UNIVERSIDAD DE COLIMA

DOCTORADO EN CIENCIAS: REA BIOTECNOLOGA

TRANSFORMACIN GENTICA DE PLANTAS DE PAPA (Solanum tuberosum L.) CON EL GEN QUE CODIFICA PARA EL INHIBIDOR DE CISTEN PROTEINASAS

DE ORIGEN HUMANO; CISTATINA C.

TESIS

PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS, REA: BIOTECNOLOGA

PRESENTA

M EN C JOS FRANCISCO MORALES DOMNGUEZ

ASESORES DR. RAFAEL GUTIERREZ CAMPOS DR. OSCAR REBOLLEDO DOMNGUEZ

Tecomn, Colima, Mxico Enero del 2006

A: A: A: A:

A mis hijmis hijmis hijmis hijos:os:os:os:

FFFFrancisco Emiliano y Lus Hernn.rancisco Emiliano y Lus Hernn.rancisco Emiliano y Lus Hernn.rancisco Emiliano y Lus Hernn.

A mi domadora:A mi domadora:A mi domadora:A mi domadora:

CristY.CristY.CristY.CristY.

A mi papA mi papA mi papA mi pap

Y a JuanitaY a JuanitaY a JuanitaY a Juanita y Rogey Rogey Rogey Roge....

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad Autnoma de Aguascalientes por el apoyo institucional brindado en mi superacin profesional.

Al Programa de Mejoramiento del Profesorado (PROMEP) por su apoyo con la beca PROMEP/ 103.5/02/2037 para la realizacin de mi Doctorado en Ciencias. Al M en C. Rafael Urza Macias Rector de la Universidad Autnoma de Aguascalientes por su confianza y apoyo incondicional. Al Dr. Rafael Gutirrez Campos, por la direccin de esta tesis, asesora, invaluables consejos y su gran amistad, mi agradecimiento sincero. Al Dr. Eugenio Prez Molphe-Balch, por la asesora, revisin del escrito, apoyo y su gran amistad, mil gracias. Al Dr. Oscar Rebolledo Domnguez, por la asesora, brindada durante todo este proceso y por su gran amistad. Al Dr. Jaime Molina Ochoa, por la asesora brindada y acertadas sugerencias. Al Dr. Juan Alberto Osuna Castro y el Dr. Elpidio Pea Beltrn, por las sugerencias en la parte experimental, en la revisin del escrito y por la confianza brindada. Al Dr. Sergio Aguilar Espinosa, Dr. Roberto Lezama Gutirrez, Dr. Alfonso Pescador Rubio, por su valiosa revisin y sugerencias en durante todo este proceso. Al M en C Carlos Dvila Figueroa y a la TLQ Martha Prez Reyes, por su gran apoyo tcnico. A M en C. Cristina Garcidueas Pia, por el apoyo, amistad y su gran amor, mil gracias. A Elizabeth Lizardi Juregui, Mariana Muoz Vega, Mireya Delgado Gutirrez, Sandra Camacho, Bernardo Velsquez, por su amistad y apoyo. A todos mis compaeros del posgrado en Ciencias por compartir esta aventura y superacin.

Y sin olvidar a mis hermanos y hermanas y a la familia Morales Ruiz, gracias por todo. Y otra vez, a todos los mencionados y los que me faltaron, mil gracias.

ndice

ndice de figuras---------------------------------------------------------------------------------------I

ndice de tablas----------------------------------------------------------------------------------------II

Abreviaturas--------------------------------------------------------------------------------------------III

Resumen------------------------------------------------------------------------------------------------IV

Abstract---------------------------------------------------------------------------------------------------V

I INTRODUCCIN -----------------------------------------------------------------------------------1

II ANTECEDENTES-----------------------------------------------------------------------------------5

2.1 Origen e historia de la papa.---------------------------------------------------------------5

2.2 Taxonmia y cultivo de la papa.----------------------------------------------------------5

2.3 Produccin de papa.-------------------------------------------------------------------------6

2.4 Importancia de la papa----------------------------------------------------------------------8

2.5 Daos en papa. ---------------------------------------------------------------------------9

2.6 Proteasas.-------------------------------------------------------------------------------------12

2.7 Inhibidores de Cisten proteinasas.-----------------------------------------------------13

2.8 Estudio molecular del gen de la cch.---------------------------------------------------16

2.9 Cultivo de tejidos en papa.----------------------------------------------------------------17

2.10 Microtuberizacin.--------------------------------------------------------------------------20

2.11 Factores que inducen la microtuberizacin.-----------------------------------------21

2.12 Transformacin gentica de plantas de papa mediada por

Agrobacterium tumefaciens. --------------------------------------------------------------23

III MATERIALES Y METODOS --------------------------------------------------------------------25

3.1 Materiales--------------------------------------------------------------------------------------25

3.2 Mtodos----------------------------------------------------------------------------------------25

3.2.1 Construccin del plsmido Pcambia:cch.-------------------------------------------25

3.2.2 Aislamiento de DNA plasmdico mediante mini preparaciones por

el mtodo de Birboin.------------------------------------------------------------------------28

3.2.3 Micropropagacin de plntulas axnicas de papa mediante cultivo

de tejidos vegetales.-------------------------------------------------------------------------29

3.2.4 Regeneracin de papa va organognesis.-----------------------------------------29

3.2.5 Microtuberizacin.-------------------------------------------------------------------------30

3.2.6 Registro y anlisis de datos.------------------------------------------------------------31

3.2.7 Germinacin de los microtubrculos y aclimatacin.-----------------------------32

3.2.8 Transformacin gentica de plantas de papa mediada por

Agrobacterium tumefaciens.---------------------------------------------------------------32

3.2.9 Anlisis histoqumico del gen uidA (gus).-------------------------------------------35

3.2.10 Anlisis molecular de las plantas transformadas mediante la

reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).-----------------------------------------35

IV RESULTADOS-------------------------------------------------------------------------------------37

4.1 Construccin y anlisis molecular del vector Pcambia:cch.----------------------37

4.2 Produccin de brotes a partir de tubrculos de la papa.--------------------------40

4.3 Propagacin de plntulas de papa. ----------------------------------------------------40

4.4 Regeneracin.--------------------------------------------------------------------------------41

4.5 Produccin de microtubrculos.---------------------------------------------------------45

4.6 Germinacin de microtubrculos.-------------------------------------------------------48

4.7 Transformacin de plantas.---------------------------------------------------------------50

V DISCUSIN ------------------------------------------------------------------------------------55

VI CONCLUSIONES----------------------------------------------------------------------------68

VII LITERATURA CITADA---------------------------------------------------------------------69

NDICE DE FIGURAS

Figura 1. Produccin mundial de papa -----------------------------------------------------7

Figura 2. Produccin nacional de papa ----------------------------------------------------8

Figura 3. Diagrama del uso integral de la papa.-----------------------------------------10

Figura 4. Mecanismo propuesto para la inhibicin de cisten proteasas ---------16

Figura 5. Proceso de tuberizacin en papa. ---------------------------------------------21

Figura 6. Mapa del vector pKYLX80 -------------------------------------------------------26

Figura 7. Mapa del vector pCAMBIA:2301 -----------------------------------------------27

Figura 8. Anlisis de restriccin de pUC18:cch -----------------------------------------38

Figura 9. Anlisis de restriccin de pBSK-:cch. -----------------------------------------38

Figura 10 Anlisis de restriccin de pCAMBIA:cch -------------------------------------39

Figura 11. Mapa de la construccin pCAMBIA:cch.-------------------------------------39

Figura 12. Micropropagacin in vitro de plntulas de papa.--------------------------40

Figura 13. Regeneracin de papa a partir de tallos.------------------------------------42

Figura 14. Produccin de tejido calloso en explantes de hoja y tallo --------------43

Figura 15. Formacin de brotes a partir de tejido calloso.-----------------------------43

Figura 16. Regeneracin de papa a partir de callos ------------------------------------44

Figura 17. Enraizamiento de plntulas de papa.-----------------------------------------44

Figura 18. Efectos de la luz contina en la produccin de tubrculos.-------------47

Figura 19. Efectos de la oscuridad en la microtuberizacin -------------------------47

Figura 20. Efecto de la sacarosa y cinetina sobre la microtuberizacin.----------48

Figura 21. Germinacin de microtubrculos.----------------------------------------------49

Figura 22. Adaptacin en suelo de plantas de papa ------------------------------------49

Figura 23. Comparacin entre plntulas transformadas y no transformadas. ----52

Figura 24. Verificacin de plantas transformadas mediante PCR.-------------------53

Figura 25. Anlisis de gus papa transformadas. -----------------------------------------53

Figura 26. Plantas regeneradas de papa con el gen de la cch.-----------------------54

Figura 27. Verificacin de plantas transgnicas por PCR y GUS.--------------------54

NDICE DE TABLAS

Tabla 1. Tratamientos analizados para la regeneracin de papa.----------------30

Tabla 2. Tratamientos analizados para la microtuberizacin.---------------------31

Tabla 3. Primera transformacin gentica de plantas de papa.------------------34

Tabla 4. Segunda Transformacin gentica de plantas de papa.----------------34

Tabla 5. Efecto de varias combinaciones de los reguladores de

crecimiento en la regeneracin de papa.-------------------------------------------41

Tabla 6. Tratamientos in vitro utilizados para la microtuberizacin.-------------45

Tabla 7. Anlisis de la expresin de GUS en explantes de hoja

y tallo de papa.----------------------------------------------------------------------------51

ABREVIATURAS

Krpm Kilo (mil) revoluciones por minuto.

L Litros

ml Mililitros

l Microlitros

Kg. Kilogramos

g Gramos

mg Miligramos

g Microgramos

ng Nanogramos

M Molar

mM Milimolar

M Micromolar

hr Hora

min. Minuto

cm Centmetro

pb Pares de bases

RNAasa Ribonucleasa

DNAasa Desoxirribonucleasa

Micro

U/l Unidades por microlitro

PCR Reaccin en cadena de la polimerasa

Npt II Neomicina fosfotransferasa II.

cch Gen de la cistatina C humana

oc-I Gen de oryzacistatina ( cistatina del arroz)

MS Medio de cultivo de Murashige y Skoog

BA Bencil adenina

AIA cido indol actico.

Cb Carbenicilina

Km Kanamicina

C Grados centgrados

RESUMEN

TRANSFORMACION GENTICA DE PLANTAS DE PAPA (Solanum tuberosum L.) CON EL GEN QUE CODIFICA PARA EL INHIBIDOR DE CISTEN PROTEINASAS DE ORIGEN

HUMANO; CISTATINA C.

Se optimiz un sistema de regeneracin in vitro por organognesis en Solanum tuberosum cv. Alfa sin el uso de zeatina. Se utilizaron explantes de hojas y tallos provenientes de plntulas de 4-5 semanas cultivadas in vitro. La formacin de callo ocurri despus de 4-5 semanas y los brotes aparecieron de 8-10 semanas despus de la formacin de los callos en medio MS conteniendo 0.05 mgL-1 TDZ, 0.1 mgL-1 BA, 1 mgL-1 GA3 y 1 mgL

-1 AIA. Alrededor del 97% de los explantes cultivados formaron callo, y la regeneracin de brotes ocurri con una frecuencia del 85.7% relativa al total de callos formados. Por otro lado, se analizaron algunos procesos para la microtuberizacin en este mismo material gentico de papa. El cultivo de segmentos nodales con un brote en MS 100% ms 2.5 mgL-1 de cinetina result en un incremento en la formacin de microtubrculos bajo condiciones de un pretratamiento de incubacin de 14 das en la oscuridad seguido por un fotoperiodo de das cortos. Los segmentos nodales produjeron en promedio 7.30.3 microtubrculos por explante. Los sistemas de regeneracin y microtuberizacin optimizados en este trabajo permitirn reducir el tiempo y costos para la propagacin de plantas de papa con caractersticas deseables.

Asimismo, se llev a cabo la transformacin de Solanum tuberosum cv. Alfa con el gen de la cistatina C humana, el cual codifica una protena pequea que es un potente inhibidor de proteasas y a la cual se le ha asignado potencial para proteccin de cultivos de inters econmico. El transgen estuvo regulado por el promotor del virus del mosaico de la coliflor potenciado (35S2). La transformacin fue realizada mediante cocultivo con las cepas EHA 105, PVG 2260 y AGL 1226 de A. tumefaciens. Los anlisis moleculares de expresin y presencia del transgen en las plantas presuntamente transformadas consistieron en anlisis histoqumicos de actividad de GUS y la tcnica de PCR con oligos especficos dirigidos a los genes cch, nptII, uidA y virD1. El transgen pareci mostrar una sobre expresin temprana ya que las plantas generadas presentaron efectos pleitrpicos fisiolgicos tales como enanismo, decremento en la dominancia apical, hojas pequeas delgadas y etioladas, as como una necrosis en el sitio de corte del tallo posiblemente debida a una apoptosis lenta. La optimizacin de este sistema de expresin permitir analizar el potencial de la cistatina C como agente de proteccin contra fitopatgenos de cultivos importantes. Palabras clave: Solanum tuberosum, cv. alfa, callo, microtubrculo, cinetina.

ABSTRACT

TRANSFORMATION OF Solanum tuberosum, CV. ALPHA, WITH GENE ENCODING TO CYSTEINE PROTEASE INHIBITORS FROM HUMAN; CYSTATIN

C. An in vitro organogenesis-based regeneration system was optimized for Solanum

tuberosum cv. Alfa without using zeatin. Leaves and stems from 4-5 week-old in vitro grown plantlets were used as explant source. Callus formation occurred after 4-5 weeks and shoots appeared 8-10 weeks after callus formation in Murashige & Skoog (MS) medium containing 0.05 mgL-1 TDZ, 0.1 mgL-1 BA, 1 mgL-1 GA3 and 1 mgL

-1

AIA. About 97% of the cultivated explants formed calli, and shoot regeneration occurred at a frequency of 85.7% relative to the total of calli formed. On the other hand, several processes for the microtuberization of this potato genetic material were analyzed. Cultivation of nodal segments containing one shoot on 100% MS amended with 2.5 mgL-1 of kinetin resulted in increased microtuber formation under conditions involving an incubation pre-treatment of 14 days in darkness followed by a short-day photoperiod. Nodal segments produced an average of 7.30.3 microtubers per explant. The regeneration and microtuberization systems optimized in the present work will permit reductions in time and costs for the propagation of potato plants with desirable characteristics.

In addition, Solanum tuberosum cv. Alfa was transformed with the human cystatin C gene, encoding a small protein with a potent protease-inhibiting activity and potential for protection of crops of economic interest. The transgene was regulated by a potentiated form of the cauliflower mosaic virus promoter (35S2). Transformation was carried out by co-culture with A. tumefaciens EHA 105, PVG 2260 and AGL 1226 strains. Molecular analyses for transgene expression and presence in putatively transformed plants consisted in histochemical analyses for GUS activity and PCR with specific oligos targeted at the cch, nptII, uidA and virD1 genes. The transgene seemed to show early overexpression in view that transformed plants presented physiologic pleiotropic effects such as dwarfism, decreased apical dominance and small, thin etiolated leaves, as well as necrosis at the stem cut site possibly due to slow apoptosis. Optimization of this expression system will allow for the analysis of the potential of cystatin C as a protection agent against phytopathogens of important crops. Keywords: Solanum tuberosum, cv. alfa, calli, microtuber, kinetin.

1

I INTRODUCCIN

Por su gran inters agrcola y econmico la papa (Solanum tuberosum L.) es uno

de los principales cultivos de cosecha a nivel mundial, sin embargo, existen grandes

prdidas debido tanto a factores biticos como abiticos. Entre los factores biticos

que ms daan a la papa se encuentran, las plagas y los patgenos (Atkinson et al.,

2001).

La Biologa Molecular de plantas, ofrece nuevas alternativas para el control de

plagas y patgenos, as como para la generacin de materiales con caractersticas

agronmicas ventajosas al lograr transferir material gentico exgeno (transgen) que

le confiera alguna de las caracterstica deseadas (Lawrence, 2002).

Existen varios mtodos de transformacin en plantas, sin embargo una de las vas

posibles para aumentar la eficacia de estos mtodos es la optimizacin de la

capacidad de regeneracin in vitro de las plntulasespecies a trabajar (Powell et al.,

1990; Le, 1991; Ly et al., 1996; MHamdi et al., 1998). En plantas de papa, es posible

la transformacin de diferentes cultivares comerciales, a partir de segmentos de tallo

y hojas desarrolladas in vitro, anteras y de discos de microtubrculos (Gmez et al.,

1997; Rodrguez et al., 2000; Trujillo et al., 2001).

Entre los genes ms estudiados como de defensa en plantas estn los que

codifican para inhibidores de proteasas (Boulter, 1993; Urwin et al., 1995; Atkinson et

al., 2001). Los inhibidores de proteasas, son pequeas protenas, que generalmente

se encuentran en altas concentraciones (10% del contenido proteco) en tejidos de

almacenamiento de la planta, pero tambin se han detectado en las hojas como

respuesta al ataque de insectos y microorganismos patgenos. Tales inhibidores se

unen con alta afinidad pero reversiblemente a enzimas proteolticas en un sitio

especfico de tal modo que inhiben su actividad (Urwin et al., 1997; Koiwa et al.,

2000; De Leo et al., 2002).

Con formato: Fuente: Cursiva

2

Los inhibidores de proteasas ms estudiados son del tipo cisten proteinasas o

cistatinas y entre estos se encuentran el oc-I (oryzacistatina de arroz) aislado de

semillas de arroz (Arai et al, 2002), y cch (cistatina c Humano) aislado de suero de

pacientes con enfermedades autoinmunes y esta presente en altas concentraciones

en mucho fluidos biolgicos como: el plasma seminal, fluido cerebroespinal y en bajas

concentraciones en otros fluidos como saliva y orina humana (Abrahamson et al.,

1990). En plantas transformadas genticamente con cistatinas exgenas

principalmente con el oc-I, indican que este tipo de inhibidores juega un papel clave

en la defensa contra diferentes plagas y patgenos (Valueva y Mosolov, 2004). Sin

embargo, no existen estudios reportados donde el gen de la cch se haya expresado

en plantas pero, los estudios ms sobresalientes de este gen son en sistemas de

expresin bacterianos donde se obtienen grandes cantidades de esta protena sin

perder sus propiedades fisicoqumicas (Abrahamson, 1988). Otro punto importante

de esta protena, se refiere a los efectos que tiene en el auto procesamiento del virus

del ciruelo, ya que este tipo de inhibidor interviene en la protelisis de la poliprotena

viral producida por el propio virus impidiendo su procesamiento infectivo (Garca et

al., 1993; Gutirrez-Campos et al., 1999). La propuesta hecha por Irie et al. (1996)

sobre la funcin de las cistatinas como inhibidores del auto procesamiento de los

potivirus ha sugerido que la cch puede jugar un papel clave en el reconocimiento e

inhibicin de proteasas exgenos o actuar en las enzimas digestivas de los intestinos

de los insectos.

Sin embargo, en plantas de papa de la variedad alfa transformadas genticamente

con el del gen de la cch podran mostrar resistencia o tolerancia a plagas y

patgenos.

Pero para que la transformacin sea eficiente se requiere de un sistema ptimo de

regeneracin. Existen diversos trabajos sobre regeneracin en papa donde se

demuestra que hay una gran dependencia del genotipo en la capacidad y eficiencia

de regeneracin (Park et al. 1995). Sin embargo, el factor ms importante para que la

3

regeneracin sea posible es el balance adecuado de reguladores del crecimiento

(Yadav y Sticklen, 1995).

La mayora de los protocolos de regeneracin en papa, se basan en colocar los

explantes en tres diferentes medios en composicin: 1) para la induccin de tejido

calloso, 2) para la induccin de brotes y 3) Enraizamiento, provocando que este

sistema sea ms laborioso y consuma tiempos ms largos (Park, 1995; Hulme et al,

1992; Curry y Cassells, 1999). Sin embargo, tambin existen protocolos de

regeneracin en un slo paso, que consisten en colocar explantes en el mismo

medio de cultivo con una adecuada combinacin de reguladores del crecimiento

hasta la obtencin de plntulas (Trujillo et, al. 2001; Rodrguez et al. 2001).

En el caso del cultivo de papa, particularmente en la variedad alfa (la de mayor

produccin y consumo en nuestro pas), es posible la produccin de plantas y

tubrculos libres de enfermedades, germoplasma, conservacin y sistemas de

transformacin gentica, sin embargo estos mtodos son lentos, costosos e

ineficientes.

Debido a lo anterior, en el presente trabajo realizamos estudios in vitro con la

planta de papa de la variedad alfa con el fin de establecer metodologas de

propagacin, microtuberizacin, aclimatacin de plntulas y microtubrculos, as

como un sistema eficaz de regeneracin va organognesis en un slo paso. De la

misma forma se generaron plantas transformadas genticamente a travs del

sistema Agrobacterium tumefaciens con el cDNA del gen de la cistatina C humana

(cch). Dicha protena fue seleccionada debido a su alta capacidad inhibitoria de

cisten proteinasas cuando es evaluada in vitro (contra la actividad enzimtica de

papana), demostrando que es mayor que en el caso de la oc-I.

4

hiptesis:

El sistema de regeneracin in vitro en un slo paso es adecuado para la

transformacin de plantas de papa mediante Agrobacterium tumefaciens con el gen

de la cch, y las plantas transformadas que se generen tendrn dicho gen.

Objetivo general.

Desarrollar un sistema in vitro de regeneracin va organognesis de plantas de papa

y transformar explantes de hoja y tallo mediante Agrobacterium tumefaciens con el

gen de la cistatina C humana.

Objetivos especficos

1. Optimizar un sistema de propagacin y microtuberizacin a partir de

segmentos nodales de plntulas de papa crecidas in vitro.

2. Optimizar un sistema de regeneracin va organognesis a partir de explantes

de hoja y tallo de plntulas crecidas in vitro.

3. Transformar genticamente plantas de papa a partir de explantes de hoja y

tallo de plntulas crecidas in vitro con el gen de la cistatina C humana (cch)

mediada por Agrobacterium tumefaciens.

4. Verificar la transformacin gentica mediante tincin histoqumica de GUS y

por PCR para los genes nptII, virD, gus y cch de lneas de papa como posibles

transformantes.

5

II ANTECEDENTES

2.1 Origen e historia de la papa

La palabra papa proviene del vocablo quechua que significa tubrculo, es una

planta tuberfera originaria de Amrica (Hawkes y Lester, 1977). Existen dos centros

de biodiversidad de papa silvestre: uno que est localizado en la regin central de

Mxico, y el segundo entre la regin central del Per y el noroeste Argentino.

Algunasde Argentina. Algunas variedades silvestres son originarias de Mxico. Los

incas del Per han cultivado esta hortaliza desde hace dos mil aos, lo que habla de

la tradicin de este producto en las culturas indgenas del continente. Fue introducida

a Europa despus de la conquista de los espaoles, apareciendo gradualmente en

varios pases europeos durante los siglos XVII y XVIII. Durante el periodo de 1600 a

1845, la papa se constituy como la principal fuente de alimentos de Irlanda, siendo

los inmigrantes de este pas los que la trajeron a Norteamrica en el ao de 1719. Por

sus altos rendimientos por hectrea y sus caractersticas alimenticias, diversas

naciones del viejo mundo incorporaron su cultivo con el fin de evitar los rigores de las

hambrunas entre sus pueblos (Hawkes, 1977; Alonso, 1991).

2.2 Taxonmia y cultivo de la papa

El cultivo de la papa se ha extendido por todo el mundo a excepcin de los pases

tropicales. La papa (Solanum tuberosum L.) pertenece a la familia Solanaceaefamilia

Solanaceae; es una planta dicotilednea herbcea anual, sus races son muy

ramificadas, finas y largas, el tallo se origina en las yemas del tubrculo y es grueso,

fuerte y anguloso con una altura que vara entre los 0.5 y 1 metros; por lo general

consta de nueve o mas foliolos cuyo tamao es mayor cuanto ms alejados se

encuentren del nudo de insercin (Hawkes, 1977).

Con formato: Color de fuente:Automtico

6

El fruto es una baya redonda de color verde, que al madurar se vuelve amarilla. A

la vez que tallos areos, la planta tiene tallos subterrneos; los primeros son de color

verde y contienen un alcaloide txico llamado solanina, que pueden formarse

tambin en los tubrculos cuando estos se exponen prolongadamente a luz. Los

tallos subterrneos o estolones, relativamente cortos, en sus extremidades se

convierten en tubrculos. En la superficie de los tubrculos se forman yemas

distribuidos en forma helicoidal, abundando sobre todo en la parte opuesta al punto

de insercin sobre el estoln. Aunque la papa puede multiplicarse por semillas y por

esquejes, en la prctica, la multiplicacin es siempre vegetativa, hacindose por

medio de los tubrculos que producen brotes en las yemas (Alonso, 1991).

En Mxico, la papa se produce tanto en el ciclo otoo-invierno como en el de

primavera-verano, aunque el ms importante es este ltimo ya que durante el mismo

se obtienen alrededor del 60 por ciento de la produccin. Se cultiva tanto en

condiciones de temporal como de riego destinndose para la primer modalidad

aproximadamente el 50 por ciento del total y el restante para riego (Sagarpa, 2004).

2.3 Produccin de papa

La produccin mundial de papa se increment rpidamente en las ltimas tres

dcadas, en una mayor proporcin que cualquier otro cultivo, exceptuando al trigo,

arroz y maz. Actualmente se cultiva en todo el mundo y en muchos pases es el

alimento bsico (Alonso, 2000; Sagarpa; 2004). En Alemania, Rusia y Polonia se

consumen alrededor de 180 kg de papa percpita por ao. Por su parte, el promedio

de consumo nacional percpita promedio en Mxico durante el periodo 1992-2001 fue

de 16.5 kilogramos por persona (Sagarpa, 2004). Pese a que la papa es un producto

originario de Amrica, la principal zona productora no est en el continente

americano, si no que est conformada por pases asiticos y europeos. Segn datos

de la FAO en el periodo comprendido entre 1992-200, la produccin mundial de papa

registr un incremento del 11 por ciento, al pasar de 277 millones de toneladas en

7

1992 a 308 millones en 2001. Casi el 60 por ciento de la produccin mundial de papa

se concentra en China, Rusia, Polonia, Estados Unidos, India y Ucrania (Fig. 1)

(Sagarpa, 2004).

Figura 1. Produccin mundial de papa en el periodo comprendido entre 1992-2001. En la figura se muestra grficamente la produccin mundial de papa en millones de toneladas (Y), por pas (X) (FAO, 2004).

En nuestro pas, la papa ocupa el quinto lugar en importancia, superado

nicamente por los granos bsicos (maz, frjol, arroz y trigo), entre las hortalizas solo

los cultivos de jitomate y chile verde ocupan una mayor superficie, en cuanto

produccin slo es superado por el jitomate (Sagarpa, 2004). En estos ltimos diez

(1992-2002) aos, los principales estados productores han sido: Sinaloa, Estado de

Mxico, Nuevo Len, Chihuahua, Sonora y Guanajuato (Fig. 2), quienes en conjunto

aportaron el 60 por ciento del total de la produccin nacional durante el periodo

analizado (Sagarpa, 2004).

0

100

200

300

400

500

600

China Rusia Polonia EstadosUnidos

India Ucrania Alemania Belosrusia Holanda Reino Unido Mxico

Pas

Mill

on

es d

e to

nel

adas

8

Figura 2. Produccin nacional de papa en el periodo comprendido entre 1992- 2001. En la figura se muestra grficamente el porcentaje de produccin nacional de papa por estado (Sagarpa, 2004).

2.4 Importancia de la papa

El destino de la produccin de papa en Mxico, est distribuido de la siguiente

manera: el 80% es consumida como alimento fresco, 7% para uso industrial y

alimentos procesados (papas fritas, almidn, alcohol, industria farmacutica) y el

13% restante, se utiliza como semilla. El 60% de las reas de cultivo de papa en

Mxico es ocupada por la variedad alfa, seguida por la variedad Lpez con un

25% y el resto lo componen entre las variedades Atlantic, White Rose, Bintje,

Nortea, Rosita, Mexiquense, entre otras.

En trminos de nutricin, 100 g de papa suplen cerca del 10% de la dosis diaria

de protena recomendada para nios, una consideracin importante para pases

que buscan mejorar la dieta de sus pobladores. Estos 100 g tambin proporcionan

el equivalente al 10% de los requerimientos de un adulto de tiamina, niacina,

Sinaloa17%

Mexico10%

Nuevo Len 9%

Chihuahua9%Sonora

8%

Guanajuato8%

Michoacan7%

Puebla7%

Coahuila5%

Jalisco4%

Veracruz4%

Otros12%

9

vitamina B6 y cido flico y cerca del 50% de vitamina C (Dilmer, 2000). Adems

de su consumo como producto fresco la papa tiene un gran potencial econmico

cuando es procesado para la industria alimentara, qumica, agroindustrial,

farmacolgica y en otras ramas industriales (Fig. 3).

Adems de que, la papa sufre varios procesos para diferentes usos, en la

actualidad se ha emprendido el mejoramiento en su produccin mediante

Biotecnologa , ya que en el pasado se enfoc en incrementar la produccin por

hectreas sembrada y en desarrollar variedades resistentes a plagas y

enfermedades (Van der Meer, 1994; Wu et al., 1995; Atkinson et al., 1997; Urwin

et al., 1997; Veramendi et al., 1999; Dilmer, 2000; Urwin et al., 2000; Atkinson et

al., 2001; Zeh et al., 2001; Vsquez, 2001; Urwin, 2001; Lauterslager et al., 2001).

2.5 Daos en papa

El cultivo de la papa y su produccin, se ve afectado tanto por factores biticos y

abiticos. Entre los factores biticos, se encuentran principalmente los patgenos y

plagas, entre los patgenos ms importantes se encuentran Los patgenos mayor

considerados estn: las bacterias, destacando ; entre las que han causado severos

daos en la produccin y sanidad de la papa se incluyen a 2 subespecies

estrechamente relacionadaos de Erwinia carotovora (E. c, Subs. carotora y

astroseptica) que causa la pudricin blanda y es conocida comnmente como piedra

negra, Ralstonia solanacearum (Pseudomas solanacearum) que causa marchitez y

daa a nivel vascular en los tubrculos, dao conocido como vaquita de la papa y

Clavibacter michiganenesis sspSubs.. sepedinicum que causa la enfermedad como

pudricin anillada de la papa y marchitez.,

10

Figura 3. Diagrama del uso integral de la papa.

11

En lo que respecta a los en virus, existe una gran lista de los que se han

identificado en el cultivo de la papa a nivel mundial y su distribucin geogrfica esta

limitada a ciertas regiones lo que puede ser determinado por las condiciones

ambientales, el tipo del suelo, la presencia del vector y transmisin mecnica,. eEntre

los principales virus se encuentran: el virus X de la papa (potexvirus), los virus Y y A

de la papa (potivirus), el virus S de la papa (carla virus) y el virus del enrollamiento de

la hoja (luteovirus) y entre estos, los ms importantes son los del tipo potivirus

(Lozoya-Saldaa et al., 2002; Bakker et al., 2003).

Entre los , en hongos patgenos de papa, uno de los ms importantes es

Phyphthora infestans que causa la enfermedad conocida como tizn tardo (Lawrence

et al., 2002), fitoplasmas causantes de la punta morada, mientras que en los

nematodos fitoparsitos estn los del genero Globodera rostochiensis y Globodera

palliada; nematodos formadores del quiste de la raz (Urwin et al., 2000) y

Meloidogyne incgnita; nematodo formador de ndulos de la raz (Hussey y Jenssen,

2002; y en plagas algunos insectos como: colepteros y hempteros principalmente

(Ashok et al.,1998; Atkinson et al., 2001; Lawrence et al., 2002).

Tradicionalmente, el control de estas plagas y patgenos requiere de la rotacin

de la tierra, resistencia del husped y de plaguicidas qumicos. Las dos primeras

estrategias proveen un control incompleto y los plaguicidas son demasiados txicos y

provocan contaminacin ambiental (Urwin et al., 1998).

Una alternativa para controlar este tipo de plagas y patgenos, consiste en proveer a

la planta de defensas transfiriendo genes que codifican para inhibidores de proteasas

(Boulter, 1993; Urwin et al., 1998; Atkinson et al., 2001), estas protenas se unen a

enzimas proteolticas (proteasas), de tal modo que inhiben su actividad (Ryan, 1990;

Abe et al., 1991; Richardson, 1991).

12

2.6 Proteasas

Las proteasas son un grupo de enzimas que tienen la capacidad de degradar total

o parcialmente las protenas. El termino proteasa incluye a tanto a endopeptidasas

como a exopeptidasas, mientras que proteinasa es usado para describir solo a

endopeptidasas (Ryan, 1990).

Las primeras funciones asignadas a este tipo de enzimas derivaron de la

implicacin en la digestin de las protenas de la dieta (Turk, 1991). Actualmente, en

animales, su significado biolgico se ha ampliado notablemente y se ha reconocido

su papel central y especfico en mltiples procesos como la coagulacin sangunea,

la cicatrizacin de heridas, la ejecucin de los programas de apoptosis (Rodrguez-

Fragoso, 2000). Recientemente, se ha estudiado la actividad metablica de proteasas

principalmente de cisten proteinasas en los intestinos de diferentes plagas y en

diversos procesos celulares de patgenos que atacan a plantas de inters

agroalimentarios (Arai, 1996; Lilley et al., 1996).

En plantas, las proteasas juegan un papel importante en la degradacin de

protenas, como un proceso esencial para el crecimiento, desarrollo y respuestas a

diferentes factores ambientales. Aunque las plantas pueden sintetizar todos los

aminocidos de novo, una gran cantidad de nuevas protenas son derivadas del

reciclado de aminocidos. Los aminocidos pueden ser generados de la degradacin

de protenas de reserva en semillas o tejidos vegetativos. Bajo condiciones de estrs,

la degradacin de protenas es acelerada para mantener el suministro adecuado de

aminocidos. Por lo que la protelisis en plantas es un proceso muy complejo que

involucra muchas proteasas (Ho et al., 2000).

Las proteasas, se clasifican en base a su mecanismo de accin y son: sern,

aspartil, cisten y metalo proteasas (Barret, 1987; Chauhan, 1991; Grant, 1996;

Chinni, 1997; RodrguezFragoso et al., 2000). Entre las proteinasas msmayor

estudiadas se encuentra las del tipo cisten, debido a que tienen un papel central en

Con formato: Fuente: Cursiva

13

diferentes funciones de protelisis en plantas superiores, desde: el catabolismo de las

protenas de reserva de semillas y en procesos fisiolgicos y de desarrollo comohasta

senescencia y muerte celular programada (Ho et al., 2000; Solomon et al., 1999).

La mayora de las cisten proteinasas pertenecen a la familia de la papana y en

su secuencia de aminocidos muestran regiones conservadas homlogas entre ellas

y son reguladas intracelularmente (en cuanto a su actividad) por protenas

denominadas inhibidores de cisten proteinasas o cistatinas, las cuales se unen de

una manera especfica y reversible al sustrato (Barrett, 1987).

2.7 Inhibidores de cisten proteinasas (cistatinas)

Los inhibidores de proteasas, son pequeas protenas, que generalmente se

encuentran en altas concentraciones (10% del contenido total de protenas) en tejidos

de almacenamiento de la planta, pero tambin se han detectado en las hojas como

respuesta al ataque de insectos y microorganismos patgenos (Johnson et al., 1989;

Ryan, 1990; Botella et al., 1993; Boulter, 1993; Urwin et al., 1997; Koiwa et al., 2000;

De Leo et al., 2002).

El nombre de cistatina lo utiliz por primera vez Barret en 1981, aplicndolo a una

protena obtenida de huevo de gallina, que present una alta inhibicin con varas

cisten proteasas. Un nmero considerable de otras protenas aisladas y

caracterizadas presentan tambin esta inhibicin de proteasas y de acuerdo a la

secuencia de aminocidos y su comparacin con la cistatina de huevo de gallina, se

ha formado una superfamilia (Barret et al., 1987). En base a estos datos, las

cistatinas se han clasificado en una familia de cuatro miembros que son: Las

estfinas, cistatinas, kiningenos y fitocistatina (Turk y Bode, 1991; De Leo et al.,

2002).

14

Las estefinas son protenas de una sola cadena polipeptdica y carecen de

puentes de disulfuro, tienen un peso molecular de 11 kDa, as mismo, todas las

protenas de esta familia contienen la regin conservada del pentapptido Gln-Val-

Val-Ala-Gly.

Las cistatinas, al igual que las estfinas son protenas de una sola cadena pero,

presentan dos puentes disulfuro, su peso molecular promedio es de 13 kDa, y

presentan el pentapptido Gln-Xaa-Val-Xaa-Gly.

Los kiningenos, son reconocidos como precursores de los procesos de la

coagulacin de la sangre y de procesos inflamatorios, adems de su funcin como

inhibidor de cisten proteinasas del tipo de papaina. Son las protenas de mayor peso

molecular de esta familia con cerca de 120 kDa.

Las fitocistatinas son protenas que se encuentran ampliamente distribuidas en

diferentes tejidos de la planta. Las principales representantes de este grupo son las

oc-I y oc-II, que fueron las primeras aisladas de semillas de arroz (Arai et al., 2002).

Tienen un peso molculas entre 12 y 16 kDa, no presentan enlaces disulfuro, estn

implicadas en los procesos de germinacin, senescencia y en defensa contra plagas

y patgenos (Boris et el., 1998; Botella et al., 1993; De Leo et al., 2002).

En nuestro grupo de investigacin estamos enfocados en el grupo 2 de las

cistatinas por su importancia en diversos procesos celulares, fisiolgicos y de defensa

en plantas. La familia de las cistatinas generalmente esta compuesta de 115 residuos

de aminocidos y con un peso molecular promedio a 13 kDa (Turk y Bode, 1991).

Son fuertes inhibidores reversibles de la cisten proteasa como la papana que inhibe

desde 1x10 12 M (Song, 1995; Abraham, 1991). Presentan regiones consenso en

aminocidos principalmente los conformados por Gln 53-Val-Val-Asp- Glu 57, dando

lugar a un lazo conformado por puente de sulfuro que reacciona con el sitio cataltico

del sustrato, asimismo, tambin estn presentes los residuos glicina 9 y alanina -10,

estos dos aminocidos forman dos lazos independientes, que interactan a travs de

puentes de hidrgeno y junto con el amino terminal adoptan una conformacin

15

altamente complementaria al sitio activo de la papana e impidiendo por lo tanto su

accin cataltica sobre el sustrato (Fig. 4) (Abe; 1987a, Fanos, 1999; Solomon, 1999).

El inhibidor de proteasas ms estudiado es la cistatina C humanao (cch), aislado

de suero de pacientes con enfermedades autoinmunes y est presentes en altas

concentraciones en mucho fluidos biolgicos tales como:: plasma seminal, fluido

cerebroespinal y en bajas concentraciones en otros fluidos como saliva y orina

humana (Abrahamson et al., 1990). La cistatina de huevo de gallina tambin es uno

de los ms estudiados y es usado como modelo accin de los inhibidores de

proteasas sobre su sustrato (Bode, 1990). El mecanismo de accin propuesto se

describe en la Figura 4.

La actividad de las cistatinas como inhibidores de proteasas se ha demostrado

tanto in vitro como en plantas transgnicas. Por ejemplo, Pernas et al., (2000),

demostraron la actividad antifngica de cistatinas extradas del castao que inhibi el

crecimiento de B. Cinerea, asimismo, se demostr esta actividad de cistatinas

extradas de semillas del mijo (Valueva, 2004).

En plantas transformadas genticamente con cistatinas exgenas, se ha visto que

este tipo de inhibidores brindan proteccin contra diferentes plagas y patgenos

debido a que estas enzimas suprimen la actividad metablica de cisten proteinasas.

En lo referente a la proteccin contra virus en plantas transgnicas de tomate, se

demostr que la expresin de oryzacistatina I y II, inhiben la replicacin de virus de la

familia picornavirus (Valueva, 2004). Por otro lado, en plantas de tabaco transgnicas

con el gen de la ocI, mostraron resistencia contra el virus del jaspeado del tabaco y el

virus Y de la papa; ambos virus pertenecientes a los potyvirus que utilizan cisten

proteinasas para el proceso de su genoma (Gutirrez-Campos et al.,1999; Valueva y

Mosolov, 2004). En la resistencia contra nematodos fitopatgenos Urwin et al .,

(1998, 2000) generaron plantas de papa con el gen de la oc-I, demostrando

resistencia a Globodera pallida y Meleoidogine incognita, asimismo Atkinson et al.

(2004) demostraron resistencia a Radopholus similis en pltano transgnico con un

el gen sinttico de la ocI (OcID86). En insectos, se analiz la actividad inhibitoria de

16

oc-I in vitro sobre la actividad biolgica de cisten proteinasas de coleopteros,

observado una completa inhibicin. Varias plantas transgnicas con genes de

inhibidores de proteasas se han generado y se ha demostrado la resistencia contra

diferentes plagas de insectos (Lawrence, 2002).

2.8 Estudio molecular del gen de la cch

Los estudios sobre la expresin de la cch en humanos son escasos sin embargo,

se han podido aislar cDNAs y verificar su expresin en diferentes tejidos humanos

como hgado, cerebro, pncreas, intestino, estmago, vesculas seminales y pulmn

(Fanos, 1999).Las evidencias ms notorias fueron detectadas en RNA mensajeros de

vesculas seminales, lo que pone de manifiesto que en la mayora de los fluidos

biolgicos y en el plasma seminal se presenta la mayor expresin de la cch

(Abrahamson, 1990). Sin embargo, los estudios ms sobresalientes de la cch han

sido en sistemas de expresin bacterianos donde se ha logrado obtener grandes

cantidades de esta protena exhibiendo las propiedades fisicoqumicas similares a las

nativas (Abrahamson, 1988).

Figura 4. Mecanismo propuesto para la inhibicin de cisten proteasas por medio de Cistatinas (Bode, 1990).

17

Otra caracterstica importante de esta protena se refiere a los efectos que tiene

en el auto procesamiento del virus del ciruelo, ya que este tipo de inhibidores

interviene en la protelisis de la poliprotena viral producida por el virus impidiendo su

procesamiento infectivo (Garca et al., 1993; Gutirrez-Campos et al., 1999). La

propuesta hecha por Irie et al. (1996) sobre la funcin de las cistatinas como

inhibidores del autoprocesamiento de los potivirus han sugerido que la cch puede

jugar un papel clave en el reconocimiento e inhibicin de proteasas exgenos a tales

enzimas digestivas en los intestinos de los insectos.

2.9 Cultivo de tejidos en papa

El cultivo de tejidos vegetales (CTV), es el conjunto de tcnicas que permite el

establecimiento, mantenimiento y desarrollo de cualquier parte de la planta, desde

una clula hasta un organismo completo, bajo condiciones artificiales y axnicas. As

mismo, es una herramienta de gran valor para la resolucin de problemas bsicos y

aplicados en la Biologa Molecular y Biotecnologa vegetal, ya que brinda la

oportunidad de disear modelos ideales para el estudio de la fisiologa, bioqumica,

gentica, clonacin, conservacin, manipulacin in vitro y en la obtencin de plantas

genticamente modificadas (Ross y ONeill, 2000).

El desarrollo de cualquier tejido vegetal es un proceso bastante complejo en el cual

intervienen una serie de factores tanto internos como externos. Entre los factores

internos que controlan el desarrollo de los diferentes tejidos vegetales destacan las

fitohormonas u hormonas vegetales o tambin conocidos como reguladores del

crecimiento vegetal (RCV).

Los RCV se clasifican en 5 grupos bsicos dependiendo de su estructura qumica

y su efecto fisiolgico y son: Las auxinas son compuestos derivados comnmente del

triptofano, y generalmente son sintetizados en los pices y estn implicados en varios

eventos relacionados con el crecimiento y desarrollo celular de la planta. participan en

la regulacin de algunos procesos como el crecimiento celular, la acidificacin de la

18

pared celular, el inicio de la divisin celular, la formacin de tejido calloso, la

diferenciacin del tejido vascular y la formacin de rganos. La auxina de origen

natural ms importante es el cido indolactico (AIA) y entre los sintticos se

encuentran el cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D), cido naftalen actico (ANA) y el

cido 4-amino-3, 5, 6-tricloropiridin-2-carboxlico (picloram) (Prez-Molphe, 1999).

Las Citocininas, Generalmente son derivados de la adenina y son sintetizados

en tejidos jvenes y races. Se le han atribuido dos propiedades fundamentales para

CTV: 1) estimulan la divisin celular y 2) rompen la latencia de las yemas axilares

hacindolas brotar. En las plantas completas, tiene la funcin de promover la

brotacin de yemas axilares, estimula la expansin de las hojas y retardan la

senescencia. Las citocininas naturales ms comunes son la zeatina, Isopentiladenina

(2iP) y el ribsido de zeatina, y entre las sintticas estn la benciladenina (BA), la

cinetina (CIN) y el N-fenil-N-1,2,3-tidiazolil-5-urea (TDZ Tidiazuron) (Martnez-

Garcia et al., 2002).

El cido giberlico, puede utilizarse en algunos casos para la elongacin de

estructuras como brotes, y la aceleracin de brotes en ciertos tipos de yemas y

meristemos. cido abscsico, es utilizado en algunos casos para inhibir la

germinacin de embriones maduros o para completar el proceso de los mismos.

Una de las vas posibles para aumentar la eficacia de los mtodos de

transformacin gentica mediante Agrobacterium tumefaciens es la optimizacin de la

capacidad de regeneracin in vitro de las plntulasespecies a trabajar. Aunque las

clulas vegetales son totipotenciales y poseen la capacidad de diferenciarse, algunos

tejidos son ms fciles de ser inducidos para formar nuevas plantas. Las condiciones

necesarias para la regeneracin eficiente varan entre clulas de la planta y tejidos

as como de la especie (Powell et al., 1990; Le, 1991; Ly et al., 1996; MHamdi et al.,

1998)

19

En lo referente a la plantaespecie de inters, ha sido posible la regeneracin de

plantas completas de diversos cultivares comerciales, a partir de diferentes explantes;

segmentos de tallo y hojas desarrolladas in vitro (Visser et al., 1989; Visser, 1991;

Hulm et al., 1992; Yadav y Sticklen, 1995; Gmez et al., 1997; Rodrguez et al.,

2000; Trujillo et al., 2001), anteras, (De Block, 1988) y plantas enteras partiendo de

discos de tubrculos (Marchetti et al., 2000). Esto con el fin de producir cultivos

transgnicos resistentes a diferentes tipos de plagas, produccin de vacunas orales

contra diferentes enfermedades y en aumentar la calidad nutricional de la papa (Van

der Meer, 1994; Wu et al., 1995; Beaujean et al., 1998; Veramendi et al., 1999;

Dilmer, 2000; Urwin et al., 2000; Zeh, 2001; Vsquez et al., 2001; Urwin, 2001;

Lauterslager et al., 2001).

A pesar de que a nivel mundial se han realizado numerosos trabajos en papa en

regeneracin y transformacin, se ha demostrado que existe una gran dependencia

del genotipo en la capacidad y eficiencia de regeneracin (Park et al. 1995). Sin

embargo, el factor ms importante para que la regeneracin sea posible es el balance

adecuado de reguladores del crecimiento, tales como auxinas y citocininas. Entre las

auxinas mejorms empleadas para la brotacin estn el cido indolactico (AIA) y la

bencilaminopurina (BAP) (Park, 1995) y el uso de citocininas como la zeatina pueden

mejor la eficiencia de la regeneracin (Yadav y Sticklen, 1995).

La mayora de los protocolos de regeneracin en papa, se basan en colocar los

explantes en diferentes medios de cultivo. pPrimeramente en uno diseado, para la

induccin de tejido calloso, y luego en otro para la induccin de brotes y por ltimo en

un medio de Eenraizamiento. Este proceso de regeneracin, lo que en esta especie

hace que sea ms laboriosa y consuma tiempos ms largos (Park, 1995; Hulme et al,

1992; Curry y Cassells, 1999). Sin embargo, tambin existen protocolos de

regeneracin en un solo paso, y el cual consisten en colocar explantes en el mismo

medio de cultivo hasta la obtencin de plntulas (Trujillo et, al. 2001; Rodrguez et al.

2001).

Con formato: Fuente: Cursiva

20

2.10 Microtuberizacin

La propagacin in vitro de papa mediante brotes axilares ha sido reportado por un

gran numero de investigadores y ha llegado ser un sistema efectivo para una rpida

multiplicacin de nuevos cultivos o existentes libres de enfermedades (Alisdair y

Willmitzer, 2001). Como alternativa del producto final de la micropropagacin de papa

son los pequeos tubrculos o microtubrculos. Los microtubrculos se usan

convenientemente para almacenar o transportar germoplasma y tambin pueden ser

adaptados para una produccin a gran escala (Hussey y Stacey, 1981; Estrada et al.,

1986; Ortiz y Lozoya 1987; Banfalvi et al., 1997; Eugichi, 2000).

El tubrculo de la papa no se forma en la raz como comn se piensa, si no que se

desarrolla en un tallo subterrneo llamado estoln. En condiciones que no son

favorables para la formacin del tubrculo como por ejemplo. dDas largos (LD; por

sus siglas en ingls), los estolones frecuentemente emergen fuera del suelo y

producen un nuevo brote, sin embargo en condiciones favorables como das cortos

(SD: por sus siglas en ingls), los estolones siguen creciendo hasta el hinchamiento

de la punta para formar el tubrculo. Este hinchamiento es debido a que el estoln

deja de crecer y las clulas de la punta y del cortex se alargan y se dividen

transversalmente. Ms tarde las clulas en la regin perimedular se extienden y se

dividen en orientaciones al azar para formar el tubrculo maduro (Fig. 5). (Vecchio et

al., 1994; Alisdair y Willmitzer, 2001).

Con formato: Fuente: Cursiva

21

Figura 5. Proceso de tuberizacin en papa. La figura muestra las diferentes etapas de formacin del tubrculo de papa en la punta de los estolones (Viola et al. 2001).

Los procesos de desarrollo del tubrculo, son difciles de estudiar en campo o en

plantas crecidas en tierra, debido al bajo nivel de sincrona de los procesos de

tuberizacin en esas condiciones. Para evitar estos problemas, se han desarrollado

mtodos in vitro, que conducen a una sincronizacin de la tuberizacin, as como a

una alta frecuencia de produccin (Villafranca et al., 1998; Alisdair y Willmitzer, 2001;

Coleman et al.; 2001).

2.11 Factores que inducen la microtuberizacin

La induccin de la microtuberizacin es debido tanto a factores ambientales como

endgenos, haciendo que esta sea favorecida por: foto perodos principalmente de

das cortos (SD), principalmente; temperatura relativamente bajas (20-24 C), alta

concentracin de sacarosa (8-10%) al medio de cultivo, intensidad de luz alta, baja

cantidad de nitrgeno y la adicin de reguladores del crecimiento como citocininas

(Hussey y stacey, 1984; Suttle, 1998; Jackson, 1999; Alisdair y Willmitzer, 2001;

Martnez-Garca et al., 2002).

a) Efecto de la sacarosa sobre la tuberizacin.

Xu et al. (1998), mencionan que la microtuberizacin es altamente dependiente de

la concentracin de sacarosa, y que a su vez este carbohidrato es un inductor de

22

varios genes en el tubrculo, tales como Llos de la patatina (protena de reserva),

inhibidor de proteinasas II (regulador de proteasas) y ADP-Glc pirofosforilasa. Sobre

la concentracin de sacarosa, los mismos autores reportan, que existen altos niveles

de GA en la punta de los estolones (puesto que GA, es un inhibidor de la

microtuberizacin) cuando se agrega al medio una concentracin del 1% de sacarosa

y disminuyen cuando se incrementa la cantidad de sacarosa en un 8%, sugiriendo

que la sacarosa puede modular los niveles de GA en los estolones y desarrollar

mayor cantidad de estos para la induccin de los tubrculos. La prueba principal de

estos datos se basa en la produccin de plantas transgnicas de papa con el gen en

antisentido de la ADP-Glc pirofosforilasa, donde se observ que los tubrculos tienen

una baja actividad de esta enzima y por lo tanto niveles bajos de almidn, as mismo,

se observ que el nico cambio fue un incremento en el nmero de tubrculos

producidos y un decremento de tamao (Muller-Rober et al., 1992; Xu et al., 1998).

Aunque algunos investigadores han propuesto que no es necesario la adicin de

sacarosa al medio para la microtuberizacin ya que, esta se puede dar bajo otras

condiciones externas como temperatura y fotoperiodos de das cortos (Garner y

Blake, 1989). Sin embargo, existe un mayor nmero de investigadores que aseguran

que las altas concentraciones de sacarosa promueve la microtuberizacin y que

posiblemente esta se d sin sacarosa dependiendo del genotipo que se estudie

(Jackson, 1999).

b) Efectos del fotoperiodo sobre la tuberizacin

Algunas especies de papa tales como: S. dDemissum, y S. Ttuberosum son

plantas de das corto que requieren de 12 horas luz o menos para el proceso de la

microtuberizacin. El fotoperiodo tiene un efecto importante sobre los niveles de GA

en muchas especies de papa, puesto que existe un incremento de GA en plantas

puestas sobre LD que en SD. Por ejemplo, se ha visto que los niveles en la actividad

de GA decrecen en hojas de plantas de S. tuberosum ssp. Andigena, cuando son

transferidas de LD a SD (Dobranzki y Mandi, 1993; Seabrook et al., 1993; Jackson;

1999; Dobranzki, 2001).

23

En otros estudios se ha comprobado el efecto que tiene el fotoperiodo sobre la

ruta metablica del GA; en espinaca y chcharo, donde existe baja actividad de las

enzimas GA 20-oxidasa y de la GA12-aldehdo involucradas en la sntesis de GA y

por ende menos actividad de GA. Asimismo, estos estudios sobre los efectos del

fotoperiodo ha sido bien documentado por varios investigadores sobre una amplia

gama de variedades de papa obteniendo mayor cantidad de microtubrculos (Gopal

et al., 1998).

c) Efectos de la temperatura.

Las altas temperaturas (28 C o ms) son inhibitorias para la microtuberizacin ya

sea en SD o LD, aunque los efectos inhibitorios se han visto ms en SD.

Las altas temperaturas afectan la particin de los asimilados de carbono,

decreciendo la cantidad de estos hacia los microtubrculos e incrementando la

cantidad a otra parte de la planta. Este efecto se estableci mediante la variacin de

temperatura en diferentes partes de la planta (30 C 35 C alta y 17-26 C bajas)

donde se observ que las altas temperaturas dan origen a plntulas con brotes

laterales y e inhibiendo parcialmente la microtuberizacin, bloqueando el desarrollo

de los estolones (Jackson, 1999).

2.12 Transformacin gentica de plantas de papa mediada por Agrobacterium tumefaciens

La transformacin gentica de diferentes variedades de papa mediada por A.

tumefaciens, ha sido mundialmente utilizada para la introduccin de genes forneos

(De Block 1988; Visser et al. 1989; Dymocket al., 1991; Mitten et al. 1990; Escudero

et al., 1995; Pfitzner, 1998; Chong y Langridge, 2000). Sin embargo, muchos de

estos mtodos son poco eficientes, debido principalmente a una baja produccin de

brotes en el medio utilizado para la regeneracin. A pesar de esto, se ha tenido xito

en la transformacin de diferentes variedades de papa para producir cultivos:

resistentes a varios tipos de plagas; con vacunas orales contra diferentes

enfermedades; y con mayor calidad nutricional (Van der Meer, 1994; Wu et al., 1995;

Urwin et al., 1995; Constabel, 1999; Veramendi et al., 1999; Kumar et al., 1995;

24

Bendalman et al., 2000; Dilmer, 2000; Urwin et al., 2000; Urwin et al., 2001; et al.,

2001; Vsquez, 2001; Lauterslager et al., 2001).

En algunos casos ha sido necesario optimizar mtodos de transformacin para

variedades especficas de papa. Como Beaujean et al., (1998) quienes trabajaron

con Bintje, Desire y Kaptah Vande; y de Trujillo et al., (2001) trabajando con Diacol

Capiro (DC) y Parda Pastusa (PP). Sin embargo, Y een la mayora de los casos se

han utilizado sistemas de regeneracin ya establecidos para la misma o diferente

variedad, con el fin de verificar la expresin y funcionalidad del gen de inters. Por

ejemplo en la transformacin de la variedad Desire mediada por A. tumefaciens,

Lecardonnel et al., (1999) utilizaron los genes marcadores nptII y uidA y observaron

que la expresin en las hojas provoca rechazo alimenticio a larvas de Leptinotarsa

decemlineata S (escarabajo dorado de la papa); Zeh et al., (2001), expresaron el gen

en antisentido de la treonina sintasa con el fin de verificar el punto de divergencia

entre la sntesis de los aminocidos treonina y metionina, como consecuencia de

esto se obtuvo una alta acumulacin de metionina en las plantas transgnicas, lo que

hizo que estas tuvieran un gran valor nutricional; y Narvez y Ryan (2002) trabajando

con la misma variedad, pero con el gen precursor de la sistemina, transformaron

segmentos de tallo y secciones de microtubrculos donde se generaron plantas con

caractersticas resistentes a heridas y patgenos. En variedades Europeas como la

116/86, se utilizaron diferentes medios de regeneracin, tal es el caso de

Moravckova et al., (2004) quienes transformaron con los genes fusionados de la

quitinasa III y de la glucanasa I, donde las plantas transformadas mostraron

inhibicin del crecimiento del hongo Rhizoctonia solan, al estar en contacto con

estas; Chakraborty et al., (2000) trabajaron con la misma lnea pero con el gen AmA1

de Amaranthus hypochondriacus, que codifica para una protena rica en aminocidos

esenciales donde se logr obtener tubrculos con un alto valor nutricional para los

humanos. En algunas otras se obtuvieron plantas con caractersticas resistentes a

nematodos utilizando el gen de oryzacistatina I (Urwin et el., 1998; Cowgill et al.,

2002; Urwin et al., 2000; Urwin et al., 2003; Hussey et al., 2002; Williamson y

Hussey, 1996).

Comentario [EPMB1]: Estos son genes marcadores, no pueden conferir resistencia por si mismos

Comentario [EPMB2]: Sistemina?

25

III MATERIALES Y METODOS

3.1 Materiales

Material vegetal de tubrculo de papa variedad alfa, donado por el Ing. Roberto

Garcidueas del Comit Estatal de Sanidad Vegetal del Estado de Guanajuato

(CESAVEG).

Cepas bacterianas

Agrobacterium tumefaciens para la transformacin de las cepas EHA 105,

PGV 2260 y AGL1226.

Escherichia coli: cepa DH5, para la transformacin bacteriana en el diseo de las

construcciones utilizadas.

3.2 Mtodos 3.2.1 Construccin del plsmido pCAMBIA:cch

El gen de la cistatina C humana , se encontraba inicialmente clonado en el vector

pUC18 en los sitios de restriccin Eco RI. Con el fin de generar nuevos sitios de

restriccin en el gen de la cch y clonarlo en el vector de expresin de plantas

pCAMBIA 2301, primeramente se liber el gen de la cch del vector pUC18 mediante

restriccin con la enzima Eco RI, siguiendo el protocolo descrito por Sambrook et. al.,

(1989) este fragmento posteriormente se subclon en el vector pBSK- y luego en el

vector pKYLX80 (Fig. 6).

Como se puede apreciar en la Figura 7, el vector pCAMBIA carece del promotor

que dirija la expresin del transgen de la cch y as como de la secuencia de

terminacin. Para que el gen de la cch tuviera el promotor y el terminador, se fusion

el promotor del virus del mosaico de la coliflor potenciado (35S2 ) y el terminador de la

ribulosa bifosfato carboxilasa (rbcS 3), en el sitio de clonacin mltiple del vector

Comentario [EPMB3]: dnde se obtuvo?

26

pCAMBIA, ambos fragmentos fueron cortados mediante restriccin del vector

pKYLX80. El promotor se liber con las enzimas Eco RI y Bam HI y el terminador de

la rbcS 3, con Bam HI y Cla I (Fig. 7B).

La construccin pCAMBIA:cch, fue incorporada mediante transformacin gentica

bacteriana en la cepa curada DH5 de E. coli por choque trmico y la verificacin de

la transformacin se realiz mediante el aislamiento de DNA plasmdico de las

colonias como presuntas positivas; as como por anlisis de restriccin.

Figura 6. Mapa del vector pKYLX80 y fragmento linearizado del promotor, sitio mltiple de clonacin y el terminador. Organizacin del vector de expresin en plantas, que se utiliz para liberar el promotor potenciado del virus del mosaico de la coliflor (35S2) y el terminador de la ribulosa bifosfato carboxilasa (rbcS3). B) fragmento linearizado del vector pKYLX80 donde se muestra el sitio de restriccin Eco RI del promotor, sitio mltiple de clonacin, y el de rbcS3.

Promotor35S2

rbcS3Km

Hind III-BamHI-XhoI-PstI-SacI-XbaI

Eco RI

Eco RI BamHI ClaI

A B

27

Figura 7. Mapa del vector pCAMBIA:2301 y linearizacin del cassette de expresin. Organizacin del vector binario de expresin en plantas pCAMBIA:2301. El vector presenta el cassette de expresin limitado por los bordes izquierdo y derecho (t-border: left and right), donde esta presente el gen de seleccin a kamanicina, el gen reportero gus y el sitio mltiple de clonacin. B) linearizacin del cassette de expresin donde se muestra los sitios de restriccin Eco RI-Bam HI dentro del sitio mltiple de clonacin, este sitio fue utilizado para insertar el gen de la cch con su promotor y secuencia de terminacin.

A

Borde izq.

35sPoly A

Gen de seleccin de plantas

35S Lac Z 35S Gus Nos Poly A

Borde Der.

Sitio multiple de clonacin

EcoRI-BamHI

B

28

3.2.2 Aislamiento de DNA plasmdico mediante mini

preparaciones (minipreps) por el mtodo de Birboin

Se inocul una colonia aislada de las posibles transformantes en 3 ml de medio

LB (Sambrook y Maniatis, 1989) lquido con el antibitico carbenicilna (Cb), y se

incub a 37 C con agitacin constante durante toda la noche. Al da siguiente se

tom 1.5 ml de cultivo y se transfiri a un tubo para microcentrgufa y se centrfug a

12000g por 2 min. El sobrenadante se desech y la pastilla se resuspendi en 100

L de solucin I (glucosa 50 mM, Tris-HCl 25 mM, EDTA 10 mM) y se dej a

temperatura ambiente durante 5 min. Transcurrido este tiempo se agregaron 200 L

de la solucin II (NaOH 0.2N, SDS 1%) y se mezcl por inversin por 5 min.

Enseguida, se adicionaron 150 L solucin III (acetato de potasio 5M, cido glacial

actico 1N) y se dej precipitar en hielo por 5 min. Las muestras se centrifugaron a

12000g a 4 C durante 5 min. El sobrenadante se transfiri a un tubo nuevo y se le

agreg 2 L de RNAasa y se dej incubar a 37C por 30 min. Pasado ese tiempo, se

realizaron extracciones con fenol-cloroformo 1:1 (V:V), y cloroformo-alcoholisoamlico

24:1 (V:V). En ambos casos, se recuper la fase acuosa y los cidos nucleicos se

precipitaron con 2.5 volmenes de etanol absoluto fro, mezclando vigorosamente por

inversin e incubando despus a -70C por 30 min. La pastilla con el DNA se

recuper centrifugando a 12000g a 4C por 5 min. y se lav con etanol fro al 70%,

secando luego bajo vaco.

La integridad de la molcula de DNA plasmdico, se analiz mediante

electroforesis en gel de agarosa al 1% en buffer de corrida de TPE (Sambrook y

Maniatis,1989) 1X, el gel fue teido con bromuro de etidio y visualizado bajo luz

ultravioleta.

29

3.2.3 Micropropagacin de plntulas axnicas de papa

mediante cultivo de tejidos vegetales

Tubrculos de papa de la variedad alfa fueron lavados suavemente con abundante

agua y Extran al 5% y posteriormente fueron secados y puestos sobre una capa de

algodn hmedo e incubados a temperatura ambiente y en oscuridad durante 4-5

semanas. Los brotes generados despus de ese tiempo, fueron lavados con Extran

al 5% por 5 min, y desinfectados dos veces con una mezcla de blanqueador

comercial (cloralex) al 1% y etanol 10% durante 10 min, finalmente se enjuagaron

dos veces con agua destilada estril.

Los brotes se cortaron en segmentos de aproximadamente 1 cm de longitud y

fueron colocados horizontalmente en medio basal MS propuesto por Murashige y

Skoog (1962) al 50% con sacarosa al 3% y 8 gL-1 de agar e incubados bajo

condiciones de luz continua a 25 C.

Las plntulas obtenidas mediante micropropagacin fueron cortadas por

segmentos nodales y propagados en el mismo medio y bajo las mismas condiciones

experimentales antes mencionadas. El material vegetal obtenido mediante este

proceso se utiliz como fuente de explantes para los experimentos de regeneracin

de papa por organognesis y microtuberizacin.

3.2.4 Regeneracin de papa por organognesis

Se utilizaron explantes de hoja y tallos de plntulas de 4 semanas crecidas in

vitro. Los explantes de hoja fueron cortados de su base y se colocaron con el haz en

contacto con el medio, mientras que los tallos fueron de regiones interndales de

aproximadamente 0.5 cm de longitud y colocados horizontalmente en el medio.

30

Como medio basal se utiliz el MS al 50% suplementado con casena hidrolizada

0.05%, cido ascrbico 40 mgL-1 y sacarosa 3%.

Los explantes se sometieron a cinco tratamientos diferentes con reguladores del

crecimiento como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1. Tratamientos analizados para la regeneracin de papa.

Se usaron 40 explantes de tallos y 40 de hoja por tratamiento y el experimento

completo se realiz cuatro veces de forma independiente. Los explantes fueron

incubados en la oscuridad durante 4-5 semanas hasta la aparicin de tejido calloso y

posteriormente bajo lmparas de luz fluorescente (54 mol/m2s) en ciclos de 8/16 h

luz/oscuridad a 25 C durante 4-5 semanas, para la induccin de brotes. El nmero

de brotes por explante se cuantific a los 60 das de iniciado el experimento.

3.2.5 Microtuberizacin

Se cortaron segmentos nodales de plntulas axnicas in vitro y se colocaron en

forma vertical en el medio de cultivo. Como medio basal se utiliz el MS al 50%,

probndose ocho diferentes condiciones diseadas para favorecer la

TRATAMIENTO (medio MS)

Concentracin de reguladores del Crecimiento en mg/l.

GA3 AIA TDZ BA 2IP Zeatina

MSR1 1 1 0 0.5 0 0

MSR2 1 1 0.1 0 0 0

MSR3 1 1 0.05 0.1 0 0

MSR4 1 1 0 0 3 0

MSR5 1 1 0 0 0 3

31

microtuberizacin (Tabla 2). Se utilizaron 10 explantes por cada tratamiento y el

nmero de microtubrculos se registr a los 28 das de iniciado el experimento.

Tabla 2. Tratamientos analizados para la microtuberizacin.

Donde sac; sacarosa, osc; oscuridad.

3.2.6 Registro y anlisis de datos

La toma de datos se realiz de acuerdo a lo especificado para cada medio en la

regeneracin de plantas, donde se tomaron los datos para la respuesta de induccin

de brotes .Se determin si existi diferencia significativa entre los 5 tratamientos

empleados con los explantes de tallo y hoja para cada uno. Para ello se emple la

prueba para el anlisis de varianza (anova) no paramtrico, para un diseo

completamente al azar, propuesta por Kruskal-Wallis, asimismo se realiz la prueba

de las medias de los rangos mltiples estandarizados de Tukey-Kramer con la

tratamiento Condiciones del medio Condiciones de incubacin

MST1

Slido con 3% sac.

16 hr Luz /8 h osc.

MST2 Slido con 8% sac.

8 h Luz/16 h osc.

MST3 Slido con 8% sac. Preincubacin por 14 das en osc. 8 h Luz /16 h osc.

MST4 Slido con 3% Sac. Preincubacin por 14 das en osc. 8 h Luz /16 h osc.

MST5 Lquido con 8% sac.

Luz continua.

MST6 Liquido con 3% sac.

Luz continua.

MST7 Slido, 3% sac. y 2.5 mg.L-1 cinetina.

8 h Luz /16 h osc.

MST 8 Slido, 8% sac.y 2,5 mg.L-1 cinetina.

Preincubacin por 14 das en osc. 8 h Luz /16 h osc.

32

finalidad de seleccionar el mejor tratamiento. El software estadstico utilizado para

esta prueba fue el INSTAT 2.

3.2.7 Germinacin de los microtubrculos y aclimatacin de

las plantas generadas

Los microtubrculos obtenidos fueron sometidos a dos tratamientos con el fin de

inducir su germinacin in vitro. En ambos tratamientos se utiliz como medio basal

MS 50%. El primer tratamiento fue libre de hormonas mientras que para el segundo

fue adicionado con 2,5 mgL-1 de cinetina. Ambos se incubaron bajo luz continua

durante 2 semanas. Adicionalmente, se intent la germinacin ex vitro, para lo cual se

colocaron los microtubrculos sobre una capa de algodn hmedo hasta su

germinacin. Los microtubrculos con brotes adventicios y races fueron transferidos

a suelo y aclimatados en el laboratorio y posteriormente bajo condiciones de

invernadero.

3.2.8 Transformacin gentica de plantas de papa mediada por

Agrobacterium tumefaciens

Con el fin de establecer las condiciones de transformacin gentica de papa de la

variedad alfa utilizando la cepa EHA 105 de Agrobacterium tumefaciens, se

analizaron varios protocolos de transformacin para diferentes variedades de papa

como se muestra en la tabla 2. A esta primera fase de anlisis donde se utiliz la

cepa EHA 105, se le denomin como primera transformacin y la segunda

transformacin fue aquella donde se trabaj con las cepas PGV 2260, AGL 1226 y

EHA 105, donde se utiliz como medio de regeneracin MS3, tal como se muestra en

la Tabla 3.

33

El protocolo en general para la transformacin fue el siguiente: Colonias aisladas

de Agrobacterium fueron incubadas en medio YEB a 28 C por 24 hrs. con agitacin

continua. La obtencin de la concentracin de la bacteria se hizo mediante

espectrofotometra a una absorbancia de 650 nm, y se diluy en medio fresco YEB a

una concentracin de 1x108 bacterias por ml. Como explantes se utilizaron regiones

interndales de tallo y hojas de 4 semanas de crecida in vitro. Antes de la infeccin,

los explantes, fueron incubados en medio MS para la primera transformacin y para la

segunda en MS3 durante 24 hrs. Pasado este tiempo, los explantes fueron incubados

en 20 ml de medio MS lquido el cual contena la bacteria y se incubaron en oscuridad

a 28C y en agitacin constante. Despus de la infeccin, los explantes fueron

secados en papel filtro y colocados en medio de cocultivo MS3 durante 48 hr.

Despus del cocultivo, los explantes fueron lavados en medio MS lquido adicionado

con 10 ml L-1 de antibitico PPM. Los explantes fueron lavados varias veces hasta

quitar el exceso de bacteria y fueron secados sobre papal filtro estril e incubados en

medio de seleccin hasta la obtencin de brotes.

Para la primera transformacin los medios de regeneracin y de seleccin fueron

los siguientes:

MS(A): ANA 200 mg L-1, GA320 mg L-1, 2-ip 2 mg L-1, Cb 250 mg L-1y Km 50 mg L-1.

MS (B): zeatina 0.8 mg L-1, 2,4-D 500 mg L-1, Claforam 500 mg L-1y Km 50.

MS(C): ANA 0.2 mg L-1, zeatina 2 mg L-1, PPM 20 mg L-1 y Km 50 mg L-1.

MS (D): zeatina 3 mg L-1, GA3 mg L-1, AIA 1 mg L-1, Km 150 mg L-1 y Cb 500 mg L-1.

MS1 (E): GA3 mg L-1l, BA 0.5 mg L-1, AIA 1 mg L-1. PPM 10-20 ml/l, Km 50-150 mg L-1.

MS3 (F): GA3 1 mg L-1l, AIA 1 mg L-1, TDZ 0.05 mg L-1, BA 0.1 mg L-1, PPM 10-20 ml/l, Km

50-150 mg/l. MS (G): PPM 20 ml/l y Km 50 mg/l.

Nota: el medio de seleccin en todos los casos fue el mismo que el de regeneracin

slo que con la adicin de antibitico.

34

Tabla 3. Primera transformacin gentica de plantas de papa.

Tabla 4. Segunda Transformacin gentica de plantas de papa.

P r im e ra t ra n s fo rm a c i n

C e p a d e A g ro b a c te r iu m

T ip o d e

e x p la n te y c a n tid a d

P re

t ra ta m ie n to

D il d e b a c te r ia y

t ie m p o d e in c u b a c i n (m in )

M e d io

R e fe re n c ia

T a llo 4 0 H o ja 4 0

N O

1 5 m in .

M S (A ) T a k a h a T . e t a l., (1 9 9 8 )

T a llo 4 0

(s e c c io n a d o s lo n g itu d in a l)

H o ja 4 0

M S

2 4 h rs .

1 :1 0

3 0 m in .

M S (B )

B e a u je a n e t a l., (1 9 9 8 )

T a llo 4 0 H o ja 4 0

M S 2 4 h rs .

1 :1 0 -1 :5 0 1 5 -3 0 m in .

M S (C ) M h a m d i M . e t a l., (1 9 9 8 )

T a llo 4 0 H o ja 4 0

M S 2 4 h rs .

1 :1 0 , 1 :5 0 , 1 :1 0 0

1 0 -3 0 m in .

M S (D ) T ru jil lo C . e t a l., (2 0 0 1 )

T a llo 4 0 H o ja 4 0

M S 2 4 h rs .

1 :5 0 , 1 :1 0 0 1 0 -3 0 m in

M S 1 (E )

T a llo 4 0 H o ja 4 0

M S 2 4 h rs .

1 :1 0 1 0 m in .

M S 3 (F )

F ra n c is c o M o ra le s P ro p u e s to p a ra e s ta te s is .

E H A R 1 0 5

S e c c io n e s d e m ic ro tu b rc u lo s

1 :1 0 0 1 0 m in .

M S (G )

S egun da transform ac in C epa de A. tum efac iens

D il. B act.

N o . D e ta llo s

N o . ho ja

Lavados con A n tib i tico

M ed io de S e lecc in M S 3

E H A 105: pC A M B IA :C C H

90 80 P P M 10m l/L 24 h rs.

P P M 10 m l/L K m 25 m g/L

E H A 105: C A M B IA :C C H

90 80 P P M 10m l/L 4 h rs .

P P M 10 m l/L K m 25 m g/L

A g l:C A M B IA :C C H

90 70 P P M 10m l/L 4 h rs .

P P M 10 m l/L K m 25 m g/L

pG V:C A M B IA :C C H

90 80 P P M 10m l/L 4 h rs .

P P M 10 m l/L K m 25 m g/L

35

3.2.9 Anlisis histoqumico del gen uidA

Los explantes y plntulas que crecieron en medio de seleccin, se analizaron para

comprobar transformacin mediante la tincin histoqumica del gen reportero uidA

que codifica para la -glucuronidasa (GUS).

El protocolo que se utiliz fue el propuesto por Jefferson (1987). Para monitorear

la expresin de GUS en los explantes, sSe tomaron 3 de tallo y 3 de hoja al azar a los

7, 15 y 21 das despus de la transformacin y para las plntulas hasta la aparicin

de brotes axilares. Los explantes se colocaron en un tubo para microcentrfuga de 1.5

ml y se cubrieron completamente con el reactivo para la deteccin histoqumica dede

GUS. Posteriormente se incubaron a 37 C en oscuridad durante 24 hr, enseguida se

elimin la clorofila de los explantes mediante lavados consecutivos con etanol al 70%,

hasta que los explantes quedaran transparentes y se pudiera observar la tincin azul.

3.2.10 Anlisis molecular de las plantas transformadas mediante

la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

Para analizar molecularmente las plantas como presuntas transformantes, fue

necesario extraer el DNA genmico y posteriormente la amplificacin enzimtica in

vitro de los transgenes de la cch, gus y nptII y as como descartar la presencia de

Aagrobacterium con la amplificacin de los genes vir, por medio de la reaccin en

cadena de la polimerasa (PCR) (Vollenhofer et al., 1999).

El protocolo para la extraccin de DNA fue el de CTAB (Porebsky, 1997), con

algunas modificaciones hechas en el laboratorio para tejidos de papa. Se pesaron 30

mg de tejido vegetal y se congelaron con nitrgeno lquido y se pulverizo con la ayuda

del mortero. El tejido pulverizado, se pas un tubo para micro centrfuga de 1.5 ml y

se homogeniz con 3 volmenes de buffer de extraccin (apndice), se mezcl por

36

inversin durante 5 min., y se dej Incubar a 60 C durante 20 min con agitacin

constante. Las muestras se centrifugaron a 12 rpm durante 5 min y el sobrenadante

se paso a un nuevo tubo. Enseguida se hicieron extracciones con un volumen (1:1)

de fenol:cloroformo-alcoholisoamilico y una ms con cloroformo: alcoholisoamlico

(24:1). El sobrenadante de las extracciones se paso a un nuevo tubo y los cidos

nucleicos se precipitaron con un volumen de isopropanol e incubando a 20 C por 20

min. La pastilla de DNA se recuper centrifugando a 12 rpm por 5 min y se lav dos

veces con 200 l de etanol 70% para quitar el exceso de sal. Al final la pastilla se

resuspendi en 50 l de agua desionizada estril.

La integracin de la molcula de DNA se visualiz mediante electrofresis en gel

de agarosa al 1% teido con bromuro de etidio y bajo luz ultravioleta.

La amplificacin de los genes de cch, nptII, gus y vir, se realiz acorde al protocolo

del kit comercial PCR Super Mix de Gibbco. La concentracin del templete de DNA

fue de 0.2 g y de oligos de 0.1 g. La mezcla de reaccin, se llevo a cabo en un tubo

para PCR de 0.5 ml durante 30 ciclos con las condiciones siguientes:

desnaturalizacin 94 C por 1 min., alineamiento, 55 C, 1 min y reaccin de la

polimerasa a 72 C por 1.30 min., la amplificacin de las muestras se llev a cabo en

el termociclador de Perkin Elmer 480.

37

IV RESULTADOS

4.1 Construccin y anlisis molecular del vector pCAMBIA:cch

El gen clona de la cch, estaba inicialmente clonado en el vector pUC18. El gen

fue liberado del vector mediante anlisis de restriccin con la enzima Eco RI. La

muestra de la digestin fue corrida por electroforesis, donde se observ claramente

el fragmento liberado de un peso de 772 pb (Fig. 8). Con el fin de tener un sitio de

restriccin que permitiera la insercin del gen de la cch en el vector de expresin de

plantas el pCAMBIA, se utiliz como generador de nuevos sitios de restriccin el

plsmido pBSK-, que fue digerido con la enzima Eco RI (Fig. 9). Posteriormente,

tanto el gen de la cch como el vector pBSK-:fueron corridos por electroforesis y

purificados del gel de agarosa, siguiendo el protocolo de un kit comercial (Gibco), y

se procedi con la ligacin de ambos. La orientacin de la construccin pBSK-:cch,

se verific mediante anlisis de restriccin con las enzimas Xho y Sac I; sitios que

fueron adicionados al gen de la cch y donde se muestra un aumento de 91pb

quedando a 863 pb. (Fig. 10). Una vez obtenido esta construccin se volvi a liberar

el fragmento y se clon en los vectores pKYLX80 y pCAMBIA. Con la construccin

pCAMBIA:cch (Fig. 11), se procedi a realizar la transformacin de Agrobacterium

tumefacienes cepa EHA105 mediante la tcnica de cruza triparental y la verificacin

fue mediante la tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).

Comentario [SIP4]: En pgina aparte

38

1 2 3 4 5 6

Figura 8. Anlisis de restriccin de pUC18:cch con Eco RI y linearizacin del vector pBSK-. En los carriles1, 2 y 4 se observa el corte enzimtico de la construccin puc18:CCH, donde el 2.69 kb corresponde al vector y el fragmento de 772 a la CCH. Carril 3 MPM 1Kb. Carriles 5 y 6,corresponden al vector pBSK- linearizado con la enzima Eco RI. El gel fue teido con bromuro de etidio y visualizado bajo luz ultravioleta.

Figura 9. Anlisis de restriccin de pBSK-:cch. Carriles 1 y 2, muestras de DNA plasmdico digerido donde se observa el plsmido de 2.96 kpb., y el fragmento de cch de 863 pb. Carril 3, DNA plasmdico falso positivo, y carril 4, MPM 1 kb.

pBSSK- 2.96 Kb.

pUC18 2.69 Kb.

gen cch

Aprox. 772 pb.

gen cch

Aprox. 863 pb.

Comentario [EPMB5]: Marcadores?

39

1 2 3 4 5

Figura 10. Anlisis de restriccin de pCAMBIA:cch con Xho y Sac. Carriles 1 al 4 muestras de la digestin, donde se observa una banda de alto peso molecular que corresponde al vector y otra de aproximadamente 863 perteneciente al peso molecular de la cch.

Figura 11. Mapa de la construccin pCAMBIA:cch. El gen de la cch fue insertado dentro del sitio mltiple de clonacin del vector dirigido por el promotor potenciado del virus del mosaico de la coliflor (35S2) y la secuencia de terminacin de la ribulosa 5 fosfato (rbcs3). El gen de seleccin nptII, se encuentra cerca del borde izquierdo bajo el promotor 35S y el gen uidA cerca del borde derecho con el promotor 35S.

Borde izq. CaMV35

Poly A

Gen de seleccin de plantas

35S Lac Z

35S Gus Nos Poly A

Borde Der.

35S 2 pKYLX80

rbcs 3 pKYLX80

cch

Cch, 863 pb

40

4.2 Produccin de brotes a partir de tubrculos de la papa

Se trabaj con tubrculos de papa esterilizadosdesinfectados, que fueron

incubados para la germinacin de brotes. Despus de tres semanas de incubacin los

tubrculos produjeron brotes de 3 cm de longitud. Estos brotes se cortaron en

segmentos de 1 cm de longitud con una yema axilar y de nueva cuenta fueron

desinfectados y colocados verticalmente en medio de propagacin (Fig. 12A), donde

crecieron sanamente hasta la formacin de plntulas completas y posteriormente

fueron utilizados para propagacin y regeneracin (Fig. 12B).

4.3 Propagacin de plntulas

Los brotes del tubrculo de la papa a las 4 semanas de ser incubados en medio

de propagacin, produjeron plntulas de 10 cm de longitud con apariencia sana,

vigorosas y races. Durante la primera semana de incubacin, se observ que todos

los segmentos nodales formaron plntulas entre 4-5 cm de longitud, a la segunda

semana tenan abundantes races y en la cuarta semana ya se tena plntulas de

aproximadamente 10-12 cm de longitud (Fig. 12B).

Figura 12. Micropropagacin in vitro de plntulas de papa. A) Segmentos nodales colocados en medio para propagacin provenientes de brotes del tubrculo. B) propagacin de plntulas a las 4 semanas de ser incubadas. Las condiciones de propagacin son: 25C, bajo luz contina.

A B

Comentario [SIP6]: Estos ya no fueron desinfectados, solo el tubrculo?

Comentario [SIP7]: Homogeneizar justificacin

41

4.4 Regeneracin

Para verificar que el sistema de regeneracin fuera eficiente se propuso un tiempo

mximo de 5 semanas para la induccin de tejido calloso y de 6 semanas para la

brotacin a partir de tejido calloso. La aparicin de tejido calloso en los extremos de

los tallos y en los bordes de las hojas se observ a las dos semanas de iniciado el

experimento (Fig. 13A y B), a partir de la quinta semana la formacin de tejido calloso

fue en todo el explante (Fig. 13C y D). La formacin de tejido calloso ocurri

principalmente en los tratamientos con TDZ 0.05 mgL-1 y con 0.1 BA mgL-1 (MS3),

BA 0.5 mgL-1 (MS1) y 2iP 3 mgL-1 (MS4). Con respecto a los medios tratados con

TDZ 0.1 mgL-1 y zeatina 3 mgL-1, no se observ induccin de tejido calloso y mucho

menos la aparicin de brotes.

Tabla 5. Efecto de varias combinaciones de los reguladores de crecimiento en la regeneracin de papa.

bencil adenina (BA), thidiazuron (TDZ), cido indolactico (AIA), cido

giberlico (GA3), Isopentiladenina (2ip) y zeatina. En la formacin de tejido calloso y la proliferacin de brotes adventicios en papa variedad alfa. Z los valores se refieren al porcentaje de explantes que producen tejido calloso. Y significa el nmero de brotes por explante. X anlisis de comparacin mltiple Tukey Kramer (P0.01)

Tratamiento Tipo de explante

Explante con Callo (%)z

Brotes por explantey

MSR1 Hoja 67.5 6.1 0.1b Tallo 71.3 6.5 0.1b

MSR2 Hoja 6.3 0.5 0.1c

Tallo 7.5 0.8 .02c

MSR3 Hoja 81.3 10 0.2

Tallo 91.3 10 0.2a

MSR4 Hoja 92.5 0

Tallo 95.0 0 MSR5 Hoja 0 0