RMI).

• Identificación de plaquetas reticuladas y cálculo del Indice de Madurez Plaquetaria (PMI).

ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS: APLICACIONES

Page 55: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Analizar, de forma cualitativa o cuantitativa, fenómenos dinámicos o transitorios de la Bioquímica intracelular, cuya alteración sea causa, consecuencia o esté relacionada con situaciones fisiopatológicas de relevancia clínica.

+ADP

ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES: OBJETIVO

Page 56: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Se realiza usando fluorocromos, sustratos fluorogénicos específicos o partículas fluorescentes cuyas propiedades varían en función de: • Entorno celular: pH, iones, moléculas oxidantes, reductoras • Actividad de enzimas intracelulares específicos: oxidasas, peptidasas • Transporte a través de membrana plasmática o de orgánulos • Acumulación selectiva en compartimentos intracelulares

El proceso de preparación de la muestra debe respetar la viabilidad y competencia funcional. En muchas aplicaciones en Inmuno-Hematología, el análisis funcional se puede realizar en muestras de sangre entera, con un grado de manipulación mínima. En estudios de activación, se puede requerir una etapa de estimulación celular controlada.

ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES: METODOS

Page 57: Citometria de Flujo IESJJ 2012

• Fluidez y permeabilidad de membrana

• Fagocitosis de microorganismos

• Transporte de partículas y moléculas solubles al interior de la célula

• Retención intracelular de moléculas

• Extrusión de sustratos a través de bombas de eflujo

• Potenciales de membrana plasmática y mitocondrial

• pH intracelular y su regulación dinámica

• Movimientos de iones a través de membrana o desde depósitos intracelulares,

• Generación de especies reactivas de oxígeno y óxido nítricoNiveles de glutátion

• Citoenzimología de flujo

• Síntesis de ADN

• Niveles de depósitos de lípidos metabólicos y estructurales

ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES: INFORMACION

Page 58: Citometria de Flujo IESJJ 2012

• Identificación de blastos en el diagnóstico de leucemias.

• Seguimiento de la activación de leucocitos o plaquetas.

• Análisis del contenido en iones y la regulación del equilibrio iónico celular.

• Detección de la expresión de superficie procoagulante en plaquetas.

• Seguimiento y cuantificación de fagocitosis de microbios o partículas sintéticas.

• Análisis de la respuesta oxidativa en fagocitos ("Burst oxidativo").

• Análisis de la actividad de proteasas intralisosomales en fagocitos.

• Análisis de la actividad proteolítica intracelular en células tumorales invasivas.

• Determinación del pH intracelular y su regulación.

• Análisis del estrés oxidativo inducido y de las defensas antioxidantes celulares.

• Identificación y cuantificación de células en apoptosis.

ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES: APLICACIONES

Page 59: Citometria de Flujo IESJJ 2012

• Concepto de citometría de flujo

• Funcionamiento de un citómetro de flujo

• Fluorescencia y marcadores fluorescentes

• Parámetros analizables por citometría de flujo

• Aplicaciones de la citometria de flujo

• La citometría del futuro

ASPECTOS BASICOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Page 60: Citometria de Flujo IESJJ 2012

CITOLOGIA CITOMETRIA CITOMICA

• Aumento de complejidad técnica y de información generada • Demanda de mejor rendimiento y mayor capacidad de análisis de datos • Búsqueda de nuevos parámetros biológicos y nuevas áreas de aplicación

LA EVOLUCION DE LA CITOLOGIA ANALITICA

Page 61: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Flow Cytometry Confocal Microscopy

Laser Scanning Cytometry

High Content Analysis by Automated Bioimage Analysis

Multispectral Image-in-flow Cytometry

Mass-Spectrometry Flow Cytometry

NUEVA INSTRUMENTACION

Page 62: Citometria de Flujo IESJJ 2012

Acoustic focusing cytometry uses ultrasound waves (over 2 MHz) to position cells into a single focused line along the central axis of a flow channel without high velocity or high volumetric sheath fluid, which can damage cells. The acoustic focusing actually concentrates the cells in the center of the fluid with sound energy. This means considerable flexibility in the sample concentration. The end result is more accurate and precise data. Acoustic focusing separates the alignment of cells from the particle flow rate. This allows to increase or decrease flow without disrupting the focus of cells in the capillary.

CITOMETRIA ACÚSTICA: AUMENTO DE VELOCIDAD

Page 63: Citometria de Flujo IESJJ 2012

CITOMETRIA DE ALTO RENDIMIENTO: SCREENING

Page 64: Citometria de Flujo IESJJ 2012

HERRAMIENTAS BIOINFORMÁTICAS: MAYOR INFORMACION

Page 65: Citometria de Flujo IESJJ 2012

• Cells are hydrodinamically focused into a core stream and orthogonally illuminated for both darkfield and fluorescence imaging. The cells are simultaneously transilluminated via a spectrally limited source for brightfield imaging.

• Light is collected from the cells with an imaging objective lens and is projected on a charge coupled detector(CCD).

• Prior to projection on the CCD, the light is passed through a spectral descomposition optical system that directs different spectral bands to different lateral positions across the detector.

CITOMETRIA DE IMAGEN EN FLUJO: FORMA Y FUNCIÓN

Page 66: Citometria de Flujo IESJJ 2012

200+ params/cell population statistics object values

Tabular Data

see every cell flexible viewing enhance & color tag populations virtual cell sort

Workspace uni + bivariates flexible gating click dot to view cell custom parameters

CITOMETRIA DE IMAGEN EN FLUJO: FORMA Y FUNCIÓN

Page 67: Citometria de Flujo IESJJ 2012

http://www.uv.es/~oconnor/IES-JJ-2012