Curso de Aplicaciones clínicas de la Citometria de Flujo Año 2013

Bioq. Viviana Novoa

Los Sindromes Mielodisplásicos son un grupo de enfermedades clonales de la Stem Cells hematopoyética caracterizada por citopenia(s), displasia de una o más líneas celulares mieloides, hematopoyesis inefectiva y aumentado riesgo de desarrollar leucemia mieloide aguda.

Presencia de alteraciones morfológicas, acumulación de

anomalías genéticas y diversas alteraciones fenotípicas en precursores y células maduras en M.O.

Incidencia en E.E.U.U: 3.4 casos /100.000 habitantes. Otros países han reportado datos similares.

Su incidencia aumenta con la edad. Más frecuente entre los 65-70 años. En 70 años: 15-50 casos/100.000 habitantes.

Es más frecuente en hombre que en mujeres.

Poco frecuente en niños y adolescentes. Representa 5% de los tumores hematopoyéticos en pacientes menores de 14 años. El pronóstico y el curso de la enfermedad varía entre pacientes. Existen SMD primarios y secundarios.

Agentes alquilantes: mostazas nitrogenadas, nitrosureas, clorambucilo, ciclofosfamida, cisplatino y carboplatino.

Agentes que inhiben la DNA topoisomerasa II: etopósidos y antacíclicos.

Radioterapia: irradiación corporal total o hemicuerpo

Exposición a solventes, químicos, pesticidas, fertilizantes, benceno y derivados del petróleo.

FAB (1976): 2 categorías ( AREB y LMMC)

FAB (1982): basada en criterios morfológicos (% de blastos en SP y MO, n° abs. de monocitos, bastones de Auer y cant. sideroblastos en anillo). 5 categorías (AR, ARSA, AREB, AREB-t, LMMC)

OMS/WHO (1999 y 2001): introduce cambios para separar algunas entidades. Disminuye el % de blastos a 20% y reclasifica la LMMC a MDS/MPD. 10 categorias ( por ej: se divide AREB en AREB1 y AREB2, se agrega MDS con del(5q) y se elimina AREB-t)

OMS/WHO (2008): clasifica los SMD y los SMP. 11 categorías.

Citopenia refractaria con displasia unilinaje (RCUD) Anemia refractaria (AR) Neutropenia refractaria (NR) Trombocitopenia refractaria (TR)

Anemia refractaria con sideroblastos en anillo (ARSA) Citopenia refractaria con displasia multilinaje (CRDM) Anemia refractaria con exceso de blastos tipo 1 (AREB-1) Anemia refractaria con exceso de blastos tipo 2 (AREB-2) SMD asociado con deleción aislada a del (5q) SMD no clasificable (MDS-U) SMD en chicos

Prerrequisitos o criterios escenciales: Citopenia constante en uno o más de los siguientes linajes: Hg11g/dl; neutrófilos

1,5x109/l; plaquetas100x109/l. Exclusión de otras causas hematopoyéticas o no hematopoyéticas de desórdenes

primarios para citopenias o displasia.

Criterios decisivos o relacionado: Displasia de al menos 10% de todas las células en uno o más linajes en MO: mieloide,

eritroide, megacariocítico o más de 15% de sideroblastos en anillo. 5-19% de blastos en MO. Anomalías cromosómicas típicas por citogenética convencional o por FISH.

Co-criterios (para pacientes que cumplen criterios escenciales pero no criterios decisivos pero presentan características clínicas típicas de SMD): Fenotipo anormal de células (eritroides o mieloides) de MO claramente indicadores

de población monoclonal por Citometría de Flujo. Signos moleculares evidentes de población monoclonal: Humara, Mutaciones

puntuales (ej:RAS) Reducción marcada y persistente de UFC de MO y/o de células progenitoras de SP. Cumplir con los Prerrequisitos y 1 criterio decisivo o relacionado. Sin 1 criterio decisivo pero

con 1 co-criterio se denominaría “Altamente sospechoso”.

La Citometría de flujo (CF) permite realizar una evaluación cuali-cuantitativa de las diferentes poblaciones celulares de la MO en las serie mielomonocítica y eritroide, como así también en los progenitores hematopoyéticos CD34+, detectando cambios fenotípicos en los patrones de maduración y diferenciación, pudiendo así definir la existencia de un desorden mieloide clonal

Evaluación cuantitativa y cualitativa de: Precursores CD34+ Serie granulocitica neutrófilo Serie monocítica Serie eritroide

Evaluación CUANTITATIVA de blastos CD34(+) o CD117(+)CD34(-), hematogonias B CD34(+) y celulas monociticas inmaduras.

Evaluación CUALITATIVA de alteraciones en los patrones de maduración de las distintas series y patrones inmunofenotípicos de los precursores CD34(+).

NO existen marcadores ni patrones aberrantes ESPECIFICOS de SMD

La citometría distingue entre MO react. / normal vs. neoplasia mieloide

2007. Definitions and standards in the diagnosis and treatment of the myelodysplastic syndromes: Consensus statements and report from a working conference.

2008. Flow cytometry in myelodysplastic syndromes: report from a working conference.

2009. Standardization of flow cytometry in myelodysplastic syndromes: report from the first European LeukemiaNet working conference on flow cytometric in myelodysplastic syndromes.

2009. Diagnostic utility of flow cytometric in low-grade myelodysplastic syndrome: a prospective validation study.

2012. Implementation of flow cytometry in the diagnostic work-up of myelodysplastic syndromes in a multicenter approach: Report from the Dutch Working Party on flow cytometry in MDS.

2012. Update on developmentets in the diagnosis and prognostic evaluation of patients with myelodysplastic syndromes (MDS): consensus statements and report from an expert workshop.

2012. Standardization of flow cytometry in myelodysplastic syndromes: a report from an international consortium and the European LeukemiaNet working group.

2009 y 2010. Primer y Segundo Consenso del Grupo Rioplatense de Citometría de Flujo.

Estandarizar el estudio de esta patología para poder llegar a resultados homogéneos

Unificar criterios preanalíticos y procesamiento de la muestra. Definir paneles de marcación mínimos y métodos de análisis. Establecer modelos de informes de resultados.

Educación y capacitación continua.

Muestra válida: Aspirado de médula ósea en fresco sin fijador. Anticoagulante: EDTA (dentro de 24 hs.) o Heparina (más de

24 hs.)

Conservación: temperatura ambiente. Tener en cuenta: Hemólisis. Presencia de coágulos Hemodilución ( volumen de la muestra inferior a 3 ml) Viabilidad celular: depende de anticoagulante utilizado, tiempo

y temperatura hasta / durante el procesamiento, métodos de procesamiento, ciertas condiciones que aceleren la muerte celular (terapia recibida, tumor con alta tasa de proliferación).

>24 horas. Un resultado positivo siempre es informativo a pesar de la baja viabilidad, y ante un resultado negativo, se hará constar en el informe (los granulocitos pueden degranularse con el pasar del tiempo).

Muestra coagulada, no puede ser rechazada, pero los resultados obtenidos deberán ser tomados con precaución.

Muestra anormalmente rotulada. Se debe clarificar la situación específicamente con el personal que obtuvo la muestra. Si no puede ser confirmada la identificación de la muestra, debe rechazarse.

Inspección inicial de la muestra: hemólisis, coágulos, temperatura extrema, muestra mal rotulada

Lisis de eritrocitos: se recomienda lisis posterior al marcado.

Ajuste del número de células: 0,5 – 106 cél. / tubo.Ver viabilidad celular.

Adquisición de datos: no menos de 50000 eventos totales ó

no menos de 100 eventos en la población de interés.

El panel debe permitir distinguir todas poblaciones celulares presentes en la muestra, aún las menos frecuentes, en todos los estadios madurativos (precursores mieloides, linfoides y eritroides y células maduras de los linajes mieloides, monocitoides y linfoides)

Deberá identificar anomalías feneotípicas presentes en las distintas líneas celulares ( sobreexpresión, subexpresión o ausencia de Ag, asincronismo madurativo, infidelidad de linaje).

Deberá ser suficientemente amplio para identificar la presencia

de células anormales, aún las no sospechadas originalmente por el médico y caracterizar en forma completa la población anormal detectada.

FITC PE PerCP/PECy5.5 APC

CD16 CD13 CD45 CD11b Maduración granulocítica

CD15 CD33 CD45 CD34 Precursores. Serie granulocítica y monocítica.

CD36 CD64 CD45 CD14 Maduración monocítica

HLA-DR CD11b CD45 CD34 Maduración monocítica y granulocítica

CD71 CD36 CD45 CD34 Precursores y maduración eritroide

CD71 CD13 CD45 CD34 Precursores (mieloides, eritroides y linfoides)

HLA-DR CD117 CD34 CD38 Precursores mieloides tempranos y de diferenciación, mastocitos y

células plasmáticas.

HLA-DR CD123 CD45 CD34 Células dendríticas , basófilos y sus precursores.

CD5 CD7 CD34 CD56 Precursores . Ags aberrantes. Linaje linfoide T y NK

CD3 CD8 CD45 CD4 Población linfoide T

CD10 CD20 CD19 CD34 Precursores linfoides B

PacB PacO FITC PE PerCPCy5.5 PECy7 APC APCH7

HLA-DR CD45 CD16 CD13 CD34 CD117 CD11b CD10 Maduración neutrófilo y PNH.

HLA-DR CD45 CD35 CD64 CD34 CD117 IREM2 CD14 Maduración monocito y PNH

HLA-DR CD45 CD36 CD105 CD34 CD117 CD33 CD71 Maduración eritroide

HLA-DR CD45 TDT CD56 CD34 CD117 CD7 CD19 Maduración B y aberrante Ags linfoides

HLA-DR CD45 CD15 NG2 CD34 CD117 CD22 CD38 Expresión aberrante en stem cells

Población % (n=12) CD34+ 1.1 + 0.6 (0.3-2.6)

CD34+ or CD117+ 2.2 + 1.4 (0.6-6)

Células eritroides 4.7 + 2.1 (2-9) Neutrófilos 67 + 6.1 (57-80)

Monocitos 4.3 + 1.4 (2-6.5)

Eosinófilos 2.5 + 1.3 (0.8-5)

Basófilos 0.4 + 0.7 (<0.1-2.4) Mastocitos 0.02 + 0.01 (<0.03)

Cél plasmáticas 0.2 + 0.2 (0.01-0.5)

LB maduros 2.9 + 1.5 (1.6-6.3)

Precursores B 0.9 + 0.8 (0.1-3.9) LT 9.2 + 4.5 (2.6-18)

Células NK 2.8 + 1.4 (0.7-5)

Distribución de las poblaciones en MO normal

Precursores mieloides CD34+

Precursores linfoides CD34+

El porcentaje de precursores CD34+ linfoides se informa sobre el total de CD34+. Se considera anormal <5% del total de las CD34+.

a- Se seleccionan las células en Gate CD34+ CD34/SSC b- En un segundo paso, se excluyen las células NO viables en FSC/SSC. c- El perfil de CD45/SSC permite constatar pureza de la población seleccionada.

Valores normales para las distintas subpoblaciones de CD34+

Linaje celular Frecuencia . Inmaduras 52% (19-66%) Eritroide 15% (5%-35%) Megacariocítica ‹1% Neutrófilo 31% (12%-39%) Eosinófilo ‹1% Basófilo ‹1% (‹1%-3%) Monocítico 5% (3%-15%) Mastocitos ‹1% Cel. dendrítica plasmocitoide 6% (1%-15%) Linfoide B 14% (‹1%-45%)

CD45-PerCP

Precursores en MO normal

T-SSC

CD34+ HPC

Precursores inmaduros Precursores B Precursores neutrófilos

Progenitores mieloides CD34+ Aumento relativo y absoluto de células CD34+. Aumento relativo y absoluto de células CD34(-)CD117(+). SSC anormal (granularidad). Expresión anormal de CD45 (-, o ). Expresión anormal de CD34 (-, o ). Expresión anormal de CD38 (- o ). Expresión asincrónica de CD11b y/o CD15. Pérdida o sobreexpresión de expresión de CD13,CD33 o DR. Expresión de Antígenos Linfoides: CD5, CD7, CD19 o CD56. Progenitores CD34(+) linfoides B Disminución o ausencia relativa y absoluta de células CD19(+)CD10(+) Ausencia de expresión de CD79a.

Mieloides

Linfoide B

Inmaduras

Linfoides B

Mieloides

Eritroides

MO normal MO patológica

HLA DR CD123 CD45

CD11b CD13 CD45 CD34

MO normal MO patológica

HLA DR-FITC

CD123-PE

CD45-PerCP Cy5.5

CD34 A

PC

Hipogranularidad (SSC )

Anormalidad en los patrones de maduración (CD16/CD13,

CD11b/CD13)

Asincronismo CD10/CD16

Ausencia o disminución de CD13 o CD33.

Expresión de CD34, CD117, HLA-DR.

Expresión de Ag. Linfoides.

Expresión disminuida de CD45.

Desvío asincrónico hacia la izquierda.

MYELOBLAST PROMYELOCYTE MYELOCYTE METAMYELOCYT BAND/

NEUTROPHIL

103

102

101

CD34

HLA-DR CD117

CD13

CD33 CD11b

CD15

CD64

CD65

CD54

CD10

CD16

CD35

CD13

Cambios fenotípicos en la diferenciación mieloide normal

Patrón normal Patrones alterados

Patrones alterados Patrón Normal

SSC anormal (granularidad).

Patrones anormales de HLA-DR/CD11b, CD64/CD36/CD14, DR/CD33, CD11b/CD13.

Pérdida de expresión de CD13, CD14 y CD33.

Expresión de CD34.

Expresión de Ag. Linfoides (con excepción del CD4).

Disminución de la expresión de CD45.

Expresión de CD56.

MONOBLAST

PROMONOCYTE

MONOCYTE

CD34

CD117

CD64

CD45

CD11b

CD14

HLA-DR

CD36

CD11c

Cambios fenotípicos en la diferenciación monocítica normal

CD36-FITC

CD64-PE

Diferenciación monocítica

CD14++

CD36 FITC

CD14 A

PC

CD13 P

E

CD11b FITC

CD36 CD64 CD45 CD14

MO normal MO patológica

Aumento del % de células eritroides nucleadas.

Alterado patrón CD71/CD235a.

Expresión anormal de CD45.

Expresión anormal de CD71, CD117 o CD36.

Expresión de CD34.

INMATURE

MATURE

CD34

CD117

HLA-DR

CD45

CD13

CD33

GphA

CD36

CD71

Cambios fenotípicos de la diferenciación eritroide

Disminución de la expresión de CD71 y/o CD36 Aumento de la proporción de línea eritroide con expresión CD117 (más de 30% del total de las células seleccionadas como eritroides). Expresión aberrante de antígenos linfoides: CD5, CD7, CD19, CD56.

Resultados: % de células CD34(+) % de células CD34(-)CD117(+) % de granulocitos. % de monocitos % serie eritroide % de otras células identificadas. Fenotipo conservado o alterado de las células CD34(+). Presencia o

ausencia de hematogonias. Patrón madurativo conservado o alterado en serie granulocítica,

monocítica y/o eritroide.

Conclusiones: Sin evidencia fenotípica que sugiera proceso mielodisplásico. Evidencia fenotípica de desorden mieloide clonal sugerente de

SMD.

Presencia de blastos o células atípicas: evaluar todos las líneas celulares.

Citopenias: evaluar todos las líneas celulares. Descartar algunos SLPC-B que se presentan con citopenia. En anemias aisladas la CF no está indicada de primera instancia.

Leucocitosis: Monocitosis Eosinofilia Neutrofilia: solo en presencia de blastos. Policitemia, trombosis o basofilia: la CF no está indicada en

primera instancia ( frecuentemente asociadas a patologías no neoplásicas o en patologías en las que la CF no aporta datos relevantes).

Displasia multilinaje: Malnutrición

Falla multiorgánica Drogas inmunosupresoras o citotóxicas. Abuso de alcohol

Deficiencia de Vit B12 o Acido Fólico.

Sobreexpresión de CD64 en sepsis.

Ausencia de CD16 en granulocitos: descartar PNH.

Ausencia de CD14 en monocitos: descartar PNH.

La muestra para el estudio de SMD por CF debe ser el aspirado de médula ósea.

Evaluar todas las poblaciones presentes en MO, por lo menos las mayoritarias, con amplios paneles de Ac. Monoclonales.

Los datos obtenidos por CF deben ser capaces de categorizar MO como normal o posiblemente compatible con SMD o desorden mieloide clonal.

La CF en SMD puede ser sólo usada como una parte del diagnóstico.

No existe un marcador diagnóstico específico para SMD.

El grado de asociación de las alteraciones fenotípicas con los SMD es variable.

Un mayor número de alteraciones en los precursores

hematopoyéticos muestran un mayor grado de especificidad diagnóstica y también se asocian con peor pronóstico.

Repetidos estudios pueden ser necesarios en casos no

concluyentes y también para monitorear el curso de la enfermedad tanto en pacientes de bajo riesgo no tratados como en los pacientes con tratamiento.

La coincidencia de los SMD con otras patologías como SLP,

mastocitosis y HPN deben ser considerados. Tener en cuenta que las citopenias pueden ser causa de otras

patologías como leucemias agudas, anemias aplásicas y algunos SLPC como la Tricoleucemia.