Técnica Descripción y funciones de los componentes del aparato

Conceptos esenciales

Fluorocromo: Molécula capaz de absorber fotones y emitir fotones de menor energía (mayor longitud de onda).

Fluoróforo: Parte del fluorocromo responsable de la emisión de fluorescencia.

Marcador fluorescente o sonda fluorescente: Fluorocromo diseñado para unirse a una región específica de una muestra biológica o responder a un determinado estímulo.

Longitud de onda de excitación: Longitud de onda a la que un fluorocromo puede absorber fotones.

Longitud de onda de emisión: Longitud de onda a la que un fluorocromo emite fotones de fluorescencia.

MARCAJE DE CELULAS CON ANTICUERPOS FLUORESCENTES

Se utilizan generalmente inmunoglobulinas monoclonales de rata contra antígenos concretos en lasupercicie de las células

Marcadas con colorantes fluorescentes verde (fluoresceina) y/o rojo (picoeritrina).

El anticuerpo es enfrentado a las células durante media hora, luego se lava y se procesa por elcitómetro de flujo.

RUIDO CUANTICO

Al analizar los resultados, siempre nos vamos a encontrar con una fluorescenciainespecífica que se produce por adsorción de algunas moléculas de anticuerpo ala superficie celular sin mediar un reconocimiento antígeno anticuerpo.

Es preciso hacer un control negativo.

Las muestras deben ser tratadas con un anticuerpo del mismo animal que elutilizado para los marcajes, marcado con el mismo colorante pero que no esespecífico. Se unirá por un mecanismo distinto de la unión antígeno anticuerpo

Permite cuantificar y poder establecer el umbral por encima del cual seconsidere que el resultado no se debe a inespecificidad sino a la fijación delanticuerpo.

TECNICAS BASICAS DE MARCAJE CELULAR

ANTICUERPOS DIRECTOS.

Se utilizan anticuerpos monoclonales específicos contra antígenos concretos que vienen ya marcados con elfluorocromo en su presentación comercial.

1.- En un tubo seco colocar 100 µl de una solución celular de 10 Mc/ml (1 Mc).

2.- Controles: Añadir el anticuerpo marcado generalmente se ponen 20 µl excepto para los de ruido defondo que son uso 1:40 en 15 µl.

3.- Colocar los tubos en hielo picado y trasladar a nevera, incubar 30 minutos.

4.- Extraer las muestras del frio, añadir 3,5 ml de solución de Hanks.

5.-Centrifugar a 1800 rpm, descartar el sobrenadante, resuspender y añadir 500 µl de solución de Hanks.

Partes del citometro

Sistema combinado de flujo, óptica y electrónica.

El sistema de flujo introduce y restringe a las célulaspara su análisis individual.

El sistema óptico excita la muestra y colecta las señalesde luz provenientes de la misma.

El sistema electrónico convierte la señal óptica en unaseñal electrónica y la digitaliza para el análisis encomputadora.

Sistema de flujo

El sistema de flujo del FACS posee un capilar a través del cual se hace pasar un líquido isotónico, a manera de una funda, con una velocidad y presión constante

Se hace pasar la suspensión celular, con aproximadamente de 5 x 105 a 2 x 107 células/mL y a una presión mayor que la del flujo acarreador.

Sistema óptico

La fluorescencia y la luz dispersada se producencuando una célula contenida en el líquidoinyectado pasa por el rayo enfocado de un láser.

La luz dispersada hacia el frente es colectadapor un detector que capta la luz difractadaentre 1 y 10º arriba o abajo del punto deincidencia del láser.

La luz dispersada lateralmente y la fluorescenciason colectadas por un lente que está a 90º deleje de incidencia del láser.

Los colorantes más utilizados:

Fluoresceína con excitación máxima a495 nm y emisión máxima a 520nm.

Picoeritrina con excitación a 495 yemisión a 576nm

Sus características permiten utilizarlossimultáneamente con un laser de488nm.

Sistema eléctrico

Para la obtención física de las poblaciones celulares, esnecesario que las células vayan en gotas aisladas para distinguiry separar una población de otra.

Célula atraviesa el rayo láser, se ilumina por variosmicrosegundos y durante ese tiempo emite un pulsofluorescente.

Si este pulso cae en los límites de amplitud predeterminados, segenera eléctricamente un pulso cargado.

Toma en cuenta la demora que hay entre el evento de la célulaestando incidida por el láser y el lugar donde debe formarse lagota.

Este pulso llega a un cristal piezoeléctrico

Se expande y contrae ligeramente cuando se aplica un voltaje yeste movimiento guía a un oscilador que hace vibrar laestructura por donde pasa el capilar.

¿Cómo funciona?

La suspensión celular se inyecta al flujo laminar donde las células pasan unadespués de la otra a través de un capilar y llegan hasta un rayo láser.

Cuando este rayo incide en una célula, la luz de excitación sale haciadelante y hacia los lados de la célula y esto genera información.

La luz dispersada hacia delante provee información sobre el tamaño de lacélula.

La luz dispersada hacia los lados provee información sobre la granularidad,tamaño y morfología celular.

Diseño del título y del contenido con SmartArt

Si la célula va marcada con un fluoróforo, la luz fluorescente se procesa, a travésdel fotomultiplicador.

Los resultados son analizados por el software del citómetro.

El FACS posee una unidad de “sorteo”

Las células se cargan eléctricamente y las gotas resultantes se desvían al pasar a través de un campo eléctrico.

Obtención de los datos e interpretación

La computadora produce un histograma o un despliegue de dos parámetros a partir de la luz dispersada por las células o a partir de la fluorescencia.