ANTÍGENO “H” FLAGELAR DE SALMONELLA ENTÉRICA

UNIVESIDAD MICHOACANA DE SAN NICOLAS DE HIDALGO

FACULTAD DE QUIMICO FARMACOBIOLOGIA

Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae, formado por bacilos gramnegativos, anaerobios facultativos, con flagelos perítricos y que no desarrollan cápsula (excepto la especie S. typhi) ni esporas. Son bacterias móviles que producen H2S. Fermentan glucosa, pero no lactosa, y no producen ureasa. Tiene una estructura antigénica con tres tiposde antígenos:1. Antígeno somático (O)2. Antígeno flagelar (H) o (d)3. Antígeno capsular o de envoltura (Vi) o (K)(específico para Salmonella typhi, dublin, yparatyphi C)

INTRODUCCIÓN

FUNDAMENTO

ANTÍGENOS PARTICULADOS

AGLUTINACIÓN

Los principios son los mismos que en la precipitación, la diferencia radica en que en este caso el Ag no es soluble sino particulados.

La formación de las redes dará como consecuencia agregados en forma de grumos en el fondo del tubo. El Ag no se encuentra en solución sino en suspensión y al ser una partícula grande, se formen o no los agregados, sedimentará; la diferencia entre una reacción negativa, donde lo que vemos en el sedimento es sólo el Ag y una positiva, donde se forman los complejos, esta dada por la característica visual del sedimento que, en el primer caso será un botón homogéneo de células y en el segundo serán grumos.

SEMICUANTITATIVA

Esta técnica se realiza normalmente en microtubos o placas de fondo en U y consiste, al igual que en el caso de la precipitación, en colocar concentraciones constantes de uno de los reactivos en contacto con concentraciones variables del reactivo a determinar.

Las reacciones antígeno-anticuerpo tienen diversas consecuencias y existen varios tipos de reacciones:

Relación de Aglutinación

 En las reacciones de aglutinación, un anticuerpo puede unirse a la vez a dos antígenos, asimismo cada antígeno puede unirse a varios anticuerpos y formar un entramado de complejos antígeno-anticuerpo.

Recordemos que…

TÉCNICAS

AGLUTINACIÓN EN MICROPLACA

Sirve para determinar el titulo de anticuerpos.Todos los pocillos contienen una suspensión antigénica celular. En las diferentes filas(A-H) se han añadido volúmenes iguales de diluciones dobles seriadas del suero problema. Si existen anticuerpos suficientes como para aglutinar las células, el entramado cae al fondo del pocillo a modo de película.

NUMERO DE POCILLO DILUCION1 1:22 1:43 1:84 1:165 1:326 1:647 1:1288 1:2569 1:512

10 1:102411 Testigo antisuero12 Testigo antígeno

AGLUTINACIÓN EN TUBO

Es una prueba lenta, ya que luego de mezclar en el tubo la suspensión del antígeno con el suero, debe incubarse en estufa a 37°C durante 48 hrs.

CONSIDERAR QUE: todos los tubos tienen el mismo volumen de antígeno y que las diluciones del suero son: ½ ,1/4, 1/8, 1/16…1/1024. Si se observa un aglutinado en el fondo del tubo y liquido claro es una reacción negativa.

METODOLOGÍA

PREPARACIÓN DEL ANTÍGENO FLAGELAR

* Inocular 100 ml de caldo de soya tripticasa con la cepa de Salmonella entérica incubar (37°C / 18-24 hrs.)

*Agregar formaldehido a una concentración final del 0.3%. (T°Amb. 24-48 hrs.)

*Cosechar el cultivo por centrifugación a 3000 rpm/ 30 min.

PREPARACIÓN DEL ANTÍGENO FLAGELAR

*Desechar sobrenadante y resuspender el sedimento bacteriano en sol. Salina formalinizada al 0.3% (igualar la turbidez con el tubo No.3 del nefelómetro de Mcfarland).

*Probar la esterilidad del producto biológico. (Sembrar en caldo de soya tripticasa). Incubar a 37°C /24 hrs.

*En vasar la suspensión en un frasco ámpula esteril y mantenerlo en refrigeración.

OBTENCIÓN DEL SUERO TESTIGO

INMUNIZACIÓN DEL CONEJO

Se realiza en las venas, las cuales están representadas en el borde exterior de la oreja del conejo, se tiene varias opciones para poder inocularlo.

Aplicación Dias Fecha Dosis 1 0 5/10/2010 0.5 ml2 4 10/10/2010 1 ml3 8 14/10/2010 2 ml4 12 18/10/2010 3 ml5 16 27/10/2010 3 ml Sangrado 18 3/11/2010 10 ml

OBTENCIÓN DEL ANTISUERO

*Obtener de 10 a 50 ml de sangre del corazón

*Separar suero (centrifugar a 3000rpm/10´).

*Utilizar el antisuero para realizar la titulación correspondiente

OBSERVACIONES Y RESULTADOS

REACCIONES DE AGLUTINACIÓN EN TUBO

DILUCION1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:102

4TESTIGOantisuero

Testigo antigeno

SOLN. SALINA

0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml

ANTISUERO

0.2ml 0.2 ag bact

Incubar a 37ºC por 24 hrs. Y refrigerar por otras 24 hrs masReportar el titulo de suero hasta el ultimo tubo que se forme la malla en el fondo. los títulos mayores a 1:64 se consideran representativos.

SE OBTIENE….

TUBO 1 TUBO2

AGLUTINACIÓN EN MICROPLACA

SE REALIZA EL MISMO PROCEDIMIENTO, SÓLO CAMBIA LA CANTIDAD: 50 MICROLITROS.

MICROPLACA

• http://books.google.com.mx/books?id=MfW3TuHLa4gC&pg=PA226-IA15&lpg=PA226-IA15&dq=aglutinacion+en+microplaca&source=bl&ots=4m69MJRSyG&sig=PcNlDVsc19Zqulvu1mtfzhc5DUo&hl=es&ei=7cDmTM3aH5K24Ab5pt34Ag&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=3&sqi=2&ved=0CCYQ6AEwAg#v=onepage&q&f=false

• http://www.revistaapi.com/2%20edicao%202006/pdfs/mat%2006.pdf

• http://www.salonhogar.com/ciencias/organismos/inmunidad.html

REFERENCIAS

PRESENTARON:

CICLO ESCOLAR AGOSTO 2010-FEBRERO 2011

GUTIERREZ FRAZCO ELVIA MARIAMADRIGAL BEDOLLA SELENE YUNUÉNMALDONADO CIANCA PAULINAOCAMPO CATALAN LILIBETPEREZ CEBALLOS ELIZABET