UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS...

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

CARRERA DE QUÍMICA Y FARMACIA

TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO

PARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICOS Y FARMACÉUTICOS

TEMA

“DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ÁCIDOS CLOROGÉNICOS, EN

ESPECIES DE CAFÉ (Coffea arábica, Coffea canephora) CULTIVADO EN

ECUADOR”.

AUTORES:

ESTRADA MEZA BLANCA CAROLINA

LUNA PERALTA ALEX HUGO

TUTORA:

Ph.D. TATIANA ZAMORA ZAMORA

CO-TUTORA:

Ph.D. MERIBARY MONSALVE PAREDES

GUAYAQUIL - ECUADOR

2020

i

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

CARRERA QUÍMICA Y FARMACIA

UNIDAD DE TITULACIÓN

FICHA DE REGISTRO DE TESIS/TRABAJO DE GRADUACIÓN

TÍTULO Y SUBTÍTULO:

“DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ÁCIDOS CLOROGÉNICOS, EN ESPECIES DE CAFÉ (Coffea arábica, Coffea canephora) CULTIVADO EN

ECUADOR”.

AUTOR (ES): Estrada Meza Blanca Carolina Luna Peralta Alex Hugo

DOCENTE TUTOR Y DOCENTE REVISOR :

Ph.D. Tatiana Zamora Zamora, (Tutora) Ph.D. Meribary Monsalve Paredes (Co-tutora) Dra. María del Carmen Villacrés (Revisor)

INSTITUCIÓN: Universidad de Guayaquil

UNIDAD/FACULTAD: Ciencias Químicas

MAESTRÍA/ESPECIALIDAD:

GRADO OBTENIDO: Tercer Nivel / Químicos y Farmacéuticos

FECHA DE PUBLICACIÓN: 2020 No. DE PÁGINAS: 82

ÁREAS TEMÁTICAS: Investigación

PALABRAS CLAVES/ KEYWORDS:

Ácidos clorogénicos, 5-CQA, Coffea arábica, Coffea Canephora, UPLC-MS

RESUMEN El presente trabajo de investigación tiene como objetivo identificar y cuantificar el contenido de los isómeros de ácidos clorogénicos en granos de café en tres etapas del proceso de maduración del grano, de las especies arábica y robusta cultivadas en Ecuador. A partir de los extractos hidroalcohólicos obtenidos por maceración se realizó la determinación de seis isómeros de ácidos clorogénicos, siendo estos 3-CQA, 5-CQA, 4-CQA, 3,4- diCQA, 3,5- diCQA y 4,5-diCQA, mediante cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas utilizando como fase estacionaria una columna C18 (100 mm de longitud, 2.1mm de diámetro interno) y como fase móvil un gradiente de ácido fórmico al 0.1 % (fase A) y acetonitrilo (fase B). Los resultados obtenidos permiten confirmar que el 5-CQA es el compuesto clorogénico de mayor concentración en las especies estudiadas, con valores diferentes para las variedades de ambas especies evidenciando que en C. arábica predomina un contenido menor de estos compuestos en el grano verde con respecto a los granos en estado maduro, y en C. robusta es mayor el contenido de ácidos clorogénicos en el grano verde. Adicionalmente, el estudio realizado ha permitido la optimización y disponibilidad de un método analítico (UPLC-MS) para la determinación de ácidos clorogénicos con resultados satisfactorios de precisión en un tiempo corto de análisis. Esta información es de interés tanto para laboratorios de control, como para la caracterización de las especies estudiadas.

ADJUNTO PDF: X SI NO

CONTACTO CON AUTOR/ES: Teléfono: 0995387811 Teléfono: 0980154846

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INSTITUCIÓN:

Nombre: FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

Teléfono: (04) 2293680

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xii

AGRADECIMIENTO

Sobre todas las cosas, a Dios.

Han pasado cinco años y medio desde que empezó este largo camino por

convertirnos en profesionales, el cual hemos recorrido juntos, desde nivelación

hasta la realización de esta tesis. Al final de todo este proceso ambos tenemos

una sola meta, y es, que nuestros padres se alegren al ver en nosotros el fruto

de su esfuerzo. Finalmente, el momento ha llegado y orgullosos podemos decir,

que todo lo logrado se lo debemos enteramente a ustedes.

Es conocido, que la realización de una tesis no es tarea fácil y para ello fue

necesaria la ayuda de muchas personas, a quienes les guardamos el más

sincero cariño y agradecimiento.

Agradecemos en primer lugar a nuestra tutora, Ph. D Tatiana Zamora y co–tutora

Ph. D Meribary Monsalve quiénes bajo su dirección nos supieron guiar en nuestro

proceso de titulación.

Nuestro profundo agradecimiento al QF. Sergio Maquilón y al M.Sc. Jean Carlos

Belandria, quienes, sin tener la obligación nos brindaron su ayuda y tuvieron para

con nosotros la mejor disposición en todo momento.

Al Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias, en especial al Ing. Luis

Plaza, por su colaboración brindada.

Por último y no menos importante, a todas las personas que de una u otra

manera nos acompañaron y fueron parte de este proceso, amigos y familia.

A todos ustedes, muchas gracias.

xiii

ÍNDICE GENERAL

RESUMEN ................................................................................................. XX

INTRODUCCIÓN ...........................................................................................1

CAPÍTULO I ...................................................................................................2

PROBLEMA ...................................................................................................2

I.1 Planteamiento del problema ..................................................................2

I.2 Formulación del problema .....................................................................4

I.3 Justificación ...........................................................................................5

I.4 Hipótesis ...............................................................................................6

I.5 Objetivos ...............................................................................................7

I.5.1 Objetivo General .............................................................................7

I.5.2 Objetivos específicos ......................................................................7

I.6 Operacionalización de las variables ......................................................8

CAPÍTULO II ..................................................................................................9

MARCO TEORICO ........................................................................................9

II.1 Café .....................................................................................................9

II.1.1 Producción de café en Ecuador .....................................................9

II.2 Especies de café cultivadas en Ecuador............................................. 11

II.2.1 Café robusta ................................................................................ 11

II.2.2 Variedades................................................................................... 11

II.3 Café arábica ....................................................................................... 12

xiv

II.3.1 Variedades................................................................................... 12

II.4 Composición química del café ............................................................ 14

II.5 Ácidos clorogénicos............................................................................ 15

II.5.1 Estructura .................................................................................... 15

II.5.2 Propiedades ................................................................................. 19

II.6 Análisis cromatográfico ...................................................................... 21

II.6.1 Cromatografía .............................................................................. 21

II.6.2 Detectores de Cromatografía Líquida ........................................... 23

II.7 Análisis de metodologías utilizadas en la determinación de ácidos

clorogénicos en café, derivados y otras especies vegetales. ........................ 26

CAPÍTULO III: METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN ........................... 37

III.1 Tipo de investigación ......................................................................... 37

III.2 Equipos, aparatos, materiales y reactivos .......................................... 37

III.2.1 Reactivos .................................................................................... 37

III.2.2 Materiales ................................................................................... 37

III.2.3 Equipos y Aparatos ..................................................................... 38

III.3 Muestras ........................................................................................... 38

III.4 Diseño experimental .......................................................................... 39

III.4.1 Selección de muestras ................................................................... 40

III.4.2 Determinación de Humedad ........................................................... 42

III.4.3 Análisis cromatográfico de los ácidos clorogénicos ........................ 42

III.4.3.1 Preparación de soluciones stocks (3-CQA, 4-CQA, 5-CQA, 3,4-

xv

diCQA, 3,5-diCQA, 4,5-diCQA) ................................................................. 43

III.4.3.2 Preparación de la curva de calibración .................................... 43

III.4.3.3 Condiciones cromatográficas ................................................... 44

III.4.3.4 Método de extracción del ácido clorogénico............................. 44

III.4.3.5 Preparación de muestras para el análisis cromatográfico......... 45

CAPÍTULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES ........................................ 46

IV.1 Determinación del porcentaje de humedad ....................................... 46

IV.2 Optimización de condiciones cromatográficas .................................. 46

IV.3 Curva de calibración ......................................................................... 48

IV.4 Análisis del contenido de ácidos clorogénicos .................................. 51

IV.4.1 Análisis del contenido de Mono-isómeros de ácidos clorogénicos

en Coffea arábica y Coffea canephora. ..................................................... 53

IV.4.2 Análisis del contenido de Di-isómeros de ácidos clorogénicos en

Coffea arábica y Coffea canephora ........................................................... 56

CONCLUSIONES ........................................................................................ 59

RECOMENDACIONES ................................................................................ 60

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 61

GLOSARIO .................................................................................................. 66

ANEXOS ...................................................................................................... 67

xvi

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla I. Taxonomía del café .......................................................................... 9

Tabla II. Composición química (Arábica y Robusta). .................................... 14

Tabla III. Isómeros de ácidos clorogénicos .................................................. 15

Tabla IV. Diferencias entre HPLC y UPLC. .................................................. 22

Tabla V. Comparación de la metodología utilizada en diferentes estudios para

la determinación de ácidos clorogénicos. ..................................................... 26

Tabla VI. Identificación de especies, variedades y código de muestras que

fueron objeto de estudio. .............................................................................. 38

Tabla VII. Volúmenes de trabajo de la curva de calibración ......................... 43

Tabla VIII. Elución en modo gradientes de las fases A y B ......................... 44

Tabla IX. Porcentaje de humedad de acuerdo a las especies de café ......... 46

Tabla X. Tiempo de retención de los isómeros de ácidos clorogénicos. ....... 48

Tabla XI. Niveles de concentración utilizados para la curva de calibración y

áreas obtenidas de los compuestos MonoCQA ............................................ 49

Tabla XII. Linealidad de la curva de calibración de los MonoCQA ............... 49

Tabla XIII. Niveles de concentración utilizados para la curva de calibración y

áreas obtenidas de los compuestos diCQA .................................................. 50

Tabla XIV. Linealidad de la curva de calibración de los diCQA .................... 50

Tabla XV. Rango de valores de concentración para cada isómero de ácido

clorogénico .................................................................................................. 53

xvii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1.Zonas productoras de café en Ecuador ......................................... 10

Figura 2. Estructura química de los ácidos cafeoilquínicos 3-CQA, 4-CQA y

5-CQA .......................................................................................................... 17

Figura 3.Estructura química de los ácidos dicafeoilquinícos 3,4-diCQA, 3,5-

diCQA y 4,5-diCQA ...................................................................................... 18

Figura 4. Estructura química de los ácidos feruoilquínico 3-FQA, 4-FQA y 5-

FQA ............................................................................................................. 19

Figura 5. Componentes del espectrómetro de masas.................................. 24

Figura 6. Flujograma de la metodología aplicada ........................................ 39

Figura 7.Caracterización de los estados de maduración del café ................ 40

Figura 8. Muestras seleccionadas de acuerdo al grado de maduración ....... 41

Figura 9. Cromatograma obtenido mediante UPLC-MS de un mix de

estándares a una concentración de 1 ppm ................................................... 47

Figura 10. Curva de calibración de los estándares MonoCQA ..................... 49

Figura 11. Curva de calibración de los estándares diCQA ........................... 50

Figura 12. Contenido de mono-CQA y di-CQA en especies de café cultivadas

en Ecuador. ................................................................................................. 52

Figura 13.Contenido de ácido 5-cafeoilquínico, en especie Coffea arábica.54

Figura 14. Contenido de ácido 5-cafeoilquínico, en especie Coffea canephora

..................................................................................................................... 55

Figura 16. Cromatograma de la muestra de café robusta: A) Elución de los

monoCQA; B) Elución de los diCQA ............................................................ 57

Figura 15. Cromatograma de la muestra de café arábica: A) Elución de los

monoCQA; B) Elución de los diCQA ............................................................ 58

xviii

ÍNDICE DE ANEXOS

Anexos A. Muestreo, junio de 2019 ............................................................ 67

Anexos B. Muestras seleccionadas de Coffea arábica ................................ 68

Anexos C. Muestras seleccionadas de Coffea canephora ........................... 69

Anexos D. Resultados obtenidos en la determinación de humedad ............ 70

Anexos E. Maceración hidroalcohólica de las muestras .............................. 71

Anexos F. Extractos hidroalcohólicos en viales. ......................................... 71

Anexos G. Cromatógrafo UPLC Waters (modelo ACQUITY) con detector de

espectrometría de masas (QDa). ................................................................ 71

xix

LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS

CQA Ácidos Clorogénicos

MONO-CQA Mono-ácidos clorogénicos

DI-CQA Di-ácidos clorogénicos

ULPC Cromatografía liquida de ultra rendimiento

MS Espectrómetro de masas

QDa Detector de masas

CIE Comission Internationale de l´Eclairage

DDA Días después de la antesis

3-CQA 3-cafeoilquínico



3,4-diCQA ácido 3,4-dicafeolquínico



xx

“DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ÁCIDOS CLOROGÉNICOS, EN

ESPECIES DE CAFÉ (Coffea arábica, Coffea canephora) CULTIVADO EN

ECUADOR”.

Autores: Blanca Carolina Estrada Meza

Alex Hugo Luna Peralta

Tutora: Ph.D Tatiana Zamora Zamora

RESUMEN

El presente trabajo de investigación tiene como objetivo identificar y cuantificar el

contenido de los isómeros de ácidos clorogénicos en granos de café en tres etapas del

proceso de maduración del grano, de las especies arábica y robusta cultivadas en

Ecuador. A partir de los extractos hidroalcohólicos obtenidos por maceración se realizó

la determinación de seis isómeros de ácidos clorogénicos, siendo estos 3-CQA, 5-CQA,

4-CQA, 3,4-diCQA, 3,5-diCQA y 4,5-diCQA, mediante cromatografía de líquidos

acoplada a espectrometría de masas utilizando como fase estacionaria una columna

C18 (100 mm de longitud, 2.1mm de diámetro interno) y como fase móvil un gradiente

de ácido fórmico al 0.1 % (fase A) y acetonitrilo (fase B). Los resultados obtenidos

permiten confirmar que el 5-CQA es el compuesto clorogénico de mayor concentración

en las especies estudiadas, con valores diferentes para las variedades de ambas

especies evidenciando que en C. arábica predomina un contenido menor de estos

compuestos en el grano verde con respecto a los granos en estado maduro, y en C.

robusta es mayor el contenido de ácidos clorogénicos en el grano verde.

Adicionalmente, el estudio realizado ha permitido la optimización y disponibilidad de un

método analítico (UPLC-MS) para la determinación de ácidos clorogénicos con

resultados satisfactorios de precisión en un tiempo corto de análisis. Esta información

es de interés tanto para laboratorios de control, como para la caracterización de las

especies estudiadas.

Palabras claves: Ácidos clorogénicos, 5-CQA, Coffea arábica, Coffea robusta,

UPLC-MS.

xxi

"DETERMINATION OF THE CONTENT OF CHLOROGENIC ACIDS, IN

COFFEE SPECIES (Coffea arabica, Coffea canephora) CULTIVATED IN

ECUADOR".

Authors: Blanca Carolina Estrada Meza

Alex Hugo Luna Peralta

Tutor: Ph.D Tatiana Zamora Zamora

ABSTRACT

The purpose of this investigation is to identify and quantify chlorogenic acids in

isomers of Ecuadorian arabic and robust species coffee beans, in three stages of

maturity. From the hydroalcoholic extracts obtained by maceration, was determined six

isomers of chlorogenic acids: 3CQA, 5CQA, 4CQA, 3,4DiCQA, 3,5DiCQA and

4,5DiCQA, by liquid chromatography /mass spectrometry, using as a stationary phase a

C18 column (100 mm long, 2.1 mm internal diameter) and as a mobile phase a gradient

of 0.1% formic acid (phase A) and acetonitrile (phase B). The results obtained confirm

that 5-CQA is the chlorogenic compound with the highest concentration in the studied

species, with different values for the varieties of both species, evidencing that a smaller

content of these compounds in green grain predominates in Coffea Arabica, compared

to grains in mature state; and in Coffea Robusta the content of chlorogenic acids in the

green grain is greater. Additionally, the study has allowed the optimization and availability

of an analytical method (UPLC-MS) for the determination of chlorogenic acids with

satisfactory and precise results in a short time of analysis. This information is of interest

both for quality control and for the characterization of the species studied.

Keywords: Chlorogenic acids, 5-CQA, Coffea arabica, Coffea robusta, UPLC-

1

INTRODUCCIÓN

Para Ecuador el café es un bien agropecuario de exportación de alta

relevancia. Ecuador es uno de los pocos países en el mundo que cultiva y

exporta las dos principales especies comerciales en el contexto mundial, Coffea

arabica (café arábica) y Coffea canephora (café robusta).

Los ácidos clorogénicos, uno de los compuestos químicos del café, son

compuestos fenólicos producidos por una amplia variedad de organismos en la

naturaleza, a los cuales se les atribuyen variedad de beneficios y propiedades,

tales como, actividad anti-hipertensiva, antioxidante, mejoramiento en el

metabolismo de lípidos y glucosa, entre otros (Mainheart, A. 2017).

Además de las propiedades terapéuticas, se ha reportado que los ácidos

clorogénicos tienen una marcada influencia en la calidad del café, debido a que

la concentración de estos ácidos incide directamente en el aroma y sabor del

mismo (Chaves-Ulate & Esquivel-Rodíguez, 2019).

En este sentido, y por los diferentes beneficios que se adjudican a los ácidos

clorogénicos, la determinación de estos compuestos fenólicos en el café

ecuatoriano, constituye un valor agregado a uno de los recursos vegetales de

mayor importancia socioeconómica para el país.

El presente trabajo evalúa el contenido de compuestos bioactivos conocidos

como ácidos clorogénicos en granos de café seleccionados de las especies

Coffea arábica y Coffea canephora, en diferentes estados de maduración, para

posteriormente establecer comparaciones y ponderar así, la calidad que el

producto nacional presenta.

A partir de las muestras, se aplicaron metodologías que permiten una

satisfactoria obtención de los ácidos clorogénicos en el extracto de café para

posteriores ensayos de análisis; además de técnicas cromatográficas como

UPLC-MS que, en función del tipo de muestra y compuesto, además de la

información espectral que proporciona dicho sistema, se definió como la más

adecuada.

2

CAPÍTULO I

PROBLEMA

I.1 Planteamiento del problema

El café es considerado un recurso agrícola de gran importancia

socioeconómica en Ecuador; constituyendo uno de los sectores productivos con

mayor potencial de desarrollo en generación de divisas a lo largo de muchas

décadas.

Actualmente la caficultura ecuatoriana atraviesa por escenarios críticos,

debido a la baja producción de café que se registra en el país, la disminución del

rendimiento de los cafetos y la reducción de superficie productiva para este rubro.

Ante esta situación, se considera que la poca investigación existente sobre el café

ecuatoriano, impide el acertado planteamiento de proyectos estratégicos que

permitan mitigar este escenario.

Factores externos como la variabilidad en los precios de café en el mercado

internacional, representa otra problemática para el sector cafetero. Según cifras

oficiales de la Asociación Nacional de Exportadores de Café (ANECAFE), a

octubre del 2019 las exportaciones de café reportaron cifras significativamente

bajas en comparación con años anteriores. Desde el año 2012 en adelante, se

ha registrado una disminución de un 78%, en las exportaciones de café y sus

derivados, lo que en la actualidad representa una pérdida de aproximadamente

USD 214 millones, en generación de divisas para el país.

Por lo que se considera, que basar la mayor parte de la economía proveniente

de un recurso natural como el café, únicamente en las exportaciones no es del

todo acertado, debido a la enorme susceptibilidad de este sector frente a factores

externos; siendo necesario diversificar los usos o aplicaciones de la especie en

función de las propiedades y calidad del fruto.

El café es una especie vegetal, que puede ser aprovechada como producto al

granel, como materia prima para elaboración de derivados, y como producto

natural para el aprovechamiento del contenido de compuestos químicos que

posterior a procesos industriales pueden ser exportados como materia prima,

entre otros. Esto, siempre y cuando exista el levantamiento de información que

permita ampliar la oferta en cuanto al aprovechamiento de la producción agrícola.

3

Al respecto, en el país, centros especializados de investigación realizan

esfuerzos científicos para el mejoramiento biológico de la especie Coffea, pero

desde el espacio de las ciencias químicas es necesario conocer los potenciales

de la especie en función de su composición química.

4

I.2 Formulación del problema

De acuerdo con los antecedentes del planteamiento del problema, es

necesario establecer como interrogante para este estudio: ¿Cuáles son los

niveles de concentración de los isómeros de ácidos clorogénicos presentes en

el café de acuerdo a la especie y grado de maduración de las especies de Coffea

cultivadas en Ecuador?

5

I.3 Justificación

Los ácidos clorogénicos comprenden un grupo de ácidos resultantes de la

unión entre ácidos transcinámicos y el ácido quínico. Estos compuestos fenólicos

son reconocidos por la diversa actividad biológica que presentan, según lo

reportado por numerosos estudios. En comparación con otras especies, el café

presenta un mayor contenido de ácidos clorogénicos, los cuales en su mayoría

se encuentran como mono y di-ésteres, y forman más de 40 compuestos.

Actualmente el sector cafetalero del país enfrenta problemas en toda su

cadena productiva, razón por la cual se requiere del compromiso de todos

quienes son parte de la cadena agroindustrial del café, así como de las

instituciones de educación superior que promueven la investigación y el

desarrollo del sector cafetalero como una contribución efectiva al impulso de la

transformación de la matriz productiva del país.

La información que se pueda obtener, sobre la composición química, y de

compuestos bioactivos en el café, permitiría a los actores del sector tener un

mayor conocimiento sobre este recurso agrícola, y encauzaría un mejor

aprovechamiento del grano de café ecuatoriano.

El presente trabajo evalúa el contenido de ácidos clorogénicos, 3-

cafeoilquínico, 5-cafeoilquínico, 4-cafeoilquínico, acido 3,4-dicafeolquínico, acido

3,5-dicafeolquínico, acido 4,5-dicafeolquínico en granos de café ecuatoriano

seleccionados de acuerdo a especies, variedades y grado de maduración,

consideradas variables para este estudio.

Para el alcance de las metas planteadas, se hace necesaria la aplicación de

técnicas cromatográficas que permiten no solo identificar, sino confirmar y

cuantificar el contenido de ácidos clorogénicos; para posteriormente poder

establecer comparaciones entre las variables antes mencionadas.

Para ello, en la presente investigación se ha llevado a cabo la optimización de

las condiciones analíticas para la determinación satisfactoria y rápida de ácidos

clorogénicos. Cabe destacar, que la metodología desarrollada en este trabajo

constituye una base para posteriores determinaciones de estos compuestos en

especies similares, mediante la aplicación de un sistema de Cromatografía

Liquida de Ultra Rendimiento acoplado a un detector de espectrometría de

6

masas (UPLC – MS), de tal manera que en comparación con otras metodologías

se puedan obtener resultados de identificación y cuantificación, con mayor

precisión y en un menor tiempo de análisis.

I.4 Hipótesis

El café ecuatoriano presenta diferencias en su contenido de ácidos

clorogénicos de acuerdo a su especie y estado de maduración.

7

I.5 Objetivos

I.5.1 Objetivo General

Determinar el contenido de isómeros de ácidos clorogénicos en especies

seleccionadas del género Coffea cultivado en Ecuador.

I.5.2 Objetivos específicos

• Optimizar condiciones analíticas para la identificación y cuantificación

cromatográfica de los isómeros de ácidos clorogénicos presentes en el café

cultivado en el Ecuador.

• Evaluar el contenido de ácidos clorogénicos en las especies

seleccionadas de café ecuatoriano de acuerdo al grado de maduración de la

especie.

• Establecer un estudio comparativo entre los niveles de ácidos

clorogénicos del café cultivado en Ecuador, de acuerdo a su especie y grado de

maduración.

8

I.6 Operacionalización de las variables

VARIABLES CONCEPTUALIZACIÓN INDICADORES

DEPENDIENTES

Identificación de ácidos

clorogénicos

Detección de los

compuestos

Tiempo de retención y espectro MS

Contenido de ácidos

clorogénicos

Cantidad de metabolitos

contenidos en una matriz

mg/Kg

INDEPENDIENTES

Especie

Identificación botánica de la especie

Características

Grado de maduración

Establecido mediante escala colorimétrica

CIE

Elaborado por: Autores, (2020).

9

CAPÍTULO II

MARCO TEORICO

II.1 Café

El café es uno de los productos más consumidos a nivel mundial. Según el

Servicio Ecuatoriano de Normalización (INEN), se puede definir al café como el

producto comestible de las especies cultivadas del genero Coffea, en las cuales

frutos y granos son utilizados como alimentos. Taxonómicamente la planta de

café corresponde a la división Magnoliophyta, como se observa en la Tabla I.

Tabla I. Taxonomía del café.

CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA

REINO Vegetal

DIVISION Magnoliophyta

CLASE Dicotyledoneae

SUBCLASE Asteridae

ORDEN Rubiales

FAMILIA Rubiaceae

GENERO Coffea

Fuente: Bold et al., 1980.

II.1.1 Producción de café en Ecuador

El café para Ecuador es uno de los principales productos de exportación, lo

que lo convierte en una de las especies de mayor relevancia para el país. En

materia económica el café ecuatoriano en el 2019 genero $55.785.542 en

divisas, según datos de la Asociación Nacional de Exportadores de Café

(ANECAFE). En el ámbito social, el sector cafetalero es generador de empleo

para las familias que basan sus recursos en la agricultura, incluso, en la región

amazónica la producción de café permite que las distintas etnias como los

Kichwas, Shuaras, Tsáchilas se beneficien mediante el comercio de este

producto (PROECUADOR, 2013).

10

Según datos de ANECAFE, Ecuador presenta una producción mixta, es decir,

que cultiva las especies arábica (Coffea arábica) y robusta (Coffea canephora),

razón por la cual, es uno de los 14 países entre cerca de 70 que exporta ambas

especies.

En Ecuador, la siembra de café se da en sus cuatro regiones naturales: la

región costa siembra 112.000 hectáreas, la región andina 62.000 hectáreas, la

región amazónica 55.000 hectáreas y la región Insular 1000 hectáreas de

cafetales.

En la Figura 1, se destacan las principales zonas del Ecuador donde existe

mayor producción cafetalera, de acuerdo con registros del año 2017 reportados

por el INEN.

Figura 1.Zonas productoras de café en Ecuador

Fuente: INEN-ESPAC 2017

11

Las principales zonas de cultivo de café se dividen en:

• Zona oriental: Comprenden a las provincias de Napo, Sucumbíos y

Francisco de Orellana. Productoras de café robusta.

• Zona centro oeste: la provincia de Manabí. Productora de café arábico

• Zona central: provincias de Pichincha, Esmeraldas, Bolívar, Cotopaxi y

Los Ríos. Productoras de café arábico y robusta

• Zona sur: provincias de Loja, Zamora Chinchipe y El Oro. Productoras de

café arábico

II.2 Especies de café cultivadas en Ecuador.

II.2.1 Café robusta

La especie Coffea canephora conocida como café robusta, es un arbusto

multicaule el cual puede alcanzar de hasta 12 metros de altura. Las

inflorescencias son axilares, formadas por uno o tres verticilos, constituido cada

uno por 15 a 30 flores blancas, cuya corola posee de 5 a 7 pétalos. Sus ramas

son largas de 20 a 35 cm de largo y 8 a 15 cm de ancho, oblongas acuminadas

y con relieve abarquillado. (Játiva Reyes, M., y Tinoco J., L. 1994).

II.2.2 Variedades

Congolensis

La variedad congolensis posee varias características útiles, como una gran

tolerancia a la enfermedad de la Roya (Hemileia vastratix), al barrenillo blanco

del tallo y a la invasión de nematodos. Es originaria del Congo y tiene el potencial

de dar rendimientos constantes (Duicela, et al 2006).

Timor

La variedad Timor resulta del cruce natural entre Coffea canephora y Coffea

arábica. Las plantas de esta variedad, presentan variabilidad en sus

características morfológicas y productivas. Los rangos de adaptación son

limitados y presentan resistencia a la Roya del cafeto y también resistencia a la

12

enfermedad de los frutos causados por el hongo Colletotrichum coffeanum (CBD)

(INIAP, 1993).

Conilon

La variedad Conilon se origina en Gabón (África) y posteriormente introducida

en el sureste de Brasil. Presenta gran diferencia genética en productividad,

tamaño, maduración y además alta tolerancia a plagas y enfermedades. Posee

hojas pequeñas con bordes ondulados y presenta una fecundación cruzada,

ocasionada principalmente por la auto-incompatibilidad (INCAPER, 2007).

II.3 Café arábica

La especia arábica es originaria de las montañas sur occidentales de Etiopía,

en el altiplano del Sudán y el Norte de Kenia, en el África nororiental, el mismo

que está ubicado entre 1.300 a 2.000 metros de altitud.

Se encuentra en estado silvestre y alcanza entre 9 y 12 metros de altura, con

hojas opuestas y simples con color verde oscuro, borde ondulado, base obtusa

y ápice acuminado. Produce una drupa carnosa y ovoide de color rojo la cual

contiene dos semillas (Amores et al., 2004).

II.3.1 Variedades

Sarchimor

Proviene de un cruce entre dos variedades: Villa Sarchi (de la familia de café

bourbon), y Timor. Se combinaron los nombres de Villa Sarchí e Híbrido de Timor

para llamarle finalmente Sarchimor. Esta es una variedad que se ha utilizado

para mejorar la resistencia a la Roya.

Esta variedad se ha vuelto popular en muchas fincas del continente americano

debido a su excelente taza de productividad y su tolerancia a diferentes plagas

(INIAP, 1993).

Caturra rojo

La variedad Caturra rojo proviene de una mutación del Borbón, en el estado

Minas Gerais en Brasil. Es una planta de tronco grueso, porte bajo, y poco

ramificado. Posee entrenudos cortos en sus ramas y en el tallo, lo que lo hace

https://es.wikipedia.org/wiki/Hoja

https://es.wikipedia.org/wiki/Hoja

https://es.wikipedia.org/wiki/Drupa

https://es.wikipedia.org/wiki/Semilla

13

un alto productor. Posee hojas grandes, redondeadas, gruesas, de borde

ondulado, y de color verde oscuro. Es un arbusto de un aspecto compacto y de

mucho vigor. Las ramas laterales forman un ángulo cerrado con el tronco (INIAP,

1993).

Catuaí rojo

Es una variedad originaria de Brasil, resultado del cruzamiento de Caturra y

Mundo Novo. Es de porte pequeño e internudos cortos. Presenta gran

uniformidad genética y tiene la propiedad de producir mucho, y debido al

crecimiento secundario en las bandolas (palmilla), desde pequeño posee un

potencial de muy alta producción.

El Catuaì rojo es la variedad de más amplia distribución en Ecuador, así como

el Catuaì amarillo; ambos mantienen características y cualidades similares pero

el Catuaì rojo es de preferencia por parte de los productores (INIAP, 1993).

Pacas

Es un híbrido que se formó de forma natural de la variedad Bourbón, debe su

nombre al apellido de la familia en cuya propiedad se identificó la variedad.

El arbusto de Pacas es de porte bajo, sus ramas laterales forman un ángulo

de 45 grados. Posee follaje abundante, con hojas de color verde oscuro, así

como entrenudos cortos que le dan un aspecto compacto. El fruto de Pacas es

de color rojo y tamaño es mediano. Esta variedad desarrolla una gran tolerancia

a los problemas de sequía, viento y sol y se adapta mejor a altitudes de 500 a

1000 msnm (INIAP, 1993).

Acawa

La variedad Acawa, es originaria del cruce de Mundo Novo y Sarchimor, es

una semilla altamente productiva con muy buenas características organolépticas,

son resistentes a los periodos prolongados de sequía y a la enfermedad de la

Roya (INIAP, 1993).

Catucai

La variedad Catucai se originó a partir del cruce de Icatú y Catuaí en el Instituto

Brasileño del Café (IBC). Generalmente presenta resistencia moderada a la

Roya (Hemileia vastratix), es decir, ocurre poca caída de hojas y

14

consecuentemente menor daño en la planta (Ministerio de Agricultura y

Ganadería, 2014).

II.4 Composición química del café

El café contiene más de 2000 compuestos diferentes, como carbohidratos,

fibras, compuestos de nitrógeno, lípidos, minerales, ácidos y ésteres. Entre

estos, los ácidos clorogénicos (CQA) y la cafeína presentan importantes

beneficios para la salud.

La especie arábica posee características fenotípicas diferentes con respecto

a la especie robusta; estas características inciden en la diferencias o variaciones

en el contenido y/o proporción de los compuestos químicos de las especies,

como se detalla en la Tabla II. En donde se evidencia que en general presentan

un mismo orden de magnitudes, a excepción de ciertos compuestos tales como,

ácidos clorogénicos, sacarosa, cafeína y lípidos.

Tabla II. Composición química (Arábica y Robusta).

Componente químico Arábica (%) Robusta (%)

Polisacáridos 50,8 56,40

Sacarosa 8,00 4,00

Azucares reductores 0,10 0,40

Proteínas 9,80 9,50

Aminoácidos 0,50 0,80

Cafeína 1,20 2,20

Trigonelina 1,00 0,70

Lípidos 16,20 10,00

Ácidos alifáticos 1,10 1,20

Ácidos clorogénicos 6,90 10,40

Minerales 4,20 4,40

Compuestos

aromáticos

Trazas trazas

Fuente: Cenicafe.org

15

II.5 Ácidos clorogénicos

Los ácidos clorogénicos comprenden una de las familias más importantes de

compuestos polifenólicos presentes en especies vegetales. Son un complejo

grupo de moléculas que incluyen no solamente ésteres del ácido caféico, sino

también ésteres de otros cinamatos, así como los ácidos dicafeoilquinico y

cafeoilferuoilquínico.

II.5.1 Estructura

Los ácidos clorogénicos, deben su estructura a la esterificación entre varios

ácidos hidroxicinámicos con el ácido quínico. Debido a las diferentes posiciones,

variedades y posibilidades de condensación entre estos, el término ácidos

clorogénicos abarca un extenso grupo de ácidos denominados acorde a su

estructura, tal como son los ácidos cafeoilquínicos, ácidos dicafeoilquínicos y

ácidos ferúlicos.

Los ácidos clorogénicos pueden encontrarse principalmente como mono y di-

ésteres, estructuras conjugadas por la esterificación en las posiciones 1-, 3-, 4-,

5-del ácido quínico. Así tenemos, los ácidos cafeoilquínicos (CQA), ácidos

dicafeoilquínicos (diCQA), los ácidos feruloilquínicos (FQA) y los ácidos p-

coumaroilquínicos (p-CoQA) (Marin, G. 2008). En la Tabla III, se detalla la

clasificación de los principales ácidos clorogénicos y sus isómeros.

Tabla III. Isómeros de ácidos clorogénicos.

CLASIFICACIÓN ACORDE A LOS ISÓMEROS DE LOS ÁCIDOS

CLOROGÉNICOS

Ácidos

cafeoilquínicos (CQA)

Ácidos

dicafeoilquínicos (DiCQA)

Ácidos

feruloilquínicos (FQA)

ácido 3-cafeoilquínico

(3-CQA)

acido 4-cafeoilquínico

(4-CQA)

ácido 5-cafeoilquínico

(5-CQA)

ácido 3,4-dicafeoilquínico

(3,4-DiCQA)


(3,5-DiCQA)


(4,5-DiCQA)

ácido 3-feruloilquinico

(3-FQA)


(4-FQA)


(5-FQA)


16

Los principales ácidos clorogénicos presentes en el café son, ácido 3-

caffeoilquínico (3-CQA), ácido 4-cafeoilquínico (4-CQA), ácido 5-cafeoilquínico

(5-CQA), ácido 3,4dicaffeoilquínico (3,4-diCQA), ácido 3,5-dicaffeoylquinic (3,5-

diCQA) y ácido 4,5dicaffeoylquinic (4,5-diCQA). También se pueden encontrar,

trazas de ácido 3-feruloilquínico (3-FQA), ácido 4-feruloilquínico (4-FQA), Ácido

5-feruloilquínico (5-FQA), ácido 3-p-cumaroilquínico (3-p-CoQA), ácido 4-p-

cumaroilquínico (4-p-CoQA) y el ácido 5-p-coumaroylquinic (5-p-CoQA) (Liang,

N., & Kitts, D. 2015).

El ácido clorogénico más abundante en el café, es el ácido 5-cafeoilquínico

(5-CQA), el cual se encuentra en mayor concentración en granos de café verde.

Este compuesto ha sido objeto de múltiples estudios, los cuales le atribuyen

distintas propiedades farmacológicas.

A continuación, se muestran las estructuras de los diferentes isómeros de

ácidos clorogénicos, específicamente los ácidos cafeoilquínicos,

dicafeoilquínicos y feruoilquínicos.

ácido 3-cafeoilquínico.

17



Figura 2. Estructura química de los ácidos cafeoilquínicos 3-CQA, 4-CQA y 5-CQA.


Ácido 3,5-dicafeoilquínico.

18



Figura 3.Estructura química de los ácidos dicafeoilquinícos 3,4-diCQA, 3,5-

diCQA y 4,5-diCQA.


19

Ácido 3-feruoilquínico. Ácido 4-feruoilquínico.

Ácido 5-feruoilquínico.

Figura 4. Estructura química de los ácidos feruoilquínico 3-FQA, 4-FQA y 5- FQA.


II.5.2 Propiedades

En las especies vegetales, los ácidos clorogénicos generalmente se localizan

en las paredes celulares unidos a polisacáridos mediante esterificación (Aerts &

Baumann, 1994). Estos compuestos son biosintetizados a partir de la

fenilalanina, y tienen una marcada influencia en la plasticidad y textura de las

plantas, además de cumplir funciones de protección contra daños por herbívoros,

plagas, luz UV y daños físicos (Marin, G. 2008).

Por otra parte, debido a las múltiples propiedades farmacológicas que se les

adjudican a los ácidos clorogénicos y sus isómeros, múltiples investigaciones

describen a éstos ácidos como compuestos bioactivos que poseen propiedades

antimicrobianas, antiinflamatorias, entre otras (Dillenburg et al., 2017).

Estudios in vitro e in vivo relacionan los ácidos clorogénicos con la prevención

de enfermedades cardiovasculares (W. Jiang, Wei, & He, 2015), y de

enfermedades catalogadas como crónicas tales como diabetes (Bagdas et al.,

2015) y obesidad (Gugliucci and Bastos, 2009).

20

En la actualidad, son muchas las propiedades terapéuticas que se le atribuyen

a estos compuestos, entre las que destacan principalmente aquellas que

involucran efectos antioxidantes, captación de radicales libres, inhibición

tumoral, efectos hiperglucémicos, antihipertensivos, así como de protección y

tratamiento de patologías cardiovasculares. Algunos autores (Mu et al., 2017;

Jiang et al., 2000) indican que estos compuestos tienen un gran potencial para

ser utilizados en la investigación y desarrollo de fármacos antitumorales, debido

a que son considerados prooxidantes, es decir tienen un papel importante en la

inhibición del crecimiento de células tumorales.

Se ha reportado, que en los granos de café existen importantes cantidades de

compuestos fenólicos, y se considera que estos compuestos además de los

mencionados beneficios para la salud, también inciden directamente en la

calidad del café, debido a que juegan un papel importante en el sabor y aroma

del mismo (Brigitta et al., 2016).

Diversas investigaciones acerca de ácidos clorogénicos, se han enfocado,

sobre todo, en determinar la biodisponibilidad de estos compuestos, la forma de

absorción y el metabolismo de los mismos en los humanos, así como sus

potenciales efectos en la salud.

La composición química de los granos de café, presenta variaciones en

relación con factores tales como la especie, la madurez, tostación del grano la

fermentación, entre otros; por ejemplo en el caso del tostado del café, los ácidos

clorogénicos cambian su composición debido a que son inestables

térmicamente; debido a las altas temperaturas, parte de estos compuestos son

isomerizados, otros son transformados en quinolactonas, y una última parte son

degradados a compuestos de bajo peso molecular (Clifford, 2000).

Con respecto al estado de maduración del fruto de café, se ha reportado que

existen diferentes tendencias en el contenido de CQA según el grado de

maduración de los granos de café, se sugiere además un mayor contenido de

mono-CQA en granos verdes, así como un contenido de los di-CQA superior en

granos en estado maduro (Anthony et al., 1993; Clifford, M. 1985; Guyot et al;

1988). Estudios sugieren que, en el fruto del café, las transformaciones de estos

compuestos transcinánimos, puede deberse en parte a una hidrólisis producida

21

por la oxidación que sufren los alimentos, a medida que aumenta su madurez

(Clifford, 2000).

II.6 Análisis cromatográfico

II.6.1 Cromatografía

La cromatografía es una técnica de separación física en la cual, los

componentes de la muestra se distribuyen entre dos fases de diferente

naturaleza como consecuencia de la variación que se establece al ser

arrastrados por una fase móvil, líquida o gaseosa, a través de una fase

estacionaria, sólida o líquida. La adecuada elección de estas fases permite que

tales diferencias se traduzcan en una separación efectiva de los solutos.

La cromatografía se puede clasificar en dos métodos, la Cromatografía de

Gases (GC) y la Cromatografía de Líquidos (LC). La cromatografía de gases es

una técnica de separación en la que la fase móvil es un gas. Esta se lleva a cabo

siempre en columna, por lo tanto, esta técnica es utilizada comúnmente para la

separación de compuestos orgánicos e inorgánicos que sean térmicamente

estables y volátiles. Por otra parte, la cromatografía de líquidos es un método de

separación, que se da gracias a la afinidad del compuesto por una fase móvil o

por una fase estacionaria. A diferencia con la cromatografía de gases, la

cromatografía líquida no está limitada por la volatilidad o la estabilidad térmica

de la muestra (Sgariglia, M et al., 2010).

La cromatografía líquida comprende hoy en día, dos importantes sistemas

HPLC Y UPLC. Las siglas HPLC obedecen a la abreviación en inglés de

Cromatografía de Líquidos de Alto Rendimiento. Considerando que es una

técnica que sirve para separar diferentes constituyentes de una mezcla, es la

técnica más utilizada para identificar, cuantificar y separar compuestos de una

muestra. En tanto, UPLC corresponde a Cromografía Liquida de Ultra

Rendimiento por sus siglas en inglés, esta es una variación del HPLC, pero el

fundamento cromatográfico es el mismo. La diferencia entre el HPLC y el UPLC,

es la separación más rápida del compuesto con una buena eficiencia y

resolución, debido al mejoramiento en la tecnología de columnas de menor

diámetro y partículas de fase estacionaria de menor tamaño que responden a

ultra presiones.

22

Es importante destacar que los sistemas de UPLC tienden a ampliar su

utilización cada vez más, ya que mediante ella se aprovechan al máximo los

principios cromatográficos, usando columnas cortas con un tamaño de partícula

de 2 μm, esto conlleva tiempos de análisis mucho más rápidos. Cabe mencionar,

que existen diversas diferencias entre las técnicas HPLC y UPLC como se detalla

en la Tabla IV.

En vista de las ventajas que presenta el sistema UPLC en comparación con

el HPLC, para el presente trabajo se optó por utilizar la cromatografía líquida de

ultra rendimiento (UPLC), tal y como se detalla en el capítulo de metodología.

Tabla IV. Diferencias entre HPLC y UPLC.

Cromatografía líquida de alto

rendimiento (HPLC)

Cromatografía líquida de ultra

rendimiento (UPLC)

Presión inferior a 400 bar Presión hasta 1000 bar

Largos tiempos de análisis Cortos tiempos de análisis

Menos contrapresión, más vida de la

columna.

Más contrapresión disminuye la vida

de las columnas. Aumentar la

temperatura de la columna reduce el

problema de contrapresión en UPLC.

Diámetro interno 3 a 10 μm. Diámetro interno de 0,75 a 1,8 μm.

Detectores utilizan grandes caudales

y celdas de detección más grandes.

Detectores que usan caudales

pequeños y límites de detección

bajos.

Más consumo de solvente, menos

rendimiento de muestra.

Disminuye el consumo de solvente y

aumenta el rendimiento de la muestra.

Elaborado por: (Ahmadeen, 2012).

23

II.6.2 Detectores de Cromatografía Líquida

El detector es un componente principal en el cromatógrafo; existen varios tipos

de detectores que se utilizan dependiendo de la química del compuesto,

permitiendo ubicar en tiempo y espacio cada componente de la muestra

analizada. Los detectores en cromatografía de líquidos se dividen en 2 grupos.

Los detectores basados en una propiedad de la disolución que responden a una

característica de la fase móvil, tal como el índice de refracción, la constante

dieléctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos. Por

otra parte, los detectores que se basan en algunas de las propiedades del soluto,

como la absorbancia UV, fluorescencia, o intensidad de difusión, que no son

propias de la fase móvil (Álvarez, 2019).

Los tipos de detectores más empleados en la cromatografía liquida son:

• Detector UV

• Detector Índice de Refracción

• Detector de Fluorescencia

• Detectores electroquímicos

• Espectrómetro de masa

Espectrometría de masas

Es un instrumento que mide las masas de moléculas individuales que han sido

convertidas en iones, por lo tanto, no puede medir la masa molecular

directamente, pero mide la relación masa/carga de los iones formados de las

moléculas. Los espectrómetros de masas como se observa en la Figura 5

contienen siete partes. El sistema de entrada, junto con la fuente de iones y el

tipo de analizador de masas definen el tipo de espectrómetro y las capacidades

del sistema (Mendieta, C et al., 2017).

La determinación de masas, se realiza mediante:

• Generación de moléculas (fragmentos de átomos) en fase gaseosa.

• Ionización de los mismos.

• Separación en función de su relación m/z.

• Detección de los iones.

24

Fuentes de iones

gaseosos

Analizador de masas

Transductor de iones

10-5 a 10-8 Torr Bomba de vacío

Introducción de muestra

Procesador de la señal

Ionización Selección de iones Detección de iones

Elaborado por: Autores, 2020.

Figura 5. Componentes del espectrómetro de masas

Como parte de la optimización de condiciones cromatográficas para la

determinación de ácidos clorogénicos, y en vista de las ventajas que ofrecen

ciertos detectores sobre otros, en el presente estudio se empleó un

espectrómetro de masas por su capacidad de analizar y proporcionar la identidad

molecular de un amplio rango de componentes, separándolos por su función

masa/carga, detectando su presencia y/o cuantificando su concentración, y

reduciendo el riesgo de coeluciones o interferencias de componentes

inesperados.

En el transcurso de los últimos años, para la determinación de ácidos

clorogénicos en especies vegetales, se han descrito nuevas metodologías que

procuran una óptima identificación y cuantificación de los ácidos clorogénicos,

por ello se han empleado diferentes sistemas cromatográficos, entre los que

destacan el sistema HPLC y el sistema UPLC, debido a la polaridad de los

compuestos a analizar; este último sistema representa una opción o un escenario

mejorado debido a las ventajas que ofrece en comparación con el HPLC, tal

como se ha descrito en la Tabla IV.

25

Las metodologías analizadas en la Tabla V, sugieren que para la extracción

de los ácidos clorogénicos y en base a la polaridad de los analitos de interés, se

utiliza una mezcla de solventes polares (agua, etanol, metanol, entre otros.) en

diferentes proporciones, permitiendo una extracción satisfactoria de los CQA.

26

II.7 Análisis de metodologías utilizadas en la determinación de ácidos clorogénicos en café, derivados y otras especies

vegetales.

Tabla V. Comparación de la metodología utilizada en diferentes estudios para la determinación de ácidos clorogénicos.

TEMAS ESPECIE COMPUESTO PREPARACION DE MUESTRA

ANALISIS INSTRUMENTAL

REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA

Desarrollo de un método de análisis para la cuantificación de ácidos clorogénicos en café.

Café arábica 5-CQA Pesar 1 g de café tostado y molido en un balón aforado de 100 ml y agregar 50 ml de agua caliente. Colocar el balón en un baño maría (90-95 °C) por 60 min. Enfriar a temperatura ambiente y aforar con agua destilada. Filtrar y diluir el filtrado 10 veces.

Técnica de espectroscopía UV (longitud de onda 200- 400 nm)

Solis L, Herrera C., 2005.

27

Contenido de ácidos clorogénicos en granos de Coffea arabica y C. canephora, según el desarrollo del fruto.

Café arábica 3- CQA 4- CQA 5- CQA; 3,4-diCQA 3,5-diCQA 4,5-diCQA 4- FQA 5- FQA Ácido cafeico Ácidos orto y para cumáricos

Las muestras se trataron con nitrógeno líquido, se molieron y se tamizaron. Se tomó un gramo de café almendra molido en un matraz, se le adicionó una solución de 100 ml de metanol acuoso 70 % v/v y 0,5 % de sulfato de sodio. Se sometió a 125 rpm y maceración. El extracto obtenido se filtró.

Se usó un equipo HPLC, en fase reversa con la precolumna y la columna Symmetry C18. Se utilizaron dos solventes para la fase móvil, solvente A: 100 ml de agua y 1 ml

de H3PO4 (85 % alta pureza), y solvente B: acetonitrilo grado HPLC, eluídas en modo gradiente A/B. la detección se efectuó a 324 nm UV

Marín G., & Puerta Q., 2008.

Cuantificación de cafeína, trigonelina y ácido clorogénico por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

Café arábica 5-CQA Las muestras fueron molidas, se tomó un 1 g de cada muestra para ser extraído en un matraz de 250 ml conteniendo 100 ml de mezcla metanol-agua (70/30) y 0.5 % de Na2SO4. El matraz fue agitado durante 10 horas a una temperatura de 4 °C en oscuridad El extracto orgánico fue filtrado

para eliminar el polvo.

Se utilizó un equipo HPLC. Se utilizaron dos solventes para la fase móvil. El solvente A fue agua con 2 mM de ácido fosfórico, pH 2.7; el solvente B fue metanol al 5 % de 2 mM de ácido fosfórico, pH 3.9. Se utilizó el siguiente gradiente: mezcla A-B (75/25) La detección se hizo a una longitud de onda de 325 nm.

López Bóbeda, J. R. 2008.

28

Determinación de ácidos clorogénico y cafeico, cafeína, polifenoles totales y actividad antioxidante de tres variedades de café (Coffea arabice L.).

Café arabica 5-CQA Se pesó 1 g de muestra molida y se añadió 20 ml de agua a 100 °C, se llevó a baño maría (90- 95 °C) por 5 minutos, se dejó enfriar a temperatura ambiente, luego se pasaron a unos microtubos y se centrifugó a 10.000 rpm por 5 minutos a una temperatura de 4 °C.

Se realizó por HPLC. La fase móvil fluyó en un sistema de gradiente binario preparado con metanol (solvente A) y solución buffer (solvente B). La detección se realizó a una longitud de onda de 330 nm, usando un detector UV - VIS.

Félix Zamora, M. D. R. 2009.

29

Comparative profiles of Achyrocline alata (Kunth) DC. and A. satureioides (Lam.) DC., Asteraceae, applying HPLC-DAD- MS.

Achyrocline alata (Kunth) A. satureioides (Lam.) DC., Asteraceae,

5-CQA, 3,4-diCQA, 3,5-diCQA 4,5-diCQA

Se pesaron 100 mg de muestra, se extrajeron con 3 ml de MeOH: H2O (7:3) y 3 ml de cloruro de metileno con el objetivo de eliminar compuestos apolares. Luego, esta mezcla se sometió a ultrasonidos durante 20 minutos seguidos.

.

Se utilizó un equipo HPLC con un detector de matriz de diodos acoplado a un espectrómetro de masas. Para el HPLC una columna monolítica (Onyx ™ 150 x 4,6mm - C-18 - Phenomenex) y una pre-columna del mismo. La fase móvil consistió en una elución de gradiente lineal a un caudal de 3 ml / min con las siguientes mezclas: agua: ácido acético 1 % (v/v) (faseA) y acetonitrilo: ácido acético al 1% (fase B) como eluyentes. Los primeros 8 minutos se eluyeron con fase B con gradiente 5-12 %, siguiente 13-22 % (8- 25 min), 22-35 % (25- 29 min), 35 % (29-30 min), 35-100% (30-34 min).

Zampieron et al., 2009.

30

Comparison of nine common coffee extraction methods: instrumental and sensory analysis.

Café 3- CQA 4- CQA 5- CQA

Se pesó 2 g de café extracto, 500 µl Carrez I (solución acuosa de ZnSO₄ al 30 %),500 µl Carrez II (15 % de hexaciano de potasio acuoso) y 500 ml de metanol se diluyeron con agua destilada hasta 25 ml y filtrada con papel de filtro y un filtro de jeringa (0.45 µm)

Se utilizó un equipo HPLC equipado con una columna Agilent Eclipse Plus C18 y un diodo detector de matriz. La fase móvil A era agua (que contenía 0,1 % de ácido fórmico) y la fase móvil B fue acetonitrilo (0.1 % de ácido fórmico). El modo degradado es 1 min con 5 % de fase móvil B, luego 10 min con 25 % de B y finalmente 50 % de B por 20 min. El caudal fue 0,35 ml / min. El detector se ajustó a 325 nm para ácidos clorogénicos.

Gloess et al., 2013.

31

Identification and characterization of chlorogenic acids, chlorogenic acid glycosides and flavonoids from Lonicera henryi L. (Caprifoliaceae) leaves by LC–MS.

Hojas verdes de L. henryi

3-CQA 5-CQA 3,4-diCQA 3,5-diCQA

Se extrajeron hojas verdes frescas (5 g) con metanol acuoso, homogeneizado con una licuadora por 30 min y se filtró. Los solventes se eliminaron por evaporación al vacío y se reconstituyeron las muestras en metanol y fueron filtrados a través de un filtro de membrana para utilizarse directamente LC – MS.

Se utilizó un equipo HPLC, la separación se logró en una columna que contiene C18 amida 5 µm, con un diámetro interno de 5 mm 3 mm El solvente A: agua / ácido fórmico (1000: 0,05 v / v) y el disolvente B: Metanol. Los disolventes se administraron a un caudal total de 500 µl / min. El gradiente perfil fue de 10 % B a 70 % B linealmente en 70 minutos seguido por 10 min isocrático y un retorno al 10% de B a los 90 min. Se usó un detector DAD con una celda de flujo de tubo de luz (registrando a254,28 y 320 nm y escaneo de 200 a 600 nm).

Jaiswal, R, Müller, A, Karar, M, & Kuhnert. 2014.

32

Assessment of protected designation of origin for Colombian coffees based on HRMS- based metabolomics.

Café arábica 3- CQA 4- CQA 5- CQA

Las muestras pasaron a través de líquido nitrógeno y triturado en un molino ultra centrífugo a 14.000 RPM. Se extrajeron 3 g de muestra con 10 ml. de acetonitrilo / agua / ácido fórmico (80:20), (v / v), sonicar 15 min y centrifugado a 6000 RPM durante 10 min. El sobrenadante, se diluyeron 2 ml del sobrenadante con 6 ml de agua Mili-Q y la solución se usó para el análisis de cromatografía líquida de fase inversa (RP)

Se instaló un sistema UPLC (interconectado a una masa híbrida de alta resolución cuadrupolo- ToF, Espectrómetro (HRMS) utilizando un Interfaz Z-spray-ESI que funciona tanto en ionización positiva como negativa. Un concentrador MiVac Duo, se empleó para llevar muestras de extractos a sequedad al vacío.

Hoyos. D et al., 2017.

33

Chlorogenic acid isomer contents in 100 plants comercialized in Brazil.

Las plantas se compraron en seco.

4- CQA 5- CQA, 3,4-diCQA 4,5-diCQA

Se realizó pesando 40 g de muestra de cada proveedor, que luego fue homogeneizado y triturado en un molino de martillos con un tamiz de malla. Para extraer los ácidos clorogénicos, se pesaron 0,5 g de la muestra triturada y se añadieron 15 ml de solución de extracción (74 % de agua: 26 % de etanol), se calentó en un baño de agua a 60 °C bajo agitación a 240 rpm durante 22 minutos. Luego se midió el volumen a 100 ml, filtrado a través de una membrana PVDF.

Se utilizó un equipo UPLC, con un detector de matriz de diodos, una bomba ternaria y un horno de columna controlada a 30 ° C. Utilizamos una columna C18 con una longitud de 100 mm, un diámetro interno de 2,1 mm y un tamaño de partícula de 1,7 μm. La fase móvil fue agua acidificada con ácido fórmico (0.1%, pH 2.4) (solvente A) y acetonitrilo (solvente B). La elución se realizó con un gradiente lineal. La velocidad de flujo fue de 0.3 ml/min, y el volumen de inyección fue de 10 μl.

Meinhart, A, 2017.

34

Analysis of chlorogenic acids isomers and caffeic acid in 89 herbal infusions (tea).

Se obtuvieron muestras de plantas de tres proveedores diferentes

4- CQA, 5- CQA, 3,4-diCQA 4,5-diCQA

La preparación de infusiones acuosas (té). Para este fin, 2 g de muestra se añadieron a 300 ml de agua hirviendo y se dejaron durante 16 minutos, la infusión se enfrió rápidamente a temperatura ambiente, se filtró a través de un tubo de 0,22 μm. filtro de membrana de PVDF y se inyecto al cromatógrafo.

El método de análisis se utilizó un equipo UPLC con detector de matriz de diodos, inyector automático, horno de columna a 30 ºC y una columna C18 de fase inversa de 100 mm de longitud, 2,1 mm de diámetro interno y un tamaño de partícula de 1,7 μm. La fase móvil estaba compuesta de agua acidificada con ácido fórmico (0.1 %, pH 2.4; (eluyente A) y acetonitrilo (eluyente B) con un gradiente lineal. El caudal fue de 0,3 ml con un volumen de inyección de 10 μl.

Meinhart, A, 2018.

35

Componentes bioactivos de diferentes marcas de café comerciales de Panamá. Relación entre ácidos clorogénicos y cafeína.

Especie Coffea arábica; 8 son de variedad geisha, 1 variedad pacamara y 9 no se le identificó la variedad en los empaques comerciales

3-CQA 5-CQA

La muestra de café comercial (0,5 g si es café mezclado y 0,25 g si es café puro) fue mezclada con 25 ml de agua destilada y se colocó a calentar auna temperatura de 90 °C. Se dejó enfriar y luego se trasvasó la muestra a un tubo para centrífuga de 50 ml y se centrifugó por 15 minutos (10.000 rpm) decantó en un matraz volumétrico de 25 ml y se aforó con agua destilada.

Se utilizó un equipo HPLC, un detector de arreglo de diodos operando a 325 y 280 nm Con una columna ZORBAX SB-C18 Stable Bond Analytical (4.6 x 150 mm, 5 µm). Las condiciones de separación establecidas fueron las siguientes: volumen de inyección de 20 µl, flujo de 0.4 ml/min. La fase móvil A (agua con 0.02 % ácido trifluoroacético), fase móvil B (metanol con 0.02 % de ácido trifluoroacético), temperatura de 25 °C y tiempo de corrida de 60 min

Vega, A., De León, J. A., Reyes, S. M., & Miranda, S. Y. 2018.

36

Contents of chlorogenic acids and caffeine in various coffee related products.

83 productos diferentes relacionados con el café

3- CQA 4- CQA 5- CQA, 3,4-diCQA 4,5-diCQA

Se midió por cada muestra 2.5 ml y se transfirió a tubo de centrífuga con 0,1 ml de cada una de las soluciones de Carrez I (10,6 g de trihidrato de ferrocianuro de potasio disuelto en 100 ml de agua destilada) y II (21,9 g de acetato de zinc dihidratado y 2 ml de ácido acético glacial diluido con agua destilada a 100 ml) fue añadido para aclarar la muestra. Se mezclaron con vórtice por 2 min. El volumen total se llevó a 50 ml mediante la adición de metanol al 10 %. La solución se centrifugó a 3500 rpm por 10 min. Se usó un filtro de jeringa de PTFE para filtrar el flotante.

Se realizó un equipo HPLC-DAD con un Accucore C18 (150 mm 4,6 mm, 2,6 um, Thermo Scientific, MA, EE. UU.). La fase móvil fue compuesta del eluyente A (tampón K2HPO4 20 mM que contiene fosfato al 0.1 % ácido) y eluyente B (acetonitrilo que contiene fosfato al 0.1 % ácido). El modo de gradiente se estableció inicialmente en una relación A / B de 97:3 de 0 a 5 min, luego el eluyente B a 75:25 de 25 a 35 min. La velocidad de flujo y el volumen de inyección fueron de 1 ml / min y 10 µl, respectivamente. Se utilizaron Longitudes de onda de 272 nm para el análisis de CGA.

Jong-Sup et al., 2019.


37

CAPÍTULO III: METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN

III.1 Tipo de investigación

El presente trabajo de investigación tiene como modalidad, la investigación

experimental, descriptiva y correlacional por cuanto está encaminado al estudio

de una (o más) variables, con el fin de describir el modo en que se produce un

acontecimiento particular.

III.2 Equipos, aparatos, materiales y reactivos

III.2.1 Reactivos

ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO

• Acetonitrilo grado HPLC (MERCK)

• Ácido fórmico grado HPLC (MERCK)

• Agua destilada.

• Agua tipo 1

• Etanol grado absoluto

• Metanol grado HPLC (MERCK)

Estándares de ácidos clorogénicos*

• 3- CQA (Chem Impex).

• 4-CQA (Cayman Chemical)

• 5-CQA (Cayman Chemical)

• 3,4-diCQA (Cayman Chemical)

• 3,5-diCQA (Cayman Chemical)

• 4,5-diCQA (Carbo synth)

*Certificados con pureza ≥ 95%

III.2.2 Materiales

DETERMINACIÓN DE HUMEDAD ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO

• Desecador

• Espátula

• Papel aluminio

• Pinzas metálicas

• Barras magnéticas

• Columna UPLC C18 (Waters) 2.1 x 100mm Acquity

• Filtros específicos 0.45 µm

• Jeringas

• Matraces aforados (10 ml)

• Matraces erlenmeyer (50 ml)

• Papel filtro

• Pipetas automáticas (1-100 ul)

• Viales de alta recuperación 1ml

38

III.2.3 Equipos y Aparatos

EQUIPOS APARATOS

• Balanza analítica (OHAUS)

• Cromatógrafo UPLC Waters con

Detector de masas (QDa) ACQUITY

• Agitar magnético (CORNING)

• Horno de secado (BIOBASE)

III.3 Muestras

Las muestras de café arábica y robusta fueron recolectadas en el Instituto

Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIAP), Estación Experimental

Tropical Pichilingue, en el cantón Quevedo, provincia de Los Ríos. En esta

estación experimental el cultivo de café se realiza en parcelas, diferenciadas

entre sí de acuerdo a especies clasificadas.

La estación experimental maneja al menos 20 variedades de café, de las

cuales 7 variedades fueron tomadas como objeto de estudio y seleccionadas de

acuerdo a criterios de mayor comercialización y/o mayor producción del grano

de café. En la Tabla VI, se presenta la identificación mediante códigos, asignada

por el INIAP para las variedades recolectadas de acuerdo a cada especie.

Tabla VII. Identificación de especies, variedades y código de muestras que fueron objeto de estudio.

ESPECIE VARIEDAD ECOTIPO

Arábica Catuaì Rojo T16

Arábica Sarchimor T15

Arábica Pacas T17

Arábica Caturra Rojo T18

Arábica Acawa T5

Arábica Catucai T1

ESPECIE VARIEDAD ECOTIPO

Robusta Congolensis T18





39

III.4 Diseño experimental

En la Figura 6, se describe la metodología que se aplicó en el trabajo de

investigación realizado.

1. Recolección de muestras.

2. Determinación de humedad.

Separación por especie y

grado de maduración (verde,

pintón y maduro).

3. Preparación de soluciones

stock de cada estándar.

Estándar 3-CQA; 4-CQA; 5-

CQA; 3,4-diCQA; 3,5-diCQA y

4,5-diCQA con una

4. Preparación de curva de

calibración.

5. Selección de condiciones

cromatográficas.

concentración de 100 ppm.

Preparación de soluciones de

trabajo (mix) de estándares

en un rango de concentración

0,25-10,00 ppm.

6. Método de extracción de

ácidos clorogénicos en base a

Avalos & Mera (2018).

7. Preparación de muestras de análisis.

8. Análisis de datos.

Extracción hidroalcohólica por

maceración a partir de

muestra fresca.

Determinar mediante

UPLC/MS.

Figura 6. Flujograma de la metodología aplicada


9. Reporte de resultados.

40

III.4.1 Selección de muestras

Para la separación y caracterización de las muestras de café de las especies

arábica y robusta, se tomaron en cuenta los parámetros de forma, color y grado

de maduración; para estos dos últimos parámetros se tomó como referencia la

escala detallada en la Figura 7, en la cual se observa el estado de maduración

por color y sus días después de la antesis (DDA). Para este trabajo se

seleccionaron 3 estados de maduración: verde aproximadamente 182 DDA,

pintón aproximadamente 217 DDA y maduro aproximadamente 231 DDA.

Figura 7.Caracterización de los estados de maduración del café

Fuente: Carvajal, Aristizábal, Oliveros & Mejía, 2011.

41

En la Figura 8, se observa a modo de ejemplo, la aplicación de los criterios

para la selección de las muestras.

Cabe mencionar que los mismos parámetros fueron aplicados a todas las

muestras que fueron objeto de estudio.

Coffea arábica

Coffea canephora

Figura 8. Muestras seleccionadas de acuerdo al grado de maduración


42

III.4.2 Determinación de Humedad

Método gravimétrico

En cajas de aluminio se pesaron aproximadamente 1 g de cada una de las

muestras, estas fueron secadas en un horno a 105°C durante 3 horas. Cumplido

el tiempo, las muestras fueron sacadas y colocadas en un desecador para

enfriarlas a temperatura ambiente, y posteriormente ser pesadas. Después se

llevaron a calentar 1 hora adicional y fueron pesadas nuevamente. Este método

se repitió hasta tener un peso constante en las muestras. Los valores obtenidos

se evaluaron mediante la siguiente ecuación:

Dónde:

𝑯𝒈 =

𝑴𝟐 − 𝑴𝟏

𝑴𝟐 − 𝑴

𝑿𝟏𝟎𝟎

Hg: Perdida en peso por desecación (%)

M2: masa del envase con la muestra de ensayos (g)

M1: masa del envase con la muestra de ensayo desecado (g)

M: masa del envase vacía (g)

III.4.3 Análisis cromatográfico de los ácidos clorogénicos

Para el desarrollo del análisis cromatográfico se tomó como base las

condiciones analíticas planteadas por Avalos&Mera, (2018) en su trabajo de

investigación. Las condiciones instrumentales fueron optimizadas para la

detección de los compuestos objetos de estudio mediante espectrómetro de

masas.

Fundamento del método de maceración hidroalcohólica

Se realizó la extracción de ácidos clorogénicos mediante una maceración

hidroalcohólica, la cual se fundamenta en la capacidad del solvente de retener

los metabolitos, de manera que se obtenga un extracto líquido (con los principios

activos disueltos) y el material vegetal sobrante.

43

III.4.3.1 Preparación de soluciones stocks (3-CQA, 4-CQA, 5-CQA, 3,4-

diCQA, 3,5-diCQA, 4,5-diCQA)

Se prepararon soluciones stock, con estándares certificados de ácidos

clorogénicos, 3-CQA, 4-CQA, 5-CQA, 3,4-diCQA, 3,5-diCQA, 4,5-diCQA.

• Para las soluciones stock de 3-CQA, 4-CQA, 5-CQA se pesaron 10 mg de

cada estándar. Luego, cada uno fue traspasado a un matraz de 100 ml, para

dilución y enrace con acetonitrilo:metanol (ACN:MetOH). Para cada dilución se

obtuvo una concentración de 100 ppm.

• Para las soluciones stock de 3,4-diCQA, 3,5-diCQA, 4,5-diCQA se

pesaron 5 mg de cada estándar. Luego, cada uno fue traspasado a un matraz

de 50 ml, para dilución y enrace con ACN:MetOH. Para cada dilución se obtuvo

una concentración de 100 ppm.

III.4.3.2 Preparación de la curva de calibración

De las soluciones stocks que se encuentran en una concentración de 100

ppm, se realizó un mix de todas, y se llevó a una concentración de 10 ppm, a

partir de esta solución se prepararon diferentes diluciones para obtener los

puntos para la curva de calibración de los ácidos clorogénicos (0,25; 1,00; 2,50;

5,00 y 10,00 ppm). En Tabla VII, se observan las distintas soluciones de trabajo

y las alícuotas que se tomaron para ser llevadas a enrace en un matraz

volumétrico de 10 ml.

Tabla VIII. Volúmenes de trabajo de la curva de calibración.

Concentración (ppm) Volumen (ml)

0,25 0,25

1,00 1,00

2,50 2,50

5,00 5,00

10,00 10,00

Elaborado por: Autores, (2020)

44

III.4.3.3 Condiciones cromatográficas

Se emplearon condiciones cromatográficas en las cuales se aplicó un sistema

cromatográfico de fase reversa, con una columna C18 de 2.1 mm de diámetro

interno y 100 mm de longitud, con un tamaño de partículas de 1.7 µm (marca

waters). En la fase móvil se utilizó agua con ácido fórmico al 0.1 % (Fase A) y

acetonitrilo grado HPLC (fase B). La elución se realizó en modo gradiente, como

se observa en la Tabla VIII, con un flujo de 0.350 ml/min. La detección se realizó

con un detector de espectrometría de masas con un cono de voltaje entre 5 a 35

voltios y un escáner de masas que va de 100 a 600 m/z. El volumen de inyección

de la muestra fue de 2 μl y la temperatura del horno de la columna fue de 25°C.

Tabla VIII. Elución en modo gradientes de las fases A y B.

Tiempo (min)

Fase A Fase B

0,00 90 10

2,27 85 15

2,49 75 25

5,67 75 25

5,89 90 10

9,00 90 10


III.4.3.4 Método de extracción del ácido clorogénico

Para la extracción del ácido clorogénico se trituraron y pesaron 2,5 g. de

granos de café, los cuales fueron llevado a un matraz de 50 ml, para su posterior

enrace con una solución hidroalcohólica etanol: agua (2:1). Se procedió a una

maceración de 6 horas mediante agitación magnética. Posteriormente, se filtró

(papel filtro) el extracto de los granos de café obtenido de la maceración. Este

método está basado en el procedimiento desarrollado por (Ávalos & Mera, 2018).

45

III.4.3.5 Preparación de muestras para el análisis cromatográfico

Por cada extracto de muestra se tomó una alícuota de 100 µl y fue llevada a

un vial de alta recuperación y se añadió 900 µl de metanol grado HPLC para

obtener una dilución 1:10 y posteriormente llevada al cromatógrafo para su

cuantificación.

46

CAPÍTULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES

IV.1 Determinación del porcentaje de humedad

Respecto a los ensayos realizados para la determinación de humedad en

granos de café, en la Tabla IX se presentan los valores obtenidos para todas las

muestras analizadas de acuerdo a la especie.

Tabla IX. Porcentaje de humedad de acuerdo a las especies de café.

Promedio Promedio DS

Promedio CV

Coffea arábica (%)

65,68 2,42 3,70%

Promedio

Coffea canephora (%)

Promedio DS

Promedio CV

65,94 2,73 4,18%


Los valores promedios de humedad obtenidos para el presente trabajo fueron

de 65,88 % y 65,94 % en granos de Coffea arábica y Coffea canephora

respectivamente. Estos resultados se asemejan a los obtenidos en el estudio

desarrollado por Ávalos y Mera, (2018) en el que se reporta una humedad de

67,20 % para granos de café frescos.

IV.2 Optimización de condiciones cromatográficas

En el presente trabajo se realizaron ensayos cromatográficos mediante un

sistema UPLC con un detector de espectrometría de masas, inyectando un mix

de solución de estándares de ácidos clorogénicos (3-CQA, 5-CQA, 4-CQA, 3,4-

diCQA, 3,5-diCQA y 4,5-diCQA). Cabe mencionar que las condiciones

cromatográficas, así como la preparación de las muestras, han sido optimizadas

a partir del estudio realizado por (Ávalos & Mera, 2018). En comparación con

dicha metodología, los ensayos de la presente investigación fueron realizados

con un volumen de inyección de 2 μl. Se empleó una columna C18 de 2.1 mm

de diámetro interno y 100 mm de longitud, con un tamaño de partículas de 1.7

μm (marca waters).

47

En la fase móvil se utilizó agua con ácido fórmico al 0.1% (Fase A) y

acetonitrilo grado HPLC (fase B); lo que permitió la acidificación de la fase móvil,

y a la vez favoreció la ionización de los compuestos. La elución se realizó en

modo gradiente entre las fases A/B como se detalla en la Tabla VIII. Con un flujo

de 0.350 ml/min, la temperatura del horno de columna fue de 25°C. Se tomó

como muestra la extracción hidroalcohólica realizada a partir de los solventes

etanol:agua (2:1).

En la Figura 9, se puede apreciar el orden de elución de los distintos isómeros

de ácidos clorogénicos, a partir de 6 estándares certificados (3-CQA, 5-CQA, 4-

CQA, 3,4-diCQA, 3,5-diCQA Y 4,5-diCQA), demostrando así que el orden de

elución obtenido es similar a los resultados reportados por Ávalos & Mera,

(2018).

Figura 9. Cromatograma obtenido mediante UPLC-MS de un mix de estándares a una concentración de 1 ppm.


48

En cuanto a la Figura 9, en la Tabla X se presentan los tiempos de retención

de los 6 isómeros de ácidos clorogénicos que se detectaron mediante el sistema

UPLC-MS, el cual por ser un equipo que posee características de mayor

rendimiento y mejor resolución, permitió la elución de los compuestos en un

menor tiempo.

Tabla X. Tiempo de retención de los isómeros de ácidos clorogénicos.

Compuestos Peso molecular

(g/mol)

Tiempo de retención (min)

3-CQA 354.31 1,488

5-CQA 354.31 2,240

4-CQA 354.31 2,477

3,4-diCQA 516.45 4,560

3,5-diCQA 516.45 4,692

4,5-diCQA 516.45 4,912


En el trabajo realizado se empleó un espectrómetro de masas con analizador

de triple cuadrupolo, debido a su alta sensibilidad y el uso de masas específicas

para la identificación de compuestos. Se utilizó un rango de masas entre 100 a

600 m/z con el propósito de abarcar el peso molecular de todos los compuestos,

y por ende de sus iones específicos (M++1) obtenidos por ionización electrospray

en modo positivo; este rango de masas (m/z) fue también propuesto por Cifford,

et al. (2005), quien menciona que los mono-CQA responden a una masa de 353

m/z y los di-CQA a una masa de 515 m/z.

IV.3 Curva de calibración

La elaboración de la curva de calibración (Tabla XI y Tabla XIII) con las

soluciones estándares de diferentes concentraciones permitió la cuantificación

de la concentración de los isómeros presentes en las muestras en base a la

ecuación de la recta. La curva demostró el comportamiento lineal de los

compuestos como se observa en la Tabla XII y Tabla XIV.

49

Figura 10. Curva de calibración de los estándares Mono-CQA.


Tabla XI. Niveles de concentración utilizados para la curva de calibración y

áreas obtenidas de los compuestos MonoCQA.

Concentración (ppm)

Área

3-CQA

Área

5-CQA

Área

4-CQA

0,25 23743,41 13024,75 13708,30

1,00 133430,91 50592,18 77032,75

2,50 336619,42 262140,04 351507,99

5,00 647405,03 498605,37 580924,26

10,00 1229223,16 952630,02 1113613,09

Tabla XII. Linealidad de la curva de calibración de los MonoCQA.

Compuesto Ecuación de la recta R

3-CQA y = 1,24e+005 x + 1,32e+004 0,998226

5-CQA y = 9,86e+004 x – 7,57e+003 0,995538

4-CQA y = 1,14e+005 x + 2,00e+003 0,995195

mg

/Kg

50

Figura 11. Curva de calibración de los estándares di-CQA.


Tabla XIII. Niveles de concentración utilizados para la curva de calibración y

áreas obtenidas de los compuestos diCQA.

Concentración (ppm)

Área

3,4-diCQA

Área

3,5-diCQA

Área

4,5-diCQA

0,25 25607,09 11502,73 37641,59

1,00 134118,93 64857,91 177009,08

2,50 371624,09 192717,41 475100,38

5,00 808158,55 427668,40 993553,49

10,00 1736754,31 898414,03 1909573,99

Tabla XIV. Linealidad de la curva de calibración

Compuesto Ecuación de la recta

de los diCQA.

R

3,4-diCQA Y = 1,79e+005 X – 5,01e+004 0,998975

3,5-diCQA Y = 9,29e+004 X – 2,62e+004 0,999451

4,5-diCQA Y = 1,89e+005 X + 2,15e+003 0,998386

mg

/Kg

51

IV.4 Análisis del contenido de ácidos clorogénicos

En el presente estudio, se evaluó el contenido de ácidos clorogénicos en base

a la detección mediante UPLC-MS, de los mono-isómeros 3-CQA, 4-CQA, 5-

CQA y, los di-isómeros 3,4-diCQA, 3,5-diCQA, 4,5-diCQA, en granos de café de

distintas variedades pertenecientes a las especies Coffea arábica y Coffea

canephora cultivadas en Ecuador, cada una en diferentes etapas de maduración.

De acuerdo con los análisis cromatográficos realizados en las distintas

muestras, en la Figura 12 se reportan a manera de gráfico los resultados

obtenidos, a partir de los cuales, en términos generales se puede constatar

importantes diferencias del contenido de ácidos clorogénicos entre la especie

arábica y robusta, además de variaciones en la concentración de estos

compuestos según el estado de maduración de las muestras analizadas.

Información bibliográfica consultada, señala que estudios realizados en

muestras de café de diferentes orígenes refieren un similar comportamiento de

aumento o disminución del contenido de estos compuestos fenólicos con

respecto al grado de maduración. En el caso de trabajos realizados con granos

de café arábica de Asia y Europa, se reporta un mayor contenido de mono-CQA

en el estado maduro, en comparación con el grano verde; mientras que en café

de Sudamérica, el grano de robusta presenta mayor contenido de CQA en estado

verde (Marín et al, 2008; Clifford et al, 1987; Ohiokpehai et al, 1982).

Si bien la mayoría de variedades analizadas presentan un comportamiento

semejante al reportado por la bibliografía, en algunas de ellas se puede constatar

que el contenido de CQA en sus diferentes estados de maduración difiere a lo

señalado por la literatura, razón por la cual se procede a realizar el análisis de

resultados, destacando algunos de los comportamientos más relevantes

reportados para este estudio. Para lo cual, en la Tabla XV se detallan los rangos

de concentraciones obtenidos para cada isómero de ácido clorogénico.

52

0,000

1000,000

2000,000

3000,000

4000,000

5000,000

6000,000

7000,000

8000,000

9000,000

3-C

QA

5-C

QA

4-C

QA

3,4

-diC

QA

3,5

-diC

QA

4,5

-diC

QA

3-C

QA

5-C

QA

4-C

QA

3,4

-diC

QA

3,5

-diC

QA

4,5

-diC

QA

3-C

QA

5-C

QA

4-C

QA

3,4

-diC

QA

3,5

-diC

QA

4,5

-diC

QA

3-C

QA

5-C

QA

4-C

QA

3,4

-diC

QA

3,5

-diC

QA

4,5

-diC

QA

3-C

QA

5-C

QA

4-C

QA

3,4

-diC

QA

3,5

-diC

QA

4,5

-diC

QA

3-C

QA

5-C

QA

4-C

QA

3,4

-diC

QA

3,5

-diC

QA

4,5

-diC

QA

3-C

QA

5-C

QA

4-C

QA

3,4

-diC

QA

3,5

-diC

QA

4,5

-diC

QA

3-C

QA

5-C

QA

4-C

QA

3,4

-diC

QA

3,5

-diC

QA

4,5

-diC

QA

3-C

QA

5-C

QA

4-C

QA

3,4

-diC

QA

3,5

-diC

QA

4,5

-diC

QA

3-C

QA

5-C

QA

4-C

QA

3,4

-diC

QA

3,5

-diC

QA

4,5

-diC

QA

T16 CatuaiRojo Arábica

T15 SarchimorArábica

T17 PacasArábica

T18 CaturraRojo Arábica

T5 AcawaArábica

T1 CatucaiArábica

T18Congolensis

Robusta

T3 CongolensisRobusta



Figura 12. Contenido de mono-CQA y di-CQA en especies de café cultivadas en Ecuador.

mg/K

g

53

Tabla XV. Rango de valores de concentración para cada isómero de ácido

clorogénico.

Especie arábica Especie robusta

Rango de concentración en mg/Kg

Rango de concentración en mg/Kg

Compuestos Verde Pintón Maduro Verde Pintón Maduro

3-CQA 11-91 53-421 48-164 43-191 56-263 73-456

5-CQA 197-1477 506-2919 565-1579 1489-7699 1452-5078 1165-4974

4-CQA 66-382 111-864 179-418 240 414 245-957

3,4-diCQA 90-133 99-195 109-164 137-359 187-314 172-359

3,5-diCQA 113-228 138-271 129-232 471-829 228-543 175-408

4,5-diCQA 22-63 43-123 59-160 89-246 109-230 130-301

Elaborado por: Autores, 2020.

IV.4.1 Análisis del contenido de Mono-isómeros de ácidos clorogénicos

en Coffea arábica y Coffea canephora.

De acuerdo con los análisis realizados, se confirmó la presencia de los

isómeros 3-CQA, 4-CQA, 5-CQA en todas las variedades de café que fueron

objeto de estudio. Se describe en primer lugar el comportamiento y las

concentraciones registradas para 5-CQA, el cual es según numerosos estudios

el ácido clorogénico que presenta mayor concentración en comparación con

otros mono-isómeros y di-isómeros de ácidos clorogénicos en granos de café

arábica y robusta (Gonzales et al, 2018; Gotelan et al, 2007; Ramírez, 1988).

En variedades de la especie Coffea arábica, los valores obtenidos para la

concentración de 5-CQA, independientemente del estado de maduración, se

mantuvieron dentro de un rango de 350 - 1580 mg/Kg (Tabla XV), como se

muestra en la Figura 13, a excepción de la variedad Catuaí Rojo, que en estado

pintón presentó un incremento en la concentración de hasta 2918 mg/Kg.

Es importante resaltar, que para la variedad Catuaí Rojo, de la especie Coffea

arábica, se reporta un aumento en la concentración de todos los isómeros de

CQA, cuando esta se encuentra en estado pintón, tal como se observa en la

Figura 12. Cabe destacar, que para la especie arábica, estudios como el

realizado por Maldonado, C. (2017), señalan a esta variedad como una de las

54

que mejores características sensoriales presenta; esto puede tener relación con

la concentración elevada de CQA que contienen los granos cuando se

encuentran en estado pintón y maduro, ya que como mencionan Tfouni et al,

(2013) y Brigitta et al, (2016), estos compuestos fenólicos tienen una marcada

influencia en el aroma y la calidad sensorial del café.

Figura 13.Contenido de ácido 5-cafeoilquínico, en especie Coffea arábica.

Fuente: Autores, (2020).

Los resultados muestran la tendencia de mayor concentración en los granos

maduros de la especie Coffea arábica; lo cual guarda correspondencia con lo

referido por Marín, et al. (2003), cuando menciona que la acidez titulable de los

granos de Coffea arábica, es mayor cuando estos se encuentran en estado

maduro.

Por otra parte, en la Figura 14, se observa que para la especie Coffea

canephora el valor más alto registrado de 5-CQA fue 7690 mg/Kg, el cual se

encontró en granos verdes del ecotipo T5. Es necesario señalar, que esta

concentración es la máxima alcanzada por los isómeros de ácidos clorogénicos

en todas las variedades analizadas, incluyendo a las de la especie arábica. En

el caso de Coffea robusta, el 5-CQA constituye el compuesto clorogénico de

mayor concentración, tal como lo reportan la mayoría de autores.

5-CQA C. ARÁBICA

9000

8000

7000 VERDE

6000 PINTÓN

5000 MADURO

4000

3000

2000

1000

0

T16 Ecotipos T5 T1

mg/

Kg

55

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

T3 T5

mg/

Kg

5-CQA C. ROBUSTA

Figura 14. Contenido de ácido 5-cafeoilquínico, en especie

Coffea canephora

Fuentes: Autores, (2020).

Si bien múltiples investigaciones refieren que en el café robusta el mayor

contenido de 5-CQA se encuentra en los granos verdes (Somporn et al, 2011;

Marin et al, 2003; Naveed et al, 2018), en la Figura 14 se evidencia que el ecotipo

T3 de robusta presenta un ligero incremento en el grano en estado maduro,

presumiblemente debido a que este ecotipo de congolensis constituye un clon

biológicamente mejorado.

Cabe destacar además, que los isómeros 3-CQA y 4-CQA se encuentran

considerablemente en menor concentración; y entre ellos, el ácido 4-

cafeoilquínico es mayor en ambas especies registrándose un rango de

concentración de 240 - 957 mg/Kg (Tabla XV), principalmente en los granos en

estado pintón y maduro. Sin embargo, es de señalar que en ciertas variedades

la concentración mínima de 4-CQA no fue detectable, lo que puede deberse en

parte, a que los valores mínimos hayan estado por debajo de los límites de

detección planteados para este estudio. Por su parte, el mayor contenido del

ácido 3-CQA se encontró generalmente en los granos en estado maduro, con

valores inferiores a 456 mg/Kg en las variedades que fueron objeto de análisis.

56

Al respecto, Craig et al (2016), señala una mayor concentración del 4-CQA

en especies de café arábica, en comparación con el contenido de 3-CQA, lo cual

es similar a lo evidenciado en el presente estudio.

De acuerdo con los resultados obtenidos, se considera que el análisis del

contenido de ácidos clorogénicos en diferentes especies de café de acuerdo con

su grado de maduración resulta de gran utilidad, al permitir determinar los

estadios óptimos del grano en los cuales puede existir un mejor aprovechamiento

de los CQA.

IV.4.2 Análisis del contenido de Di-isómeros de ácidos clorogénicos en

Coffea arábica y Coffea canephora.

Además de los mono-isómeros, se detectó la presencia de di-isómeros de

ácidos clorogénicos 3,4-diCQA, 3,5-diCQA, 4,5-diCQA en todas las muestras de

café seleccionadas. Estos compuestos presentaron variaciones en su contenido

de acuerdo al grado de maduración de las especies que fueron analizadas.

En la Figura 12, se puede observar que existe una notable diferencia en

cuanto al contenido de mono-isómeros y di-isómeros en muestras de café.

Para Coffea arábica, en todas sus variedades, los valores obtenidos de los

tres di-isómeros en los tres estados de maduración se mantuvieron en los rangos

de 22 -271mg/Kg (Tabla XV). Tal como señala Moon, et al. (2006), este valor

puede ser considerado bajo, si es comparado con los valores obtenidos para los

mono-CQA. La tendencia descrita en el apartado previo para la variedad Catuaí

Rojo también se presentó para este caso, ya que esta reportó los valores de

concentración más altos para el ácido 3,5-dicafeoilquínico y ácido 3,4-

dicafeoilquínico en el grano en estado pintón.

Los datos obtenidos sugieren que el 4,5-dicafeoilquínico fue el di-isómero con

menor concentración en las muestras estudiadas con una concentración inferior

a 160 mg/Kg.

La concentración de di-isómeros de ácidos clorogénicos en la especie Coffea

canephora demostró un comportamiento similar en cuanto al contenido de estos

ácidos, para los ecotipos analizados el rango de concentración se mantuvo entre

175 – 829 mg/Kg. El ácido 3,5-dicafeoilquínico fue el di-isómero en mayor

concentración, y su valor máximo fue reportado en el ecotipo T5 en granos verde.

57

A)

B)

Estudios como el realizado por Balyaya & Clifford, (1995), reconocen al 3,5-

diCQA como el isómero di-CQA de mayor concentración tanto en granos de

arábica como de robusta; sin embargo, otros autores como Farah et al, (2005);

Ky et al, (1997) mencionan al 4,5-diCQA como el más abundante de los di-

isómeros en muestras de café arábica y robusta.

En este caso, es de señalar que si bien el contenido de 3,5-diCQA fue mayor

en todas las muestras analizadas, entre especies, la concentración superior se

reporta en Coffea canephora. Estos resultados se asemejan a los obtenidos por

Marín, et al. (2008), en que se determina una mayor concentración de di-

isomeros para la variedad de café robusta.

A manera de ejemplo, en la Figura 15 y Figura 16 se presentan los

cromatogramas obtenidos a partir de la inyección de muestras de granos de café

robusta y arábica, en estado pintón.

Figura 15. Cromatograma de la muestra de café robusta: A) Elución de los monoCQA; B) Elución de los diCQA

58

B)

Figura 16. Cromatograma de la muestra de café arábica: A) Elución de los monoCQA; B) Elución de los diCQA

A)

59

CONCLUSIONES

De acuerdo al estudio realizado, y tal como se recoge en esta memoria, se

logró optimizar las condiciones analíticas para la identificación y cuantificación

cromatográfica de los isómeros de ácido clorogénico. Esta optimización permitió

el desarrollo del método mediante un sistema UPLC acoplada a un detector de

espectrometría de masas, consiguiendo la separación y elución de los

compuestos en un menor tiempo de análisis.

Se confirmó la presencia de isómeros de ácidos clorogénicos, en todas las

variedades de café, de las especies que fueron objeto de estudio; existiendo

diferencias en el contenido de los mono-isómeros y di-isómeros clorogénicos

entre la especie Coffea arábica y Coffea canephora. De las dos especies que

fueron analizadas, los granos de café robusta fueron los que presentaron una

mayor concentración de ácidos clorogénicos.

Los isómeros de ácidos clorogénicos presentan variaciones en su

concentración, de acuerdo al grado de maduración del grano de café. Así, las

variedades de café arábica estudiadas, presentaron la concentración máxima de

clorogénicos en estado pintón y maduro, mientras que las muestras de café

robusta, presentaron una mayor concentración de CQA en el grano verde.

60

RECOMENDACIONES

Se recomienda el desarrollo de estudios que permitan el levantamiento de

información acerca de los factores biológicos que pueden incidir en la variabilidad

del contenido de los isómeros de ácidos clorogénicos.

Así también se considera importante dar continuidad al estudio químico de las

especies de Coffea para la identificación de marcadores que caractericen el

origen de las especies, con la finalidad de poder conocer cómo afectan las

condiciones ambientales (temperatura, humedad, tipo de suelo) al contenido del

recurso vegetal, no solo por la concentración de estos compuestos fenólicos.

61

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66

GLOSARIO

Antesis: Es el periodo de florescencia o floración de las plantas con flores.

Bandolas: son ramas secundarias

Ecotipo: Es una misma especie que en ambientes diferentes tienen una

expresión fenotípica distinta por la interacción de los genes con el medio

ambiente.

Especie: En taxonomía, se denomina especie (del latín species) a la unidad

básica de clasificación biológica.

Internudos: Porción del tallo localizada entre dos nudos contiguos.

Isómeros: Son moléculas que tienen la misma fórmula molecular pero diferente

estructura.

Multicaule: Se aplica a la planta que tiene muchos tallos que nacen juntos.

Variedad: En botánica es una población con caracteres que la hacen reconocible

a pesar de que hibrida libremente con otras poblaciones de la misma especie.

67

ANEXOS.

Anexos A. Muestreo en junio de 2019. Estación Experimental

Tropical Pichilingue, en el cantón Quevedo, provincia de Los Ríos.

68

Anexos B. Muestras seleccionadas de Coffea arábica.

Coffea arábica

69

Anexos C. Muestras seleccionadas de Coffea canephora.

Coffea canephora

70

Anexos D. Resultados obtenidos en la determinación de humedad.

Muestra

Promedio

DS

CV (%)

T16V 62.32 1.32 2.11

T16P 65.76 1.13 1.72

T16M 65.75 2.14 3.26

T15V 63.90 2.69 4.21

T15P 68.29 1.34 1.96

T15M 66.92 2.47 3.69

T17V 64.56 6.17 9.56

T17P 66.80 3.04 4.55

T17M 63.56 2.27 3.57

T18V 63.05 0.37 0.58

T18P 64.10 0.64 0.99

T18M 65.78 3.31 5.03

T5V 69.22 0.69 0.99

T5P 65.95 2.30 3.48

T5M 67.54 0.62 0.92

T1V 64.68 6.46 9.99

T1P 68.07 1.02 1.50

T1M 66.02 5.55 8.41

RT18V 66.61 3.72 5.58

RT18P 64.21 4.41 6.86

RT18M 66.91 0.30 0.44

RT3V 64.76 5.43 8.39

RT3P 67.77 2.62 3.87

RT3M 64.54 4.30 6.66

RT4V 65.66 2.14 3.25

RT4P 66.27 1.92 2.90

RT4M 67.29 2.60 3.87

RT5V 68.81 0.73 1.06

RT5P 63.17 3.72 5.89

RT5M 65.33 0.93 1.42

71

Anexos E. Maceración hidroalcohólica de las muestras.

Anexos F. Extractos hidroalcohólicos en viales.

Anexos G. Cromatógrafo UPLC Waters (modelo ACQUITY) con detector de espectrometría de masas (QDa).

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