CROMATOGRAFÍA

LÍQUIDOSLÍQUIDOS

PLANAR COLUMNA COLUMNA

IEC IEC SEC SEC

FLUIDO SUPERCRÍTICO

BPC BPC

TLC PC

GASES

GSC GLC

LSC LSC

BPC-NP GPC GFC BPC-RP

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDO-SÓLIDO (LSC)

• Principio: Adsorción de los analitos en la superficie polar, ligeramente ácida de la sílicagel.

• F.E.: Sílica gel (pH 2-8); Alúmina (pH 2-12).• F.M.: Disolventes no-polares como hexano,

CHCl3 (en raras ocasiones agua).• Aplicaciones: Para muestras no-polares y

semi-polares; solubles en hexano; isómeros posicionales.

CROMATOGRAFÍA DE FASE QUÍMICAMENTE UNIDA (BPC)

• Ambas fase normal (F.N.) y fase reversa (F.R.)• Principio: F.R. – Estructura hidrofóbica

responsable de la partición del analito entre la superficie hidrofóbica y metanol (no agua).

• F.E.: Superficies hidrofóbicas en sílica gel -RP-18, RP-8, ODS.

• F.M.: Metanol o acetonitrilo y agua.• Aplicaciones: Compuestos solubles en agua o

metanol, proteínas, péptidos, azúcares, ácidos grasos, fármacos.

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO (IEC)

• Principio: Adsorción reversible de iones en F.E. Con grupos funcionales de cargas opuestas.

• F.E.: Para cationes - SO32- , CO3

2-

• Para aniones - NH4+, NH3

+

• F.M.: Buffer acuoso con pH y fuerza de buffer cuidadosamente controlados.

• Aplicaciones: Todos los compuestos ionizados, aniones, cationes, azúcares, ácidos carboxílicos, aminas, etc.

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN (GPC)

• Principio: Los poros internos de la F.E. excluyen a los analitos solvatados en función de su volumen hidrodinámico. VR se correlaciona con P.M. por calibración.

• F.E.: Estireno, 8% DVB-con diámetros de poro de 80, 100, 150, 300, 500 o 1000 Ao.

• F.M.: Un buen disolvente de polímeros, las mas de las veces Tolueno o THF.

• Aplicaciones: Polímeros orgánicos, poliestirenos, polietilenos, metacrilatos.

HPLC COLUMNA

FASES ESTACIONARIAS Sílica gel - LSCRP-18 - BPCStyragel - SEC

FASE MÓVIL

FASE ESTACIONARIA

COLUMNA CROMATOGRÁFICA: ESQUEMA

Flujo por gravedadSin presión

Muestra

Adsorbente

Columnavidrio

Solvente

Componentesde la muestraseparados

A B

COLUMNA CROMATOGRÁFICA

VENTAJAS LIMITACIONES

• Barato • Lento

• Simple • Baja Resolución

• Buen Método Prep. • Cuantitativo difícil

CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA PRESIÓN: ESQUEMA

Reservoriode disolvente

Bomba

Medidor de presiónInyector

Columna Detector

Desecho

Registrador

Sistema de Datoso Integrador

UN CROMATOGRAMA TÍPICO

.Tiempo de retención (tr)R )

Área de picoAlturade pico

“pico” delsolvente

Inyección

Res

pues

ta d

el d

etec

tor

Línea Base

Tiempo

• Velocidad - Minutos

• Alta resolución

• Alta precisión

• Alta sensibilidad : 10-9 a 10-12 g

• Sistemas automatizados

VENTAJAS DE HPLC

ANÁLISIS DE PPB DE AFLATOXINAS

Aflatoxinas en mantequilla de maní;Detección por fluorescencia

1. Aflatoxina B1 5 ppb2. Aflatoxina G 1 1 ppb3. Aflatoxina B2 3 ppb

4. Aflatoxina G 2 1 ppb

1

243

0 10 20 30 minutos

ANÁLISIS RÁPIDOS POR HPLC

•

0 5 10

(PARTÍCULAS PEQUEÑAS, COLUMNAS CORTAS, FLUJO ALTO)

COLUMNA : 3 cm3M ODS

FLUJO : 3.5 ml / min

URACILO

FENOLNITROBENCENO

TIEMPO ( SEG )

HPLC DE ALTA RESOLUCIÓN

ORINA HUMANA1 columna, eluciónpor pasos, 65.5 hrs

SEPARATION OF URINE BY ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHYReprinted by permission of Dr. P.B.Hamilton(Handbook of Biochemistry, Selected Data for Molecular Biology, B-47, CRC Press, Cleveland, 1968)

LC ALTA RESOLUCIÓN, RÁPIDA

"HPLC of Naturally Occuring Xanthones", K. Hostetman & H.M. McNair,J. Chromatogr,. 116 (1976) 201.

N = 3200L = 250 mmH = 0.078 mmRS = 4

0 1 2 3 4 5Time [min]

12

3

O

O

MeO

OMe OMe

OMe

O

O

MeO

OMe

OMe

O

O

MeO

OMe OMe

OMe

OMe

1

2

3

• Instrumentación Costosa• Requiere Capacitación: 6-12 meses• No existen detectores universales /sensibles• Consumibles caros• Requiere de espectroscopias para confirmación

LIMITACIONES DE HPLC

.

VERSATILIDAD DE HPLC

A M I N AS

DROGAS

PE STICIDASVITA MINAS

NU CL EOT ID OESTEROIDES

ÁCID

OS G

RASO

S

A M I N O A C I D S

FL A VO NO ID ES

FSAB

ORE

S

P O L I M E R OS

AZÚCARESP R O T E IN S

CERAS

ADITIVOS

HIDROCARBUROS

AN TI -O XIDA NTSP L A S T IC IZ E R S

VENTAJAS DE HPLC• RÁPIDA – Usa partículas pequeñas y columnas

cortas.• ALTA RESOLUCIÓN – N alta, muchas formas de

aumentar , muchos tipos de columnas.• VERSÁTIL – ¡si la muestra se puede disolver, se

puede separar por HPLC! BUENOS ANÁLISIS CUANTITATIVOS – ~1 - 2% RSD• FÁCIL DE ESCALAR – columnas gruesas, muestras

mas grandes y colectores de fracciones.

VENTAJAS DE CG

• MAS ALTA RESOLUCIÓN – Columnas capilaresN=400,000.

• RÁPIDA, CUANTITATIVA y FÁCIL DE USAR.• COSTO MODERADO - ~$15K – probablemente

el método instrumental mas empleado.• BUENA SENSIBILIDAD – Análisis de trazas.• NO MUY VERSÁTIL – Sólo volátiles.

ANÁLISIS CUALITATIVO (1)

• Técnicas auxiliares (MS, IR, UV-VIS, NMR) permiten una identificación positiva

Tiempo de retención (tr)

Inyección

Tiempo

Seña

li

Cafeina

Teofillina Teobromina

"X"

ANÁLISIS CUALITATIVO (2)

1. Estándar

2. Desconocido

tR(teofilina) = tR(“X”), entonces se sugiere que “X” es teofilina.Para una identificación absoluta se requiere de confirmación por, LC-MS

LC / ESPECTRÓMETRO DE MASASEspectrómetro de masas

Sistema de datos

Espectro de masasMuestra enriquecida

AlVacio

Solvente

Muestra

Efluente de LC

ANÁLISIS CUANTITATIVOSe

ñal

Tiempo

Área depico : Apico: h

Altura de

SÍNTESIS DE EMPAQUES

• La formación de un enlace covalente entre la sílice y la fase proporciona estabilidad térmica y previene la hidrólisis.

Si OH Si O Si

OH

OH

C18

Si C18

H2O

Cl3+ 3 HCl

Partícula de soporte de sílicaEnlace covalente

HPLC con FQU (BPC)

• FASE NORMAL

• Adsorbentes polares: -CN, -NH

• Solventes no-polares: iso-octano, cloruro de metileno

• Muestras no-polares y semipolares

• FASE REVERSA

• Adsorbentes no-polares: RP-18 (ODS), RP-8 (Octil)

• Solventes polares: agua, metanol, acetonitrilo

• Muestras tanto polares como no-polares

EMPAQUES PARA HPLC (1)

REVERSED-PHASE (AND ION-PAIR) METHOD a

C-18 (octadecyl or ODS) Rugged; highly retentive; widely available

C-8 (octyl-) Similar to, but slightly less retentive, than C-18

C-3, C-4 Less retentive; used mostly for peptides and proteins

C-1 (trimethyl-silyl, TMS) Least retentive; least stable

Phenyl Moderately retentive; some selectivity differences

CN (cyano) Moderately retentive; used for both reversed- and normal-phase

NH2-(amino) Weak retention; used for carbohydrates; less stable

Polystyrene b Stable with 1 < pH < 13 mobile phases;better peak shape and longer column life for some separations

NORMAL-PHASE METHOD a

CCN- (cyano) Rugged; fairly polar; general utility

OH- (diol) More polar than CN-

NH2- (amino) Highly polar; less stable

Silica b Very rugged; cheap; less convenient to operate; used in prep LC

EMPAQUES PARA HPLC (2)

SIZE-EXCLUSION METHOD a

Silicab Very rugged; adsorptive

Silanized silica Less adsorptive, wide solvent compatibility;with organic solvents

OH- (diol) Less stable; used in aqueous SEC (gel filtration)

Polystyreneb Used widely for organic SEC (GPC); incompatible with highly polar solvents

ION-EXCHANGE METHOD a

Bonded-phase Less stable and reproducible

Polystyreneb Less efficient; stable; more reproducible

aSilica-based bonded phases, except as noted.bNo bonded phase on these packings.

L.S. Snyder, J.L. Glajch and J.J. Kirkland, "Practical HPLC Method Development" ,J. Wiley (1988) 80-105.

Inyección

tM

t'R(A)

tR(A)

t'R(B)

tR(B)

Pico de unsoluto no retenido

Soluto A Soluto B

t

TIEMPO

PARÁMETROS DE RETENCIÓN

t'R(A) = tR(A) - tM

K´(A) = t'R(A) / tM

t = tR(B) - tR(A)

Inyección

tM

t'R

tR

W h

Wb

PARÁMETROS DE EFICIENCIA

• Platos teóricos :

• Altura de plato :

HETP H Lc

N

N 16 tR

wb

2

5.545 tR

wh

2

Inyección

tMt'R(A)

t'R(B)

Soluto A Soluto B

TIEMPO

SELECTIVIDAD EN HPLC

• mayor de 1.2 es el valor aceptable

=t’R(B)

t’R(A)

kR(B)

kR(A)

=

FACTOR DE RETENCIÓNFACTOR DE CAPACIDAD k´ = t´R / tO

o 1 2 3 4

t =10 t' =1R

k´ = 2 k´ = 3

Solvente

Tiempo (min)• k´ en el intervalo de 2 a 10• Nota: k´ Inversamente proporcional • a la fuerza del solvente

k´ = 1

EFICIENCIA vs SELECTIVIDAD

REFERENCIA

EFICIENCIA INCREMENTADA (>N)MISMA SELECTIVIDAD (

SELECTIVIDAD INCREMENTADA (>)MISMA EFICIENCIA (N)

RESOLUCIÓN:CAPACIDAD, SELECTIVIDAD Y EFICIENCIA

t

Wb(1) Wb(2)

RS t

12 Wb(1) Wb(2)

Wb Wb

ECUACIÓN MAESTRA DE LA RESOLUCIÓN

• LA RESOLUCIÓN (RS) ES UNA FUNCIÓN DE TRES FACTORES

CAPACIDAD SELECTIVIDAD EFICIENCIA

41

'1' Nk

ksR