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Leucemia linfática crónica BLeucemia linfática crónica B: una enfermedad heterogénea.
Estudio del rol de las mutaciones de IgVH y BCL-6
en esta heterogeneidad. Aproximaciones genómica y
funcional.
Leucemia linfática crónica BLeucemia linfática crónica B: una enfermedad heterogénea.
Estudio del rol de las mutaciones de IgVH y BCL-6
en esta heterogeneidad. Aproximaciones genómica y
funcional.
Eloisa Jantus Lewintre
HOSPITAL UNIVERSITARIO LA FE SERVICIO HEMATOLOGIA
2 de Octubre de 2008
INTRODUCCIÓINTRODUCCIÓNN
La leucemia linfática crónica Bleucemia linfática crónica B (LLC-B) se define como:
Enfermedad causada por la acumulación progresiva monoclonal de células B que co-expresan CD5+ y CD19+, originada a partir de linfocitos B maduros con experiencia antigénica.
Actualmente se la describe como una enfermedad por acumulación de células B con un alto nivel de proliferación, mientras que anteriormente se creía que se debía a un defecto en la apoptosis de células inmuno-incompetentes.
Curso clínico variable:
Grupo de pacientes con enfermedad agresiva con necesidad de tratamiento
Grupo de pacientes con enfermedad indolente
Se presenta en edad avanzada (10-15% en < 50 años)
Afecta más a hombres que a mujeres (1.5 : 1.0 ).
LLC-B: LLC-B: GENERALIDADESGENERALIDADES
Desarrollo de Linfocitos B normalesDesarrollo de Linfocitos B normales
CD10
CD19CD34
CD10
CD19CD34
CD10
CD19CD34
Pro B
Pre B
BCR
Cel B inmadura
M.O.
D9 J4V3
Vías de maduración de las células B: Vías de maduración de las células B:
dependencia de células Tdependencia de células T
Chiorazzi N, N Engl J Med 2005
BCL6 mutations
AIDAID
Mutado No MutadoEstim
. antig
énica
Selección por antígeno
Lesión genética
LLC clon mutadoLLC clon mutado LLC clon no mutadoLLC clon no mutado
Desarrollo y evolución de las células de LLC-BDesarrollo y evolución de las células de LLC-B
HETEROGENEIDAD
FACTORES PRONÓSTICO EN FACTORES PRONÓSTICO EN LLCLLC Estadíos de Binet o Rai
Tiempo duplicación linfocitario
Timidina-kinasa
2 microglobulina
LDH
Patrón histopatológico de médula ósea.
Estado mutacional de IgVH
Mutaciones en región 5’ no-codificante del gen
BCL6
Expresión de CD38
Expresión de ZAP-70
Alteraciones citogenéticas (del 17p, del11q, del 13q,
+12)
Hamblin TJ,. Blood. 1999
years
MUTACIONES SOMÁTICAS EN IgVMUTACIONES SOMÁTICAS EN IgVH H y y BCL6 BCL6
years
MESES
100806040200
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
GRUPOS
GRUPO IBCL6 + / IgVH+
GRUPO IIBCL6 - / IgVH +
GRUPO IIIBCL6 - / IgVH -
Sarsotti E, Leukemia.2004
ILT
No se pueden determinar No se pueden determinar de rutina en diagnósticode rutina en diagnóstico
EXPRESIÓN DE ZAP70 y EXPRESIÓN DE ZAP70 y CD38CD38
Del Príncipe y col, 2006Del Príncipe y col, 2006
Damle RN.Blood 1999:94;1840-47Damle y col, 1999
Damle RN.Blood 1999:94;1840-47Damle y col, 1999
Damle RN.Blood 1999:94;1840-47Damle RN.Blood 1999:94;1840-47Damle y col, 1999
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GRUPO IBCL6 + / IgVH+
GRUPO IIBCL6 - / IgVH +
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Sarsotti E, Leukemia.2004
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GRUPO IBCL6 + / IgVH+
GRUPO IIBCL6 - / IgVH +
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Sarsotti E, Leukemia.2004
ILT
OBJETIVO PRINCIPALOBJETIVO PRINCIPAL
Valorar la implicación de las mutaciones en los genes IgVH y BCL-6 como responsables de la
heterogeneidad en el comportamiento biológico y expresión génica en la LLC-B e identificar nuevos
marcadores subrogados de las mutaciones en IgVH y de pronóstico en estadíos tempranos de la
enfermedad
HIPOTESIS
LLC: formas clínicas heterog.
Subgrupos moleculares
Influyen en evolución y necesidad de tratamiento
(ptes en estadío A)
Perfiles genómicos y funcionales DIFERENTES?
CAPÍTULO ICAPÍTULO I: :
ESTUDIOS FUNCIONALESESTUDIOS FUNCIONALES
OBJETIVOSOBJETIVOS::
1. Evaluar el estado mutacional de IgVH en muestras de LLC mediante protocolo Biomed2 modificado y valorar su utilidad
2. Secuenciar la región 5’ no codif del gen BCL6 y correlacionar polimorfismos y mutaciones en esta región con expresión.
3. Realizar estudios de quimiosensibilidad in vitro con Btz y correlacionarlos con el estado mutacional de los genes IgVH y BCL6
LLC-B: diagnóstico NCI 1996 [Cheson, Blood,1996]
N=74
Edad mediana: 67,4 años (42-86)
Inmunofenotipo, CD38, ZAP70 por FC
Alteraciones citogenéticas (FISH)
Estadío A de Binet
56.7% varones
Otros: score, TDL, LDH, 2microglob
CDR1 CDR2N
N
Dominio variableDominio constanteCDR2 CDR3CDR1
V D JmRNA (gen)
Ig, cadena pesada (proteína)
CDR3
Dominio variable
ESTADO MUTACIONAL DEL GEN IgVESTADO MUTACIONAL DEL GEN IgVHH
6 VH-Leader
Homología
<98% MUT
>98% NO-MUT
CARACTERIZACIÓN DE LAS MUTACIONES EN CARACTERIZACIÓN DE LAS MUTACIONES EN IgVIgVHH VH Familia IgVH
mutado IgVH No
mutado
VH Familia IgVH mutado
IgVH No
mutado
VH3
44 %
3-7 6
VH1
24 %
1-69 6
3-23 1-3 4
3-30 5 1 1-2 3 2
3-30-3 1-8 1 1
3-33 4 3 1-58 1
3-9 1 1 TOTAL 8 10
3-72 1
VH4
19%
4-34 4
3-74 4-61 3
3-11 4-39 1 2
3-20 3 1 4-31 2
3-21 1 4-59 2
3-48 1 TOTAL 12 2
3-53 2 VH28%
2-5 6
3-64 1 VH53%
5-51 1 1
3-66 2 VH61.3%
6-1 1
TOTAL 26 7
Mutadas= 54 (73%) No mut= 20 (27.0%)
Representación esquemática del gen BCL-6.
Los exones codificantes y no codificantes se representan por rectángulos llenos y vacíos, respectivamente. La región que sufre SHM y que hemos analizado aparece indicada por una línea azul.
ESTADO MUTACIONAL DEL GEN BCL6ESTADO MUTACIONAL DEL GEN BCL6
E1.21C (sentido): CTC TTG CCA AAT GCT TTGE1.24 (antisentido): TAA TTC CCC TCC TTC CT
E1.23 (sentido): AGG AAG GAG GGG AAT TAGE1.P1.6 (antisentido): AAG CAG TTT GCA AGC GAG
E1.P1.7(sentido): TTC TCG CTT GCA AAC TGCE1.26 (antisentido) CAC GAT ACT TCA TCT CAT C
E1.10E1.11
E1.12
E1.21C
E1.26
741 pb
ESTUDIO DE LA REGION 5’ DEL GEN ESTUDIO DE LA REGION 5’ DEL GEN BCL6 BCL6
N=69
100% IgVH mut
20 mutadas
(29%)
34 mutacione
s
31 mutac. diferentes
Sustit. nucleót.
C (35.3%)
T (29.4%)
G (26.5%)
MUTACIONES
POLIMORFISMOS
delT 520 (29.0%)
397 G>C (17.4%)
502 G>A (7.2%)
0
2
4
6
8
10
12
14
1-49
50-9
9
100-
149
150-
199
200-
249
250-
299
300-
349
350-
399
400-
449
450-
499
500-
549
550-
599
600-
649
650-
699
700-
749
750-
790
Posición
Fre
cu
en
cia
de m
uta
cio
nes
MUTACIONES DEL GEN BCL6 MUTACIONES DEL GEN BCL6
BCL6: RELACIÓN ENTRE BCL6: RELACIÓN ENTRE MUTACIONES Y EXPRESIÓN MUTACIONES Y EXPRESIÓN
Prueba estadística: Pearson
BAY 117082
BORTEZOMIB
Stress oxidativo,
Citoquinas (CD40 L, IL-4, IL-1, TNFa, otros)
Infeccion viral/ bacteriana
BCL2
Btz
Control
24 hs
37ºC
5% CO2
CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES
RPMI 15% FBS
APOPTOSIS
Anexina V
+ PI
Inducción de apoptosis por Inducción de apoptosis por Btz en células con IgVBtz en células con IgVHH
mutado: correlación con mutado: correlación con mutaciones en BCL-6.mutaciones en BCL-6.
Tratamiento
Células con IgVH mutado:
Mutaciones en BCL-6
n % Apoptosis (media
SEM)
p*
Btz 0.1 M IgVH mut/ BCL-6 no-mut
9 67.66 1.91 0.032
IgVH mut/ BCL-6 mut 11 51.59 4.61
Btz 1.0 M IgVH mut/ BCL-6 no-mut
8 73.84 2.59 0.034
IgVH mut/ BCL-6 mut 9 62.12 3.44
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CAPÍTULO IICAPÍTULO II: :
ESTUDIOS GENÓMICOSESTUDIOS GENÓMICOS
OBJETIVOS:OBJETIVOS:
1. Estudiar la firma molecular de la LLC-B mediante el uso de micromatrices de alta densidad, identificando vías metabólicas o términos de ontología génica que estuvieran sobrerepresentados en esta patología.
2. Estudiar el perfil de expresión génica en distintos grupos moleculares de LLC-B con el fin de identificar genes y vías metabólicas diferencialmente expresados.
3. Validar los resultados obtenidos del estudio transcriptómico mediante RTqPCR.
Células B seleccionadasCélulas B seleccionadas ( CD19+ bolas inmunomagnéticas)
• 11 Controles sanos
• 36 muestras LLC-B estadío A de Binet (no tratados)
* 24 IgVH mutado 15 BCL6 no mutado (G1)
9 BCL6 mutado (G2)
* 12 IgVH no mutado (G3)
CD19
Grupo
INICIALMicromatric
es
Validación metodolog
. por RTqPCR
IgVH mut=24
BCL6mut=9
IgVH no mut= 12
N=36
LLC
-B:
est
ad
ío
A
METODOLOGÍA GENÓMICAMETODOLOGÍA GENÓMICA
Extracción de ARN total de linf B
Hibridación con Micromatrices de ADN (microarrays, chips)
Human Genome U133 Plus 2.0 (Affymetrix)
Transcripción a ADNc
Marcaje con fluorescencia
Suite GEPASMontaner D, Nucleic Acids Res, 2006, 34:W486-91
Datos
1. Preprocesamiento: Normalización, QC
2. Cluster jerárquico
3. Expresión diferencial (estudio supervisado) -> prueba t
4. Estudio de Anotación Funcional -> FatiScan
CONTROLES CONTROLES
vsvs
LLCLLC
LLC-B
Cluster jerárquico – Método Cluster jerárquico – Método UPGMAUPGMA
ASXL2
NEDD8
GLIPR1
SMAD3
POLB
FIRMA MOLECULAR LLC-B
HG U133 2.0 Plus (Affymetrix)
GLIPR1POLR3BPOLR2LASXL2NEDD8SCLY
RAD51L1RBM14POLE4ERCC1
Repar. y replic. ADN
SIGLEC10CLSTN1HLADOBFCRL5
Proteína integr. membr.
Proteína relacionada a patogén. en gllioma ->pro apoptotica en Ca de próstata y vejiga
Polimerasas involucr. en transcrip.
Gen asociado a carcinogen.
Codif proteina similar a ubiquitina
->ciclo celular, embriogen.
Factor de transcrip esencial p/ todos los linajes hematopoy.
ANÁLISIS FUNCIONAL: FatiScanANÁLISIS FUNCIONAL: FatiScan
ACTIVADOS EN LEUCEMIA
REPRIMIDOS EN CONTROLES
ACTIVADOS EN CONTROLES
REPRIMIDOS EN LEUCEMIA
- Sínt de ATP acopl a transp de electrones- Replicación ADN- Recombinación ADN- Reparación ADN- Metabol. de nucleótidos- Metabol. de hexosas- Ciclo celular- Fosforilación oxidativa- Vía de las pentosas fosfato- Ciclo del citrato
- Muerte celular - Diferenciación celular- Apoptosis- Proteólisis mediada por ubiquitina
GO
KEGG
GO GO
KEGG
G1G1 + + G2G2 (IgV (IgVHH mut) mut)
vsvs
G3G3 (IgV (IgVHH no mut) no mut)
LPL: enzima del metabolismo lipídico. Formación y estabiliz de “lipid raft” en LLC
BC7A (B-cell CLL/lymphoma 7A) involucrado en traslocaciones cromosóm. en linfomas no Hodgkin
CD82: gen supresor de metástasis
DUSP22: fosfatasa dual. Activa vía JNK
BCL11A: prot dedo de Zn, expresada en CG
MGC9913RGS4CRY1
DMD
BCL7A
LPL
TUBA8
ITGA9
BCL11ADUSP22PDLIM5
SVHADAM29
CD82FUT8
CRY1: componente del reloj circadiano
ANÁLISIS FUNCIONAL: FatiScanANÁLISIS FUNCIONAL: FatiScanG1G1 + + G2G2 (IgV (IgVHH mut) mut) vs. vs. G3G3 (IgV (IgVHH no mut) no mut)
ACTIVADOS EN IgVH no
mut
REPRIMIDOS EN IgVH mut
ACTIVADOS EN IgVH mut
REPRIMIDOS EN IgVH no
mut
- Señalización vía proteina G- Procesos rítmicos- Vía de señalización Frizzled-2 (WNT)
- Vía de señalización mediada por Ca- Interacc ECM- receptor- Vía de señalización Hedgehog- Uniones tipo Gap
- Regulac positiva de IkB kinasa- Metabol glicerolipídico- Ribosoma
- Apoptosis
GO
KEGG
GO GO
- Adhesión celular homofílica
KEGG
GO
Expresión diferencial - FatiScanExpresión diferencial - FatiScanG1G1 (IgV (IgVHH mut/ BCL6 no mut) mut/ BCL6 no mut) vs. vs. G2G2 (IgV(IgVHH mut/ BCL6 mut) mut/ BCL6 mut)
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No hay genes expresados significativamente de manera diferencial
MET. DE VALIDACIÓN: PCR cuantitat. a tiempo realMET. DE VALIDACIÓN: PCR cuantitat. a tiempo real
Genes validados
(N=14)
Valor Expresión Normalizado= ETCpT(C)-CpT(S)x ER
CpR(S)-CpR(C)
ET = Efic.del gen diana ER = Efic. del gen de referenciaCpT ciclo umbral del gen diana CpR ciclo umbral del gen de referencia C=Calibrador ; S= muestra
Validación de resultados: Validación de resultados: Cuantificación de mRNA por RTqPCRCuantificación de mRNA por RTqPCR
IgVH Gen No mut
(media + 2SEM) Mut
(media + 2SEM)
p (prueba de Mann
Whitney) CRY1 0.335 + 0.114 0.075 + 0.050 <0.001 LPL 297.01 + 89.32 53.62 + 44.86 <0.001 MGC9913 1.96 + 1.193 0.308 + 0.302 <0.001 BCL7A 0.2512 + 0.128 0.062 + 0.038 0.002 IFT57 0.919 +1.718 0.647 + 0.170 0.007 FUT8 0.966 +0.334 1.841 + 0.370 0.007 DUSP22 0.649 + 0.361 1.383 + 0.504 0.008 BCL11A 0.641 + 0.140 0.937 + 0.160 0.008 CD82 0.359 + 0.100 1.044 + 0.382 0.011 ITGA9 0.381 + 0.122 0.221 + 0.070 0.025 ZAP70* 0.412 + 0.384 0.151 + 0.056 0.033 FAHD1 0.855 + 0.214 1.259 + 0.196 0.037 PDLIM5 0.684 + 0.136 0.961 + 0.192 0.049 SVH 1.051 + 0.252 1.689 + 0.394 0.049
* No signif. estadíst. en datos de micromatrices
CAPÍTULO IIICAPÍTULO III: :
MARCADORES PRONÓSTICO MARCADORES PRONÓSTICO EN LLC-BEN LLC-B
OBJETIVOS:OBJETIVOS:
1. Validar biológicamente los marcadores identificados en un grupo muestral independiente.
2. Valorar la utilidad de los genes seleccionados como marcadores subrogados del estado mutacional de IgVH y de pronóstico en estadíos tempranos de la LLC-B
Grupo
INICIALMicromatric
es
Validación metodolog
. por RTqPCR
IgVH mut=24
BCL6mut=9
IgVH no mut= 12
N=36
Grupo
VALIDACIÓN
Validación
BIOLÓGICA RTqPCR
N=38
IgVH mut=30
BCL6mut=11
IgVH no mut= 8
N=74
Marcador Subrogado
IgVH
IgVH mut=54
IgVH no mut= 20
Marcador Pronóstico
(ILT)
LLC
-B:
est
ad
ío
A
Correlación entre expresión relativa y Correlación entre expresión relativa y estado mutacional de IgVestado mutacional de IgVHH en muestras en muestras
del del grupo de validacióngrupo de validación
IgVH Gen
No mut (media + 2SEM)
Mut (media + 2SEM)
p (prueba de Mann
Whitney)
CRY1 0.275 + 0.114 0.055 + 0.004 <0.001 LPL 228.4 + 59.6 20.11 + 13.72 <0.001 BCL7A 1.44 + 0.742 0.073 + 0.042 <0.001 ZAP70 0.661 + 0.418 0.071 + 0.052 <0.001 CD82 0.433 + 0.076 0.689 + 0.112 0.013 DUSP22 1.18 + 0.38 1.90 + 0.30 0.023
Marcadores subrogados de IgVMarcadores subrogados de IgVHH
Sensibilidad, especificidad, y área Sensibilidad, especificidad, y área bajo la curva ROCbajo la curva ROC
en grupo de validaciónen grupo de validación
Gen Sensib (%) Especif (%) Valor de Corte Area ROC
CRY1 100 100 < 0.090 1.00
LPL 100 93 < 82.45 0.987
BCL7A 100 82 < 0.1150 0.950
ZAP70 100 89 < 0.1050 0.960
CD82 83 50 > 0.4050 0.78
DUSP22 90 63 > 1.020 0.76
Expresión de genes seleccionados y Expresión de genes seleccionados y
estado mutacional del gen IgVestado mutacional del gen IgVHH
NNoo MMuutt MMuutt CCoonnccoorrddaanncciiaa GGeenn VVaalloorr ddee ccoorrttee
n % n % %
p
(Chi cuadrado)
>0.090 19 27.1 4 5.7 CRY1 <0.090 1 1.4 46 65.7
92.8 <0.0001
>82.45 20 28.2 6 8.5 LPL <82.45 0 0.0 45 63.4
91.6 <0.0001
>0.105 20 28.2 12 16.9 ZAP70 <0.105 0 0.0 39 54.9
83.1 <0.0001
<0.115 17 23.9 10 14.1 BCL7A >0.115 3 4.2 41 57.7
81.6 <0.0001
CRY1 y LPL CRY1 y LPL como como
marcadores marcadores subrogados del subrogados del
estado estado mutacional de mutacional de
IgVIgVHH
Las barras de error representan el 95% del intervalo de confianza. La línea roja muestra el valor de corte para cada parámetro
A
B
A
B
No mut Mut
No mut MutIgVH
IgVH
La significación estadística de las diferencias entre curvas fue evaluada por la prueba Log-rank.
Curvas de Kaplan-Meier: Mutaciones en Curvas de Kaplan-Meier: Mutaciones en IgVIgVHH
Actualm. usado en clínica.
Curvas de Kaplan-Meier: Curvas de Kaplan-Meier: LPL, CRY1 y ZAP70LPL, CRY1 y ZAP70
N=71
CRY1CRY1
p<0.0001
LPLLPL
p<0.0001
ZAP70-ZAP70-RTqPCRRTqPCR
p=0.001
CRY1: ¿NUEVO BIOMARCADOR EN LLC-B?CRY1: ¿NUEVO BIOMARCADOR EN LLC-B? Correlación Correlación con la expresión de ZAP70 o LPL y estado mutacional de con la expresión de ZAP70 o LPL y estado mutacional de
IgVIgVHH CRY1 + CRY1 -
ZAP70 qPCR + 22 10
ZAP70 qPCR - 1 38
CRY1 + CRY1 -
LPL + 21 5
LPL - 2 42
19 IgVH No mut3 IgVH Mut 2= ZAP70 FC+
CD38+
38 IgVH Mut
20 IgVH No mut1 IgVH Mut 1= ZAP70 FC+
CD38+
42 IgVH Mut
9 IgVH Mut1 IgVH No mut
1 IgVH Mut
CD38+
4 IgVH Mut1 IgVH No mut
2 IgVH Mut
15.5% discordancias
10.0% discordancias
CRY1: Expresión en PBMCCRY1: Expresión en PBMC
Gen IgV HP
(prueba de Mann Whitney)
No mut(media + 2 SEM)
Mut (media + 2 SEM)
CRY1 0.380 + 0.245 0.051 + 0.038 0.007
MARCADOR SUBROGADO IgVIgVHH
Ensayo ClínicoEnsayo Clínico
N=18 sin selección de células B
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
1. Los estudios funcionales y de expresión génica que hemos realizado sobre muestras de pacientes en estadíos tempranos de LLC, demuestran la heterogeneidad de esta entidad y manifiestan la existencia de subgrupos moleculares bien definidos dentro de esta patología.
2. Mas de un centenar de genes diferencian los perfiles transcriptómicos de muestras con y sin mutaciones en el gen IgVH, en cambio no se encuentran diferencias en los perfiles de expresión con respecto a las mutaciones en BCL6.
3. En el análisis de anotaciones funcionales, la herramienta FatiScan encuentra en las muestras con IgVH no mutado sobreexpresadas vías de señalización involucradas en supervivencia y proliferación celular provenientes del entorno y de la matriz extracelular e inhibida la apoptosis.
4. Existen varios genes cuya expresión podría utilizarse como marcador subrogado del estado mutacional de IgVH y de pronóstico en LLC-B, siendo el gen CRY1, uno de los que proponemos para ser incorporado en ensayos clínicos y posiblemente en la práctica clínica.
Hospital ClínicoHospital Clínico
Javier García Conde
Ma Jose Terol
Isana Benet
Pilar Eroles
Isabel Marugan
Elena Sarsotti
Miguel Marín
CIPFCIPF
Hematología MolecularHematología Molecular
Rosa Farras
Cristina Reinoso
Sandra Gallach
CIPFCIPF
BioinformáticaBioinformática
Joaquín Dopazo
David Montaner
Hospital Arnau de Hospital Arnau de VilanovaVilanova
Jose Ramón Mayans
Carlos García Ballesteros