Citometria Brian

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“La citometría de flujo es un método analítico que permite la medición rápida de ciertas características físicas y químicas de células o partículas microscópicas en suspensión que producen una señal de forma individual al interferir con una fuente de luz” CITOMETRIA DE FLUJO

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“La citometría de flujo es un método analítico que permite la medición rápida de ciertas características físicas y químicas de células o partículas microscópicas en suspensión que producen una señal de forma individual al interferir con una fuente de luz”

CITOMETRIA DE FLUJO

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NIVELES DE ANALISISMOLECULAR(esferas fluorescentes)

SUBCELULAR CELULAR SUPRACELULAR

Proteínas extracelulares

Viriones individuales

Bacterias Hibridomas

Secuencias de ADN o ARN libres

Liposomas Hongos unicelulares

Fusiones celulares

Complejos inmunes circulantes

Cromosomas aislados

Células humanas y animales

Orgánulos aislados

Protoplastos vegetales

Núcleos aislados

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EXTRACELULARES

DE SUPERFICIE

CITOPLASMATICO

NUCLEARES

PARAMETROS DE ANALISIS

A NIVEL CELULAR

Ploidía de ADN Regulación del ciclo

celular Acción de hormonas

Metabolismo celular Transducción de señales Lesión celular

Caracterización población celular

Interacciones célula-célula Resistencia a fármacos

Activación celular Interacciones célula-célula Diferenciación celular

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¿COMO FUNCIONA EL CITOMETRO DE FLUJO?

IMAGEN DE:Rodrigo Blanco Salado, Alfredo Corell

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¿Qué es un fluorocromo?

488 nm

LuzIncidente

HO O

CO2H

Molécula de

Fluoresceína

530 nm

LuzFluorescente

Emitida

• El fluorocromo absorbe la luz del láser

• El fluorocromo emite un rayo luminoso dediferente longitud de onda

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PRINCIPALES FLUOROCROMOS UTILIZADOS EN CITOMETRÍA DE FLUJO

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DATOS OBTENIDOS

1. PARAMETROS ESTRUCTURALES• El tamaño relativo (Forward scatter-FSC)• La granularidad o complejidad citoplasmática. (Side scatter-SSC)

2. CD (antigenos de superficie): La intensidad de fluorescencia (Identidad)• Linaje• Recuento • Activación

4. ALTERACION EN EL INMUNOFENOTIPO• Inmunoproliferacion/inmunodeficiencia

5. ALTERACION EN EL GENOTIPO• Cambios en contenido DNA• Cambio en la expresion de genes

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PRESENTACION DE LOS DATOS

• Histograma

• Gráfico de Puntos (Dot Plot)

• Gráfico de Contorno (Countour Plot)

• Gráfico de Densidad (Density Plot)

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REGISTRO PRIMARIO

IMAGEN DE:Rodrigo Blanco Salado, Alfredo Corell

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IMAGEN DE:Rodrigo Blanco Salado, Alfredo Corell

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Granulocitos

DetritosLinfocitos

Monocitos

DISPERCION NORMAL

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Countour Plot Density Plot

IMAGEN DE:Rodrigo Blanco Salado, Alfredo Corell

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APLICACIONES CLINICASINMUNOFENOTIPIFICACIONi

PLAQUETASi TRANSPLANTES

CANCERi

o LEUCEMIAS Y LINFOMASo ENFERMEDAD MINIMA RESIDUALo SUBPOBLACIONES LINFOIDES

(INMUNODEFICIENCIAS)o RAZON LtCD4/CD8(VIH-SIDA)

o CONTENIDO DE DNA (ploidia DNA)o FASES DEL CICLO CELULARo PROTEINAS DEL CICLO CELULARo ONCOGENES (p53 y otros)

o GLICOPROTEINAS (TROMBASTENIA DE GLANZMANN)

o FISIOLOGIA PLAQUETARIAo Igs ASOCIADAS A PLAQUETAS

(PURPURA TROMBOCITOPENIA INMUNE)

o CELULAS PROGENITORAS(CD34, CD117)

o CROSS MATCH

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ESTUDIOS FUNCIONALES

CUANTIFICACION DE MOLECULAS

DETECCION DE CITOQUINAS

SOLUBLES

• Citocinas Intracelulares• Fagocitosis• Estallido respiratorio• pH intracelular• Potencial de membrana

• En base a partículas cubiertas con Ig anticitocinas

• Recuento absoluto de células• CD 64 en granulocitos(infeccion)

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APLICACIÓN DE LA CITOMETRIA EN HEMATOLOGIA

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VENTAJAS EN HEMATOLOGIA Análisis multiparamétrico

Acceso mínimamente invasivo a parámetros celulares

Analiza grandes cantidades en poco tiempo. Aprox: 500-4000 cel/seg.

Resolución de heterogeneidad celular

Selección fenotípica de subpoblaciones

Selección manual de marcadores: Permite separar subpoblaciones celulares. (Clasificación de patologías).

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INMUNOFENOTIPIFICACION DE LEUCEMIAS

“Los distintos tipos de leucemias son un grupo heterogéneo de patologías resultantes de una proliferación descontrolada de una o más tipos celulares hematopoyeticos tanto en médula ósea como sangre periférica”

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RETENCION DE ANTIGENOS

Células malignas frecuentemente conservan antígenos asociados con la célula normal a partir de la cual fueron derivados. Ejm:

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CD10CD34CD8

HLA-DR

TIMOCITOLINFOCITOPRE B

CD10CD19CD34CD38

LINFOCITO BCD19CD20CD22IgM

LINFOCITO TCOOPERADOR

CD4 CD3CD28 TCRCD5

CD1 CD8CD2 CD71CD3 CD38CD4 TCR

LINFOCITO TCITOTOXICO

CD8CD3CD28CD5

NK MADUROCD2CD8+/-CD16CD56CD57

MADURACION DE LINEA LINFOIDE

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BIBLIOGRAFIA1. BARRERA RAMÍREZ LOURDES MARÍA, DRAGO SERRANO MA. ELISA, PÉREZ RAMOS

JULIA, SAINZ ESPUÑES TERESITA DEL ROSARIO, ZAMORA ANA CECILIA, GÓMEZ ARROYO FABIOLA et al . CITOMETRÍA DE FLUJO: VÍNCULO ENTRE LA INVESTIGACIÓN BÁSICA Y LA APLICACIÓN CLÍNICA. Rev. Inst. Nal. Enf. Resp. Mex. [revista en la Internet]. 2004 Mar [citado 2012 Mar 12] ; 17(1): 42-55. Disponible en: http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0187-75852004000100007&lng=es

2. Statistical file matching of flow cytometry data, ELSEIVER, Journal and biomedical Informatics, Gyemin Lee a, William Finn, Clayton Scott

3. Maryalice Stetler-Stevenson. Flow cytometry in lymphoma diagnosis and prognosis: useful? Best Practice & Research Clinical Haematology Vol. 16, No. 4, pp. 583–597, 2003

4. Diagnosing PNH with FLAER and Multiparameter Flow Cytometry, D. Robert Sutherland,1 Nancy Kuek, Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 72B:167–177 (2007)

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