Leucemia linfática crónica B Leucemia linfática crónica B: una enfermedad heterogénea. Estudio...

Leucemia linfática crónica BLeucemia linfática crónica B: una enfermedad heterogénea.

Estudio del rol de las mutaciones de IgVH y BCL-6

en esta heterogeneidad. Aproximaciones genómica y

funcional.

Leucemia linfática crónica BLeucemia linfática crónica B: una enfermedad heterogénea.

Estudio del rol de las mutaciones de IgVH y BCL-6

en esta heterogeneidad. Aproximaciones genómica y

funcional.

Eloisa Jantus Lewintre

HOSPITAL UNIVERSITARIO LA FE SERVICIO HEMATOLOGIA

2 de Octubre de 2008

INTRODUCCIÓINTRODUCCIÓNN

La leucemia linfática crónica Bleucemia linfática crónica B (LLC-B) se define como:

Enfermedad causada por la acumulación progresiva monoclonal de células B que co-expresan CD5+ y CD19+, originada a partir de linfocitos B maduros con experiencia antigénica.

Actualmente se la describe como una enfermedad por acumulación de células B con un alto nivel de proliferación, mientras que anteriormente se creía que se debía a un defecto en la apoptosis de células inmuno-incompetentes.

Curso clínico variable:

Grupo de pacientes con enfermedad agresiva con necesidad de tratamiento

Grupo de pacientes con enfermedad indolente

Se presenta en edad avanzada (10-15% en < 50 años)

Afecta más a hombres que a mujeres (1.5 : 1.0 ).

LLC-B: LLC-B: GENERALIDADESGENERALIDADES

Desarrollo de Linfocitos B normalesDesarrollo de Linfocitos B normales

CD10

CD19CD34

CD10

CD19CD34

CD10

CD19CD34

Pro B

Pre B

BCR

Cel B inmadura

M.O.

D9 J4V3

Vías de maduración de las células B: Vías de maduración de las células B:

dependencia de células Tdependencia de células T

Chiorazzi N, N Engl J Med 2005

BCL6 mutations

AIDAID

Mutado No MutadoEstim

. antig

énica

Selección por antígeno

Lesión genética

LLC clon mutadoLLC clon mutado LLC clon no mutadoLLC clon no mutado

Desarrollo y evolución de las células de LLC-BDesarrollo y evolución de las células de LLC-B

HETEROGENEIDAD

FACTORES PRONÓSTICO EN FACTORES PRONÓSTICO EN LLCLLC Estadíos de Binet o Rai

Tiempo duplicación linfocitario

Timidina-kinasa

2 microglobulina

LDH

Patrón histopatológico de médula ósea.

Estado mutacional de IgVH

Mutaciones en región 5’ no-codificante del gen

BCL6

Expresión de CD38

Expresión de ZAP-70

Alteraciones citogenéticas (del 17p, del11q, del 13q,

+12)

Hamblin TJ,. Blood. 1999

years

MUTACIONES SOMÁTICAS EN IgVMUTACIONES SOMÁTICAS EN IgVH H y y BCL6 BCL6

years

MESES

100806040200

1,0

,8

,6

,4

,2

0,0

GRUPOS

GRUPO IBCL6 + / IgVH+

GRUPO IIBCL6 - / IgVH +

GRUPO IIIBCL6 - / IgVH -

Sarsotti E, Leukemia.2004

ILT

No se pueden determinar No se pueden determinar de rutina en diagnósticode rutina en diagnóstico

EXPRESIÓN DE ZAP70 y EXPRESIÓN DE ZAP70 y CD38CD38

Del Príncipe y col, 2006Del Príncipe y col, 2006

Damle RN.Blood 1999:94;1840-47Damle y col, 1999

Damle RN.Blood 1999:94;1840-47Damle y col, 1999

Damle RN.Blood 1999:94;1840-47Damle RN.Blood 1999:94;1840-47Damle y col, 1999

years

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GRUPOS



GRUPO IIIBCL6 - /IgVH -


ILT

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,2

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GRUPOS





ILT

OBJETIVO PRINCIPALOBJETIVO PRINCIPAL

Valorar la implicación de las mutaciones en los genes IgVH y BCL-6 como responsables de la

heterogeneidad en el comportamiento biológico y expresión génica en la LLC-B e identificar nuevos

marcadores subrogados de las mutaciones en IgVH y de pronóstico en estadíos tempranos de la

enfermedad

HIPOTESIS

LLC: formas clínicas heterog.

Subgrupos moleculares

Influyen en evolución y necesidad de tratamiento

(ptes en estadío A)

Perfiles genómicos y funcionales DIFERENTES?

CAPÍTULO ICAPÍTULO I: :

ESTUDIOS FUNCIONALESESTUDIOS FUNCIONALES

OBJETIVOSOBJETIVOS::

1. Evaluar el estado mutacional de IgVH en muestras de LLC mediante protocolo Biomed2 modificado y valorar su utilidad

2. Secuenciar la región 5’ no codif del gen BCL6 y correlacionar polimorfismos y mutaciones en esta región con expresión.

3. Realizar estudios de quimiosensibilidad in vitro con Btz y correlacionarlos con el estado mutacional de los genes IgVH y BCL6

LLC-B: diagnóstico NCI 1996 [Cheson, Blood,1996]

N=74

Edad mediana: 67,4 años (42-86)

Inmunofenotipo, CD38, ZAP70 por FC

Alteraciones citogenéticas (FISH)

Estadío A de Binet

56.7% varones

Otros: score, TDL, LDH, 2microglob

CDR1 CDR2N

N

Dominio variableDominio constanteCDR2 CDR3CDR1

V D JmRNA (gen)

Ig, cadena pesada (proteína)

CDR3

Dominio variable

ESTADO MUTACIONAL DEL GEN IgVESTADO MUTACIONAL DEL GEN IgVHH

6 VH-Leader

Homología

<98% MUT

>98% NO-MUT

CARACTERIZACIÓN DE LAS MUTACIONES EN CARACTERIZACIÓN DE LAS MUTACIONES EN IgVIgVHH VH Familia IgVH

mutado IgVH No

mutado

VH Familia IgVH mutado

IgVH No

mutado

VH3

44 %

3-7 6

VH1

24 %

1-69 6

3-23 1-3 4

3-30 5 1 1-2 3 2

3-30-3 1-8 1 1

3-33 4 3 1-58 1

3-9 1 1 TOTAL 8 10

3-72 1

VH4

19%

4-34 4

3-74 4-61 3

3-11 4-39 1 2

3-20 3 1 4-31 2

3-21 1 4-59 2

3-48 1 TOTAL 12 2

3-53 2 VH28%

2-5 6

3-64 1 VH53%

5-51 1 1

3-66 2 VH61.3%

6-1 1

TOTAL 26 7

Mutadas= 54 (73%) No mut= 20 (27.0%)

Representación esquemática del gen BCL-6.

Los exones codificantes y no codificantes se representan por rectángulos llenos y vacíos, respectivamente. La región que sufre SHM y que hemos analizado aparece indicada por una línea azul.

ESTADO MUTACIONAL DEL GEN BCL6ESTADO MUTACIONAL DEL GEN BCL6

E1.21C (sentido): CTC TTG CCA AAT GCT TTGE1.24 (antisentido): TAA TTC CCC TCC TTC CT

E1.23 (sentido): AGG AAG GAG GGG AAT TAGE1.P1.6 (antisentido): AAG CAG TTT GCA AGC GAG

E1.P1.7(sentido): TTC TCG CTT GCA AAC TGCE1.26 (antisentido) CAC GAT ACT TCA TCT CAT C

E1.10E1.11

E1.12

E1.21C

E1.26

741 pb

ESTUDIO DE LA REGION 5’ DEL GEN ESTUDIO DE LA REGION 5’ DEL GEN BCL6 BCL6

N=69

100% IgVH mut

20 mutadas

(29%)

34 mutacione

s

31 mutac. diferentes

Sustit. nucleót.

C (35.3%)

T (29.4%)

G (26.5%)

MUTACIONES

POLIMORFISMOS

delT 520 (29.0%)

397 G>C (17.4%)

502 G>A (7.2%)

0

2

4

6

8

10

12

14

1-49

50-9

9

100-

149

150-

199

200-

249

250-

299

300-

349

350-

399

400-

449

450-

499

500-

549

550-

599

600-

649

650-

699

700-

749

750-

790

Posición

Fre

cu

en

cia

de m

uta

cio

nes

MUTACIONES DEL GEN BCL6 MUTACIONES DEL GEN BCL6

BCL6: RELACIÓN ENTRE BCL6: RELACIÓN ENTRE MUTACIONES Y EXPRESIÓN MUTACIONES Y EXPRESIÓN

Prueba estadística: Pearson

BAY 117082

BORTEZOMIB

Stress oxidativo,

Citoquinas (CD40 L, IL-4, IL-1, TNFa, otros)

Infeccion viral/ bacteriana

BCL2

Btz

Control

24 hs

37ºC

5% CO2

CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES

RPMI 15% FBS

APOPTOSIS

Anexina V

+ PI

Inducción de apoptosis por Inducción de apoptosis por Btz en células con IgVBtz en células con IgVHH

mutado: correlación con mutado: correlación con mutaciones en BCL-6.mutaciones en BCL-6.

Tratamiento

Células con IgVH mutado:

Mutaciones en BCL-6

n % Apoptosis (media

SEM)

p*

Btz 0.1 M IgVH mut/ BCL-6 no-mut

9 67.66 1.91 0.032

IgVH mut/ BCL-6 mut 11 51.59 4.61

Btz 1.0 M IgVH mut/ BCL-6 no-mut

8 73.84 2.59 0.034

IgVH mut/ BCL-6 mut 9 62.12 3.44

years

MESES

100806040200

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,8

,6

,4

,2

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GRUPOS





ILT

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,2

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ILT

CAPÍTULO IICAPÍTULO II: :

ESTUDIOS GENÓMICOSESTUDIOS GENÓMICOS

OBJETIVOS:OBJETIVOS:

1. Estudiar la firma molecular de la LLC-B mediante el uso de micromatrices de alta densidad, identificando vías metabólicas o términos de ontología génica que estuvieran sobrerepresentados en esta patología.

2. Estudiar el perfil de expresión génica en distintos grupos moleculares de LLC-B con el fin de identificar genes y vías metabólicas diferencialmente expresados.

3. Validar los resultados obtenidos del estudio transcriptómico mediante RTqPCR.

Células B seleccionadasCélulas B seleccionadas ( CD19+ bolas inmunomagnéticas)

• 11 Controles sanos

• 36 muestras LLC-B estadío A de Binet (no tratados)

* 24 IgVH mutado 15 BCL6 no mutado (G1)

9 BCL6 mutado (G2)

* 12 IgVH no mutado (G3)

CD19

Grupo

INICIALMicromatric

es

Validación metodolog

. por RTqPCR

IgVH mut=24

BCL6mut=9

IgVH no mut= 12

N=36

LLC

-B:

est

ad

ío

A

METODOLOGÍA GENÓMICAMETODOLOGÍA GENÓMICA

Extracción de ARN total de linf B

Hibridación con Micromatrices de ADN (microarrays, chips)

Human Genome U133 Plus 2.0 (Affymetrix)

Transcripción a ADNc

Marcaje con fluorescencia

Suite GEPASMontaner D, Nucleic Acids Res, 2006, 34:W486-91

Datos

1. Preprocesamiento: Normalización, QC

2. Cluster jerárquico

3. Expresión diferencial (estudio supervisado) -> prueba t

4. Estudio de Anotación Funcional -> FatiScan

CONTROLES CONTROLES

vsvs

LLCLLC

LLC-B

Cluster jerárquico – Método Cluster jerárquico – Método UPGMAUPGMA

ASXL2

NEDD8

GLIPR1

SMAD3

POLB

FIRMA MOLECULAR LLC-B

HG U133 2.0 Plus (Affymetrix)

GLIPR1POLR3BPOLR2LASXL2NEDD8SCLY

RAD51L1RBM14POLE4ERCC1

Repar. y replic. ADN

SIGLEC10CLSTN1HLADOBFCRL5

Proteína integr. membr.

Proteína relacionada a patogén. en gllioma ->pro apoptotica en Ca de próstata y vejiga

Polimerasas involucr. en transcrip.

Gen asociado a carcinogen.

Codif proteina similar a ubiquitina

->ciclo celular, embriogen.

Factor de transcrip esencial p/ todos los linajes hematopoy.

ANÁLISIS FUNCIONAL: FatiScanANÁLISIS FUNCIONAL: FatiScan

ACTIVADOS EN LEUCEMIA

REPRIMIDOS EN CONTROLES

ACTIVADOS EN CONTROLES

REPRIMIDOS EN LEUCEMIA

- Sínt de ATP acopl a transp de electrones- Replicación ADN- Recombinación ADN- Reparación ADN- Metabol. de nucleótidos- Metabol. de hexosas- Ciclo celular- Fosforilación oxidativa- Vía de las pentosas fosfato- Ciclo del citrato

- Muerte celular - Diferenciación celular- Apoptosis- Proteólisis mediada por ubiquitina

GO

KEGG

GO GO

KEGG

G1G1 + + G2G2 (IgV (IgVHH mut) mut)

vsvs

G3G3 (IgV (IgVHH no mut) no mut)

LPL: enzima del metabolismo lipídico. Formación y estabiliz de “lipid raft” en LLC

BC7A (B-cell CLL/lymphoma 7A) involucrado en traslocaciones cromosóm. en linfomas no Hodgkin

CD82: gen supresor de metástasis

DUSP22: fosfatasa dual. Activa vía JNK

BCL11A: prot dedo de Zn, expresada en CG

MGC9913RGS4CRY1

DMD

BCL7A

LPL

TUBA8

ITGA9

BCL11ADUSP22PDLIM5

SVHADAM29

CD82FUT8

CRY1: componente del reloj circadiano

ANÁLISIS FUNCIONAL: FatiScanANÁLISIS FUNCIONAL: FatiScanG1G1 + + G2G2 (IgV (IgVHH mut) mut) vs. vs. G3G3 (IgV (IgVHH no mut) no mut)

ACTIVADOS EN IgVH no

mut

REPRIMIDOS EN IgVH mut

ACTIVADOS EN IgVH mut

REPRIMIDOS EN IgVH no

mut

- Señalización vía proteina G- Procesos rítmicos- Vía de señalización Frizzled-2 (WNT)

- Vía de señalización mediada por Ca- Interacc ECM- receptor- Vía de señalización Hedgehog- Uniones tipo Gap

- Regulac positiva de IkB kinasa- Metabol glicerolipídico- Ribosoma

- Apoptosis

GO

KEGG

GO GO

- Adhesión celular homofílica

KEGG

GO

Expresión diferencial - FatiScanExpresión diferencial - FatiScanG1G1 (IgV (IgVHH mut/ BCL6 no mut) mut/ BCL6 no mut) vs. vs. G2G2 (IgV(IgVHH mut/ BCL6 mut) mut/ BCL6 mut)

years

MESES

100806040200

1,0

,8

,6

,4

,2

0,0

GRUPOS





ILT

years

MESES

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1,0

,8

,6

,4

,2

0,0

GRUPOS





years

MESES

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,8

,6

,4

,2

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GRUPOS




years

MESES

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1,0

,8

,6

,4

,2

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GRUPOS




MESES

100806040200

1,0

,8

,6

,4

,2

0,0

GRUPOS





ILT

No hay genes expresados significativamente de manera diferencial

MET. DE VALIDACIÓN: PCR cuantitat. a tiempo realMET. DE VALIDACIÓN: PCR cuantitat. a tiempo real

Genes validados

(N=14)

Valor Expresión Normalizado= ETCpT(C)-CpT(S)x ER

CpR(S)-CpR(C)

ET = Efic.del gen diana ER = Efic. del gen de referenciaCpT ciclo umbral del gen diana CpR ciclo umbral del gen de referencia C=Calibrador ; S= muestra

Validación de resultados: Validación de resultados: Cuantificación de mRNA por RTqPCRCuantificación de mRNA por RTqPCR

IgVH Gen No mut

(media + 2SEM) Mut

(media + 2SEM)

p (prueba de Mann

Whitney) CRY1 0.335 + 0.114 0.075 + 0.050 <0.001 LPL 297.01 + 89.32 53.62 + 44.86 <0.001 MGC9913 1.96 + 1.193 0.308 + 0.302 <0.001 BCL7A 0.2512 + 0.128 0.062 + 0.038 0.002 IFT57 0.919 +1.718 0.647 + 0.170 0.007 FUT8 0.966 +0.334 1.841 + 0.370 0.007 DUSP22 0.649 + 0.361 1.383 + 0.504 0.008 BCL11A 0.641 + 0.140 0.937 + 0.160 0.008 CD82 0.359 + 0.100 1.044 + 0.382 0.011 ITGA9 0.381 + 0.122 0.221 + 0.070 0.025 ZAP70* 0.412 + 0.384 0.151 + 0.056 0.033 FAHD1 0.855 + 0.214 1.259 + 0.196 0.037 PDLIM5 0.684 + 0.136 0.961 + 0.192 0.049 SVH 1.051 + 0.252 1.689 + 0.394 0.049

* No signif. estadíst. en datos de micromatrices

CAPÍTULO IIICAPÍTULO III: :

MARCADORES PRONÓSTICO MARCADORES PRONÓSTICO EN LLC-BEN LLC-B

OBJETIVOS:OBJETIVOS:

1. Validar biológicamente los marcadores identificados en un grupo muestral independiente.

2. Valorar la utilidad de los genes seleccionados como marcadores subrogados del estado mutacional de IgVH y de pronóstico en estadíos tempranos de la LLC-B

Grupo

INICIALMicromatric

es

Validación metodolog

. por RTqPCR

IgVH mut=24

BCL6mut=9

IgVH no mut= 12

N=36

Grupo

VALIDACIÓN

Validación

BIOLÓGICA RTqPCR

N=38

IgVH mut=30

BCL6mut=11

IgVH no mut= 8

N=74

Marcador Subrogado

IgVH

IgVH mut=54

IgVH no mut= 20

Marcador Pronóstico

(ILT)

LLC

-B:

est

ad

ío

A

Correlación entre expresión relativa y Correlación entre expresión relativa y estado mutacional de IgVestado mutacional de IgVHH en muestras en muestras

del del grupo de validacióngrupo de validación

IgVH Gen

No mut (media + 2SEM)

Mut (media + 2SEM)

p (prueba de Mann

Whitney)

CRY1 0.275 + 0.114 0.055 + 0.004 <0.001 LPL 228.4 + 59.6 20.11 + 13.72 <0.001 BCL7A 1.44 + 0.742 0.073 + 0.042 <0.001 ZAP70 0.661 + 0.418 0.071 + 0.052 <0.001 CD82 0.433 + 0.076 0.689 + 0.112 0.013 DUSP22 1.18 + 0.38 1.90 + 0.30 0.023

Marcadores subrogados de IgVMarcadores subrogados de IgVHH

Sensibilidad, especificidad, y área Sensibilidad, especificidad, y área bajo la curva ROCbajo la curva ROC

en grupo de validaciónen grupo de validación

Gen Sensib (%) Especif (%) Valor de Corte Area ROC

CRY1 100 100 < 0.090 1.00

LPL 100 93 < 82.45 0.987

BCL7A 100 82 < 0.1150 0.950

ZAP70 100 89 < 0.1050 0.960

CD82 83 50 > 0.4050 0.78

DUSP22 90 63 > 1.020 0.76

Expresión de genes seleccionados y Expresión de genes seleccionados y

estado mutacional del gen IgVestado mutacional del gen IgVHH

NNoo MMuutt MMuutt CCoonnccoorrddaanncciiaa GGeenn VVaalloorr ddee ccoorrttee

n % n % %

p

(Chi cuadrado)

>0.090 19 27.1 4 5.7 CRY1 <0.090 1 1.4 46 65.7

92.8 <0.0001

>82.45 20 28.2 6 8.5 LPL <82.45 0 0.0 45 63.4

91.6 <0.0001

>0.105 20 28.2 12 16.9 ZAP70 <0.105 0 0.0 39 54.9

83.1 <0.0001

<0.115 17 23.9 10 14.1 BCL7A >0.115 3 4.2 41 57.7

81.6 <0.0001

CRY1 y LPL CRY1 y LPL como como

marcadores marcadores subrogados del subrogados del

estado estado mutacional de mutacional de

IgVIgVHH

Las barras de error representan el 95% del intervalo de confianza. La línea roja muestra el valor de corte para cada parámetro

A

B

A

B

No mut Mut

No mut MutIgVH

IgVH

La significación estadística de las diferencias entre curvas fue evaluada por la prueba Log-rank.

Curvas de Kaplan-Meier: Mutaciones en Curvas de Kaplan-Meier: Mutaciones en IgVIgVHH

Actualm. usado en clínica.

Curvas de Kaplan-Meier: Curvas de Kaplan-Meier: LPL, CRY1 y ZAP70LPL, CRY1 y ZAP70

N=71

CRY1CRY1

p<0.0001

LPLLPL

p<0.0001

ZAP70-ZAP70-RTqPCRRTqPCR

p=0.001

CRY1: ¿NUEVO BIOMARCADOR EN LLC-B?CRY1: ¿NUEVO BIOMARCADOR EN LLC-B? Correlación Correlación con la expresión de ZAP70 o LPL y estado mutacional de con la expresión de ZAP70 o LPL y estado mutacional de

IgVIgVHH CRY1 + CRY1 -

ZAP70 qPCR + 22 10

ZAP70 qPCR - 1 38

CRY1 + CRY1 -

LPL + 21 5

LPL - 2 42

19 IgVH No mut3 IgVH Mut 2= ZAP70 FC+

CD38+

38 IgVH Mut

20 IgVH No mut1 IgVH Mut 1= ZAP70 FC+

CD38+

42 IgVH Mut

9 IgVH Mut1 IgVH No mut

1 IgVH Mut

CD38+

4 IgVH Mut1 IgVH No mut

2 IgVH Mut

15.5% discordancias

10.0% discordancias

CRY1: Expresión en PBMCCRY1: Expresión en PBMC

Gen IgV HP

(prueba de Mann Whitney)

No mut(media + 2 SEM)

Mut (media + 2 SEM)

CRY1 0.380 + 0.245 0.051 + 0.038 0.007

MARCADOR SUBROGADO IgVIgVHH

Ensayo ClínicoEnsayo Clínico

N=18 sin selección de células B

CONCLUSIONESCONCLUSIONES

1. Los estudios funcionales y de expresión génica que hemos realizado sobre muestras de pacientes en estadíos tempranos de LLC, demuestran la heterogeneidad de esta entidad y manifiestan la existencia de subgrupos moleculares bien definidos dentro de esta patología.

2. Mas de un centenar de genes diferencian los perfiles transcriptómicos de muestras con y sin mutaciones en el gen IgVH, en cambio no se encuentran diferencias en los perfiles de expresión con respecto a las mutaciones en BCL6.

3. En el análisis de anotaciones funcionales, la herramienta FatiScan encuentra en las muestras con IgVH no mutado sobreexpresadas vías de señalización involucradas en supervivencia y proliferación celular provenientes del entorno y de la matriz extracelular e inhibida la apoptosis.

4. Existen varios genes cuya expresión podría utilizarse como marcador subrogado del estado mutacional de IgVH y de pronóstico en LLC-B, siendo el gen CRY1, uno de los que proponemos para ser incorporado en ensayos clínicos y posiblemente en la práctica clínica.

Hospital ClínicoHospital Clínico

Javier García Conde

Ma Jose Terol

Isana Benet

Pilar Eroles

Isabel Marugan

Elena Sarsotti

Miguel Marín

CIPFCIPF

Hematología MolecularHematología Molecular

Rosa Farras

Cristina Reinoso

Sandra Gallach

CIPFCIPF

BioinformáticaBioinformática

Joaquín Dopazo

David Montaner

Hospital Arnau de Hospital Arnau de VilanovaVilanova

Jose Ramón Mayans

Carlos García Ballesteros

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