Universidad Autónoma de San Luís Potosí

Facultad de Ciencias

Diseño y Construcción de un Sistema Portátil de Espectroscopia Raman para Diagnostico Médico No-Invasivo

Avance de tesis que presenta: Fernando Sebastián Chiwo González

Para obtener el grado de:

Maestro en Ingeniería Electrónica

Bajo la dirección de: Dr. Francisco Javier González Contreras

San Luis Potosí, S.L.P

   

   

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 En  este  segundo  avance  de   tesis   se   realiza  una  descripción  acerca  de   la   instrumentación  electrónica  y  de  las  técnicas  ópticas  utilizadas  para  el  diseño  y  la  construcción  del  sistema  de  espectroscopia  Raman.  También  se    hace  una  revisión  a  las  mediciones  y  al  análisis  de  datos   obtenidos.   Por   último,   en   este   avance   se   revisa   el   calendario   de   actividades  propuesto  en  el  anterior  avance  y  se  propone  un  trabajo  a  futuro.  

1. INTRODUCCIÓN

1.1 Espectroscopia Raman. Cuando un haz de luz incide sobre una superficie se pueden producir distintos modos de interacción : refracción, reflexión, absorción, dispersión o esparcimiento (scattering) del haz incidente1, como se muestra en la Fig.1.

Fig.1 Distintos modos de la interacción entre la luz y la materia1.

El esparcimiento de luz se define como un re-direccionamiento del haz de luz incidente Existen dos tipos de esparcimiento: el elástico y el inelástico. En el esparcimiento elástico la frecuencia (longitud de onda) del haz esparcido es igual a la del haz incidente, a este tipo de esparcimiento también se le conoce como Esparcimiento Rayleigh. Sin embargo, aproximadamente 1 de cada 10! de los fotones esparcidos presentan un corrimiento en frecuencia (longitud de onda) debido a la ganancia/pérdida en su energía2. Estos corrimientos en frecuencia son originados por las colisiones inelásticas entre los fotones incidentes y las moléculas de la muestra. A este tipo de esparcimiento se le conoce como Esparcimiento Raman y puede ser de dos tipos: Stokes (menor frecuencia) y Anti-Stokes (mayor frecuencia). A estos corrimientos en frecuencia se les conoce como corrimientos

   

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Raman y proporcionan información detallada única para cada molécula. En la Fig.2 se observa el proceso de esparcimiento.

Fig.2 Un haz de luz con frecuencia 𝑣! incide sobre una muestra, originando un

esparcimiento Rayleigh (que tiene la misma frecuencia que el haz incidente) y un esparcimiento Raman (con corrimientos en frecuencia)3.

Dicha información es representada en una gráfica conocida como espectro Raman, el cual muestra la intensidad de esparcimiento en función de la diferencia en frecuencia entre el haz de luz incidente y los esparcimientos de luz. Un espectro Raman típico se muestra en la Figura 3.

Fig.3 Un espectro Raman consiste en una serie de picos que proporcionan información detallada de la composición química de la muestra que se esta

analizando3. 1.2 Ventajas del uso de la Espectroscopia Raman como Diagnostico Médico

No-Invasivo.

   

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La espectroscopia Raman presenta la ventaja de ser una técnica no-invasiva para el diagnóstico médico ya que utiliza fuentes de luz con radiación no-ionizante, es decir, se utilizan fuentes de luz monocromáticas (laser) con una longitud de onda que al interactuar con el tejido humano no se produzca absorción, por lo tanto el tejido es “transparente” a la luz. A esta propiedad se le conoce como Ventana Terapéutica y esta en el rango de los 700− 1200𝑛𝑚. La selección de la longitud de onda dependerá de la aplicación que se requiera, por lo general para aplicaciones biológicas s utiliza un láser en el rango del Cercano Infrarrojo (NIR, por sus siglas en inglés, Near Infra Red)2. Otra gran ventaja que presenta la espectroscopia Raman es que no requiere una preparación previa de la muestra, y el análisis puede realizarse In Vivo d(directamente sobre el tejido humano). Con estas propiedades es posible realizar una biopsia óptica no-invasiva y casi en tiempo real, además de proporcionar un diagnóstico individualizado y así evitar falsos positivos y negativos en el diagnóstico4. 1.3 Instrumentación requerida para un Sistema de Espectroscopia Raman. Un sistema básico de espectroscopia Raman consta de las siguientes componentes2 (Fig.4):

1) Fuente de iluminación. 2) Suministro de luz. 3) Sonda Raman. 4) Colector de la señal Raman. 5) Detector y procesado de la señal.

Fig.4 Diagrama esquemático de un sistema de espectroscopia Raman.

   

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2.MOTIVACIÓN

Actualmente los sistemas de espectroscopia Raman para diagnostico médico no-invasivo no han sido aceptados en su totalidad por el personal médico debido las grandes dimensiones y elevados costos de los sistemas de espectroscopia. En la Fig.5 se muestran ejemplos de sistemas de espectroscopia comerciales.

Fig.5 Sistemas de espectroscopia comerciales.

También tiene que ser tomado en cuenta que desde hace varios años y hasta la fecha las herramientas de diagnostico médico invasivo, como la biopsia, han sido adoptadas como estándares en el área de diagnostico médico. De ser utilizada, la espectroscopia Raman promete resultados mas confiables y rápidos, además si se cuenta con un sistema portátil y de bajo costo, su utilidad incrementaría considerablemente, ya que no estaría destinado para uso exclusivo en ambientes hospitalarios.

3.OBJETIVO

3.1 Objetivo General. En este proyecto de tesis se propone el diseño y la construcción de un sistema de espectroscopia Raman basado en fibras ópticas portátil y de bajo costo para análisis in vivo siguiendo el diagrama esquemático propuesto en la Fig.4 utilizando componentes comerciales y empleando técnicas ópticas para su calibración. 3.2 Objetivo Especifico.

   

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La aplicación principal del sistema Raman será para realizar mediciones in vivo de tejido de piel, en particular de la Filagrina (FLG), que es una proteína clave requerida para la formación de la barrera del estrato corneo. Las mutaciones en la FLG se han reportado como un factor predisponente para el desarrollo de dermatitis atópica (AD por sus siglas en ingles Athopic Dermatitis ó eczema, Figura 6), ahora considerada como una enfermedad basada en un defecto genético primario en la barrera epitelial5.

Fig.6 Dermatitis atópica en un paciente pediatrico. Imagen obtenida de la

Academia Americana de Dermatología (AAD).

4.METODOLOGÍA

4.1 Métodos y Materiales. Siguiendo el diagrama esquemático propuesto se utilizo el siguiente material:

1) Diodo laser Thorlabs LP785-SF-100 de 785nm y 100mW acoplado a una fibra óptica mono modal como fuente de iluminación.

2) Sonda bifurcada Ocean Optics R200-7-VIS-NIR multi modal como suministro de luz.

3) Colimador/Acoplador a fibra Thorlabs PAF-SMA-5-B, filtro Notch de 785nm Thorlabs NF 785-33 y cable de fibra óptica Ocean Optics P200-1-VIS-NIR para la caracterización de la sonda Raman.

4) Espectrómetro Ocean Optics USB4000-VIS-NIR como colector de la señal Raman.

5) Software Ocean Optics Spectra Suite para la adquisición y procesado de la señal.

4.2 Instrumentación Electrónica. 4.2.1 Driver de Corriente Constante y Diodo Laser.

   

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En el presente estado del arte, los sistemas portátiles Raman utilizan un diodo laser en el rango del NIR operando en modo de onda continua a través de una fuente de corriente constante como fuente de excitación6. El modo de operación en onda continua (CW por sus siglas en inglés Continuous Wave) significa que el laser debe de estar siendo pulsado continuamente, esto para que la emisión de luz también sea de forma constante. La fuente de corriente constante, a pesar de ser conceptualmente sencilla, involucra una gran variedad de elementos electrónicos, lo que presenta el primer problema en la parte de diseño del espectrómetro7. Para esta parte del diseño se selecciono el driver universal de corriente constante Thorlabs IP500, debido a su bajo costo, alto rendimiento de operación en modo CW y sencillo uso (Fig.7). Este driver solo requiere una fuente de voltaje regulada de ±5𝑣 a 1𝐴 como componente adicional. Para dicha fuente se emplearon los reguladores 𝐿𝑀7805 para la fuente positiva, y el 𝐿𝑀7905 para la fuente negativa.

Fig.7 Driver de corriente constante Thorlabs IP500.

Las características del diodo laser utilizado se muestran en la Tabla 1, mientras que la relación potencia/corriente se muestra en la Fig.8: Valores Típicos Valores Máximos Longitud de Onda 786.8nm 310mW Potencia de Salida 100mW 200mW Corriente de Operación 286.6mA 310mA Voltaje de Operación 1.98V 2V Corriente de Retención 83.5mA 100mW

   

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Eficiencia de Curva 0.51W/A Temperatura 25ºC 55ºC

Tabla 1 Características del Diodo Laser.

Fig.8 Relación Potencia-Corriente del Diodo Laser.

Con esta información se configuro el driver IP500 en modo CW ajustando la corriente suministrada de 0 a 270mA (90mW aproximadamente) utilizando la relación del driver 1𝑉 = 1𝐴. Para verificar el correcto funcionamiento del diodo laser y del IP500 se utilizo un detector infrarrojo Newport Power Meter 1918-C (Figs.9, 10 y 11 respectivamente).

Fig.9 Detección utilizando el Newport Power Meter 1918-C.

   

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Fig.10 De izquierda a derecha Test Point del driver IP500 para la detección de la

corriente suministrada al diodo laser, se utiliza la relación 1V=1A y lectura de voltaje-corriente, en este caso se obtuvo como lectura 150mV, es decir, se

suministro una corriente de 150mA.

Fig.11 Potencia obtenida. Si se analiza la Fig.8, al suministrar 150mA se obtienen

alrededor de 30mW.

   

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4.3 Instrumentación Óptica. 4.3.1 Fibras Ópticas para el Suministro de Luz. Los láseres son la fuente ideal de iluminación para la espectroscopia Raman, debido a que son una fuente monocromática (luz con una sola longitud de onda) y alcanzan altas potencias (alrededor de los cientos de mili watts). La elección de la longitud de onda depende de la aplicación. En el caso del tejido biológico, se utiliza un laser de longitud de onda en el cercano infrarrojo (ó NIR, por sus siglas en ingles Near Infra-Red) debido a que este tipo de longitudes de onda puede penetrar el tejido biológico debido a la llamada ventana médica que va de los 700− 1200𝑛𝑚, donde la absorción en el tejido humano es muy baja, y por lo tanto, el tejido es transparente a la luz2. En la espectroscopia Raman se utiliza una fibra óptica especial llamada sonda Raman, esta consiste en un manojo de fibras donde usualmente la fibra que esta en el centro es la mayor dimensión y es la que transmite la luz proveniente de la fuente de iluminación y las mas pequeñas localizadas en los extremos, son las que transmiten los esparcimientos de luz2. En la Fig. 12 se observa un ejemplo de una sonda Raman.

Fig.12 Configuración de una sonda Raman2.

Debido a que el esparcimiento puede ser de dos tipos (Rayleigh y Raman), una sonda Raman típica debe tener una etapa de filtrado en la parte colectora de la fibra. Se utiliza un filtro Notch de la misma longitud de onda que el laser para filtrar el esparcimiento Rayleigh y solamente colectar el esparcimiento Raman.

   

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Como suministro de luz se utilizo una sonda bifurcada Ocean Optics R200-7-VIS-NIR para la parte de suministro de luz y un cable de fibra óptica P200-1-VIS-NIR para el acoplamiento a la fibra óptica. Ambas fibras son multi modales y tienen una apertura numérica de 0.22 y tienen el mismo diámetro de núcleo para reducir pérdidas en la transmisión. Este tipo de fibras ópticas trabajan bajo el principio de Reflexión Total Interna8, cuando la luz pasa de un material a otro su dirección cambia. Esta nueva dirección depende de un ángulo crítico, que de acuerdo a la ley de Snell, puede ser derivado utilizando los índices refractivos de dos materiales:

𝑛𝑠𝑖𝑛𝜃!"# = 𝑛!! − 𝑛!!  

donde 𝑛! y 𝑛! son los índices refractivos del núcleo y del recubrimiento de la fibra respectivamente y 𝑛 es el índice refractivo del medio. 4.3.2 Colimación, Filtrado y Acoplamiento a la Fibra Óptica. Debido a que en la espectroscopia Raman se tienen dos tipos de esparcimiento, es necesario suprimir el esparcimiento que tiene la misma frecuencia que el haz de luz incidente (Rayleigh), para esto es necesario hacer uso de un colimador para enfocar el haz de luz proveniente de la fibra óptica de forma perpendicular a un filtro Notch de la misma longitud de onda que el haz incidente, de esta forma solo se analizan los corrimientos en frecuencia del haz resultante. Posteriormente se tiene que volver a acoplar dicho haz resultante a la fibra óptica (Fig.13).

Fig.13 Colimación de un haz de luz proveniente de una fibra óptica. Para el acople

a la fibra óptica es el mismo proceso invertido. Para realizar este arreglo óptico se utilizo el componente PAF-SMA-5-B de Thorlabs, este elemento óptico es un colimador/acoplador con seis grados de libertad. Debido a que es un instrumento ajustable, se hizo una calibración utilizando el detector Newport Power Meter 1918-C a una potencia de salida aleatoria. Para el calibrado del colimador el proceso consistió en hacer el siguiente arreglo (Fig.14):

   

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Fig.14 Arreglo óptico para la calibración del colimador.

El proceso consistió primero en conectar el cable de fibra óptica al colimador (las conexiones de ambos componentes son SMA-95), posteriormente se realizo una medición de la potencia previa al colimador, y finalmente se coloco el detector a la salida del colimador para medir la potencia. Este es un proceso iterativo que requirió de múltiples ajustes para obtener la mayor potencia posible a la salida del colimador. El proceso del acoplamiento es inverso y también requiere del uso del detector (Fig.15):

Fig.15 Arreglo óptico para la calibración del acoplador.

En la Fig.16 se muestra el arreglo óptico final de la sonda Raman:

Fig.16 Arreglo óptico de la sonda Raman utilizando un colimador, un filtro Notch

de 785nm y un acoplador a la fibra óptica.

Diodo  Laser  

Fibra  Óptica  P200-­‐1-­‐VIS-­‐NIR  

Colimador   Detector  1918-­‐C  

Diodo  Laser   Acoplador  

Fibra  Óptica  P200-­‐1-­‐VIS-­‐NIR  

Detector  1918-­‐C  

   

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4.4 Detección, Procesado y Análisis de la Señal Raman. Antes de la invención de los láseres, la espectroscopia Raman era una técnica muy complicada de utilizar debido a la baja intensidad de la señal Raman9. En la actualidad los sistemas de detección Raman consisten de otro arreglo óptico hibrido mas complejo conocido como Espectrómetro, el cual cuenta con elementos ópticos y electrónicos (Fig.17):

Fig.17 Diagrama interno de un espectrómetro10.

El principio de operación de un espectrómetro es el siguiente: un haz de luz entra al espectrómetro a través de un slit (ranura) que posteriormente es dirigido de forma divergente hacia un colimador, donde el haz es enfocado hacia un grating (rejilla), que separa el haz incidente en sus componentes espectrales. Finalmente, el grating direcciona los componentes espectrales hacia un CCD (por sus siglas en inglés, Charged Coupled Device), el cual es un arreglo de detectores sensibles a distintas longitudes de onda, al percibir una señal produce una señal eléctrica, con la cual es posible realizar una cuantización adecuada de la señal Raman. Para el sistema de espectroscopia propuesto, se utilizo un espectrómetro modular Ocean Optics USB4000-VIS-NIR, cuyas características se muestran en la Tabla 2: Rango de Longitud de Onda 350-1000nm Tiempo de Integración 3.8ms-10s SNR 300:1 Grating 600 lineas/mm Slit 25um

   

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Resolución Óptica 1.5-2.3 FWHM Número de Detectores 3648

Tabla 2 Características del espectrometro USB4000-VIS-NIR.

Para el diseño de un espectrometro Raman se deben tomar en cuenta las siguientes consideraciones para obtener una mayor resolución en la señal:

a) Entre mayor sea el grating, mayor será la resolución de la señal, pero menor sera el rango espectral.

b) Entre menor sea el slit, mayor será la resolución de la señal, pero menor sera el rango espectral.

Con estas consideraciones es posible realizar el diseño del espectrometro Raman y la derivación de sus parametros reales. Los datos obtenidos se muestran en la Tabla 3:

Resolución del Pixél 7.5 pixel Dispersión 0.189nm/pixel

Resolución Óptica 1.42nm Blazing 500nm

Resolución Espectral 46𝑐𝑚!!

Tabla 3 Parametros reales del espectrometro Raman diseñado.

Como primeras pruebas, se realizaron mediciones en materiales semiconductores sin filtrado. En la Fig.17 se observa el espectro Raman obtenido de una muestra de Silicio.

   

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Fig. 17 Espectro Raman experimental del Silicio sin filtrar a 90 mW con un tiempo de integración de 1s y un promedio de 4 espectros. El Silicio presenta un pico en

aproximadamente 521𝑐𝑚!!. Se pueden observar los esparcimientos Stokes y Anti-Stokes.

Debido a la baja resolución obtenida, se realizo un ventaneo en la señal para obtener un resultado mas cuantizable, en la Fig.18 se muestra el resultado obtenido al hacer un filtrado utilizando el algoritmo Vancouver11 en el rango de 500-600𝑐𝑚!!

Fig.18 Espectro Raman del Silicio en el rango de 500-600𝑐𝑚!!.

   

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5. CONCLUSIÓN

Aunque se obtuvo una aproximación correcta, aun es complicado obtener un resultado que sea cuantizable para poder realizar una correlación con los equipos comerciales, esto en gran parte por los componentes de fabrica del espectrómetro y la configuración de la longitud de onda. En la Tabla 4 se realiza una comparación del espectrometro Raman propuesto contra espectrometros Raman comerciales:

Tabla 4 Comparación del espectrometro Raman propuesto contra espectrometros

Raman comerciales.

Es notable que el sistema aun esta en considerable desventaja en comparación con los sistemas comerciales, pero se ha llegado a la conclusión de que es posible obtener un sistema de espectroscopia Raman a bajo costo, ya que en el estado del arte, los dispositivos presentados aun presentan un elevado costo y una baja resolución. A este tipo de sistemas se les conoce como sistemas LRRS (por sus siglas en inglés, Low Resolution Raman Spectroscopy)12.

6. TRABAJO A FUTURO Y CALENDARIO DE ACTIVIDADES.

Como un trabajo a futuro esta la sustitución del espectrometro USB4000-VIS-NIR debido a su grating o en su defecto fabricar un espectrometro con todas las caracteristicas necesarias para la espectroscopia Raman y asi poder realizar un análisis cuantitativo.

   

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REFERENCIAS                                                                                                                  1  (Prasad, P. Introduction to Biophotonics, 2003)  2  (González, F.J. Noninvasive Detection of Filaggrin Molecules by Raman Spectroscopy. J.P. Thyssen, H. Maibach (eds.), Filaggrin, DOI 10.1007/978-3-642-54379-1_10, © Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2014)  3  (Ferraro JR, Nakamoto K, Brown C. Introductory Raman spectroscopy. 2nd ed. San Diego: Academic, 2003)  4  (Ramírez Elías, M.G. Uso de la Espectroscopía Raman como Método No-Invasivo en el Diagnóstico Médico: Tejido de Piel e Hígado, 2011)  5  (González, F.J.; Valdes-Rodríguez, R.; Ramírez-Elías, M.G.; Castillo-Martínez, C.; Saavedra-Alanis, V.M.and Moncada, B.; Noninvasive detection of filaggrin gene mutations using Raman spectroscopy.(170.0170) Medical optics and biotechnology; (170.1870) Dermatology; (170.5660) Raman spectroscopy. Optical Society of America, 2011)  6  (Gnyba, M.; Simulko, J.;Kwiatkowski, A; Wierzba, P.; Portable Raman Spectrometer-Design Rules and Applications, 2011)  7  (Jim Williams, Linear Technology Corporation, Current Sources for Fiber Optic Lasers A Compendium of Pleasant Current Events, 2002)  8  (Ocean Optics Fibers and Probes)  9  (Naglic, P. Raman spectroscopy for medical diagnostics. University of Ljubljana Faculty of Mathematics and Physics, 2012)  10  (Ocean Optics USB4000 Fiber Optic Spectrometer Installation and Operation Manual)  11  (Zhao, J.; Lui, H.; Mclean, D.I. and Zeng, H. Automated Autofluorescence Background Subtraction Algorithm for Biomedical Raman Spectroscopy Volume 61, Number 11, 0003-7028/07/6111-1225$2.00/0 Society for Applied Spectroscopy, 2007)  12  ( R. H. Clarke, S. Londhe, W. R. Premasiri and M. E. Womble, Low-Resolution Raman Spectroscopy: Instrumentation and Applications in Chemical Analysis, 1999)