Cromatografía en columna, en capa fina y sobre papel

Sexta práctica de Lab. Química Orgánica

Se aplicará esta técnica para separar una mezcla de Azul me metileno-Anaranjado de metilo, también se observará la acción de las resinas de intercambio iónico, las cuales deben ser activadas en día anterior.

Cap. 6-7. Química Orgánica 2010 II_UNALM

Autor: Eltsyn Jozsef Uchuypoma

CROMATOGRAFÍA 1. Introducción

La cromatografía, es la técnica de análisis químico utilizada para separar sustancias puras de mezclas complejas. Esta técnica depende del principio de adsorción selectiva (no confundir con absorción). La cromatografía fue descubierta por el botánico ruso, de origen italiano, Mijaíl Tswett en 1906, pero su uso no se generalizó hasta la década de 1930. Tswett separó los pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo extracto de hojas verdes en éter de petróleo sobre una columna de carbonato de calcio en polvo en el interior de una probeta. A medida que la disolución va filtrándose por la columna, cada componente de la mezcla precipita a diferente velocidad, quedando la columna marcada por bandas horizontales de colores, denominadas cromatogramas. Cada banda corresponde a un pigmento diferente.

2. Objetivo

• Aplicar la técnica de cromatografía en columna para separar una mezcla de azul de metileno – anaranjado de metilo.

• Trabajar con placas de cromatografía en capa fina (c.c.f.) y de papel de dimensiones particularmente menores. Para el analizar la relación de frente. Y observar el comportamiento en esta técnica cromatografía.

• Conocer que es la electroforesis y sus aplicaciones en la biología. • Diferenciar entre la c.c.f. y la de papel. • Interpretar los valores de Rf

3. Metodología

A. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA Materiales:

• Algodón • Columna cromatografía • Etanol (solvente) • Silicagel • Mezcla (azul metileno + anaranjado de metilo)

Procedimiento:

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B. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (THIN LAYER CHROMATOGRAPHY) Materiales:

• Dos placas portaobjetos. • Mezcla de silicagel y cloroformo • Mezcla de anaranjado de metilo + azul de metileno • Anaranjado de metilo • Recipiente (cámara de desarrollo) • Solvente (1 propanol – butanona – agua)

Procedimientos:

A. PREPARACIÓN DE LA COLUMNA: •Introducir un trozo de algodón hasta el fondo de la columna. •Adicionarle etanol hasta las3/4 parte. •Agregar una suspesion formada al agitar 10g de Silicagel y etanol. •Abrir la llave hasta que la altura del solvente sea de 1cm por encima de la superficie del adsorbente.

B. SIEMBRA: •Depositar 20 gotas de la mezcla a separar. •Abrir la llave hasta que todo el colorante sea absorbido por la fase fija.

C. ELUCIÓN: •Ir adicionando mas etanol hasta que se eluya todo el naranja de metilo. •Cambie de recipiente y eluya el azul de metileno; agregando el solvente agua acidulada para eluir este segundo coloarnate.

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Preparamos las placas introduciendo 2 láminas

portaobjetos (juntas) en una mezcla (Silicagel + Cloroformo).

Dejar secar y señalar 2 puntos (equidistantes de los bordes

entre sí) en una línea imaginaria a 1cm del borde inferior.

En uno de los puntos se siembra 3 gotas de la mezcla (anaranjado de metilo + azul de metileno) y el otro anarajando de metilo.

Introducir la placa en una cámara de desarrollo que contiene la fase móvil (1-propanol-butanona-agua

4:1:1)

Cuando el solvente está por llegar al borde superior de la plaquita, retire está, marque el frente del solvente,

dejar secar y calcule el Rf.

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C. CROMATOGRAFÍA SOBRE PAPEL Materiales:

• Tubo de ensayo • Papel filtro • Azul de metileno • Mezcla ( Azul de metileno y anaranjado de metilo) • Tubo capilar

Procedimiento:

1. Sobre un papel filtro. Establecer dos puntos equidistantes (de los

bordes entre sí) que se encuentre en una línea

imaginaria a 1cm del borde inferior.

2. Señalar los puntos de siembra. En uno

de los puntos con un tubo capilar,

depositar 3 gotas de la muestra, en la otra

3 gotas del azul de metilo.

3. Dejar unos minutos para que se evapore el solvente de siembra.

Introducir la tira en un tubo de ensayo que

contiene la fase movil (1- propanol -

butanona).

4. Cuando la fase móvil haya ascendido unos 8-10 cm, retire el papel y marque el frente del solvente.

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4. Conclusiones

• En la cromatografía en columna observamos que la cromatografía se basa en la diferencia de velocidad con que se desplazan los componentes de una mezcla de compuestos que se encuentran entre dos fases en íntimo contacto. El azul de metileno que es mas polar queda retenido y se necita un solvente mas polar como el agua acidulada para su adsorción; mientras que el anaranjado de metilo es menos polar por lo que sale más rápido y solo necesita de etanol debido a que es menos polar para su disolución.

• En la cromatografía en capa fina (Thin Layer Chromatography) el uso de un adsorbente eficiente como el Silicagel que se aplica en al portaobjetos formando una capa delgada y uniforme; esto hace de la c.c.f. un método versátil, sensible, rápido y eficiente. La distancia recorrida por el anaranjado de metilo es 1cm y la distancia recorrida por la mezcla (naranja de metilo + azul de metileno) es 2cm.

• En la cromatografía sobre papel, se da el fenómeno de adsorción. Se utiliza el

papel filtro como soporte de la fase fija (que puede ser normalmente el agua que contiene en un 22% u otro líquido con el que se ha impregnado el papel). Y la fase móvil es (1-propanol-butanona-agua). La relación de frente respecto al azul de metileno fue de 2,2/8; y la relación de frente de la mezcla fue de 2,6/8.

5. Bibliografía

• Lederer E. y Lederer M. Cromatografía: Revisión de sus principios y

aplicaciones. Editorial EL ATENEO. Buenos Aires. Argentina. • Harris D.C., Análisis Químico Cuantitativo, 2° edición. Editorial Reverté.

España. 2001 • Campbell N., Mitchell L. y Reece J., Biología conceptos y relaciones. 3°

edición. Editorial Prentice Hall. México.

CUESTIONARIO 1

1.- ¿Cuál es la principal utilidad de la cromatografía en columna? La importancia de esta técnica radica en: Podemos separar mezclas, por adsorción, partición y separación iónica. Además esta técnica se realiza en forma descendente

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2.- ¿Qué fenómenos físicos intervienen en una columna cromatografía que utiliza silica gel como fase fija?

• Adsorción • Desorción • Dilución • Solubilidad

3.- ¿Cuáles son las principales diferencias entre el HPCL y una columna cromatografía simple?

• La cromatografía HPLC es más eficiente y de resolución que la de columna simple. • En la cromatografía de columna simple se pude separar mezclas por adsorción,

reparto, intercambió iónico. • En cromatografía HPLC se pude usar distintos tipos de relleno de la columna: • Adsorbentes de distinto grado de polaridad materiales no polares, resinas de

intercambio iónicos soportes de selección por tamaño molecular y otros materiales especiales.

• Además la cromatografía HPLC puede ser automatizada, pero esta implica un costo muy elevado.

4.- ¿Cuál es el principal factor que hace que la HPLC sea mucho más eficiente que una columna cromatografía simple? La eficiencia de la columna cromatografía HPLC se debe a que la fase estacionaria está formada por partículas esféricas muy pequeñas y de tamaño uniforma. Así, se usan a menudo micro esferas con un tamaño de 5 a 10 micrones 5.- Estamos operando una columna cromatografía usando como absorbente silica gel y casi todos los compuestos se han eluido, excepto un compuesto que no es eluido con este solvente ¿Qué cambios introducirá para poder eluirlo? Si el solvente elegido no consigue eluir todas las sustancias de la mezcla es recomendable agregar 2 ó 3 gotas de solventes de distinta polaridad, que resultan ser más eficientes que solventes puros.

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6.- ¿Como se puede trabajar con sustancias incoloras en una columna cromatografía, sino es posible localizar las sustancia dentro de la columna? Podemos realizar el análisis del eluato por cromatografía en capa fina o sobre papel, por lo que se hace necesario el uso de un revelador para la localización de las sustancias. 7.- ¿que tipo de cromatografía utilizara para eliminar sales minerales que están contaminando una muestra de cafeína? Usaremos la cromatografía de intercambio iónico.

8 - ¿Que es un colector de fracciones y cuál es su principal utilidad?

Es un instrumento que se usa para el análisis del eluato al final de la cromatografía. El colector de fracciones nos permite un alto grado de automatización de nuestro sistema de separación cromatografía, aumentando la precisión, el rendimiento así como la comodidad de funcionamiento.

9 - ¿Qué diferencias encuentra usted entre la cromatografía de gases y la cromatografía en columna? Una de las diferencias seria que la cromatografía en columna se hace con fase fija en estado solidó o líquido a cambio la cromatografía de gases se realiza con fase fija necesariamente tiene que ser un gas. Además la cromatografía en gases se realiza ah una temperatura superior a la del medio ambiente.

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10 - ¿Que son las resinas de intercambio iónico y cuál es su utilidad?

Son sustancias insolubles con un alto peso molecular que tienen grupos iónicos en su molécula que pueden ser intercambiados cuando están en una solución que tenga sales. Al entrar en contacto con la solución cambia su ion (H+) por un catión de la solución y su (OH-) por un anión de la solución.

CUESTIONARIO 2

1. ¿Qué entiende Por Rx? Las reacciones son procesos por los cuales una o más sustancias se transforman en otras cuyas propiedades son diferentes. Para que exista una reacción debe existir una sustancia que reacciona y otra que se transforma.

Generalmente, se puede decir que ha ocurrido una reacción si se observa que al interactuar los "supuestos" reaccionantes se da la formación de un precipitado, algún cambio de temperatura, formación de algún gas, cambio de olor o cambio de color durante la reacción.

2. ¿Cuáles son las diferencias entre la c.c.f. y la de papel?

Cromatografía en Capa fina Cromatografía en Papel Uso de portaobjeto Uso de papel filtro Cámara de desarrollo Tubo de ensayo Uso de silicagel + Cloroformo Solo uso de las muestras

3. Cite algunas aplicaciones de la cromatografía en su especialidad La cromatografía es un método que sirve para hacer análisis cualitativos de tierras y compostas y que puede ser realizado en cualquier lugar a bajo costo y de forma rápida.

Separación de pigmentos vegetales mediante cromatografía en papel. 4. Interprete los valores de Rf 0.05; 0.6 y 0.98

Rf: 0.05 = La distancia recorrida por la sustancia es la 20ava parte de la distancia recorrida del solvente.

Rf 0.6 = La diferencia de las distancias recorridas entre las sustancia y el disolvente es mínima y cercana.

Rf 0.98 = La distancia recorrida por la sustancia es cercana a la del disolvente.

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5. Introduciría algún cambio cuando se tiene un Rf. de 0.05, ¿por qué?

Al tener un Rf de 0.05 no introduciría ningún cambio, ya que la distancia entra la sustancia y el disolvente es amplio y así podríamos identificar mejor la muestra.

6. Explique algún método para localizar las bandas de adsorción cuando se trabaja con sustancias incoloras en una columna. PRIMER METODO: Adición de indicadores coloreados Graff y Skau han coloreado una columna de magnesia pesada con rojo de fenol, como método para seguir la separación de mezclas de ácidos grasos de la cadena larga. Criddle y Le Tourneau describieron un método con un indicador fluorescente para la determinación de hidrocarburos en el petróleo; la muestra que contiene trazas de colorantes fluorescentes, se cromatografía sobre silicagel, con alcohol como agente deslizante. Los componentes de la muestra se disponen en la columna según su adsorbilidad, primero las parafinas, después las olefinas, a continuación las aromáticas y, finalmente los alcohólicos. Los límites entre las zonas se visualizan con luz ultravioleta por los colorantes fluorescentes, y la composición de la muestra ser establecida midiendo las zonas cuya longitud es proporcional a la concentración de los componentes de la muestra. SEGUDO METODO: Técnica de la franja Este método, propuesto por Zechmeister, consiste en pintar una franja delgada de un reactivo adecuado, con un pincel, a lo largo de la columna después de que ha sido extraída del tubo. Bell demostró la posición la posición de los azucares metilados sobre una columna de silicagel, aplicando una solución alcohólica de naftol seguida por acido sulfúrico concentrado (reacción de Molisch).

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7. ¿Qué es la “electroforesis” y cuál es su principal aplicación en los compuestos biológicos?

La electroforesis es la migración de iones existentes en una disolución por acción de un campo eléctrico. Los cationes se mueven hacia el cátodo y los aniones hacia el ánodo.

A. Electroforesis capilar: separación de una mezcla en sus componentes usando

un campo eléctrico intenso, impuesto entre los dos extremos de un tubo capilar estrecho lleno de la disolución de electrolito.

B. Electroforesis capilar de gel: forma de electroforesis capilar en la que el tubo se llena con un gel de un polímero, que sirve como tamiz de macromoléculas. Las macromoléculas más grandes migran más lentamente a través del gel.

Aplicación en la Biología: la electroforesis se usa:

• Para hallar el numero relativo de aminoácidos en la proteína. • Se usa para separar físicamente macromoléculas, proteína o ácidos

nucleícos; sobre la base de su carga eléctrica y tamaño. • La electroforesis en gel separa las macromoléculas de ADN por tamaño,

resultando una serie de bandas en cada fila del gel. Cada banda consiste en moléculas de ADN de un tamaño determinado. A menos que usted tenga un gemelo idéntico, su ADN es diferenciable del de cualquier otra persona; nuestra secuencia total de nucleótidos es única.

• Los genetistas podrían identificar rasgos singulares de la secuencia de ADN y rasgos particulares de la secuencia de ADN que comparten los miembros de una familia.

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