UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR · iii Agradecimientos ... parte del tribunal calificador que se...
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR Facultad de Ciencias Químicas Carrera de Bioquímica Clínica “Epidemiología molecular en Acinetobacter baumannii-complex resistente a carbapenémicos utilizando amplificación por reacción en cadena de la polimerasa de elementos palindrómicos extragénicos repetitivos de aislamientos en una casa de salud de la ciudad de Quito” TRABAJO DE INVESTIGACION PARA OPTAR POR EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIOQUÍMICO CLÍNICO AUTOR: JOHN H. SUCUY [email protected] TUTOR: M.Sc. JORGE REYES [email protected] Quito, Febrero 2017
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
Facultad de Ciencias Químicas
Carrera de Bioquímica Clínica
“Epidemiología molecular en Acinetobacter baumannii-complex resistente a
carbapenémicos utilizando amplificación por reacción en cadena de la polimerasa de
elementos palindrómicos extragénicos repetitivos de aislamientos en una casa de salud
de la ciudad de Quito”
TRABAJO DE INVESTIGACION PARA OPTAR POR EL TÍTULO
PROFESIONAL DE BIOQUÍMICO CLÍNICO
AUTOR: JOHN H. SUCUY
TUTOR: M.Sc. JORGE REYES
Quito, Febrero 2017
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Dedicatoria
El presente trabajo está dedicado a todas las personas que de una u otra manera,
contribuyeron para que pueda alcanzar una meta más en mi vida, como lo es la obtención
de mi título profesional.
A mis padres, Alfonso y Angélica, que sin su apoyo y esfuerzo diario, no lo hubiese
podido conseguir
A mis hermanos, Sonia, Ericka, Tatiana, Alexis, Estalin por hacer más divertidas las noches
de desvelo.
A mi novia, Daniela por apoyarme siempre y darme ánimos en todo momento.
Y a mis amigos, a toda la sarta de amigos y amigas que hice a lo largo de todos mis
estudios, a ellos gracias por sus consejos enseñanzas, y bueno momentos.
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Agradecimientos
Agradezco de manera especial al Instituto de Investigación en Salud Pública (INSPI) por
permitirme realizar proyecto de investigación y a mi tutor, Dr. Jorge Reyes por sus buenos
consejos y enseñanzas.
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMMICAS
CARRERA BIOQUÍMICA CLÍNICA
AUTORIZACIÓN DE AUTORÍA INTELECTUAL
Yo, John Hernán Sucuy Lalon en calidad de autor del trabajo de investigación:
“Epidemiología molecular en Acinetobacter baumannii-complex resistente a
carbapenémicos utilizando amplificación por reacción en cadena de la polimerasa de
elementos palindrómicos extragénicos repetitivos de aislamientos en una casa de salud
de la ciudad de Quito”, autorizo a la Universidad Central del Ecuador a hacer uso de todos
los contenidos que me pertenecen o parte de los que contiene esta obra, con fines
estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autor(es) me/nos corresponden, con excepción de la presente
autorización, seguirán vigentes a mi/nuestro favor, de conformidad con lo establecido en
los artículos 5, 6, 8; 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su
Reglamento.
También, autorizo/autorizamos a la Universidad Central del Ecuador a realizar la
digitalización y publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de
conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
Firma:
-------------------------------
John Hernán Sucuy Lalon
CI: 1723875207
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMMICAS
CARRERA BIOQUÍMICA CLÍNICA
CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TUTOR
Yo, Jorge Aníbal Reyes Chacón en calidad de tutor del trabajo de investigación titulado
“Epidemiología molecular en A. baumannii-complex resistente a carbapenémicos utilizando
amplificación por reacción en cadena de la polimerasa de elementos palindrómicos
extragénicos repetitivos de aislamientos en una casa de salud de la ciudad de Quito”,
elaborado por el estudiante John Hernán Sucuy Lalón de la Carrera de Bioquímica Clínica,
Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador, considero que el
mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo metodológico y en el campo
epistemológico, por lo que lo APRUEBO, a fin de que sea sometido a la evaluación por
parte del tribunal calificador que se designe.
En la ciudad de Quito, a los 19 días del mes de Enero de 2017
DR.JORGE ANÍBAL REYES CHACÓN
CI: 171773096-2
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMMICAS
CARRERA BIOQUÍMICA CLÍNICA
CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TRABAJO FINAL POR EL TRIBUNAL
El Tribunal constituido por:
Dra. Inés Echeverría, Dra. Gabriela Gualpa y Dr. Jorge Reyes, luego revisar el trabajo de
investigación titulado: “Epidemiología molecular en A. baumannii-complex resistente a
carbapenémicos utilizando amplificación por reacción en cadena de la polimerasa de
elementos palindrómicos extragénicos repetitivos de aislamientos en una casa de salud de
la ciudad de Quito” previo a la obtención del título de Bioquímico Clínico presentado por
el señor Sucuy Lalon John Hernán APRUEBA el trabajo presentado.
Para constancia de lo actuado firman:
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LUGAR DONDE SE REALIZO LA INVESTIGACION
El estudio epidemiológico molecular en Acinetobacter baumannii-complex resistente a
carbapenémicos utilizando amplificación por reacción en cadena de la polimerasa de
elementos palindrómicos extragénicos repetitivos de aislamientos en una casa de salud
de la ciudad de Quito se realizó en el Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública
(INSPI) ubicado en Iquique N14 285 y Yaguachi, Barrio “El Dorado”
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INDICE DE CONTENIDOS
1. INTRODUCCION .................................................................................................................... 1
1.1 Planteamiento del problema ............................................................................................. 1
1.2 Formulación del problema ..................................................................................................... 2
1.3 Preguntas directrices .............................................................................................................. 3
1.4 Objetivos ................................................................................................................................. 3
1.4.1 Objetivo general .............................................................................................................. 3
1.4.2 Objetivos específicos ........................................................................................................ 3
1.5 Justificación e importancia..................................................................................................... 4
2. MARCO REFERENCIAL O MARCO TEÓRICO ................................................................... 7
2.1 Antecedentes ............................................................................................................................ 7
2.2 Fundamentación teórica ......................................................................................................... 8
2.2.1 Acinetobacter baumannii-complex ....................................................................................... 8
2.2.2 Principales patologías causados por A. baumannii-complex ............................................ 9
2.2.2.1 Efectos sobre la salud humana y fuentes de infección ............................................... 11
2.2.3 Brotes infecciosos en hospitales ......................................................................................... 12
2.2.3.1 Infecciones asociadas a la atención en salud (IAAS) ................................................. 12
2.2.3.2 Principales tipologías de IAAS .................................................................................... 12
2.2.3.3 Indicadores de brotes infecciosos en hospitales .......................................................... 13
2.2.3.4 Medidas de control ....................................................................................................... 16
2.2.4 Mecanismos de resistencia bacteriana a fármacos utilizados en el tratamiento de
infecciones causadas por A. baumannii-complex ...................................................................... 17
2.2.4.1 Resistencia intrínseca ................................................................................................... 17
2.2.4.2 Mecanismos de resistencia adquiridos ........................................................................ 18
2.2.4.3 Mecanismo de acción de los carbapenémicos ............................................................. 20
2.2.3.4 Mecanismo de resistencia tipo carbapenemasas ......................................................... 20
2.2.4.5 Técnicas de identificación de mecanismos de resistencia ........................................... 22
2.2.5 Técnicas moleculares de identificación y determinación de clonalidad bacteriana en A.
baumannii ..................................................................................................................................... 24
2.2.5.1 Identificación de A. baumannii-complex .................................................................... 24
2.2.5.2 Técnicas moleculares determinación de brote epidemiológico o clonalidad ............. 25
ix
2.2.5.3 Análisis de plásmidos ................................................................................................... 26
2.2.5.4 Análisis del ADN mediante amplificación mediante PCR. ......................................... 26
2.2.5.5 Electroforesis de campos pulsados (PFGE) ............................................................... 28
2.2.5.6 Análisis de ADN por secuenciación: Multilocus Sequence Typing (MLST). ............ 28
2. 3 Fundamentación legal .......................................................................................................... 28
2.4 Hipótesis ................................................................................................................................. 29
2.4.1 Hi ..................................................................................................................................... 29
2.4.2 Ho ..................................................................................................................................... 29
3. MARCO METODOLÓGICO .................................................................................................... 30
3.1 Diseño de la investigación ..................................................................................................... 30
3.1.1 Enfoque de la investigación ........................................................................................... 30
3.1.2 Nivel de investigación ..................................................................................................... 30
3.1.3 Tipo de investigación...................................................................................................... 30
3.2 Población y Muestra / Métodos y Materiales...................................................................... 31
3.2.1 Muestra .......................................................................................................................... 31
3.2.2 Insumos ......................................................................................................................... 31
3.3Matriz de operacionalización de variables .......................................................................... 32
3.4 Técnicas e instrumentos de recolección de datos ............................................................... 33
3.4.1 Aislamiento e identificación .......................................................................................... 33
3.4.2 Perfil de susceptibilidad ............................................................................................... 33
3.5 Técnica de procesamiento y análisis de datos ..................................................................... 33
3.5.1 Aislamiento e identificación .......................................................................................... 33
3.5.2 Ensayos de susceptibilidad por difusión de disco ....................................................... 33
3.5.3 Extracción de ADN ....................................................................................................... 34
3.5.4 Determinación de genes Tipo OXA .............................................................................. 35
3.6 Análisis estadístico ................................................................................................................ 37
3.6.1 Interpretación de resultados ......................................................................................... 37
4 ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ....................................................................... 38
4.1 Resultados .............................................................................................................................. 38
4.1.1 Muestras clínicas donde se aisló A. baumannii-complex. ............................................ 38
4.1.2 Carbapenemasas tipo OXA en A. baumannii-complex ............................................... 41
x
4.1.3 Reacción en cadena de la polimerasa de elementos palindrómicos extragénicos
repetitivos. ................................................................................................................................ 41
4.2 Discusión .......................................................................................................................... 44
5 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ......................................................................... 50
5.1 Conclusiones .......................................................................................................................... 50
5.2 Recomendaciones .................................................................................................................. 50
6. REFERENCIAS .......................................................................................................................... 52
ANEXOS .......................................................................................................................................... 60
xi
INDICE DE ANEXOS
ANEXO 1: Problemática de resistencia a carbapenémicos...............................................64
ANEXO 2: Diagrama de flujo Identificación de genes tipo OXA.....................................65
ANEXO 3: Resistencia a los antibióticos. Perfil de susceptibilidad……………………..66
ANEXO 4: Electroforesis: de Genes Tipo OXA................................................................67
xii
INDICE DE FIGURAS
FIGURA N° 2.1. IAAS. ALCANCES Y COSTOS ........................................................................................ 13 FIGURA N° 2.2. CRITERIOS DE INFECCIÓN INTRAHOSPITALARIA .................................................. 15 FIGURA N° 3.1. ESQUEMA DE COLOCACIÓN DE DISCOS EN AGAR MÜELLER HINTON ............. 34 FIGURA N° 4.1. MUESTRAS SEGÚN SERVICIO HOSPITALARIO......................................................... 38
FIGURA N° 4.2. RELACION ENTRE AISLADOS Y GRUPO ETARIO ..................................................... 38
FIGURA N° 4.3. ELECTROFORESIS. GENES TIPO OXA EN MUESTRAS CLÍNICAS ........................ 42 FIGURA N° 4.3. DENDOGRAMA REP-PCR .............................................................................................. 42
xiii
INDICE DE TABLAS
TABLA N° 2.1. MEDIDAS DE CONTROL PARA LA GESTIÓN DE BROTES ......................................... 17 TABLA N° 2.2. BETALACTAMASAS, CLASIFICACIÓN SEGÚN AMBLER .......................................... 19 TABLA N° 2.3. PUNTOS DE CORTE SEGÚN CLSI .................................................................................... 23 TABLA N° 3.1. VARIABLES E INDICADORES.......................................................................................... 32 TABLA N° 3.2. PRIMERS FORWARD Y REVERSE, GENES TIPO OXA ................................................. 35 TABLA N° 3.3. MULTIPLEX 1 ...................................................................................................................... 35 TABLA N° 3.4. MULTIPLEX 2 ...................................................................................................................... 36 TABLA N° 3.5. PROGRAMA DEL TERMOCICLADOR ............................................................................. 36 TABLA N° 3.6. SECUENCIA DE CEBADORES (REP-PCR) ...................................................................... 36 TABLA N° 3.7. PROTOCOLO REP-PCR ...................................................................................................... 37 TABLA N° 3.8. PROGRAMA TERMOCICLADOR ..................................................................................... 37 TABLA N° 4.1. MUESTRAS SEGÚN EL SERVICIO HOSPITALARIO ..................................................... 39 TABLA N° 4.2. MUESTRAS CLÍNICA SEGÚN EL SERVICIO HOSPITALARIO. ................................... 40 TABLA N° 4.3. PERFILES DE RESISTENCIA A LOS ANTIMICROBIANOS EN A. BAUMANNII-
COMPLEX. ............................................................................................................................................. 40 TABLA N° 4.4 DISTRIBUCIÓN CLONAL ENTRE SERVICIO HOSPITALARIO Y MESES .................. 43
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS
AMC: Amoxicilina/Ácido clavulánico
AZM: Azitromicina
AZT: Aztreonam
BLEE: Beta-lactamasa de Espectro Extendido
CAZ: Ceftazidima
CIP: Ciprofloxacina
CLSI: Clinical and Laboratory Standars Institute
CRO: Ceftriaxona
CTX: Cefotaxime
FEP: Cefepime
IAAS: Infecciones asociadas a la atención en la salud
MDR: Multi-Drug Resistant (Resistente a múltiples drogas)
MSP: Ministerio de Salud Pública
NA: Ácido nalidíxico
OMS: Organización Mundial de la Salud
PCR: Polimerase chain reaction
SAM: Ampicilina/Sulbactam
SXT: Trimetoprim Sulfametoxazol
xv
Resumen
Introducción.- Acinetobacter baumannii-complex es un cocobacilo gramnegativo no
fermentador, catalasa positivo, no motil; microorganismo de baja virulencia pero conocido
por ser un patógeno oportunista causante de infecciones en pacientes hospitalizados e
inmunocomprometidos.
Objetivo.- Se pretende identificar genes de betalactamasas tipo OXA y su relación clonal
entre aislados clínicos de A. baumannii-complex resistente a múltiples drogas incluyendo
carbapenémicos en un hospital público de la ciudad de Quito.
Materiales y métodos.- La identificación de las cepas se realizó usando una batería
completa de pruebas bioquímicas, la prueba de susceptibilidad fue mediante el método de
difusión en disco y también con el equipo automatizado Vitek (concentración mínima
inhibitoria; MIC). Se amplificaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
genes tipo OXA-23, OXA-24/40, OXA-51, OXA-58, OXA-14, la relación clonal se
determinó por amplificación de elementos palindrómicos extragénicos repetitivos (REP-
PCR).
Resultados.- El tipo de muestra más común fue de aspirado traqueal, en las unidades de
cuidados intensivos. Todas estas cepas fueron resistentes a los carbapenémicos, se
identificaron genes tipo OXA-23 y OXA-51 en 26 aislados, un aislado presentó sólo el gen
OXA-23 y dos el gen OXA- 51. De los 29 aislados clínicos, 17 fueron concentrados dentro
de 6 grupos clonales. Los aislados clínicos tuvieron orígenes variados dentro de la casa de
salud, UCI el servicio del cual se obtuvieron la mayor cantidad de aislados, seguido de las
unidades emergencia, medicina interna, unidad de quemados entre otros. El tipo de muestra
más habitual resulto ser el aspirado traqueal 41%, seguido de muestra de sangre 28% y
secreción de herida con el 21%, el restante 10% correspondió a muestras de líquido ascítico
y esputo. Todas las cepas resultaron ser resistente a múltiples drogas (MDR), entre ellas a
los carbapenémicos relacionado esta resistencia con la presencia intrínseca de la
carbapenemasa de tipo OXA-51 y resistencia adquirida mediante el plásmido de la OXA-
23.
Conclusión.- La unidad de cuidados intensivos fue la más afectada, debido a la aparición
de sucesivos brotes de diferentes genotipos de A. baumannii-complex MDR. Se evidencia
la diversidad clonal que podría deberse a una posible circulación endémica o colonización
de pacientes por diferentes cepas de A. baumannii-complex. La mayoría de los aislados
presentaron la combinación de dos tipos de carbapenemasa tipo OXA. La OXA-23 y OXA-
51.
Palabras clave: Acinetobacter, betalactamasa, endémica, brote, MDR, clon, OXA.
xvi
ABSTRACT
Introduction. - A. baumannii-complex, is a non-fermenting, gram-negative coccobacillus,
catalase positive, non-motile. A microorganism with low virulence but known for being an
opportunistic pathogen causing infections in hospitalized and immunocompromised
patients.
Objective. - To identify OXA beta-lactamase genes and the clonal relationship between
clinical isolates of multi-drug resistant A. baumannii-complex including carbapenemics in a
public hospital in the city of Quito.
Materials and methods. - The identification of the strains was performed by using a
complete set of biochemical tests. The susceptibility test was performed with both the disk
diffusion method and the Vitek automated equipment (minimum inhibitory concentration
MIC). The type OXA-23, OXA-24/40, OXA-51, OXA-58, OXA-14 genes were amplified
by the polymerase chain reaction (PCR), clonal relationship was determined by
amplification of repetitive extragenic palindromic elements REP-PCR.
Results. - The most common type of sample was tracheal aspirate, in intensive care units.
All of these strains were resistant to carbapenems, OXA-23 and OXA-51 genes that were
identified in 26 isolates. One isolate presented only the OXA-23 gene and two the OXA-51
gene. Of the 29 clinical isolates, 17 were concentrated Within 6 clonal groups. The clinical
isolates had variable origins within the health home, ICU the service from which the largest
number of isolates were obtained, followed by emergency units, internal medicine, burn
unit among others. The most common type of sample turned out to be tracheal aspirate
41%, followed by blood sample 28% and wound secretion with 21%. The remaining 10%
corresponded to samples of ascites fluid and sputum. All strains were found to be multidrug
resistant (MDR), including carbapenems related to this resistance with the intrinsic
presence of carbapenemase type OXA-51 and resistance acquired by the OXA-23 plasmid.
Conclusions. - The intensive care unit was the most affected, due to the appearance of
successive outbreaks of different A. baumannii-complex MDR genotypes. There is
evidenced the clonal diversity could be due to a endemic circulation or colonization of
patients by different strains of A. baumannii-complex. The majority of isolates presented
the combination of two types of carbapenemasa type OXA. OXA-23 and OXA-51.
Key words: Acinetobacter, Betalactamase, endemic, outbreak, MDR, clone, OXA.
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CAPÍTULO I
1. INTRODUCCION
1.1 Planteamiento del problema
El género Acinetobacter, tal como se define actualmente, comprende a bacterias
gramnegativas, no exigentes, estrictamente aerobias, no fermentadores, no móviles,
bacterias-oxidasa negativas y catalasa-positivos. (Anton, 2008)
Las bacterias del género Acinetobacter suelen ser comensales, pero en ocasiones agreden a
pacientes internados, sobre todo en aquellos vulnerables como lo son los
inmunosuprimidos, en los hospitales. Son patógenos oportunistas que pueden ocasionar
infección de vías urinarias, neumonía, bacteriemia, meningitis secundaria y complicaciones
de heridas. Existen factores que predisponen a este tipo de complicaciones como: tumores
malignos, quemaduras, cirugías mayores y la inmunodepresión, por ejemplo en neonatos y
ancianos. (Paterson, 2015)
La amplia contaminación ambiental por parte de A. baumannii-complex, ha sido
demostrada en numerosos brotes hospitalarios; los sitios colonizados han incluido: muebles
hospitalarios, equipos de reanimación y mantenimiento artificial, instrumental médico
como estetoscopios, e incluso equipos informáticos como monitores y teclados. (Weber,
2010)
La aparición y rápida propagación de cepas de A. baumannii-complex multirresistente, que
provocan infecciones asociadas con la atención a la salud (IAAS) son motivo de
preocupación en centros de atención de salud, especialmente cuando se trata de un mismo
clon. (Salud O. M., 2014)
El SENTRY “Antimicrobial Surveillance Program”, en un estudio realizado a nivel de
Latinoamérica, reporto que A. baumannii-complex presenta las mayores índices de
resistencia a los antimicrobianos, estableciendo que la resistencia a los carbapenémicos es
sumamente elevada, incluso mayor que en los EEUU y en Europa. (Martínez, 2016)
Un estudio realizado en Colombia en las unidades de cuidados intensivos (UCI) de 10
hospitales de tercer nivel, determinó que de todas las bacterias estudiadas, A. baumannii-
complex presenta los porcentajes más elevados de resistencia a los antibióticos, así también
un aumento en la porcentajes de resistencia a los carbapenémicos, indicando un aumento en
la prevalencia de la resistencia al imipenem (48,1%) y al meropenem (52%). (Chávez,
2015)
2
A. baumannii-complex entre sus mecanismos de resistencia intrínseco de tipo enzimático,
posee una cefalosporinasa tipo AmpC no inducible denominada ADC (Acinetobacter-
derived cephalosporinase), que actúa inhibiendo a los betalactámicos. (Marcela, 2014)
En la actualidad, se ha incrementado la resistencia a carbapenémicos como meropenem e
imipenem, habiéndose encontrado cepas capaces de hidrolizar carbapenémicos mediante la
síntesis enzimática de carbapenemasas. (Peleg P. , 2008)
Entre las carbapenemasas que se han descrito en este microorganismo se encuentran las
metalobetalactamasas, las serinocarbapenemasas, y con mayor frecuencia presenta
carbapenemasas tipo OXA, clase D, según la clasificación de Ambler y 2df según la
clasificación de Bush y Jacoby. (Walther-Rasmussen J. , 2006)
Han sido descritos cinco tipos de carbapenemasa tipo OXA, en A. baumannii-complex,
OXA-51, intrínseca, que permite la identificación a nivel de especie y las adquiridas,
relacionadas con la resistencia a carbapenémicos: OXA-23, -40, -58 y -143. (Brown, 2004)
Países como Argentina, Bolivia, Brasil y Colombia han reportado aislados de A. baumannii
que presentan carbapenemasas tipo OXA. (Opazo, 2012). En Venezuela en el año 2009 se
registró un 36,1% y 41,4% de aislados de A. baumannii resistentes a imipenem y
meropenem respectivamente en pacientes hospitalizados. (Margot, 2012)
La importancia de infecciones que son relacionadas con cepas que son capaces de producir
carbapenemasas, deriva del impacto que causan en las unidades de salud, incluyendo así
incremento de costos hospitalarios, aumento de estadía del paciente, el uso de varias
terapias con diferentes antibióticos, uso de más técnicas de diagnóstico, etc (Sevillano,
2011).
Ha sido demostrado que cuando el A. baumannii-complex ha logrado establecerse, como
brote, estas cepas pueden volverse endémicas dentro de la institución que presta servicios
de salud. Los porcentajes de mortalidad a causa de infecciones por A. baumannii-complex
se encuentra hasta un 50%, mientras que representa un rango comprendido entre el 8% y
23% cuando los pacientes permanecen hospitalizados y entre el 10% a 43% para los
pacientes que se encuentran en la unidad de cuidados intensivos (UCI). (Weber, 2010)
1.2 Formulación del problema
La incidencia de infecciones por especies de Acinetobacter multirresistente, ha ido en
aumento, frecuentemente ocurre en pacientes con factores de riesgo y en cuidados
intensivos donde la mortalidad relacionada es elevada.
3
¿Entre las cepas de A. baumannii-complex resistentes a los carbapenémicos que han
llegado al Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública, a partir de aislamientos de
diferentes áreas en una casa de salud de la ciudad de Quito, existen genes tipo OXA y
poseen relación clonal entre sí?
1.3 Preguntas directrices
¿Cuál es el tipo de muestra y servicio hospitalario más habitual de donde se
aisló A. baumannii-complex?
¿Existe una relación clonal entre los distintos aislados de A. baumannii-
complex?
¿Cuál es la carbapenemasa tipo OXA más prevalente entre los aislamientos
del estudio?
1.4 Objetivos
1.4.1 Objetivo general
• Determinar la relación clonal y la presencia de genes de carbapenemasas tipo
OXA en aislados de A. baumannii-complex resistentes a los carbapenémicos,
provenientes de una casa de salud de la ciudad de Quito.
1.4.2 Objetivos específicos
• Determinar la relación clonal entre los aislamientos mediante la técnica de
REP-PCR.
• Determinar la carbapenemasa de tipo OXA más habitual en aislamientos de A.
baumannii-complex mediante reacción en cadena de la polimerasa.
4
1.5 Justificación e importancia
Actualmente ha incrementado la diseminación de los bacilos gramnegativos con resistencia
a los carbapenémicos mediante la producción de betalactamasas con capacidad de
hidrolizar múltiples tipos de antibióticos, dentro de estos los carbapenémicos. (Navarro,
2011) (Latibeaudiere, 2015)
Los pacientes ubicados en las unidades de cuidados intensivos son los que tienen mayor
riesgo de infección, debido a su necesidad de procedimientos invasivos como: la utilización
de sonda gástrica, intubación orotraqueal, catéteres, sonda vesical u otros; el uso de
múltiples antibióticos sin definir un tratamiento eficaz, la estancia prolongada y
enfermedades crónicas (Yomayusa N. , 2008) (Chávez, 2015)
Es decir, A. baumannii-complex, se ha convertido en un problema relacionado con las
denominadas IAAS (infecciones asociadas a la atención en la salud), en donde el paciente
que recibe atención en una unidad de salud y si su tratamiento implica procedimientos
invasivos, es susceptible de contraer una infección secundaria por A. baumannii-complex,
acrecentando así las complicaciónes, no solo en su estado de salud, sino produciendo
también un impacto de consideración en la familia del paciente, el personal de salud y
sobretodo en los centros de atención médica. Por lo que es de importancia comprender
como se desarrolla la cadena de infección, poniendo énfasis en las maneras de transmisión
para así definir estrategias adecuadas de prevención y control. (Unahalekhaka, 2011)
Una infección secundaria, debida a A. baumannii-complex, sería la causa de complicaciones
en los pacientes hospitalizados provocando: neumonías intrahospitalarias, incremento en
los índices de bacteriemias, infección del sitio operatorio o urinario; todo esto debido
principalmente a la expresión de mecanismos de resistencia mediado por carbapenemasas
de tipo OXA; la aparición y desarrollo de estas carbapenemasas es una amenaza mundial.
El uso desmedido de carbapenémicos es el factor principal, por lo que es imprescindible
desarrollar medidas de control para lograr uso adecuado y racional, para poder preservar
estos antibióticos para el futuro. (García., 2012)
Las carbapenemasas pueden estar codificadas en el cromosoma bacteriano o estar presentes
en elementos genéticos móviles. Se ha propuesto una clasificación en dos grupos:
carbapenemasas de serina (incluidas en la clasificación molecular de Ambler, clases A y D)
y metalo-β-lactamasas, MBL (Ambler, clase B), llamadas así por la dependencia de metales
como el zinc para su funcionamiento. (José David Tafur, 2008)
5
Cuando se pretende determinar carbapenemasas de tipo OXA, no es posible utilizar un
método fenotípico, es decir el método convencional de difusión en disco, como es el que
se usa en la detección de otros tipos de carbapenemasas, esto se debe a que no existen
inhibidores específicos de enzimas de clase D, por lo cual es necesaria la detección de
estas enzimas por medio de métodos moleculares. (Cantón, 2011).
Las carbapenemasas tipo OXA han sido descritas alrededor del mundo, incluyendo
América del Sur. Encontrándose cepas de A. baumannii que poseen enzimas OXA-23 en
Brasil, Argentina y Colombia. De igual manera se han hallado carbapenemasas OXA-23
como subgrupo en Europa, Australia, Tahití, China, Corea, Singapur, Vietnam, EE.UU.,
Libia y Pakistán (Evans, 2014).
El tipo OXA-58 fue descrita por primera vez en Francia, en América del Sur, han sido
hallados en Argentina, Colombia, Bolivia y Venezuela y se reportó un estudio donde se
determinó un total de 38 cepas con el gen OXA-58 en Chile, la OXA-72, fue descrito en
una cepa de A. baumannii en un aislamiento en Brasil, y de igual manera fue detectada en
Taiwán, Francia y Croacia. En Chile, dos cepas no relacionadas clonalmente de A.
baumannii en 2008 resultaron positivos para carbapenemasas OXA-40 (Quiñones, 2015).
La carbapenemasa tipo OXA-51 ha sido identificada a nivel mundial, esto es debido a su
localización cromosómica, es decir todos los aislados A. baumannii llevan consigo el gen
de OXA-51; este fue descubierto por primera en Buenos Aires, Argentina, entre 1993 y
1994, cuando existió un incremento en el número de aislamientos resistentes a
carbapenémicos. (Brown, 2004)
En cuanto a Latinoamérica se refiere, A. baumannii-complex es la fuente de infección
intrahospitalaria con frecuencias 2 a 10 veces mayores que en Canadá o Estados Unidos y
la prevalencia de la resistencia a carbapenémicos como el imipenem es de 11,45%. (Opazo,
2012)
En la actualidad en Ecuador solamente han existido limitados datos relacionados con
infecciones por A. baumannii, y menos con detección molecular de carbapenemasas tipo
OXA, solamente se encuentra reportado un brote en el hospital Eugenio Espejo en el año
2008 (Salud, 2011) y un estudio realizado en la clínica “Northospital” (Gestal, 2016)
La tendencia al aumento de la resistencia a carbapenémicos en A. baumannii en todo el
mundo es una preocupación ya que limita drásticamente la gama de alternativas
terapéuticas; el tratamiento inicial, a una infección por A. baumannii-complex es tratado
con el uso, desde carbapenémicos como el meropenem e imipenem, pasando por
6
inhibidores de betalactámicos como el sulbactam, hasta el uso de polimixinas como es la
colistina que tiene un amplio espectro frente a bacterias gramnegativas, y que puede ser
administrada por vía intravenosa o vía nebulizadores. (Kempf, 2012)
También se aplican tratamientos combinados, como es el uso de carbapenémicos y
rifampicinas ó carbapenémicos e inhibidores de betalactamasas, con lo que se logra obtener
una mayor resolución de casos con esta última opción. Los antibióticos más actuales como
lo es la tigeciclina, que es una glicilciclina con un amplio espectro que abarca cepas
resistentes a carbapenémicos y colistina, es la que posee mejor características en cuanto al
control en infecciones complicadas de piel, intra-abdominales y neumonías adquiridas en la
comunidad, a diferencia de otros, posee también baja toxicidad. (Garnacho, 2009) (FDA,
2013)
Las recurrentes infecciones producidas por una misma cepa de A. baumannii, ha provocado
alarma en las unidades de salud. Se han reportado varios casos de brotes intrahospitalarios
como: en Madagascar, en donde se comprobó, que de 120 aislamiento de A. baumannii que
presentaban resistencia a resistentes a carbapenémicos, sus fenotipos se relacionaban,
estableciendo dos fenotipos similares en porcentaje de 45% y 65% respectivamente (Tahiry
A. , 2010), casos similares presentados en Bélgica, España o Bogotá. (De Vos, 2016)
(Villalón, 2011) (Prado, 2013)
7
CAPÍTULO II
2. MARCO REFERENCIAL O MARCO TEÓRICO
2.1 Antecedentes
En la actualidad A. baumannii, un Gram negativo, no fermentador; es endémico a nivel
hospitalario debido su capacidad para permanecer en el medio ambiente por largos periodos
y capaz de colonizar pacientes y personal relacionado con atención a la salud, así también
debido a su habilidad para desarrollar mecanismos de resistencia, principalmente por la
adquisición de material genético a través de elementos móviles como lo son plásmidos,
transposones o integrones que finalmente, se manifiestan por resistencia a múltiples
antibióticos, incluso los carbapenémicos que son considerados como la terapia de elección.
(Nancy Yomayusa1, 2007)
Estudios realizados, determinaron la presencia de carbapenemasas del grupo OXA-23, en
aislados de pacientes de un hospital de cuidados intensivos en Bogotá; en este un elevado
porcentaje de los aislamientos evidenció resistencia a los carbapenémicos principalmente
imipenem y meropenem; razón por la cual es importante determinar el tipo de
carbapenemasa para un adecuado tratamiento. (Pinzon, 2006)
Estudios en Argentina describieron la emergencia y caracterización de un nuevo tipo de
carbapenemasas (OXA-51) en cepas de A. baumannii resistentes a carbapenémicos,
genéticamente distintas. (S. Brown, 2005)
En Bolivia se realizó la detección genotípica de carbapenemasas por PCR para la detección
de enzimas de tipo Oxacilinasa y Se detectó la carbapenemasa OXA-51 intrínseca de A.
baumannii en 33 aislamientos y la carbapenemasa OXA-58 en 13 aislamientos. (Colón,
2009)
En Sudamérica, se tiene estudios no tan recientes pero con resultados que se los debe
tomar en cuenta, como en Bogotá en una casa de salud en donde se determinó la existencia
de un clon conformado, este, por aislados tomados de pacientes y muestras ambientales,
presentado resistencia a los carbapenémicos y adicional se evidenció la presencia del gen
OXA 23. (Pinzon, 2006) De igual manera en Colombia en Cali se determinó la presencia de
cuatro clones presentando el gen OXA 23, en 66 aislados de una casa de salud. (Villegas,
2007) (Chávez, 2015)
8
Estudios más recientes se los han realizado en México y E.E.U.U, así en el primero se
representó un brote nosocomial de infección de vías respiratorias bajas por A. baumannii en
Hospital de General de Navarro. (Ramírez, 2013)
En E.E.U.U, se describe un brote de Acinetobacter, no solo del tipo baumannii, sino
también de A. pitti y A. nosocomialis, encontrándose mayor prevalencia de A. pitti.
(Wisplinghoff, 2012)
2.2 Fundamentación teórica
2.2.1 Acinetobacter baumannii-complex
El nombre A. proviene del griego “akineto” que significa “no motil”, este fue propuesto
inicialmente en 1954, para separarlo del género Achromobacter y no fue hasta el año de
1971 que se estableció como género. (Cisneros, 2003)
En un inicio, fue clasificado dentro de la familia Neisseiaceae, en el que también se
encontraba el A. calcoaceticus, luego fue clasificado dentro del género Moraxellaceae, su
temprana clasificación estuvo basada en el análisis de características fenotípicas las que no
distinguen especias relacionadas estrechamente. En la actualidad mediante el uso de
técnicas de secuenciación como la 16S rDNA, amplificación de segmentos polimórficos
(AFLP) y la secuenciación del gen rpoB, nuevas especias han sido identificadas, pero no
todas tienen importancia clínica. Así tenemos a A. baumannii, A. pittii y A. nosocomialis,
que en conjunto es conocido como “A. baumannii-complex”, y es el principal causante de
infecciones oportunistas y relacionado con brotes intrahospitalarios. (Opazo-Capurro,
2014)
El A. baumannii-complex es un bacilo corto Gram negativo que cuando se encuentra en
fase logarítmica de crecimiento tiene forma bacilar, se vuelve más cocoides o esféricos en
la fase estacionaria; se presenta en parejas, cadenas o agrupados irregularmente, además
son inmóviles y no forman esporas. (Bergogne-Berezin, 1996)
Son microorganismos aerobios estrictos, que crecen en un rango de temperaturas de entre
20 a 44ºC, y su temperatura óptima es de 30-35ºC y para su aislamiento es recomendable
una temperatura de 30ºC. (Vegasa, 2005)
Las diferentes especies del género A. crecen en medios comunes, para el aislamiento
directo de muestras clínicas se hace más útil el empleo de un medio selectivo que inhiba el
crecimiento de otros microorganismos. Se desarrollaron medios Leeds A. para el
9
aislamiento de A. de muestras clínicas y ambientales. La ampicilina fue excluida de este
medio y las concentraciones de vancomicina, cefulodina y cefradina se ajustaron después
de determinar la concentración inhibitoria mínima a un rango de utilidad para la diversa
colección de A.. Estos medios deben contener una fuente de carbono y energía, y amonio o
sales de nitrato como fuente de nitrógeno, con pH final de 5,5 a 6,0. Durante la incubación
es necesario agitar vigorosamente para que cualquier Acinetobacter spp. presente en la
muestra crezca más que cualquier Pseudomonas spp. (Anton, 2008)
El A. baumannii-complex crecen apropiadamente en agar MacConkey produciendo
colonias rosado pálido. Todos los integrantes del género A. son oxidasa negativos, catalasa
positivos, no fermentadores de glucosa y carecen de lisina descarboxilasa, la mayoría de
cepas no reducen los nitratos a nitritos, además, utilizan una amplia variedad de
compuestos orgánicos como fuente de carbono. (Anton, 2008)
Estas pruebas se deben complementar con la utilización de fuentes de carbono, mediante el
uso de levulinato, fenilalanina, citraconato, fenilacetato, 4-hidroxibenzoato y L-tartrato se
diferencian 19 biotipos en A. baumannii. (Gallego, 2004)
2.2.2 Principales patologías causados por A. baumannii-complex
Neumonía
Es una infección respiratoria aguda que afecta a los alvéolos pulmonares, limitándose la
respiración y por lo tanto la absorción de oxígeno. Este tipo de infección relacionada con A.
baumannii-complex suele ser común en pacientes en cuidados intensivos (UCI) o si este
usa un ventilador. (OMS, 2016)
Una neumonía adquirida en la comunidad no es usual, se lo relaciona con personas que se
encuentran los lugares con estaciones lluviosas que a su vez presentan algún tipo de
comorbilidad, sumado también el fumar y el abuso de alcohol, y han sido pocos los reportes
de esta. Se tiene datos principalmente de Asia en donde se encontró 19 casos en el 2006
(Leung, 2006) y un caso más antiguo fue en Australia que en 1989 se reportaron 2 casos
(Krisanapan, 1989). La neumonía asociada a ventiladores es más frecuente, en el mismo
estudio referente a neumonía adquirida en la comunidad se encontró también 74 casos de
neumonía intrahospitalaria, y establecieron que la causa más probable fue relacionada con
pacientes con uso de ventilador. (Leung, 2006)
En el año 2010, en Guayaquil, Ecuador un estudio relacionado con infecciones
intrahospitalarias, reveló que las neumonías asociadas a ventilación mecánica eran causadas
por Klebsiella pneumoniae, y en segundo lugar por A. baumannii. (Alemán, 2010)
10
En un estudio realizado en el 2013 en Colombia, se observó que de un total de 28 muestras
el 53,6% correspondía a secreción traqueal de pacientes que presentaban neumonía
relacionados a ventilación mecánica. (Prado, 2013)
En el 2014, fue reportado en Sevilla, España, la aparición de infecciones recurrentes por A.
baumannii, en varios centros hospitalarios, y de un total de 101 muestras, el 50,5 %
correspondía a neumonías, y de estas el 68,7% estaban asociadas a ventilación mecánica.
(López-Cortés, 2014). En el 2015 se reportó, en Turquía de un total de 33, 23 muestras de
secreción traqueal de neumonía asociada a ventiladores. (Ece, 2015)
Infecciones del torrente sanguíneo
Los casos de bacteriemias, son las infecciones más comunes y una de las causas principales
de la alta mortalidad en los hospitales. En estas, es difícil asegurar que el patógeno causal
sea el A. baumannii, debido a que este tipo de infecciones, por lo general, son de tipo
mixto, y ha sido sugerida como sinergia bacteriana. (Sung, 2012)
Las bacteriemias se presentan secundarias a una patología o procedimiento primario, así los
pacientes con mayor predisposición, son los que tienen la peor prognosis o presentan
neumonía, shock séptico, coagulación extravascular diseminada, ventilación mecánica o
terapia inapropiada. (Tognim, 2004)
Un estudio realizado en Taiwán, se evidenció que las bacteriemias a causa de A. baumannii
ocupan el tercer lugar, como agente causal. (Abbo, 2005)
En Brasil, en el año 2008, se determinó que de un total de 68 aislados de A. baumannii
resistente a carbapenémicos, 50 cepas, el 78% correspondían a hemocultivos. (Mostachio,
2009)
En el 2012, en EE.UU. de 52 hospitales se evaluaron 295 aislados de A. spp. a partir de
hemocultivos de los cuales el 63% correspondía a A. baumannii, y las muestras eran
mayoritariamente de catéteres extravasculares y tracto respiratorio (Wisplinghoff H. ,
2012).
Meningitis
Es la inflamación de las leptomeninges: la piamadre y el aracnoides, razón por la cual que
se ve afectado el líquido céfalo raquídeo, que se encuentra en el espacio subaracnoideo
(OMS, 2016)
Existe un reporte de 1997, que hace regencia estricta a casos de meningitis por A.
baumannii resistente a betalactámicos, aminoglucósidos, quinolonas y carbapenémicos y
11
resultado en el 50% de los casos sensibles a la ampicilina-sulbactam (Jimenez-Mejias,
1996).
En el año 2006 en Argentina se reportó un estudio retrospectivo de pacientes
diagnosticados con meningitis postquirúrgica, por A. baumannii, que fueron tratados con
polimixina E (colistin), obteniéndose resultados positivos (Alberto, 2007).
Infección del trato urinario, piel o herida
Aislados de A. baumannii, a partir de orina u otros, no tiene uno de los mayores índices de
prevalencia, a este grupo abarca el tercer o cuarto puesto de origen de muestra, ya que en
primer lugar se aíslan a partir de esputo o sangre, pero por esto no se le resta importancia ya
que este podría ser el foco inicial para desencadenar una infección secundaria como una
sepsis. (Kempf, 2012)
2.2.2.1 Efectos sobre la salud humana y fuentes de infección
Las bacterias del género A., son conocidas comúnmente por ser comensales, pero en
determinadas ocasiones producen llegan a producir infecciones, esto se da sobre todo en
pacientes inmunocomprometidos que se encuentran en los hospitales. También conocidos
como patógenos oportunistas ya que en ocasiones llegan a provocar infecciones de las vías
urinarias, neumonía, bacteriemia, meningitis secundaria e infecciones de heridas. (Tahiry
A. , 2010)
Existen factores predisponentes para estas enfermedades, entre estas tenemos factores como
tumores, quemaduras, cirugías mayores y sobretodo la inmunodepresión, como es el caso
de los neonatos y ancianos. (Tomas M. d., 2002)
Se debe tomar en cuenta que el ambiente hospitalario y la transmisión de persona a persona,
son las fuentes más comunes y probables de la mayoría de los brotes infecciosos en los
hospitales. La mayoría de estas infecciones se asocia en casos cuando existe contacto con
heridas expuestas o quemaduras, en algunos casos incluso a la inhalación por personas
vulnerables.
Han sido asociados los catéteres intravenosos, como fuente de infección en pacientes con
bacteriemia por A., otras fuentes de infección relacionadas con brotes son, los baños de
agua y los humificadores. (Vegasa, 2005)
12
2.2.3 Brotes infecciosos en hospitales
Se denomina “brote” al aparecimiento, en una determinada comunidad, región o institución,
de un número elevado de casos de una enfermedad con relación a valores normales o
endémicos y que, sobre todo tiene relación entre sí, por su propagación a partir de una
fuente en común (Raslan, 2011)
2.2.3.1 Infecciones asociadas a la atención en salud (IAAS)
Las IAAS o infecciones asociadas con atención a la salud; representan un problema y
sobretodo un riesgo para la seguridad del paciente, todo esto producido por numerosas
causas relacionadas tanto con los sistemas y procesos, relacionados a la atención de salud, y
con el diferente actuar del personal implicado en esto.
Las IAAS, antes llamadas infecciones intrahospitalarias, son aquellas que se adquieren
durante la estadía de un paciente en el hospital, pudiendo ser localizadas o sistémicas, que
no se había manifestado y tampoco se encontraba en periodo de incubación, cuando se dio
el ingreso del paciente. Estas pueden ser endémicas o epidémicas; las primeras son las más
comunes y las segundas son definidas por un aumento exponencial en el número de
infecciones por un microrganismo infeccioso específico, elevándose así la incidencia.
(MSP M. D., 2006)
Generalmente este tipo de infecciones se presentan con más frecuencia cuando han
transcurrido más de 48 horas a partir del ingreso, y pueden ocurrir en cualquier
establecimiento relacionado con atención de salud; también se incluye en este grupo a las
infecciones que han sido contraídas por el personal o por personas que visitan hospitales u
otros establecimientos relacionados. (Ducel, 2012)
2.2.3.2 Principales tipologías de IAAS
Existen cuatro clases principales de IAAS, y están asociadas a procedimientos invasivos o
quirúrgicos, y son:
1. Infección de tracto urinario asociada al uso de catéter (ITU-CA)
2. Neumonía asociada al uso de ventilador (NAV)
3. Infección de sitio quirúrgico (ISQ)
4. Infección del torrente sanguíneo asociada al uso de catéter (ITS-CVC)
Los alcances y costos relacionados con las IAAS, según la OMS, son numerosos por lo que
se detallan los más importantes en la Figura No 2.1.
13
Figura N° 2.1. IAAS. Alcances y costos (OMS, 2016)
2.2.3.3 Indicadores de brotes infecciosos en hospitales
Para el sistema de salud debe ser razón de sospecha de un posible brote un cambio, que
puede ser un único caso, en la conducta de las infecciones intrahospitalarias; pudiendo
presentarse en cualquier institución que preste servicios de salud ya sean estos, públicos o
privados (Bogotá, 2006)
Según el “Center for Disease Control and Prevention” (CDC), y el Ministerios de Salud
Pública del Ecuador (MSP) se evalúan varios criterios para determinar una infección
asociada a atención a la salud, que incluyen: localización o tipo de infección y el estado de
esta. Como se cita a continuación:
“1. INFECCIÓN DE HERIDA QUIRÚRGICA:
Infección superficial de la incisión:
Aparición dentro de los 30 días que siguen a la cirugía.
Afectan a la piel, tejido celular subcutáneo o músculo por encima de la fascia y debe
cumplir alguno de los siguientes criterios:
En todo momento, más de 1,4 millones de personas en el mundo contraen una
infección intrahospitalaria.
Entre el 5% y el 10% de los pacientes que ingresan a hospitales modernos del
mundo desarrollado contraerán una o más infecciones.
En los países en desarrollo, el riesgo de infección relacionada con la atención
sanitaria es de 2 a 20 veces mayor que en los países desarrollados. En algunos
países en desarrollo, la proporción de pacientes afectados puede superar el 25%.
En los EE.UU., uno de cada 136 pacientes hospitalarios se enferman gravemente a
causa de una infección contraída en el hospital; esto equivale a 2 millones de casos
y aproximadamente 80.000 muertes al año.
En Inglaterra, más de 100.000 casos de infección relacionada con la atención
sanitaria provocan cada año más de 5.000 muertes directamente relacionadas con la
infección.
En México, se calcula que 450.000 casos de infección relacionada con la atención
sanitaria causan 32 muertes por cada 100.000 habitantes por año.
Se calcula que las infecciones relacionadas con la atención sanitaria en Inglaterra
generan un costo de 1.000 millones de libras por año. En los Estados Unidos, la
cifra es de entre 4.500 millones y 5.700 millones de US$. En México, el costo
anual se aproxima a los 1.500 millones
14
Drenaje purulento.
Aislamiento de microorganismos en herida cerrada de forma primaria.
Herida deliberadamente abierta, excepto los casos en los que el cultivo es negativo.
Diagnóstico de infección por el médico o el cirujano.
2. BACTERIEMIA PRIMARIA:
Patógeno reconocido aislado en hemocultivo y que no está en relación con otra
localización, excepto dispositivos intravasculares, ó uno de los siguientes: fiebre >38ºC,
escalofríos o hipotensión, con uno de los siguientes:
Contaminante común de la piel aislado en dos hemocultivos tomados en diferentes
localizaciones, y no relacionados con infecciones de otra localización.
Contaminante común de la piel aislado en hemocultivo de paciente con dispositivo
intravascular y sometido a tratamiento antibiótico apropiado.
Antigenemia positiva y que el organismo no esté relacionado con la infección en
otra localización.
3. NEUMONÍA:
Debe cumplir cualquiera de los siguientes criterios
Estertores crepitantes o matidez a la percusión y al menos uno de los siguientes:
Nueva aparición de esputo purulento o cambio en las características del esputo.
Hemocultivo positivo.
Cultivo positivo de aspirado traqueal, cepillado bronquial o biopsia.
Infiltrado nuevo o progresivo, consolidación, cavitación o derrame pleural en RX de
tórax y cualquiera de los siguientes:
o Nueva aparición de esputo purulento o cambio en las características del
esputo.
o Hemocultivo positivo.
o Cultivo positivo de aspirado traqueal (>106 ufc/ml), cepillado bronquial
(>103 ufc/ml) o biopsia (>104 ufc/ml).
o Aislamiento de virus o detección de antígeno viral en secreciones
respiratorias.
o Título diagnóstico de anticuerpos específicos (IgM) aislado, o incremento de
cuatro veces en muestras séricas pareadas del patógeno (IgG).
15
VENTILACIÓN MECÁNICA
Estudio radiográfico que demuestra un infiltrado pulmonar (nuevo o persistente o
progresión de uno existente), consolidación, cavitación o derrame pleural que no se
modifica con kinesioterapia respiratoria si ésta se ha realizado
Al menos uno de los siguientes:
Aparición de expectoración purulenta o cambios en las características de la
expectoración
Coincide con hemocultivos positivos sin otros focos infecciosos
Identificación de microorganismos en muestra tomada por punción aspirativa
transtraqueal, cepillado, lavado bronquíoalveolar o biopsia
Cultivo positivo de muestra de derrame pleural si no se han realizado
procedimientos invasivos en cavidad pleural
Evidencia histopatológica de neumonía con recuento> 103 UFC/ml en muestra por
cepillado protegido con recuento> 104 UFC/ml en muestra por lavado
bronqueoalveolar
4. INFECCION DE VIAS URINARIAS
Criterio 1:
El o la paciente tiene al menos uno de los siguientes signos y síntomas sin otra causa
identificada: fiebre > 38° C, urgencia miccional, disuria, polaquiuria, dolor suprapúbico (en
los pacientes geriátricos se incluye agitación psicomotora que no tiene otra explicación
clínica como un signo). Cultivo de orina con > 100.000 colonias por ce con no más de dos
especies de microorganismos.
Criterio 2
El o la paciente tiene al menos 2 de los siguientes signos o síntomas sin otra causa
identificada: fiebre > de 38° C, urgencia miccional, disuria, polaquiuria, dolor suprapúbico
Y Al menos uno de los siguientes:
a. Piuria b. Microorganismos visibles al Gram de orina no centrifugada. c. Al menos dos
urocultivos positivos con el mismo patógeno Gram negativo > 50.000 colonias por ce. d.
Diagnóstico clínico por médico de infección urinaria. e. Médico ha indicado tratamiento
antimicrobiano para infección urinaria. ” (Cuervo, 2016) (MSP M. D., 2006)
16
2.2.3.4 Medidas de control
Las medidas de control están estrictamente dirigidas a controlar el brote en curso por medio
de la interrupción de la cadena de transmisión y la prevención futura de brotes similares.
Las infecciones intrahospitalarias, mediante el desarrollo de medidas adecuadas pueden ser
prevenidas, para esto se han desarrollado varios programas con mucha que han tenido
mucha efectividad, dichos programas deben contar con características como: mantener un
sistema de vigilancia epidemiológico activo, realización de intervenciones en infecciones
intrahospitalarias más comunes, dirigirse a infecciones asociadas a procedimientos de
atención del paciente estandarizar prácticas y procedimientos como se señala en la Tabla
N° 2.1. Guiados en estos lineamientos junto con la vigilancia epidemiológica, se ha
conseguido la disminución de infecciones intrahospitalarias. (MSP M. D., 2006).
En caso de presentarse un brote, en determinada casa de salud o establecimiento
relacionado con atención hospitalaria, se debe tomar en cuenta el siguiente aspecto:
Se debe establecer una entidad, dentro del hospital, que se encargue del estudio,
control y seguimiento del problema, así se podrá dar cumplimiento a las
disposiciones según las normas establecidas por el departamento de salud estatal.
Dicha casa de salud debe contar con todos los servicios para poder establecer un
sistema de notificación, ya sea en la parte bacteriana o clínica, todo esto deberá
llevarse en un registro estadístico, para establecer de manera adecuada que tipo de
infección se adquirió dentro y fuera de la casa de salud.
Aislar a los pacientes de casos comprobados y sospechosos; los trabajadores o
personal enfermo debe ser removido de sus funciones, hasta que padecimiento
haya cesado.
Se debe realizar un control microbiológico del personal, poniendo énfasis en
quienes atienden a recién nacidos y prematuros.
Desinfectar, por procesos que involucren el uso de autoclave, la ropa infectada,
colchones usados en pacientes. El lavado de paredes y pisos con hexaclorofeno en
piezas infectadas. Aseo húmedo con supresión de aspiradores de polvo,
Uso de gorras, mascarillas, pecheras, delantales y guantes esterilizados y evitar la
introducción de personal sin vestimenta adecuada y la deambulación sin necesidad.
Control bacteriológico de la esterilización del instrumental, guantes y ropas. Los
materiales e instrumentos usados serán llevados a reservorios impermeables para su
limpieza y esterilización, las gasas y elementos contaminados se deben incinerar.
Educación permanente del personal en cuanto al problema, hábitos da aseo y
cumplimiento de preceptos de asepsias.
Indicaciones precisas en el uso de antibióticos con empleo rotativo de ellos.
(Raslan, 2011)
17
Tabla N° 2.1. Medidas de control para la gestión de brotes
Tipo de presunta transmisión Medida recomendada Transmisión
Transmisión cruzada (de una
persona a otra)
Aislamiento del paciente y precauciones
mediante colocación de barreras, determinadas
por los agentes infecciosos
Transmisión por las manos Mejora del lavado de las manos; formación de
cohortes de pacientes
Agente transmitido por el aire Aislamiento de pacientes con ventilación
apropiada
Examen
Agente presente en el agua,
transmitido por el agua
Examen del sistema de abastecimiento de agua
y de todos los contenedores de líquidos
Uso de dispositivos desechables.
Agente transmitido por los
alimentos
Eliminación de los alimentos expuestos a riesgo
(Ducel, 2012)
2.2.4 Mecanismos de resistencia bacteriana a fármacos utilizados en el
tratamiento de infecciones causadas por A. baumannii-complex
2.2.4.1 Resistencia intrínseca
A. baumannii-complex expresa una resistencia mediada por la expresión de una
cefalosporinasa tipo AmpC que no es inducible y es denominada como ADC que proviene
del inglés A.-derived cephalosporinase, este mecanismo enzimático es el responsable de la
resistencia hacia los betalactámicos. (García., 2012)
Como característica particular, se sabe que la sobrexpresión de la ADC es mediada por la
presencia de secuencias de inserción, las que favorecen y promueven la transcripción del
gen, como son la ISAba1 e ISAba125. (Calvo J. , 2011)
Cuando al expresión de ADC es en bajo nivel expresa resistencia hacia la ampicilina y se
sabe que cerca de la mitad de las cepas de A. baumannii-complex, poseen sobrexpresión de
ADC produciendo resistencia a la cefalotina, piperaciclina, cefotaxima, ceftazidima y
aztreonam, que no afecta a los carbapenémicos, ni al cefepime una cefalosporina de cuarta
18
generación y cuando se presentan resistencia a este, cefepime, posee enzimas ADC-33 y
ADC-56, que son consideradas como AmpC de espectro extendido. (Suarez C. J., 2006)
Posee una oxacilinasa, como mecanismo de resistencia intrínseco, esta es la oxacilinasa
OXA- 51, y que su expresión provoca una hidrólisis débil de penicilinas y carbapenémicos;
esta también puede mostrar sobreexpresión como consecuencia de la presencia de la
secuencia de inserción ISAba1. (Mostachio, 2009)
2.2.4.2 Mecanismos de resistencia adquiridos
Aminoglucósidos: Posee enzimas modificantes de aminoglicósidos y bombas de expulsión
que promueven esta resistencia. Las enzimas modificantes: acetiltransferasas -AAC-,
nucleotiltransferasas -ANT- y fosfotransferasas -APH-, producen diferentes fenotipos de
resistencia selectiva en los aminoglicósidos. Cuando estas enzimas se combinan con
bombas de expulsión pueden otorgar resistencia hacia todos los aminoglicósidos. (Calvo,
2011)
Quinolonas: La resistencia a esto fármacos esta mediada por mutaciones en los genes
gyrA y parC las que codifican las subunidades A del ADN girasa y la topoisomerasa IV,
respectivamente. Las quinolonas son sustratos de la bomba AdeABC. (Calvo, 2011)
Tetraciclinas y glicilciclinas: En la resistencia a estos fármacos actúan las bombas de
expulsión y proteínas de protección ribosomal. Las bombas de expulsión como la TetA y
TetB, la primera la primera provoca resistencia solo a tetraciclina, en tanto que la segunda
provoca la expulsión de tetraciclina y minociclina. (Calvo, 2011)
Colistina: La resistencia a estos fármacos ha sido relacionada con la expresión de los genes
pmrA y pmrB que provocan cambios en genes relacionados con la modificación del lípido
A, con la pérdida o menor síntesis de lipopolisacárido y con la modificación de la porina
OmpW. (Calvo, 2011)
Sulfonamidas, Trimetoprim, y Cloranfenicol: La resistencia hacia la sulfonamida se
encuentra mediada por el gen sul que se encuentran en la región 3'de un integrón. El gen
dhfr confiere resistencia a trimetoprim, mientras que la bomba de expulsión CraA
(chloramphenicol resistance A.) y la bomba AdeABC promueven la resistencia al
cloranfenicol. (Calvo J. , 2011).
Betalactámicos: No es común encontrar cepas de A. baumannii-complex, sensibles a
betalactámicos en particular a penicilinas o cafalosporinas. Estos mecanismos de resistencia
son enzimáticos y no enzimáticos.
19
Los mecanismos de resistencia enzimáticos involucran la degradación del betalactámico y
esta es mediada por diferentes enzimas de tipo de ß-lactamasas, y dentro de este grupo
encuentran las betalactamasas de clase A, B o D, de acuerdo con la clasificación de Ambler
Tabla 2.2. Estas betalactamasas se pueden encontrar en elementos genéticos móviles como
son los integrones, plásmidos y transposones. (Suarez, 2006)
Tabla N° 2.2. Betalactamasas, clasificación según Ambler
Betalactamasas Variantes Perfil de resistencia
Clase A Betalactamasas de amplio espectro:
TEM-1, TEM-2
CARB-5, VEB-1, PER-1, PER-2, TEM-
92.
TEM-116, SHV-95, SHV-12, CTX-M-2,
CTX-M-43
Carbapenemasas KPC
Penicilinas
Cefalosporinas de espectro
extendido
Aztreonam
Carbapenémicos, penicilinas,
cefalosporinas y aztreonam
Clase B Carbapenemasas IMP, VIM, SPM, SIM y
NDM
Carbapenémicos, penicilinas,
cefalosporinas y no hidrolizan
aztreonam
Clase D Carbapenemasas: OXA-23, OXA-24,
OXA-58, OXA-51
Carbapenémicos, penicilinas,
cefalosporinas, débilmente
cefalosporinas de cuarta
generación
(Suarez, 2006)
En los mecanismos de resistencia no enzimáticos hacia betalactámicos están incluidos la
alteración de las proteínas de membrana externa llamadas OMPs del inglés: outer
membrane proteins, las que conducen a una disminución de la permeabilidad de la
membrana, como sucede en proteínas como la CarO que está asociada con resistencia a los
carbapenémicos como son meropenem e imipenem y la OmpW la que disminuye la
entrada de colistina y de los betalactámicos al interior de la bacteria. (Peleg, 2008)
Presenta también bombas de expulsión que, como el sistema AdeABC, que puede expulsar
betalactámicos, carbapenémicos, aminoglucósidos, macrólidos, cloranfenicol, tigeciclina,
tetraciclinas, fluoroquinolonas y trimetoprim. Finalmente posee alteración de las proteínas
de unión a penicilina o PBPs (del inglés: penicillin binding protein), cuando son blanco del
medicamento. (Yomayusa, 2008)
20
Carbapenémicos: Los carbapenémicos son antibióticos betalactámicos que poseen un
amplio espectro de actividad por lo que pueden actuar contra bacterias Gram negativas y
Gram positivas, junto con una mayor actividad y resistencia a las betalactamasas.
Estas características de los carbapenémicos hacen que estos sean imprescindibles en el
tratamiento empírico o inicial en donde se sospecha de, un patógeno multirresistente, en la
monoterapia de numerosas infecciones intrahospitalarias graves, inclusive se han usado en
algunas de origen comunitario y en particular en la terapia dirigida contra las infecciones
producidas por bacterias gramnegativas multirresistentes o que son productoras de
betalactamasas de amplio espectro y espectro extendido. (Woodforda, 2006)
2.2.4.3 Mecanismo de acción de los carbapenémicos
De igual manera que los otros betalactámicos, muestran una mayor afinidad por las
diferentes enzimas que participan en el síntesis del peptidoglucano, la estructura primordial
en la pared celular de las bacterias. Estas enzimas son conocidas como PBPs (penicillin
binding protein) y que según la función que posean se clasifican en transglicosilasas,
transpeptidasas y carboxipeptidasas.
Cada antibiótico de tipo betalactámico presenta diferente afinidad por cada PBP. Se conoce
que en bacterias gramnegativas los carbapenémicos muestran una elevada afinidad por
PBPs que poseen alto peso molecular y la diferencia de esta afinidad es lo que determina la
capacidad antimicrobiana de cada carbapenémico. (Cordes, 2009)
2.2.3.4 Mecanismo de resistencia tipo carbapenemasas
La resistencia a antimicrobianos representa un problema de salud pública, estos
mecanismos como indicamos anteriormente pueden ser intrínsecos o adaptativos. Los
primeros pueden inducir a la bacteria para que produzca enzimas que destruyan al fármaco
antibacteriano, expresar sistemas efflux de excreción que eviten que el fármaco alcance su
blanco intracelular, modificar el sitio blanco del antimicrobiano o generar una vía
metabólica alterna que evite la acción del fármaco. Entre los mecanismos adaptativos,
encontramos las adaptaciones fenotípicas, sea por el estado metabólico de la bacteria, o por
ser secundaria a su capacidad de producir biopelículas. En esta revisión, mencionamos los
principales mecanismos relacionados con la resistencia a antimicrobianos (Gerardo
Becerra, 2009)
Las carbapenemasas son un tipo de enzimas β-lactamasas con la característica de hidrolizar
a los carbapenémicos. Estas enzimas han sido clasificadas en 2 tipos según AMBLER.
(Calvo, 2011)
21
Clase A:
En este grupo se encuentran las enzimas: SME, KPC, IMI y GES, se las ha encontrado
principalmente en enterobacterias, como Klebsiella spp como portadora del gen KPC, así
también se describe un hallazgo de A. baumannii portador del gen KPC (Robledo, 2010).
Esta enzima hidroliza no solo a carbapenémicos sino también a cefalosporinas y penicilinas
(Cercenado, 2011)
Clase B:
A este grupo pertenecen las metalo-β-lactamasas, que presentan en su sitio activo zinc
como cofactor, y se caracterizan por hidrolizar además de carbapenémicos la mayoría de
los betalactámicos a excepción de aztreonam; son ejemplos de estas enzimas (IMP, VIM,
SPM-1, GIM-1); de las cuales las enzimas VIM y IMP han sido descritas en A. baumannii.
(Calvo J. , 2011)
Clase D
A este grupo pertenecen las betalactamasas de tipo OXA, enzimas que deben su nombre
debido a su capacidad poseen de hidrolizar la isoxazolynpenicilin oxacilin (oxacilina) con
más rapidez que las penicilinas. (Opazo, 2012)
Han sido descritos varios tipos y cada uno ha ido presentando diferentes características, es
decir mediando diferente tipo de resistencia frente a los antibióticos, la OXA-1, es la
responsable de ña resistencia a los aminoglucósidos, la OXA-2, inicialmente llamada PSE
por haber sido hallada en Pseudomonas aeruginosa, y la OXA-3, presentan residencia a los
betalactámicos. La OXA-10 junto con sus variantes OXA-13, OXA-14, OXA- 16, OXA-
17, OXA-19, OXA-28; presenta resistencia a la cefotaxima, ceftriaxona aztreonam y
cefatzidima. La OXA-11, es una mutación de la OXA-10, por cambiar una glicina por un
aspartato en la posición 157, será la responsable de que la cepa se presente como
betalactamasas de espectro extendido (ESBL). (Antunes, 2014)
Las OXA que presentan resistencia a los carbapenémicos son: OXA-23, OXA-40/24,
OXA-51, OXA-58, OXA-134ª, OXA-143 y OXA-48, todas estas denominadas como
OXA-like y cada una de ellas presentan diferentes variaciones genéticas por lo que
presentaran resistencia variable en función a la mutación que presenten. Asi la OXA-23
like, un plásmido descubierto en U.K en 1985, posee alrededor de 19 variantes 5 de las
cuales son cromosómicas: OXA-23, 102,103, 105, 133, 105, 133, 134; sugiriendo que,
debido a su bajo contenido de G y C, han sido recientemente adquiridas.
Las cepas que contiene la OXA-23 se ha encontrado que son resistenes a:
oximinocefalosporinas, aminopenicilinas, piperaciclinas, oxacilina, aztreonam y
carbapenémicos, con respecto a este último, posee una mayor afinidad de hidrolizar al
imipenem que al meropenem, ertapenem o doripemen. La presencia de OXA-51 ha sido
22
usada como marcador genotípico de A. baumannii, esta fue descubierta en 1996 en
Argentina posee 95 variantes de las cuales la presencia de muchas no refleja ningún tipo de
resistencia, caso contrario sucede con la las variantes OXA-51 y OXA- 69, que presentan
baja resistencia. La OXA-24/40 descrita en España en 1997, fue descrita inicialmente en A.
baumannii, pero luego se reportó de haberla encontrado en Pseudomonas aeruginosa y
Klebsiella pneumoniae; posee 3 variantes: OXA-40, OXA-25, y OXA-26 y posee gran
capacidad de hidrolizar carbapenémicos. La OXA-58 que fue descrita en Francia en 2003,
en una cepa de A. baumannii MDR, otorga baja resistencia a los carbapenémicos y
penicilinas y no hidroliza a la cefpirome y cefalotina, preseta 3 variantes: OXA-96, OXA-
97, OXA-164. La OXA-143, descrita en Brasil, estimula una baja resitencia a
carbapenémicos y ha sido hallada no solo en A. baumannii sino también en A. pittii
(Evans, 2014)
Existen otros tipos de carbapenemasa de tipo OXA que presentan resistencia a los
carbapenémicos y que han sido descritos en otros tipos de A. y que han sido encontrados en
muy pocas ocasiones, así tenemos a la OXA-134a
descrita en A. iwoffi, la OXA-211 en A.
johnsonii. OXA-213 en A. calcoaceticus, OXA-214 en A. haemoliticus, OXA-213 en A.
bereziniae. (Evans, 2014). El mecanismo por el cual actúan las carbapenemasas tipo OXA,
que dependiendo del tipo que esta sea, es mediante la formación de un puente hidrofóbico
entre el sitio activo y la hendidura de la enzima, como en el caso de la OXA-23 una
duplicación de una alanina en la posición 220 dentro del B5 y B-6 loop de la enzima,
provoca la salida de la metionina 221 y evitando en enganche del carbapenémico al blanco
(Smith, 2013).
2.2.4.5 Técnicas de identificación de mecanismos de resistencia
Ácido etilendiamintetraacético (EDTA)/ácido tioglicólico (SMA)
Esta técnica está basada en que las metalo-betalactamas (MBL) necesitan como cofactor en
la reacción iones metálicos como el Zn+2, por lo que el EDTA al ser un agente quelante
que posee la capacidad de atrapar estos iones metálicos y por consiguiente inhibe la acción
de la enzima, por lo que en esta prueba se utiliza el EDTA/SMA como inhibidor de MBL
Para este procedimiento se utiliza una placa de agar Müeller-Hinton, esta placa es sembrada
con una suspensión bacteriana estandarizada a 0,5 McFarland, luego se deberá colocar un
disco de papel Whatman Nº 6, papel filtro con un diámetro de 9mm en la placa y se
impregnará con 6µl de EDTA/SMA, luego de esto se colocarán a cada lado del disco de
EDTA/SMA un disco de IPM y MEM a una distancia de 15 mm centro-centro o 20 mm de
23
borde a borde. Una vez colocados los discos, se deberá incubar la placa a 35±2°C de 18 a
24h. (Gallego, 2004)
Después de la incubación se procederá a realizar la lectura de la prueba, considerándola
positiva cuando se observa una ampliación o distorsión que sería un efecto sinérgico entre
los discos de imipenem y meropenem con el disco de EDTA/SMA.
Mediante los Puntos de corte de “Clinical & Laboratory Standards Institute”
CLSI Guidelines 2015
Tabla N° 2.3. Puntos de Corte según CLSI
Agente
antimicrobiano
Contenido
del Disco
Criterio de
Interpretación
Zona de diámetro
(mm)
Criterio de
Interpretación MIC
(μg/mL)
S I R S I R
Doripenem 10 μg ≥ 18 15-17 ≤ 14 ≤ 2 4 ≥ 8
Imipenem 10 μg ≥ 22 19-21 ≤ 18 ≤ 2 4 ≥ 8
Meropenem 10 μg ≥ 18 15-17 ≤ 14 ≤ 2 4 ≥ 8
(CLSI, 2015)
Mediante Carba NP
RAPIDEC CARBA NP es un método de detección rápida, que se usa en la detección de
bacilos gramnegativos que sean productores de carbapenemasas como: Enterobacterias,
Pseudomonas aeruginosas y A. baumannii.
Está basada en la detección de la hidrólisis del carbapenémico producido por bacterias que
sean productoras de carbapenemasas. Cuando la hidrolisis es positiva, esta acidifica el
medio lo que provoca un cambio de color en el indicador de pH (rojo fenol).
Luego de la lisis bacteriana, añadiremos la solución de detección que contiene:
Carbapenémico: Imipenem
Rojo fenol
Zinc
Luego de la incubación de aproximadamente dos horas, se realiza la lectura de la prueba
comparando los pocillos que contiene imipenen con un blanco, que no lo tenga. (Lee, 2014)
Pruebas fenotípicas para determinar carbapenemasas tipo OXA.
24
Solamente existe una prueba fenotípica, pero se limita a la detección de la
betalactamasas tipo OXA-1. Cuando una cepa es portadora de betalactamasas tipo
OXA-1, presenta resistencia aminopenicilinas, carbooxipenicilinas y ureidopenicilinas
y con respecto a la amoxicilina-ácido clavulanio (AMC), ampicilina-sulbactam y
piperaciclina, presenta sensibilidad disminuida. La característica fenotípica más
representativa de la OXA-1, es la sinergia entre AMC y cefepime, debido a que se a la
actividad de la amoxicilina-ácido clavulánico y la reducida sensibilidad del cefepime.
Mediante técnicas moleculares.
En cuanto a técnicas moleculares, tenemos la detección de genes productores de
carbapenemasas, es así que se podrá determinar el tipo de carbapenemasa cuando mediante
una PCR , usando cebadores específicos, logrando así amplificar un gen especifico.
Además, se tiene que para la detección de carbapenemasas del tipo metalo-betalactamasa
de podrá identificar tipos como NDM, VIM, IMP, entre otros y de manera análoga usando
cebadores específicos para amplificar genes tipo oxacilinasa como es el caso de la OXA 23,
51, 24/40, 58, 143 entre otras variantes, o cualquier tipo de carbapenemasa anteriormente
descrita. (Walther-Rasmussen, 2006)
2.2.5 Técnicas moleculares de identificación y determinación de clonalidad bacteriana
en A. baumannii
2.2.5.1 Identificación de A. baumannii-complex
Reacción en cadena de la polimerasa.
La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) amplifica secuencias específicas
de ADN, permitiendo así la detección de las mismas.
El ADN de la muestra biológica en la que se pretende determinar existencia o ausencia del
gen de interés; es inicialmente desnaturalizado por calentamiento a 92-95 0C. A
continuación, estos oligonucleótidos sintéticos (primers) se unen, a temperaturas de 45-
600C, a las correspondientes secuencias complementarias de las cadenas del ADN
desnaturalizado; estas secuencias complementarias de los iniciadores están en los extremos
del fragmento del ADN que se desea amplificar.
Por último, a una temperatura de 72 0C y en presencia de deoxinucleótidos, una ADN-
polimerasa termoestable extiende cada iniciador por su extremo 3', de modo que se crean
dos cadenas de ADN, complementarias de las originales, que contienen las secuencias de
nucleótidos del fragmento de ADN que se quiere amplificar.
25
Para que se produzca este fenómeno, las secuencias complementarias de los iniciadores
tienen que estar relativamente cerca una de otra, a una distancia de 2 kilobases ó menos. El
resultado de este primer ciclo de amplificación es así, la duplicación del fragmento de ADN
de interés. Mediante la repetición secuencial de este proceso se pueden crear millones de
copias del fragmento de ADN de interés. (Farre, 1997)
Identificación del OXA-51
Dentro del grupo de las oxacilinasas, se encuentra codificado el gen que sintetiza la
oxacilinasa 51, gen que se encuentra en un cromosoma, es decir será propio de su especie.
Este factor ha sido usado ampliamente para desarrollar determinaciones usando PCR con
primers específicos para este gen, teniendo en cuenta que existe un mínimo porcentaje que
posee este gen. (Vos, 2016)
Identificación de genes tRNA.
La determinación mediante la huella de tDNA usa primers diseñados para amplificar
regiones de tDNA grupales, por lo que amplificará diferentes perfiles de las diferentes
especies, esta técnica es rápida, simple y fácil para la identificación a nivel de especie, sin
embargo este método tiene la desventaja de no discriminar entre algunas especies como es
el caso entre A. baumannii y spp. (Sevillano E. , 2011)
Identificación de gyrB
Existen sistemas comerciales de identificación como el API 20NE, Vitek 2, Phoenix y
MicroScan Walk-Away, para identificar la bacteria a nivel de especie, pero algunas
ocasiones estos no son aptos para diferenciar entre grupos del mismo complejo.
Para resolver este problema se usa una PCR multiplex, basada en la heterogeneidad del gen
gyrB, que se presenta con patrones de bandas diferentes, permitiendo así la distinción entre
estas especies. (Sevillano, 2011)
2.2.5.2 Técnicas moleculares determinación de brote epidemiológico o clonalidad
Diversas técnicas de tipificación pueden ser usadas en la determinación del origen y
diseminación de brotes infecciosos y así poder establecer su mecanismo de infección. Estas
técnicas son útiles para el estudio de evolución de la infección a lo largo del tiempo y
evaluar un tratamiento eficaz y observar como este puede estar influenciado por los niveles
de resistencia del microrganismo y la respuesta inmune del paciente.
Para escoger la técnica más apropiada de tipificación debemos tomar en cuenta ciertos
parámetros como son: tipificabilidad del microorganismo, reproducibilidad de resultados,
26
capacidad discriminatoria y posibilidad de estandarización, sin olvidar también el factor
costo. (Horcajada, 2013)
Algunas técnicas fenotípicas que han sido desarrolladas tales como biotyping, serotping,
tipificación por antibiogramas o tipificación de proteínas, poseen algunas desventajas como
bajo poder discriminatorio y baja reproducibilidad debido por ejemplo, algunas aislados no
pueden ser tipificados en función de su expresión fenotípica.
Los métodos de caracterización genotípica incluyen algunas ventajas sobre los métodos
fenotípicos, incluyendo la rapidez para obtener los resultados y una mejor sensibilidad y
especificidad. Además, los resultados no dependen de la expresión fenotípica.
Algunos métodos de tipificación genotípica han sido desarrollados usando enzimas de
restricción, otros usan reacción en cadena de la polimerasa o el análisis secuencial de
plásmidos o ADN. (Sevillano, 2011)
2.2.5.3 Análisis de plásmidos
Los plásmidos cadenas de ADN extracromosómico, que llegan a constituir
aproximadamente entre el 1% y >10% del genoma de la mayoría de bacterias. Estas se
replican dentro de la matriz celular de forma independiente y que, como se sabes la
información contenida en estos no es de importancia para la viabilidad de la bacteria, pero
si para la expresión de resistencia hacia diferentes antibióticos o factores de virulencia.
Los plásmidos pueden ser clasificados según sus características, algunas de estas con
relevancia epidemiológica como es: tamaño, su presencia en una o varias especies y
géneros, número de duplicados por bacteria, capacidad de transferirse por conjugación y
grupo de discrepancia.
Desde su descubrimiento, el número de plásmidos por bacteria ha sido usado como
marcador fenotípico. En la actualidad es poco usado y su análisis se enfocado en determinar
su transmisibilidad de los genes que poseen y ahí es donde radica su valor epidemiológico.
(Emilia, 2008)
2.2.5.4 Análisis del ADN mediante amplificación mediante PCR.
En los últimos años has sido diseñadas técnicas que se basan en reacciones de
amplificación de ADN bacteriano, principalmente la de PCR esta técnica ha sido
ampliamente utilizadas para la tipificación bacteriana.
Para esta técnica se ha definido, tres grupos dependiendo los cebadores usados así, se tiene:
27
a. Cuando los cebadores son arbitrarios o con cierta especificidad, y se amplifican
regiones del genoma que se encuentran entre dos cebadores contiguos, y estos se
encuentran separados por una distancia que no es mayor a la que la Taq polimerasa
está en capacidad de amplificas. Estas variantes suelen dar patrones de
amplificación constituidos por un número variable de bandas de ADN
b. Otras variantes son en las que en las que previa o posterior a la amplificación
génica, el producto es sometido a digestión con enzimas de restricción.
c. También están aquellas que amplifican regiones internas de ciertos genes y que
posterior a esto serán sometidos a procesos de secuenciación (Sung, 2012)
El análisis de ADN ha sido ampliamente usado para la genotipificacion. Las diferentes
técnicas desarrolladas están basadas en el uso de diferentes cebadores. Así según el tipo de
cebador usado serán:
PCR con primers arbitrarios o secuencias repetitivas del genoma bacteriano:
MAAP (multiple arbitrary amplicon profiling), que incluye técnicas como:
AP-PCR (arbitrary primed-PCR)
RAPD (random amplification of polymorphic DNA),
DAF-PCR (DNA amplification fingerprinting).
En el caso de A. baumannii complex tenemos que las técnicas:
M13 or AP3
ERIC 2 (enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase)
REP-PCR (repetitive extragenic palindrome sequence-based PCR) usando primers
REP1 y REP2. (Paul, 2012)
REP-PCR (repetitive extragenic palindrome sequence-based PCR)
En cuanto a A. baumannii-complex la técnica más usada para análisis epidemiológicos se
encuentra la REP-PCR que utiliza cebadores cuya secuencia ha sido diseñada en función de
las secuencias cromosómicas repetidas. Estas secuencias se encuentran presentes en
diferentes localizaciones en todo lo largo del cromosoma bacteriano.
Cuando dos secuencias se encuentran localizadas lo bastantemente cerca, el fragmento de
ADN que se halla entre ambas es amplificado. Debido a que el número y localización de
estas secuencias repetidas entre cepas varia, el número y tamaño de los fragmentos de ADN
generados también variará. (Luis, 2004)
28
2.2.5.5 Electroforesis de campos pulsados (PFGE)
Esta técnica es el estándar de oro para la huella de ADN, este método permite la separación
de moléculas de ADN muy grandes mediante el uso un gradiente de voltaje alternante que
es periódicamente cambiando en tres direcciones diferentes.
Una suspensión bacteriana que se encuentra embebida en plugs de agarosa y luego tratada
con enzimas permitirá la digestión de la pared celular y proteínas dejando el ADN intacto
en el plug de agarosa, luego –se usa una enzima de digestión para cortar el ADN, en A.
Baumannii-complex se usa ApaI; estos plugs son cargados en el gel de agarosa para la
electroforesis con intervalos de 5-35 segundos por 30 horas aproximadamente. El gel
resultante se lo tiñe con suber Green y se lo revels en cámara con luz UV. (Seifert, 2005)
2.2.5.6 Análisis de ADN por secuenciación: Multilocus Sequence Typing (MLST).
Esta es una técnica desarrollada y diseñada específicamente para la identificación de
clones o líneas clonales en poblaciones bacterianas. Este es un marcador molecular que se
utiliza a largo plazo para la identificación de grupos poblacionales con independencia de
pequeñas variaciones que puedan surgir por razones geográficas o relacionadas al tiempo.
En ocasiones ha sido usado para determinar cuestiones en epidemiología local o a corto
plazo como son: la caracterización de brotes, diferenciación de recidivas, reinfecciones o
fallos terapéuticos.
El método se basa en el análisis de isoenzimas (multilocus enzyme electrophoresis -
MLEE), en el que se analiza la movilidad electroforética de determinado número de
enzimas en particular, que generalmente son de entre 15 y 20, estas enzimas metabólicas
son analizadas en geles de almidón o poliacrilamida. Las diferentes variaciones observadas
en mencionadas movilidades se corresponden con variaciones en el locus o gen codificante
de cada enzima.
Cada variante es definida como “variante alélica” y los diferentes alelos de cada uno de los
genes conforman el perfil alélico que a su vez define el tipo electroforético. (Horcajada,
2013)
2. 3 Fundamentación legal
Basado en el Objetivo 4.6 del Plan Nacional del Buen Vivir 2013-2017 que establece
“Impulsar la formación de talento humano para la innovación social, la investigación básica
y aplicada en áreas de producción priorizadas, así como la resolución de problemas
nacionales, incentivando la articulación de redes de investigación e innovación con criterios
29
de aprendizaje incluyente”. Se ha dado paso al desarrollo del presente trabajo de
investigación por parte de la estudiante John Sucuy de la Universidad Central del Ecuador,
en el Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública, previo un acuerdo de
entendimiento por parte de las Instituciones involucradas en la investigación como son: el
Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública, representado por el Dr. Jorge A.
Reyes, en su carácter de Jefe del área de Microbiología, y, la Universidad Central del
Ecuador, representado por el Dr. Wilmer Narváez, Director de la carrera de Bioquímica
Clínica, y, por la otra parte, John Hernán Sucuy Lalón, en lo sucesivo denominada
"TESISTA”
Como lo plantea la Resolución Nro. MSP-INSPI-2015-0019-RES, el 17 de marzo del 2015,
en la ciudad de Guayaquil:
La Dirección Ejecutiva del Ministerio de Salud Pública considerando que, el objetivo 4 del
Plan Nacional del Buen Vivir "2013-2017" establece "fortalecer las capacidades y
potencialidades de la ciudadanía", para la construcción del estado democrático, requiere
fortalecer el rol del conocimiento promoviendo la investigación científica y tecnológica
siendo responsables con la sociedad y la naturaleza.
Que, de acuerdo al objetivo estratégico 3 del Estatuto Orgánico de Gestión Organizacional
por procesos del INSPI dispone Transferir y difundir los resultados y productos de la
investigación y desarrollo tecnológico generados en el instituto.
2.4 Hipótesis
2.4.1 Hi
Las cepas de A. baumannii-complex aisladas en una casa de salud presentan genes de
resistencia a los carbapenémicos de tipo OXA y poseen relación clonal entre sí.
2.4.2 Ho
Las cepas de A. baumannii-complex aisladas en una casa de salud no presentan genes de
resistencia a los carbapenémicos de tipo OXA y pertenecen a grupos clonales distintos.
30
CAPÍTULO III
3. MARCO METODOLÓGICO
3.1 Diseño de la investigación
La presente investigación es de tipo observacional, longitudinal y explicativo, ya que estará
enfocado a medir las variables que serán: la relación genética, de las cepas aisladas, entre sí
y presencia o ausencia de genes en un determinado periodo de tiempo.
3.1.1 Enfoque de la investigación
El presente proyecto de investigación tiene un enfoque cualitativo ya que se evaluará la
presencia, es decir se determinará la presencia o ausencia de determinados genes y la
relación clonal entre sí.
Se analizarán los resultados, se los relacionará tomando en cuenta el origen de la muestra y
el servicio de donde se obtuvo, comparándolos con la presencia de genes de resistencia y si
entre estos existe relación genética.
3.1.2 Nivel de investigación
Al ser un estudio de enfoque cualitativo, el nivel de estudio será explicativo ya que
determinaremos si existe relación causal, entre la resistencia a los carbapenémicos en A.
baumannii-complex por la presencia de genes tipo OXA.
3.1.3 Tipo de investigación
La investigación que realizaremos por la clase de objetivos planteados es de tipo aplicada
debido a que se propone resolver problemas específicos y concretos, mediante el uso de
técnicas fenotípicas y moleculares, que son consideradas como el estándar de oro en este
tipo de investigaciones.
Por la fuente de datos citados como tipo de muestra u origen es un estudio documental ya
que se tomará datos particulares de los pacientes, así como de sus respectivas historias
clínicas.
31
3.2 Población y Muestra / Métodos y Materiales
3.2.1 Muestra
Se utilizaron 29 cepas de A. baumannii-complex. Las cuales se encontraban registradas en
el Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública (INSPI-Quito) provenientes de una
casa de salud de la provincia de Pichincha, del año 2015. Dichas cepas fueron catalogadas
por la casa de salud como posibles IAAS, información que no pudo ser corroborada debido
a información faltante.
3.2.2 Insumos
3.2.2.1 Materiales
Cajas Petri
Matraces Erlenmeyer
Mechero
Papel aluminio
Micropipetas
Asas
Regla
Tubos Eppendorf
Material biológico: Cepas de A.baumannii-complex.
3.2.2.2 Equipos
Incubadoras (Binder)
Vórtex (Fisher)
Refrigeradora
Centrifugadora (Jouan)
Termomixer (Confort)
Autoclave
Densitómetro (DensiCHEK plus)
Termociclador (BioRad)
Cámara de electroforesis
Cámara de luz UV para revelación del gel (BioRad)
Cámara de Flujo (LabConco)
32
3.2.2.3 Reactivos
Medios de cultivo (Oxoid)
Agarosa (Promega)
Discos de antibiótico (Oxoid)
Agua destilada
GoTaq
Marcador de peso molecular: Ladder (100pb)
Agente intercalante: SYBR Green y/o bromuro de etidio
Buffer: TAE 1X
3.3Matriz de operacionalización de variables
Tabla N° 3.1. Variables e indicadores
VARIABLE DEFINICIÓN DIMENSIÓN INDICADOR ESCALA
Fenotipo o perfil de
sensibilidad
Susceptibilidad
de bacterias
contra agentes
antimicrobianos
in vitro
Realizado en
agar por el
método de Kirby
Bauer, difusión
de disco de
antibiótico
Presencia de
halo o zona de
inhibición
Diámetro del halo,
en mm, establecido
para cada
antibiótico por el
CLSI 2015
Identificación de A.
baumannii-complex
Determinar si el
aislado es una
cepa de A.
baumannii-
complex.
Mediante
pruebas
bioquímicas
Reacción
positiva o
negativa en
pruebas
bioquímicas
No fermentador
Citrato+
Lisinia +
Urea –
Malonato –
Moltilidad –
Rojo de Metilo –
Oxidasa +
Tipificación
molecular por
PCR
OXA 51
Bandas de los
segmentos de
los genes
amplificados
Similitud entre las
bandas de las
cepas control y de
la muestra
Identificación de
genes de resistencia a
carbapenémicos
Presencia de
genes tipo OXA
Amplificación
por PCR
Bandas de los
segmentos de
los genes
amplificados
Similitud entre las
bandas de las
cepas control y de
la muestra
Determinación de un
brote
epidemiológico.
Identificación de
relación clonal
Amplificación de
secuencias
palindrómicas
extragénicas
repetitivas
Amplificación
por REP-PCR
Bandas de los
segmentos
amplificados,
típicos de cada
cepa
Similitud entre
bandas
amplificadas
(Sucuy J.)
33
3.4 Técnicas e instrumentos de recolección de datos
3.4.1 Aislamiento e identificación
Todos los datos clínicos obtenidos fueron guardados en la base de datos del área de
microbiología del Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública.
Los aislados se consiguieron en el mismo lugar, la identificación se la realizó mediante el
uso de una batería de pruebas bioquímicas que constó de citrato, lisina, urea, malonato, rojo
de metilo y oxidasa.
Los datos obtenidos se archivarán en el programa de Microsoft Excel y en el software
WHONET.
3.4.2 Perfil de susceptibilidad
Los resultados de las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana se obtuvieron mediante el
uso de un antibiograma, método de Kirby- Bauer, es decir método de difusión de disco y
también el equipo automatizado VITEK. Los datos obtenidos a partir de este se archivaron
en el programa de Microsoft Excel y en el software WHONET, con los respectivos puntos
de corte recomendados por el CLSI 2015.
3.5 Técnica de procesamiento y análisis de datos
3.5.1 Aislamiento e identificación
Las cepas utilizadas en este estudio fueron aislados a partir del medio de preservación del
cepareo del INSPI-Q. La identificación se realizó mediante el uso de una batería completa y
utilizando colonias de 24 horas.
3.5.2 Ensayos de susceptibilidad por difusión de disco
Inicialmente se preparó una suspensión de la bacteria de 24h a partir de la siembra la cual
fue aislada en medio Agar sangre de cordero al 5%, se preparó la suspensión en solución
salina obteniéndose una concentración de bacterias equivalente a 0.5 en la escala
McFarland, que fueron medidas en un densitómetro. (CLSI, 2015).
Se utilizaron antibióticos recomendados por el CLSI 2015 y otros estudios de
susceptibilidad. La disposición de los discos se observa en la Figura N°3.1, en donde
constan: carbapenémicos: imipenem (IPM), meropenem (MEM), situados junto a un disco
impregnado con EDTA para la determinación de metalo-betalactamasas; cefalosporina de
tercera y cuarta generación ceftazidima (CAZ) y cefepime (FEP) respectivamente, en la
34
mitad de estos se ubica un disco de ampicilina sulbactam (SAM), esto para la observación
de betalactamasas de espectro extendido (BLEE). Aminoglucósidos como amikacina (AK)
y gentamicina (CN), Quinolonas de segunda generación: ácido nalidíxico (NA) y tercera
generación ciprofloxacina (CIP) y fluoroquinolonas levofloxacino (LEV), trimetoprim
sulfametoxazol (SXT) y una glicylciclina tigeciclina (TGC).
CAJA PETRI N°1 CAJA PETRI N°2
Figura N° 3.1. Esquema de colocación de discos en agar Müeller Hinton. RelaVra
2014. Distancia entre discos: 2cm (Distancia óptima para observar sinergia)
(Sucuy J.)
3.5.3 Extracción de ADN
La extracción del ADN se realizó mediante la técnica de choque térmico, formando una
suspensión a partir de colonias aisladas de A. baumanni-complex en 500 μL de agua Tris-
EDTA (TE) previamente esterilizado, luego se lo mantuvo a 95°C por 10 minutos, en un
baño térmico. El tubo ependorff resultante se lo centrifugó por 1 minuto a 14000 rpm, y el
sobrenadante con el ADN se separó en otro tubo ependorff estéril.
Como resultado final se obtuvo aproximadamente 500 µL de una solución de T.E.
conteniendo material genético de este se usó 1 µL para los ensayos de PCR en la
determinación de carbapenemasas tipo OXA y 2 µL para los ensayos de REP-PCR. El
ADN restante se almacenó a -70ºC.
35
3.5.4 Determinación de genes Tipo OXA
En la determinación, se utilizaron dos PCR multiplex con la finalidad de que los pesos
moleculares de las secuencias de los genes tipo OXA se encuentren a una distancia
prudente y puedan ser visibles en la etapa de revelar el gel. Los primers usados en la
multiplex 1 y 2 se detallan en la Tabla N°3.2, las multiplex se exponen en los tablas Tabla
N°3.3 y Tabla N°3.4.
Tabla N° 3.2. Primers forward y reverse, genes tipo OXA
OXA Longitud (bp) Secuencia 5′–3′ Tamaño del
Amplicon (bp)
A. baumannii oxa-23 Oxa-23-like-F GATCGGATTGGAGAACCAGA 501 pb
oxa-23 Oxa-23-like-R ATTTCTGACCGCATTTCCAT
A. baumannii oxa-40 OXA-24-like-F GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA 246 pb
oxa-40 OXA-24-like-R AGTTGAGCGAAAAGGGGATT
A. baumannii oxa-51 Oxa-51-like-F TAATGCTTTGATCGGCCTTG 353 pb
oxa-51 Oxa-51-like-R TGGATTGCACTTCATCTTGG
A. baumannii oxa-58 Oxa-58-like-F AAGTATTGGGGCTTGTGCTG 599 pb
oxa-58 Oxa-58-like-R CCCCTCTGCGCTCTACATAC
A. baumannii oxa-143 OXA-143-F TTCTGTCAGTGCATGCTCATC 728 pb
oxa-143 OXA-143-R CAGGCATTCCTTGCTTCATT
(Mostachio, 2009) (Opazo, 2012) (Opazo-Capurro, 2014)
Tabla N° 3.3. Multiplex 1
Reactivo Concentración Volumen
1 GoTaq 2x 14 µl
2 Agua --- 7 µl
3 Primer oxa 23 - F 10 uM 0.5 µl
4 Primer oxa 23 - R 10 uM 0.5 µl
5 Primer oxa 51 - F 10 uM 0.5 µl
6 Primer oxa 51 - R 10 uM 0.5 µl
7 Primer oxa 24 - F 10 uM 0.5 µl
8 Primer oxa 24 - R 10 uM 0.5 µl
9 ADN >30 ug/ul 1 µl
(Sucuy J.)
36
Tabla N° 3.4. Multiplex 2
Reactivo Concentración Volumen
1 GoTaq 2x 14 µl
2 Agua --- 7 µl
3 Primer oxa 40 – F 10 uM 0.5 µl
4 Primer oxa 40 – R 10 uM 0.5 µl
5 Primer oxa 143 – F 10 uM 0.5 µl
6 Primer oxa 143 – R 10 uM 0.5 µl
9 ADN >30 ug/ul 1 µl
(Sucuy J.)
El protocolo para el termociclador se detalla en la Tabla 3.5.
Tabla N° 3.5. Programa del Termociclador
(Sucuy J.)
3.5.5 Determinación de relación clonal mediante REP-PCR
En la determinación elementos palindrómicos repetitivos (REP-PCR) de los aislados, se
usaron cebadores o primers citados en diferentes estudios de clonalidad. (Higgins, 2012)
(Tomas d. M., 2005) Las secuencias se presentan en la Tabla 3.6.
Tabla N° 3.6. Secuencia de Cebadores (REP-PCR)
Primer Longitud (bp) Secuencia 5′–3′
REP 1 5`IIIICGICGICATCIGGC 3`
REP 2 5` ICGICTTATCIGGCCTAC 3`
(Higgins, 2012)
Etapa Temperatura Tiempo
Denaturación inicial 94°C 5 minutos
34 ciclos Denaturación 94°C 30 segundos
Hibridación 53°C 50 segundos
Extensión 72°C 60 segundos
Extensión final 72°C 6 minutos
Conservación 4°C ∞
37
Las características del protocolo que se usó y de la programación del termociclador se
especifican en la Tabla 3.7 y Tabla 3.8 respectivamente. Los amplicones resultantes serán
analizados en cámara UV.
Tabla N° 3.7. Protocolo REP-PCR
Reactivo Concentración Volumen
1 GoTaq 2x 17 µl
2 Agua --- 7 µl
3 Primer 1 10 uM 2 µl
4 Primer 2 10 uM 2 µl
5 MgCl 5 uM 4 µl
6 ADN >30 ug/ul 2 µl
(Sucuy J.)
Tabla N° 3.8. Programa Termociclador
(Sucuy J.)
3.6 Análisis estadístico
Los datos obtenidos a partir del estudio microbiológico y molecular, fueron evaluados
mediante es calculo estadístico porcentaje, de donde se obtendrán datos de presencia o
ausencia de genes en el total de aislados.
(Sucuy J.)
3.6.1 Interpretación de resultados
Las interpretaciones de resultados se hicieron en base a los porcentajes de similitud
obtenidos, se usarán gráficos para presentar los porcentajes obtenidos y de la misma manera
se relacionará con las variables de estudio, como son origen de muestra y servicio de cual
se obtuvo, se usará el software Bionumerics para el análisis de los dendogramas obtenidos.
Etapa Temperatura Tiempo
Denaturación inicial 94°C 10 minutos
30 ciclos Denaturación 94°C 1 minutos
Hibridación 47,5°C 1 minutos
Extensión 72°C 2 minutos
Extensión final 72°C 16 minutos
Conservación 4°C ∞
38
Figura N° 4.1 Muestras según servicio hospitalario
CAPÍTULO IV
4 ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1 Resultados
4.1.1 Muestras clínicas donde se aisló A. baumannii-complex.
Se seleccionaron 29 cepas de A. baumannii-complex, que fueron remitidas al Centro de
Referencia Nacional de Resistencia a los Antimicrobianos del Instituto Nacional en Salud
Publica e Investigación (INSPI) provenientes de diferentes servicios de la casa de salud.
Figura N° 4.1.
Descripción: UCI: Unidad de cuidados intensivos; U. Quemados: Unidad de quemados;
Med. Interna: Medicina Interna; Cirugía Gnrl: Cirugía general. (Sucuy
J.)
La edad de los pacientes
osciló, en orden de mayor a menor número de aislados, entre 30 y 60 años 15 aislados
(51,7%), menores de 30 años 8 aislados (27,6%) y mayores de 60 años 6 aislados (20,7%).
Figura N° 4.2.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
UCI U.Quemados Emergencias Traumatologia Med. Interna Neurocirugia Cirugia Gnrl.
39
Figura N° 4.2 Relación entre aislados y grupo etario. (Sucuy J.)
UCI fue el servicio hospitalario de donde se obtuvieron más aislados. El tipo de muestra
invasiva más habitual fue de aspirado traqueal con un 44,8% (13/29), seguida de muestras
de sangre 27,6% (8/29), y secreción de herida 20,1% (6/29) respectivamente Tabla N° 4.1.
Tabla N° 4.1. Muestras clínica según el servicio hospitalario.
(Sucuy J)
52%
27%
21% 30-60 años
Menor 30 años
Mayor 60 años
Servicio No Aspirado
traqueal
Sangre Herida Liq.
Ascítico
Esputo
UCI 18 11 5 1 1
U. Quemados 2 2
Emergencias 2 1 1
Traumatología 2 2
Med. Interna 2 1 1
Neurocirugía 2 1 1
Cirugía Gnrl. 1 1
40
Tabla N° 4.2. Porcentaje de resistencia a los antibióticos en A. baumannii-complex
TIPO ANTIBIÓTICO R(%) I(%) S(%)
Carbapenémico Imipenem 100 - -
Carbapenémico Meropenem 100 - -
Cefalosporina 3era G Ceftazidima 13,8 62,1 3,4
Cefalosporina 4ta G Cefepime 93,1 3,45 3,45
Inhibidor de betalactamasas Ampicilina Sulbactan 93,1 - 6,9
Aminoglucósidos Amikacina 90 3,1 6,9
Aminoglucósidos Gentamicina 93,1 - 6,9
Quinolona 2era G Ciprofloxacino 93,1 - 6,9
Fluoroquinolona 3era G Levofloxacin 93,1 3,45 3,45
Inhibidores de folato Trimetoprim/Sulfametoxaol 93,1 - 6,9
Glicilciclina Tigeciclina - 55,2 49,8
(Sucuy J)
Los aislados evaluados, presentaron resistencia a las carbapenémicos en un 100%, a las
quinolonas mostraron resistencia 93,1% y de manera similar fueron los resultados a los
inhibidores de betalactámicos y una reducida resistencia de 13% a las cefalosporinas de
tercera generación, pero presentando un elevado porcentaje de sensibilidad intermedia
(62,1%) Tabla N° 4.2
Con respecto a la Tigeciclina no hubo cepas resistentes solamente cepas intermedias y
sensibles en porcentajes de 55,2% y 49,8% respectivamente, tomando puntos de corte para
enterobacterias según la FDA (Fud and Drug Administration).
Se presentaron 4 perfiles de resistencia, en el que el mayor número de aislados corresponde
a secreciones traqueales resistente a carbapenémicos, inhibidores de betalactámicos,
cafalosporinas de tercera generación y aminoglucósidos. Tabla N° 4.3
Tabla N° 4.3. Perfiles de resistencia a los antimicrobianos en A. baumannii-complex.
Perfil N° Sec.
Traqueal
Sangre Herida Liq.
Ascítico
Esputo
IMI, MERO 1 1
IMI, MERO, SAM 1 1
IMI, MERO, SAM, FEP, AK,
GEN, CIP, LEV, STX
24 11 6 6 1
IMI, MERO, SAM, FEP, CAZ
AK, GEN, CIP, LEV, STX
3 1 1 1
41
Descripción: SAM:ampicilina-sulbactam, IMI: imipenem, MERO:meropenem,
FEP:cefepime, AK:amikacina, GEN:gentamicina, CAZ:ceftazidima, CIP: ciprofloxacin,
LEV: levofloxacion, STX: trimetoprim-sulfametoxazol. (Sucuy J)
4.1.2 Carbapenemasas tipo OXA en A. baumannii-complex
Las muestras clínicas en las que se evaluó la presencia de genes tipo OXA, dieron como
resultado la presencia del gen OXA-51 en 28 muestras (96,6%) y el gen OXA-23 en 27
muestras (93,1%). Los resultados para los genes tipo OXA 24, 58, y 143 fueron negativos.
Figura N° 4.3
Figura N° 4.3. Electroforesis. Genes Tipo OXA en muestras clínicas (Sucuy J.)
4.1.3 Reacción en cadena de la polimerasa de elementos palindrómicos
extragénicos repetitivos.
Los resultados mediante la REP-PCR, fueron analizados mediante el software Bionumerics,
usado en la interpretación y construcción del respectivo dendograma
100 pb
200 pb
300 pb
OX
A-2
3
OX
A-2
4
OX
A-5
1
501 pb
224 pb
353 pb
Identificación de los aislados
Control +
42
Figura N° 4.3 DENDOGRAMA REP-PCR
MIC (ug/ml)
>8 >=16
>=16
>=16
>=32
>=16
D
E
A
D
B
D
C
D
>8
>8
>8
>=16
>=16
>=16
>=16
>=16
>8
>8
F
43
TABLA N° 4.4 Distribución clonal entre servicio hospitalario y meses
Descripción: Clon A; Clon B; Clon C, Clon D, Clon E, Clon F
En el dendograma obtenido, se agruparon 17 cepas en 6 grupos clonales, cada grupo clonal
consta de tres cepas y solamente un grupo consta de dos, las restantes 12 cepas resultaron
diferentes una de otra.
En el grupo A los aislados obtenidos fueron 2, en el mes de mayo en neurocirugía (sangre)
y emergencia (secreción traqueal) con un porcentaje de similitud del 100% y una en el mes
de septiembre en emergencia (secreción traqueal) relacionada con las dos cepas anteriores
en un 80%.
En el grupo B los aislados fueron obtenidos, 2 en el mes de enero con una relación del
100% y 1 en el marzo todas muestras de UCI (secreción traqueal y secreción de herida).
Esta última relacionados en un 92,6%.
El grupo C conformado por 2 aislados del mes de agosto, provenientes de UCI (secreción
traqueal) y una de julio del área de traumatología (secreción de herida), con un porcentaje
de similitud del 100%.
Enero Febrero Marzo Abril Mayo Junio Julio Agosto Septiembre Octubre Noviembre Diciembre
UCI
U. Quemados
Emergencia
Traumatología
Med. Interna
Neurocirugía
Cirugía Gral.
44
El grupo D los aislados provienen, una del mes de enero del área de medicina interna
(esputo) y 2 del mes de junio del área de UCI (sangre y secreción traqueal). Estas dos
últimas relacionadas en un 100%; y con la primera en 83,8%.
En el grupo E, todas los aislados son del mes de julio, provienen del UCI (secreción
traqueal), con una similitud del 100%.
El grupo F conformado por un aislado del mes de febrero proveniente de unidad de
quemados (secreción de herida) y 2 del mes de julio de neurocirugía y traumatología
(sangre y secreción de herida, respectivamente). Encontrándose una similitud del 95,2%
entre una muestra del mes de febrero y julio; y estas dos relacionándose en 87,1% con la
otra muestra de julio.
Las cepas restantes mostraron un porcentaje de similitud inferior al 80%, por lo que no
fueron incluidas en ninguno de los grupos como clones.
4.2 Discusión
A. baumannii-complex es un cocobacilo no fermentador, Gram negativo. Comúnmente
encontrado en fuentes ambientales: objetos de uso común, agua o suelos. Se presenta a
forma de microorganismo comensal pero posee gran capacidad de producir infecciones en
pacientes hospitalizados (IAAS) pudiendo ocasionar múltiples tipos de infecciones
intrahospitalarias entre las principales, y más comunes, son causantes de neumonías,
bacteriemias, o meningitis secundaria. Presenta resistencia intrínseca mediada por una
cefalosporinasa (ACDC) y la carbapenemasa tipo OXA-51 y resistencia adquirida
principalmente por medio de otras carbapenemasas tipo OXA y bombas de flujo.
(Fernández-cuenca, 2016)
En el presente estudio fueron analizados aislados de A. baumannii-complex donde el mayor
número de muestras fueron obtenidas del servicio de unidad de cuidados intensivos (UCI),
unidad en la que se encuentra el grupo de pacientes con mayor vulnerabilidad y con
predisposición a una posible infección intrahospitalaria, no sólo por A. baumannii-complex
sino también por otros patógenos oportunistas.
La unidad de cuidados intensivos no fue el único servicio hospitalario en el que se encontró
A. baumannii-complex en la unidad de quemados, emergencia, traumatología, medicina
interna, neurocirugía y cirugía general también hubieron hallazgos de esta bacteria, así,
haciendo referencia de la ubicuidad del A. baumannii-complex y siendo uno de los
principales causantes de infecciones intrahospitalarias (Vos, 2016).
El tipo de muestra donde se aisló con mayor frecuencia A. baumannii fue el aspirado
traqueal (N=11/UCI) posiblemente relacionado la con ventilación mecánica (López-Cortés,
2014) (Ramírez, 2013). Las muestras también incluyeron hemocultivos, relacionados
45
posiblemente con el uso de sondas y/o dispositivos invasivos (Wisplinghoff H. , 2012)
(Villalón, 2011). La presencia de A. baumannii-complex en el líquido ascítico, por lo
general se la relaciona en pacientes con daño hepático, como la cirrosis, en la que se
predispone una infección debido a la disminución de proteínas del complemento y
consecuentemente deterioro en la opsonización y posterior fagocitosis (Mostafa, 2011).
Las muestras de aspirado traqueal y hemocultivos, reflejarían una posible IAAS, tomando
en cuenta los criterios del Ministerio de Salud Pública del Ecuador, como factores de riesgo
específicamente con el sitio de infección y la naturaleza de la muestra. En el caso de
neumonía, esta deberá cumplir con criterios como: que el paciente haya estado intubado o
ventilado y luego de 48h de estos procedimientos se haya presentado la infección, además
deberá cumplir con criterios específicos: a) radiológicos, b) sintomáticos, y c) laboratorio
en el que principalmente debe haber un recuento significativo de colonias (MSP, 2016)
(Unahalekhaka, 2011). Cuando se trata de hemocultivos los parámetros clínicos a tomar en
cuenta son casi similares con algunas variaciones como es que, el paciente haya sido
portador de una vía o catéter central y la infección haya sido detectada durante las
siguientes 48h de haberse realizado el procedimiento mencionado. Y con respecto a
criterios del laboratorio, se menciona que el agente patógeno no debe ser un saprófito de la
piel o contaminante y además no guardar relación con otros sitios, es decir no estar
presente en otro tejido u otras órganos (MSP, 2016). En nuestro estudio, sin embargo para
poder inferir que se trata de una IAAS, se necesitaba haber recaudado más información
acerca de los pacientes de los cuales se tomaron las muestras para poder incluirlos mediante
los criterios de IAAS según el MSP, la falencia radicó en que no se pudo conseguir datos
relacionados con las historias clínicas o sintomatológicos de los pacientes, por lo que
nuestro estudio cumple netamente criterios de laboratorio. Debido a la falta de esta
información no podemos afirmar que todas estas infecciones hayan sido de IAAS,
considerando una debilidad del estudio.
Con respecto a los grupos clonales, se describen 6 grupos de la A a la F, en el análisis del
dendograma obtenido a partir de la REP-PCR tomando en cuenta la similitud mayor al 80%
(Villalón, 2011) (Rafei R. , 2014), se puede observar que 4 de estos grupos estaban
presentes en la unidad de cuidados intensivos, con lo que podríamos aducir que cuando un
grupo clonal desaparecía, uno nuevo emergía en este servicio hospitalario en función del
tiempo.
Un brote epidemiológico está determinado por la aparición de dos o más casos que se
asocian entre sí o al aumento inusual de casos en un tiempo delimitado en determinado
lugar, es este caso la aparición de bacterias emergentes como lo es A. baumannii-complex,
y que han sido confirmados por el laboratorio, podemos establecer que en los meses de
enero en el área de cuidados intensivos (UCI) se registra el primer brote por el clon B, y de
la misma manera en los meses de junio, julio y agosto por los clones D, E y C
respectivamente, con lo que podemos afirmar que UCI fue el servicio hospitalario más
afectado con presencia de Acinetobacter, coincidiendo con casos como el presentado en
46
Italia en donde se encontraron 61 aislados de A. baumannii-complex durante un año y en
México en donde un estudio retrospectivo mostró que hubieron 151 aislados en un periodo
de 18 meses (Martínez, 2016) (Mammina, 2012).
Algo a destacar fue la variabilidad clonal existente en todos los aislados de la casa de salud,
a nivel de Sudamérica no ha sido reportado ningún caso similar, más si existieron estudios
realizados en Italia y China en los que se encontraron tres y cuatro grupos clonales,
respectivamente, y estableciendo que hubo circulación endémica o colonización simultánea
o secuencial de pacientes por múltiples cepas de A. baumannii-complex (Mammina, 2012)
(Lu, 2009). La existencia de esta variabilidad intrahospitalaria, demostraría la presencia
endémica del A. baumannii-complex en la casa de salud, convirtiéndolo en un organismo de
difícil control. La transferencia de pacientes provenientes de otras casas de salud de varios
lugares del país, se consideraría un factor para esta variabilidad, debido a que los pacientes
pudieron llegar ya colonizados y luego desarrollar la infección. La variabilidad clonal ha
sido reportada cuando los estudios se los ha realizado en varios hospitales de una misma
localidad (Valdezate, 2011) (Fernández-cuenca, 2016), y nuestro estudio pone en evidencia
la diversidad genética que presenta el A. baumannii-complex en una misma casa de salud.
En cuanto a la resistencia antibiótica, todos los aislados de A baumannii-complex,
mostraron resistencia del 100% a los carbapenémicos (criterio de inclusión) y del 93% a los
inhibidores de betalactamasas como el Sulbactam, de manera similar a las cefalosporinas de
cuarta y tercera generación, poniendo de manifiesto la complejidad para tratar este
patógeno a nivel hospitalario (Kempf, 2012) (Opazo, 2012) (Smidth, 2013) (Aly, 2014)
(Quiñones, 2015), es así que mediante los perfiles fenotípicos presentados se puede inferir
como organismo multidrogo resistente (MDRO), según los criterios dados por German et
all. (GJ, 2016). Debido a limitaciones en el estudio no se pudo determinar si los aislados
fueron extensivamente resistentes o pandrogorresitente, pero considerando estudios
similares y la proximidad con la presente investigación se podrían considerar que los
aislados corresponderían a cepas pandrogorresitente (PDRO) o extensivamente resistentes
(XDRO) (Zarrilli, 2013) (López-Cortés, 2014).
El hallazgo de A. baumannii-complex en aspirado traqueal, en UCI, hace suponer que es el
agente causal responsable de neumonía asociada a ventilación mecánica, en este estudio
donde los aislados fueron resistentes a los carbapenémicos, se avaluaron antibióticos
alternativos para el tratamiento de la neumonía como cefalosporinas de tercera y cuarta
generación (ceftazidima y cefepime), ampicilina sulbactam (SAM) y tigeciclina, resultando
resistentes al cefepime (> 90%) en un porcentaje mayor que a la ceftazidima (> 13%), pero
hubo un elevado porcentaje de aislados intermedios los cuales podrían presentarse como
resistentes tras periodo de adaptación a concentraciones elevadas del antibiótico. Un solo
aislado fue sensible al inhibidor (SAM), y tomando puntos de corte de la FDA para
tigeciclina, ningún aislado mostró resistencia, pero considerando el elevado número de
cepas intermedias (> 55%) que implica un aumento en la concentración del antibiótico con
lo que se lograría el efecto terapéutico; este procedimiento podría inducir un efecto de
47
resistencia al estar sometido a elevadas concentraciones, reduciendo las opciones
terapéuticas para el tratamiento de neumonías. Estos aislados presentaron carbapenemasas
de tipo OXA-23 y OXA-51, principales genes de resistencia hacia los carbapenémicos; la
OXA-51 se la considera intrínseca y la OXA-23 codificada por un plásmido que puede con
facilidad transferirse de una bacteria a otra (Smith, 2013)
Las sepsis por A. baumannii-complex son casos que se presentan con frecuencia en
pacientes inmunológicamente comprometidos sobre todo en servicios hospitalarios como
UCI (Fernández-cuenca, 2016), como tratamiento se utiliza gentamicina, amoxicilina
clavulánico (inhibidor) y colistín en combinación con rifampicina, imipenem o tigeciclina
(Salud C. N., 2014) (Lopez-Cortes, 2014) en este estudio se ensayó el uso gentamicina y
ampicilina sulbactam (inhibidor), resultando los aislados resistentes a estos antibióticos. En
los ensayos realizados con tigeciclina, por el método de difusión de disco, no se obtuvieron
cepas resistentes, coincidiendo con estudios en donde se obtuvieron buenos resultados con
el uso de tigeciclina (Blanco, 2012), esta opción terapéutica debe ser evaluada en conjunto
con carbapenémicos o cefalosporinas y mas no como monoterapia (Lopez-Cortes, 2014).
Estos aislados presentaron de forma similar genes que codifican carbapenemasa tipo OXA-
23 y OXA-51, a excepción de un aislado que solamente presentó OXA-23, mostrando que
posiblemente este asilado, solo con OXA-23, correspondería a otro tipo de Acinetobacter
(Aly, 2014) . Y como se mencionó anteriormente serán los principales genes mediadores de
resistencia hacia los carbapenémicos.
En relación al resto de muestras se encontraron cuatro perfiles de susceptibilidad,
presentado resistencia al imipenem, meropenem, ampicilina/sulbactam, cefepime,
amikacina y gentamicina, concordando con estudios previos como en Turquía o Colombia
en donde se señala que la mayoría de aislados fueron secreciones traqueales y sangre, y en
donde el perfil fenotípico resulto casi similar, exceptuando al cefepime al cual resultaron
resistentes y el colistín el cual no pudo ser evaluado (Ece, 2015) (Chávez, 2015).
En referencia a la carbapenemasa tipo OXA, en el resto de aislados (secreción de herida,
esputo, líquido ascítico) se hallaron, de manera similar, OXA-51 y OXA-23. Hasta el
momento se han descrito más 350 betalactamasas tipo OXA, genéticamente diversas
(Antunes, 2014) en este grupo se encuentran las betalactamasas de espectro extendido
(BLEE) y según Evans at all, consideran como carbapenemasas tipo OXA,
aproximadamente 191 de estas variantes (Evans, 2014). Este tipo de genes se encuentran
dentro de las oxacilinasas del grupo D de las betalactamasas, según la calificación de
Ambler y en el grupo 2d según la clasificación Bush, Jacoby y Madeiros (Vila, 2010), su
identificación es un reto para los investigadores debido a que estos no se los puede observar
mediante un antibiograma, como en el caso de BLEE o AmpC, y tampoco mediante el uso
de métodos de identificación rápida como el Blue-CarbaTest; por lo que es imprescindible
el uso de técnicas moleculares específicamente el uso de PCR (Calvo J. , 2011).
48
Las betalactamasas tipo OXA representan interés a nivel microbiológico debido a que se
encuentran codificadas en genes tipo OXA en diferentes patógenos (Staphylococcus,
Pseudomonas aueruginosa, A. baumannii, Enterobacter cloacae, Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae, entre otros) y su resistencia a los antimicrobianos estará en función
de la carbapenemasa tipo OXA que presente. Así la expresión de la OXA-1 u OXA-2
(betalactamasas de espectro extendido) implica resistencia a las penicilinas y
cefalosporinas, la OXA-10 y sus variantes (OXA-13, OXA-16, OXA-17, OXA-19, OXA-
28) presentan resistencia a: cefotaxima, ceftriaxona, aztreonam, y ceftazidima. Dentro del
grupo de las carbapenemasas de tipo OXA se encuentran las OXA-23, OXA-40/24, OXA-
51, OXA-58, OXA-134ª, OXA-143 y OXA-48, que han sido halladas con más frecuencias
y prevalentes a nivel de Suramérica (Opazo, 2012) cada una de estas presentan diferentes
variaciones por lo que presentarán resistencia variable en función a la mutación que
presenten (Evans, 2014) (Antunes, 2014).
En nuestro estudio se identificó la OXA-23 like en donde los aislados fueron de origen
variable (aspirado traqueal, secreción de herida, esputo, líquido ascítico), sin embargo 2
aislados no la presentaron, uno de aspirado traqueal y un hemocultivo. Este gen de
localización plasmática fue descrito en U.K en 1985, posee 19 variantes 5 de las cuales son
cromosómicas: OXA-23, OXA-102, OXA-103, OXA-105, OXA-133, OXA-105, OXA-
133, OXA-134; sugiriendo que, mediante su bajo contenido de GC, han sido recientemente
adquiridas. Las cepas que poseen el gen de OXA-23 se las ha encontrado que son
resistentes a: oximinocefalosporinas (cefotaxima, ceftriaxona, caftazidima, cefepime),
aminopenicilinas (ampicilina, amoxicilina), piperaciclinas, oxacilina, aztreonam y
carbapenémicos. En este estudio, mediante ensayos MIC, se encontró que los aislados
presentaron resistencia a la ceftriaxona, piperaciclina-tazobactam, ampicilina y amoxicilina;
con relación a la cefotaxima y ceftazidima presentaron resistencia intermedia pero también
se hallaron aislados sensibles en bajo número (3%). Para el cefepime, mediante difusión de
disco, presentaron resistencia. Con respecto a los carbapenémicos posee una mayor
afinidad para hidrolizar al imipenem que al meropenem, ertapenem o doripemen (Evans,
2014), en nuestro estudio todos los aislados presentaron resistencia total al imipenem y
meropenem, que fue la característica incluyente de las cepas para tomarlas en cuenta. Los
genes, de carbapenemasa OXA-23 like, son frecuentemente transmitidos por plásmidos a
otras cepas que no lo posean, pudiéndose encontrar en muchas especies de Acinetobacter y
enterobacterias (Evans, 2014); en nuestro estudio una sola cepa presentó únicamente el gen
OXA-23, tomando en cuenta que A. baumannii posee la carbapenemasa OXA-51 tipo
cromosómica se puede decir que esta cepa es un A. no baumannii. La OXA-23 desde su
descripción ha sido ampliamente descritas a nivel mundial como en Líbano, Cuba, Bélgica,
Venezuela, Colombia, Brasil, (Rafei R. , 2014) (Quiñones, 2015) (Vos, 2016) (Ramos,
2012) (Villegas, 2007) (Dalla-costa, 2003).
En 28 de los 29 aislados se identificaron el gen de la carbapenemasa OXA-51-like, la
excepción se dio en un aislado de hemocultivo, la presencia de OXA-51-like ha sido usada
49
como marcador genotípico de A. baumannii, pero teniéndose en cuenta que se debe hacer
pruebas moleculares adicionales para su confirmación (Zander, 2013), en América latina
fue descrita en 1996 en Argentina, posee 95 variantes y existe diferente capacidad
hidrolítica entre cada una de ellas. En el caso de las carbapenemasas OXA-51 y OXA- 69,
poseen baja actividad hidrolítica de carbapenémicos y en particular menor afinidad por el
imipenem. Se podría inferir un efecto sinérgico entre la OXA-23 con una alta afinidad por
el imipenem y la OXA-51 que fue encontrada. La presencia de la OXA-51 ha sido
documentada en varios lugares como en Madagascar, España, Italia, Korea, Argentina,
Bolivia, Brasil, Colombia, Venezuela (Tahiry, 2010) (Ruiz, 2007) (Mammina, 2012) (Sung,
2012) (Opazo, 2012) (Brown, 2004). Se ha visto que la presencia de una carbapenemasa de
tipo OXA junto a la bomba de reflujo AdeABC, provoca el aumento de los valores de MIC
(concentración mínima inhibitoria) de los carbapenémicos de >6ug/ml a 32ug/ml. (Evans,
2014).
La amplificación de elementos palindrómicos extragénicos repetitivos (REP-PCR), es uno
de los métodos moleculares de tipificación epidemiológica, que contrasta con otras
técnicas, debido a su bajo costo, su rapidez, estandarización rápida, y sencillez de
metodología, pero que al ser una técnica basada en la PCR está sujeta a problemas como la
deficiente interpretación de patrones de bandas, también es una técnica de baja
reproducibilidad dentro del mismo laboratorio o entre laboratorios (Rafei, 2014), y que al
ser una técnica molecular es susceptible de proporcionar falsos positivos o negativos
debido a errores en su procedimiento como la posible contaminación de muestras, material
genético de baja calidad o una deficiente estandarización. No muy recomendada en la
determinación de brotes intrahospitalarios debido a su bajo poder discriminatorio en
comparación con PFGE o MLST (Fernández Cuenca, 2013) mientras que el “gold standar”
en cuanto a técnicas moleculares sigue siendo la electroforesis de campos pulsados (PFGE)
(Higgins, 2012) debido a que su poder discriminatorio de esta puede llegar hasta el 95% de
similitud entre cepas (Crnich, 2014). Existe una gran variedad de técnicas moleculares para
la identificación de brotes como: REP-PCR, MLST, PFGE o ERIC-PCR, pero se deberá
seleccionar la técnica apropiada en función de criterios o parámetros de la investigación
como es el factor tiempo, costo-eficacia, finalidad del estudio, reproducibilidad o
disponibilidad de personal capacitado. (Cardona, 2013)
50
CAPÍTULO V
5 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1 Conclusiones
Con los datos obtenidos en la presente investigación podemos obtener las siguientes
conclusiones
El origen de las muestras clínicas fue variable. La mayor cantidad de aislados provienen de
UCI. Las muestras de aspirado traqueal fueron las más prevalentes seguidas de muestras de
sangre y secreción de herida, todas estas relacionándolas con tratamientos invasivos como
el uso de sondas o sistemas de ventilación mecánica, y se incluye la exposición de heridas
abiertas.
Mediante el perfil fenotípico mostrado por el A. baumannii-complex se lo catalogó como
MDR. Presentó resistencia a los antibióticos de primera línea en el tratamiento de
neumonías, y sepsis como son carbapenémicos y cefalosporinas, resultando sensible para la
tigeciclina. El colistín a pesar de una de las mejores opciones terapéuticas no pudo ser
evaluado.
La mayoría de aislados presentaron la combinación de estas dos carbapenemasas tipo OXA,
y un pequeño grupo de 3 aislados que presentó un solo gen tipo OXA considerando como
factor suficiente para presentar resistencia a los carbapenémicos.
Mediante la REP-PCR se encontraron 6 grupos clonales, 4 se establecieron en UCI, los
otros dos restantes, aparecieron en diferentes servicios hospitalarios, un grupo en: unidad
de quemados, traumatología y neurocirugía; y el otro grupo en emergencia y neurocirugía,
todos estos en diferente tiempo.
No se pudo concluir que las muestras hayan sido IAAS, debido a la falta de datos clínicos y
sintomáticos del paciente, por lo que solo se tomó en cuenta el criterio del laboratorio y
origen de las muestras y no todos los criterios del MSP.
5.2 Recomendaciones
La difusión de los datos encontrados a la respectiva casa de salud involucrada, haciendo
énfasis en las áreas de los hospitales en donde se encontraban los pacientes de quienes
fueron tomadas las muestras; todo esto para poder tomar medidas apropiadas ya sea en
51
el equipo usado o en el personal de salud, con el fin de evitar nuevos brotes
intrahospitalarios y tomar medidas adecuadas para su correcta resolución
La identificación inmediata de A. baumannii-complex, seria de mucha ayuda en el
control de infecciones debido a que se podría implementar las medidas terapéuticas
oportunas con antimicrobianos efectivos.
La implementación de técnicas moleculares en hospitales, no es muy factible debido
principalmente al factor económico por lo que se recomienda mantener contacto con
laboratorios de referencia, para así tener datos confiables, seguros y oportuno.
La determinación de carbapenemasas tipo OXA, y la REP-PCR al ser procedimientos
enteramente moleculares debe tomarse las medidas necesarias para evitar cualquier tipo
de contaminación o error , ya sea en el momento de la extracción del ADN o en la
preparación de la mezcla madre.
En los aislados del presente estudio se encontró presencia de OXA-23 y OXA-51; pero
se recomienda la continua vigilancia de otro tipo de OXA, ya que estas al ser plásmidos
y como han sido encontradas en países vecinos podrían, en cualquier momento,
aparecer en cepas de alguna casa de salud.
52
6. REFERENCIAS
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60
ANEXOS
ANEXO 1: Esquema Causa-Efecto
(Sucuy J.)
Resistencia a los
carbapenémicos.
Elevada
estancia
hospitalaria
Agravamiento de los
pacientes
Aumento de
mortalidad y
morbilidad
Diseminación
intrahospitalaria de
organismos
resistentes
Altos costos asumidos
por familiares o
departamentos
gubernamentales
Disminución de
alternativas
terapéuticas
Presencia de genes de
resistencia y
diseminación de estos.
Presencia de
múltiples
infecciones
61
ANEXO 2: Resistencia a los antibióticos. Perfil de susceptibilidad Acinetobacter
baumannii complex
Método de Difusión de disco. Diámetro de halos en mm. Puntos de corte tomados según el
CLSI 2016
N° COD.
INSPI
CAZ IMI EDTA MERO SAM FEP CS AK CN CIP NA LVX STX TGC
1 15-0032 16 8 - 6 8 10 16 12 6 6 6 11 6 13
2 15-0034 17 9 - 6 9 10 15 13 6 6 6 10 6 15
3 15-0063 17 6 - 6 6 10 15 11 6 6 6 9 6 15
4 15-0103 8 10 - 8 10 10 15 12 6 6 6 12 6 15
5 15-0139 18 7 - 6 7 8 15 11 6 6 6 11 6 16
6 15-0365 18 9 - 8 9 10 16 12 6 6 6 10 6 15
7 15-0454 7 28 - 26 26 24 15 22 22 30 20 27 22 22
8 15-0599 17 9 6 8 8 15 12 6 6 6 11 6 15
9 15-0624 18 8 6 8 8 15 11 6 6 6 10 6 16
10 15-0639 10 7 - 6 6 10 15 12 6 6 6 10 6 15
11 15-0678 17 6 - 6 6 7 16 12 6 6 6 8 6 15
12 15-0681 17 7 6 7 7 16 11 6 6 6 11 6 16
13 15-0695 17 7 6 7 7 15 13 6 6 6 11 6 15
14 15-0698 17 10 6 7 10 16 11 6 6 6 10 6 15
15 15-0788 17 7 - 6 6 6 16 13 6 6 6 10 6 16
16 15-0862 17 7 - 6 6 7 15 12 6 6 6 9 6 15
17 15-0864 16 7 - 6 6 6 16 11 6 6 6 6 6 16
18 15-0870 15 6 - 6 6 6 16 9 6 6 6 9 6 19
19 15-0871 17 7 - 6 6 8 16 12 6 6 6 9 6 15
20 15-0892 16 7 - 6 6 6 17 12 6 6 6 9 6 17
21 15-0893 6 6 - 6 6 9 15 14 6 6 6 7 6 14
22 15-0895 16 7 - 6 6 6 16 12 6 6 6 10 6 16
23 15-0914 17 6 - 6 6 8 15 11 6 6 6 10 6 15
24 15-0915 21 11 - 8 18 17 16 22 19 27 24 29 26 20
25 15-1035 21 9 - 6 6 7 18 15 6 6 6 12 6 22
26 15-1038 18 7 - 6 7 8 15 13 6 6 6 11 6 18
27 15-1090 18 8 - 6 6 10 16 12 6 6 6 10 7 15
28 15-1452 17 7 - 7 11 9 16 14 6 9 6 15 6 22
29 15-1465 16 7 - 6 6 8 13 11 6 6 6 9 6 15
(Sucuy J.)
62
ANEXO 3: Determinación de genes tipo OXA
Determinacion de genes tipo OXA
Reactivacion de cepas
Extracción de ADN
Choque térmico a 95°C por 10min, centrifugación por
10min a 14000 rpm y separación de sobrenadante
en otro tubo.
Preparación de Master mix Multiplx 1; tabla 3.2
Multiplex 2: Tabla 3.3.
Reacción de PCR Programa Termociclado :
tabla 3.4
Electroforesis en gel de 1,5% de Agarosa
Amplificacion de genes tipo OXA
FIN
Cultivo de
cepas
(Sucuy J.)
63
ANEXO 4: Electroforesis de Genes Tipo OXA
100 pb
300 pb
500 pb OX
A-2
3
OX
A-2
4
OX
A-5
1
501 pb
224 pb
353 pb
Identificación de los aislados
Control +
OX
A-2
3
OX
A-2
4
OX
A-5
1
Identificación de los aislados
501 pb
224 pb
353 pb
100 pb
300 pb
500 pb
Control +
