Trabajo Final Endocrinologia

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ENDOCRINOLOGIA INDICE 1.- Introducción a las Hormonas y a la Endocrinología. Principales glándulas endócrinas y hormonas que producen………………………………… pág. 02- 05 2.- Hipófisis anterior y posterior, Tiroides, Paratiroides, Suprarrenales Páncreas……………………………………………………………………… 3.- Endocrinología reproductiva Estructura, ubicación y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino…………………………………… 5.- Estructura, ubicación y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino………………………………………………………. 5.- Ciclo hormonal femenino……………………………………………… 6.- Principales alteraciones patológicas de las hormonas……………… 7.- Metodología para la determinación de hormonas…………………… 8.- Bibliografía………………………………………………………………. Trabajo final Página 1

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INDICE

1- Introduccioacuten a las Hormonas y a la Endocrinologiacutea Principales glaacutendulas endoacutecrinas y hormonas que producenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip paacuteg 02- 05

2- Hipoacutefisis anterior y posterior Tiroides Paratiroides Suprarrenales Paacutencreashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

3- Endocrinologiacutea reproductiva Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculinohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

5- Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femeninohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

5- Ciclo hormonal femeninohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

6- Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonashelliphelliphelliphelliphelliphellip

7- Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

8- Bibliografiacuteahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

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INTRODUCCION A LAS HORMONAS Y A LA ENDOCRINOLOGIA

La endocrinologiacutea es la rama de la medicina encargada del estudio de los desoacuterdenes producidos por alteraciones de las glaacutendulas endocrinas que son aquellas que vierten su producto a la circulacioacuten sanguiacutenea Estas substancias dotadas de gran actividad bioloacutegica regulan todos los procesos metaboacutelicos del organismo y son en consecuencia indispensables para el mantenimiento de la vida

Las hormonas son sustancias segregadas por ceacutelulas especializadas localizadas en glaacutendulas de secrecioacuten interna o glaacutendulas endoacutecrinas (carentes de conductos) o tambieacuten por ceacutelulas epiteliales e intersticiales con el fin de afectar la funcioacuten de otras ceacutelulas Hay hormonas animales y hormonas vegetales como las auxinas aacutecido absciacutesico citoquinina giberelina y el etileno Las hormonas pertenecen al grupo de los mensajeros quiacutemicos que incluye tambieacuten a los neurotransmisores Las hormonas maacutes estudiadas en animales (y humanos) son las producidas por las glaacutendulas endocrinas pero tambieacuten son producidas por casi todos los oacuterganos humanos y animales

La especialidad meacutedica que se encarga del estudio de las enfermedades relacionadas con las hormonas es la endocrinologiacutea

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Tipos de hormonas seguacuten su naturaleza quiacutemica

Hormonas peptiacutedicas

Son derivados de aminoaacutecidos (como las hormonas tiroideas) o bien oligopeacuteptidos (como la vasopresina) o polipeacuteptidos (como la hormona del crecimiento) En general este tipo de hormonas no pueden atravesar la membrana plasmaacutetica de la ceacutelula diana por lo cual los receptores para estas hormonas se hallan en la superficie celular Las hormonas tiroideas son una excepcioacuten ya que se unen a receptores especiacuteficos que se hallan en el nuacutecleo

Hormonas lipiacutedicas

Son esteroides (como la testosterona) o eicosanoides (como las prostaglandinas) Dado su caraacutecter lipoacutefilo atraviesan sin problemas la bicapa lipiacutedica de las membranas celulares y sus receptores especiacuteficos se hallan en el interior de la ceacutelula diana

Mecanismo de accioacuten

Las Hormonas tienen la caracteriacutestica de actuar sobre las ceacutelulas diana que deben disponer de una serie de receptores especiacuteficos Hay dos tipos de receptores celulares

Receptores de membrana los usan las hormonas peptiacutedicas Las hormonas peptiacutedicas (1er mensajero) se fija a un receptor proteico que hay en la membrana de la ceacutelula y estimula la actividad de otra proteiacutena (unidad cataliacutetica) que hace pasar el ATP (intracelular) a AMP (2ordm mensajero) que junto con el calcio intracelular activa la enzima proteiacutena quinasa (responsable de producir la fosforilacioacuten de las proteiacutenas de la ceacutelula que produce una accioacuten bioloacutegica determinada) Esta es la teoriacutea o hipoacutetesis de 2ordm mensajero o de Sutherland

Receptores intracelulares los usan las hormonas esteroideas La hormona atraviesa la membrana de la ceacutelula diana por difusioacuten Una vez dentro del citoplasma penetra incluso en el nuacutecleo donde se fija el DNA y hace que se sintetice ARNm que induce a la siacutentesis de nuevas proteiacutenas que se traduciraacuten en una respuesta fisioloacutegica

Farmacologiacutea

Una gran cantidad de hormonas son usadas como medicamentos Las maacutes comuacutenmente usadas son estradiol y progesterona en las piacuteldoras anticonceptivas y en la terapia de reemplazo hormonal la tiroxina en forma de levotiroxina en el tratamiento para el hipotiroidismo los corticoides para enfermedades autoinmunes trastornos respiratorios severos y ciertos cuadros aleacutergicos La insulina es usada por muchos diabeacuteticos Preparaciones locales usadas en otorrinolaringologiacutea frecuentemente contienen equivalentes a la

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adrenalina Los esteroides y la vitamina D son componentes de ciertas cremas que se utilizan en dermatologiacutea

Principales glaacutendulas endoacutecrinas y hormonas que producen

Glaacutendula endocrina

hormonas tejido blanco

Acciones principales

Hipotaacutelamo (produccioacuten) Hipoacutefisis neurohipoacutefisis (almacenamiento y liberacioacuten)

Oxitocina Uacutetero Estimula las contracciones

Glaacutendulas mamarias

Estimula la expulsioacuten de leche hacia los conductos

Hormona antidiureacutetica (vasopresina)

Rintildeones (conductos colectores)

Estimula la reabsorcioacuten de agua conserva agua

Hipoacutefisis (produccioacuten) Loacutebulo anterior de la hipoacutefisis

Hormona del crecimiento (GH)

General Estimula el crecimiento al promover la siacutentesis de proteiacutenas

Prolactina Glaacutendulas mamarias

Estimula la produccioacuten de leche

Hormona estimulante del tiroides (TSH)

tiroides Estimula la secrecioacuten de hormonas tiroideas estimula el aumento de tamantildeo del tiroides

Hormona adrenocorticotroacutepica (ACTH)

Corteza suprarrenal

Estimula la secrecioacuten de hormonas corticosuprarrenales

Hormonas gonadotroacutepicas (foliculoestimulante FSH luteinizante LH)

Goacutenadas Estimula el funcionamiento y crecimiento gonadales

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Tiroides Tiroxina (T4) y triyodotironina (T3)

General Estimulan el metabolismo esencial para el crecimiento y desarrollo normal

Calcitonina Hueso Reduce la concentracioacuten sanguiacutenea de calcio inhibiendo la degradacioacuten oacutesea por osteoclastos

Glaacutendulas paratiroides

Hormona paratiroidea

Hueso rintildeones tubo digestivo

Incrementa la concentracioacuten sanguiacutenea de calcio estimulando la degradacioacuten oacutesea estimula la reabsorcioacuten de calcio por los rintildeones activa la vitamina D

Islotes de Langerhans del paacutencreas

Insulina General Reduce la concentracioacuten sanguiacutenea de glucosa facilitando la captacioacuten y el empleo de eacutesta por las ceacutelulas estimula la glucogeacutenesis estimula el almacenamiento de grasa y la siacutentesis de proteiacutena

Glucagoacuten Hiacutegado tejido adiposo

Eleva la concentracioacuten sanguiacutenea de la glucosa estimulando la glucogenoacutelisis y la gluconeogeacutenesis moviliza la grasa

Meacutedula suprarrenal

Adrenalina y noradrenalina

Muacutesculo miocardio vasos sanguiacuteneos hiacutegado tejido adiposo

Ayuda al organismo a afrontar el estres incrementa la frecuencia cardiaca la presioacuten arterial la tasa metaboacutelica desviacutea el riego sanguiacuteneo moviliza grasa eleva la concentracioacuten sanguiacutenea de azuacutecar

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Corteza suprarrenal

Mineralocorticoides (aldosterona)

Tuacutebulos renales

Mantiene el equilibrio de sodio y fosfato

Glucocorticoides (cortisol)

General Ayuda al organismo a adaptarse al estres a largo plazo eleva la concentracioacuten sanguiacutenea de glucosa moviliza grasa

Glaacutendula pineal Melatonina Goacutenadas ceacutelulas pigmentarias otros tejidos

Influye en los procesos reproductivos en cricetos y otros animales pigmentacioacuten en algunos vertebrados puede controlar biorritmos en algunos animales puede ayudar a controlar el inicio de la pubertad en el ser humano

Ovario Estroacutegenos (estradiol)

General uacutetero

Desarrollo y mantenimiento de caracteres sexuales femeninos estimula el crecimiento del revestimiento uterino

Progesterona Uacutetero mama Estimula el desarrollo del revestimiento uterino

Testiacuteculos Testosterona General estructuras reproductivas

Desarrollo y mantenimiento de caracteres sexuales masculinos promueve la espermatogeacutenesisproduce el crecimiento en la adolescencia

Inhibina Loacutebulo anterior de la hipoacutefisis

Inhibe la liberacioacuten de FSH

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Hipoacutefisis anterior y posterior Tiroides Paratiroides Suprarrenales y Paacutencreas

La hipoacutefisis o glaacutendula pituitaria

Es la glaacutendula que controla el resto de las glaacutendulas entre ellas la tiroides Es una glaacutendula compleja que se aloja en un espacio oacuteseo llamado silla turca del hueso esfenoides situada en la base del craacuteneo en la fosa cerebral media que conecta con el hipotaacutelamo a traveacutes del tallo pituitario o tallo hipofisario Tiene un peso aproximado de 05 g

Etimologiacutea

El teacutermino laquohipoacutefisisraquo proviene del griego hipo (lsquodebajorsquo) y fisis (lsquocrecerrsquo)

Partes

La hipoacutefisis consta de tres partes

Loacutebulo anterior o adenohipoacutefisis procede embrioloacutegicamente de un esbozo fariacutengeo (bolsa de Rathke) y es responsable de la secrecioacuten de numerosas hormonas (ver maacutes adelante)

Hipoacutefisis media o pars intermedia produce dos polipeacuteptidos llamados melanotropinas u hormonas estimulantes de los melanocitos que inducen el aumento de la siacutentesis de melanina de las ceacutelulas de la piel

Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo

Adenohipoacutefisis

La adenohipoacutefisis segrega muchas hormonas de las cuales seis son relevantes para la funcioacuten fisioloacutegica adecuada del organismo las cuales son segregadas por 5 tipos de ceacutelulas diferentes Estas ceacutelulas son de origen epitelial y como muchas glaacutendulas endocrinas estaacuten organizadas en lagunas rodeadas de capilares sinusoides fenestrados a los cuales se vierte su secrecioacuten hormonal Los tipos de ceacutelulas se clasificaban antes de acuerdo a su tincioacuten y eran acidoacutefilas basoacutefilas y cromoacutefobas (o que no se tintildeen) Pero en la actualidad se cuenta con teacutecnicas de inmunohistoquiacutemica y se han podido identificar 5 tipos celulares

Ceacutelulas somatoacutetropas que segregan GH (acidoacutefilas) Ceacutelulas lactotropas o mamoacutetropas que segregan PRL (acidoacutefilas)

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Ceacutelulas corticoacutetropas que segregan ACTH (basoacutefila)

Ceacutelulas gonadoacutetropas que segregan las gonadotropinas LH y FSH (basoacutefila)

Ceacutelulas tirotropas que secretan la TSH (basoacutefila)

Las ceacutelulas cromoacutefobas son en realidad ceacutelulas desgastadas y pueden haber sido cualquiera de las cinco anteriores

Hormonas de la adenohipoacutefisis

Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)

Prolactina (PRL) u hormona luteotroacutepica Estimula el desarrollo de los acinos mamarios y estimula la traduccioacuten de los genes para las proteiacutenas de la leche

Las demaacutes hormonas son hormonas troacuteficas que tienen su efecto en algunas glaacutendulas endocrinas perifeacutericas

Hormona estimulante del tiroides (TSH) o tirotropina Estimula la produccioacuten de hormonas por parte del tiroides

Hormona estimulante de la corteza suprarrenal (ACTH) o corticotropina Estimula la produccioacuten de hormonas por parte de las glaacutendulas suprarrenales

Hormona luteinizante (LH) Estimulan la produccioacuten de hormonas por parte de las goacutenadas y la ovulacioacuten

Hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Misma funcioacuten que la anterior

La LH y la FSH se denominan gonadotropinas ya que regulan la funcioacuten de las goacutenadas

Neurohipoacutefisis

La neurohipoacutefisis tiene un origen embrioloacutegico diferente al del resto de la hipoacutefisis mediante un crecimiento hacia abajo del hipotaacutelamo por lo que tiene funciones diferentes Se suele dividir a su vez en tres partes eminencia media infundibulo y pars nervosa de las cuales la uacuteltima es la maacutes funcional Las ceacutelulas de la neurohipoacutefisis se conocen como pituicitos y no son maacutes que ceacutelulas gliales de sosteacuten Por tanto la neurohipoacutefisis no es en realidad una glaacutendula secretora ya que se limita a almacenar los productos de secrecioacuten

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del hipotaacutelamo En efecto los axoplasmas de las neuronas de los nuacutecleos hipotalamicos supraoacuteptico y paraventricular secretan la ADH y la oxitocina respectivamente que se almacenan en las vesiacuteculas de los axones que de eacutel llegan a la neurohipoacutefisis dichas vesiacuteculas se liberan cerca del plexo primario hipofisiario en respuesta impulsos eleacutectricos por parte del hipotaacutelamo

Hormona antidiureacutetica (ADH) o vasopresina Se secreta en estiacutemulo a una disminucioacuten del volumen plasmaacutetico y como consecuencia de la disminucioacuten en la presioacuten arterial que esto ocasiona y su secrecioacuten aumenta la reabsorcioacuten de agua desde los tuacutebulos colectores renales por medio de la translocacioacuten a la membrana de la acuaporina II tambieacuten provoca una fuerte vasoconstriccioacuten por lo que tambieacuten es llamada vasopresina

Oxitocina Estimula la contraccioacuten de las ceacutelulas mioepiteliales de las glaacutendulas mamarias lo que causa la eyeccioacuten de leche por parte de la mama y se estimula por la succioacuten transmitiendo sentildeales al hipotalamo (retroalimentacioacuten) para que secrete mas oxitocina Causa contracciones del musculo liso del uacutetero en el orgasmo y tambieacuten los tiacutepicos espasmos de la etapa final del parto

Regulacioacuten hipotalaacutemica

La hipoacutefisis y el hipotaacutelamo estaacuten conectados por un sistema capilar denominado sistema portal el cual proviene de la arteria caroacutetida interna y del poliacutegono de Willis e irriga primero al hipotaacutelamo formando el plexo capilar primario que drena en los vasos porta hipofisiarios que a su vez forman el plexo capilar hipofisiario

La importancia de este sistema es que transporta las hormonas liberadoras o hipofisiotroacutepicas que secreta el hipotaacutelamo con fines reguladores de la secrecioacuten adenohipofisiaria Estas hormonas son

Somatoliberina (GHRH) Estimula la secrecioacuten de GH por parte de la hipoacutefisis

Corticoliberina (ARH) Estimula la secrecioacuten de ACTH por parte de la hipoacutefisis

Tiroliberina (TRH) Estimula la secrecioacuten de TSH por parte de la hipoacutefisis

Gonadoliberina (LHRH) Estimula la secrecioacuten de LH y FSH por parte de la hipoacutefisis

Hormona inhibidora de la GH (GHIH) o somatostatina Inhibe la secrecioacuten de la GH por parte de la hipoacutefisis

La prolactina estaacute regulada negativamente por dopamina un neurotransmisor

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Hay que tener en cuenta que la regulacioacuten de la secrecioacuten de las hormonas hipofisiarias se realiza mediante un mecanismo de retroalimentacioacuten negativa el cual se establece entre el hipotaacutelamo la hipofisis y los receptores especiacuteficos para cada hormona localizado en los oacuterganos diana

El proceso se realiza en el momento en que el sistema nervioso central recibe un estiacutemulo el hipotaacutelamo recibe parte de ese estiacutemulo y actuacutea sobre la hipoacutefisis a su vez el hipotaacutelamo secreta las respectivas hormonas en la adenohipoacutefisis o libera las de la neurohipoacutefisis estas se incorporan a la circulacioacuten viajan por medio de la sangre y son captados por receptores especiacuteficos ubicados en los oacuterganos diana un ejemplo es la captacioacuten de la TSH por parte de los loacutebulos tiroideos de la glaacutendula tiroides

En ese momento el oacutergano diana que en todo caso es cualquiera de las glaacutendulas endocrinas comienzan a secretar sus propias hormonas con lo que se enviacutea un estiacutemulo al sistema nervioso especiacuteficamente al hipotaacutelamo o directamente a la hipoacutefisis con lo cual se contrarresta el estiacutemulo inicial

TRASTORNOS ASOCIADOS A LA HIPOFISIS

Condicioacuten Etiologiacutea Hormona

Acromegalia sobreproduccioacuten hormona de crecimiento

Gigantismo sobreproduccioacuten hormona de crecimiento

Deficiencia de la hormona de crecimiento

baja produccioacuten hormona de crecimiento

Siacutendrome de secrecioacuten inadecuada de la hormona antidiureacutetica

sobreproduccioacuten vasopresina

Diabetes insiacutepida baja produccioacuten vasopresina

Siacutendrome de Sheehan baja produccioacuten cualquier hormona hipofisaria

Adenoma hipofisario sobreproduccioacuten cualquier hormona hipofisaria

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Hipopituitarismo baja produccioacuten cualquier hormona hipofisaria

HORMONAS DEL HIPOTALAMO

El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta

Suele considerarse el centro integrador del sistema nervioso vegetativo (o sistema nervioso autoacutenomo) dentro del sistema nervioso perifeacuterico Tambieacuten se encarga de realizar funciones de integracioacuten somato-vegetativa

En conjunto con la hipoacutefisis realiza la homeostasis del organismo por medio de un sistema de realimentacioacuten negativa

Anatomiacutea

El dienceacutefalo estaacute constituido por el taacutelamo el hipotaacutelamo el epitaacutelamo y el subtaacutelamo El taacutelamo son dos masas en el medio del cerebro entre los dos hemisferios cerebrales El hipotaacutelamo estaacute debajo del taacutelamo y sus liacutemites estaacuten constituidos por

superior el piso del III ventriacuteculo anterior el quiasma oacuteptico

inferior y lateral subtaacutelamo

posterior liacutenea imaginaria entre los cuerpos mamilares y la comisura posterior del cerebro

Nuacutecleos neuronales

nuacutecleos laterales se relacionan con el hambre preoacuteptico funcioacuten parasimpaacutetica

supraoacuteptico produce hormona antidiureacutetica

paraventricular produce oxitocina

hipotalaacutemico anterior centro de la sed

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supraquiasmaacutetico regulacioacuten del ciclo circadiano

ventromedial centro de la saciedad

arcuato interviene en la conducta emocional y actividad endoacutecrina

mamilar funcioacuten simpaacutetica

hipotalaacutemico posterior participan en la memoria

Funciones

El hipotaacutelamo regula el hambre el apetito y la saciedad por medio de hormonas y peacuteptidos como la colecistoquinina el nivel de glucosa y aacutecidos grasos en sangre y el neuropeacuteptido Y entre otros

El hipotaacutelamo anterior o rostral (parasimpaacutetico) disipa (difunde) el calor y el hipotaacutelamo posterior o caudal (simpaacutetico) se encarga de mantener la temperatura corporal constante5 aumentando o disminuyendo la frecuencia respiratoria y la sudoracioacuten

La porcioacuten anterior y posterior del hipotaacutelamo regula el ciclo del suentildeo y de la vigilia (ritmo circadiano)

Hormonas

El hipotaacutelamo en cuanto oacutergano endocrino se ocupa de liberar factores liberadores o inhibidores a la sangre pero tambieacuten es capaz de producir neurohormonas listas para su secrecioacuten

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Neurohormonas

El hipotaacutelamo produce en los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares la ADH (hormona antidiureacutetica) o vasopresina la cual se acumula en la neurohipoacutefisis desde donde es secretada La vasopresina regula el balance de agua en el cuerpo actuando sobre los rintildeones Esta hormona se almacena en la hipoacutefisis posterior de donde es liberada La disfuncioacuten del hipotaacutelamo en la produccioacuten de ADH causa diabetes insiacutepida

La oxitocina es tambieacuten producida por el hipotaacutelamo y almacenada y liberada por la neurohipoacutefisis tambieacuten comparte similitudes en su estructura proteiacutenica y llegan a compartir algunas funciones En el caso de los hombres se desconoce su funcionalidad pero se la asocia con los genitales externos y con receptores de la vesiacutecula seminal

En el caso de las mujeres la oxitocina acelera el nuacutemero de contracciones en el parto e influye al uacutetero a que se reacomode despueacutes del parto Tambieacuten incita a las fibras musculares que rodean a las ceacutelulas secretoras de leche de las glaacutendulas mamarias a secretar leche en respuesta al acto de mamar del nintildeo

Factores hipotalaacutemicos

Aparte de las dos hormonas de accioacuten directa mencionadas el hipotaacutelamo secreta diversas hormonas o factores que regulan la secrecioacuten de hormonas hipofisarias

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Hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH LHRH o LHRF) Es un decapeacuteptido (una cadena de 10 aminoaacutecidos) que actuacutea sobre la hipoacutefisis estimulando la produccioacuten y la liberacioacuten de la hormona luteinizante (LH) y la hormona foliculoestimulante (FSH) El balance de estas hormonas coordina el ciclo menstrual femenino y la espermatogeacutenesis en los hombres

Hormona liberadora de tirotropina (TRH) Es un tripeacuteptido (moleacutecula compuesta por tres aminoaacutecidos) Estimula la secrecioacuten de prolactina (PRL) y de tirotropina (TSH) por parte de la adenohipoacutefisis

Corte sagital medio del cerebro El punto blanco en frente del hipotaacutelamo es el quiasma oacuteptico debajo del cual estaacute la pituitaria La liacutenea blanca entre la pituitaria y el espacio negro es la silla turca (hueso)

Hormona liberadora de corticotropina (CRH o CRF) Se sintetiza en los nuacutecleos paraventriculares a partir de un precursor polipeptiacutedico de unos 41aminoaacutecidos y posee una vida larga (minutos) Las neuronas secretoras se encuentran en la porcioacuten anterior de los nuacutecleos paraventriculares y sus axones terminan en la capa externa de la eminencia media Estimula la liberacioacuten de adrenocorticotropina (ACTH) y β-endorfina por parte de la adenohipoacutefisis La hormona antidiureacutetica y la angiotensina II potencian el efecto liberador de CRH

Somatocrinina hormona liberadora de somatotropina (STH) o factor liberador de hormona del crecimiento (GRF) Las neuronas productoras de este factor se encuentran en el nuacutecleo arcuato del hipotaacutelamo Se sintetiza a partir de un precursor de 107 o 108 aminoaacutecidos Estimula la liberacioacuten de la hormona del crecimiento hipofisaria (GH)

Somatostatina u hormona inhibidora de la liberacioacuten de somatotropina (GIH) Como su nombre indica inhibe la secrecioacuten de somatotropinay de otras hormonas como la insulina el glucagoacuten el polipeacuteptido pancreaacutetico y la TSH La zona secretora se encuentra en la regioacuten periventricular del hipotaacutelamo Es un tetradecapeacuteptido que se encuentra en el hipotaacutelamo y en las ceacutelulas D de los islotes de Langerhans Su precursor posee 116 aminoaacutecidos Hormona liberadora de corticotropina

PIF (Factor inhibidor de la liberacioacuten de prolactina) Actuacutea en forma constante inhibiendo la secrecioacuten de prolactina hipofisaria Dado que la dopamina inhibe tambieacuten la produccioacuten de prolactina al unirse a las

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ceacutelulas lactotropas de la hipoacutefisis durante alguacuten tiempo se pensoacute que se trataba de PIF la dopamina puede ser un PIF secundario Las neuronas secretoras de PIF se encuentran en el nuacutecleo arcuato hipotalaacutemico

Angiotensina II (AII) Es un octapeacuteptido que estimula la accioacuten de la hormona liberadora de corticotropina libera algo de adrenocorticotropina hipofisaria

Hormona tiroidea

Las hormonas tiroideas son producidas por la glaacutendula tiroides Su efecto es el aumento del metabolismo basal lo cual es indispensable para un correcto desarrollo fetal y el funcionamiento adecuado de los sistemas cardiovascular musculoesqueleacutetico hematopoyeacutetico asiacute como para respuestas corporales adecuadas en cuanto a produccioacuten de calor consumo de oxiacutegeno y regulacioacuten de otros sistemas hormonales

Tipos de hormona tiroidea

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T4 T3

Existen tres hormonas circulantescirculantesco grande

T4 tetrayodotironina o tiroxina T3 o triyodotironina

T3 reversa Esta es bioloacutegicamente inactiva

Los niveles plasmaacuteticos de estas hormonas se mantienen estables durante toda la vida con excepcioacuten del periacuteodo neonatal y en algunas enfermedades o con el uso de algunos faacutermacos

Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas

Los yoduros que se ingieren en los alimentos y en el agua son concentrados de forma activa por la glaacutendula tiroides convertidos a yodo orgaacutenico por la peroxidasa tiroidea e incorporados a la tirosina en la tiroglobulina intrafolicular contenida en el coloide de la superficie apical de la ceacutelula folicular del tiroides

Las tirosinas son yodadas en un lugar (monoyodotirosina) o en dos (diyodotirosina) y se acoplan para formar las hormonas activas

diyodotirosina + diyodotirosina (r) --gt tetrayodotironina [tiroxina T4] diyodotirosina + monoyodotirosina( r) --gt triyodotironina [T3]

Otra fuente de T3 en el interior de la glaacutendula tiroides es el producto de la monodesyodacioacuten del anillo externo de la T4 por una selenoenzima la desyodasa tipo I (5-D-I) Esta enzima se encuentra tambieacuten en el hiacutegado y los rintildeones La T3 resultante pasa a la circulacioacuten Tambieacuten existe una isoenzima que efectuacutea la misma reaccioacuten llamada desyodasa tipo II que se encuentra en el cerebro y la hipoacutefisis La T3 resultante actuacutea localmente2

La tiroglobulina una glucoproteiacutena que contiene T3 y T4 en su matriz es captada por el foliacuteculo en forma de gotitas de coloide por las ceacutelulas tiroideas

Todas las reacciones necesarias para la formacioacuten de T3 y T4 son influidas y controladas por la hormona estimulante del tiroides (TSH) llamada tambieacuten tirotropina que estimula las ceacutelulas foliculares en la glaacutendula tiroides

Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas se metabolizan principalmente en el hiacutegado Producto de una conjugacioacuten con los aacutecidos glucoroacutenico y sulfuacuterico por medio de un grupo hidroxilo fenoacutelico se genera una forma excretable a traveacutes de la bilis

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Una parte de los productos conjugados eliminados por la bilis se hidroliza y se absorbe como hormona activa en el intestino Es un fenoacutemeno conocido como circulacioacuten enterohepaacutetica El resto se elimina por las heces

En la circulacioacuten sanguiacutenea la T4 se metaboliza a T3 y T3 reversa las que a su vez se desyodan produceacutendose diyodotironinas inactivas

Efectos de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas tienen dos efectos fisioloacutegicos principales

1 Aumentan la siacutentesis de proteiacutenas praacutecticamente en todos los tejidos del organismo (La T3 y la T4 penetran en las ceacutelulas donde la T3 que se obtiene de la circulacioacuten y por la conversioacuten de T4 en T3 dentro de la ceacutelula se une a receptores nucleares individuales e influye sobre la formacioacuten de ARNm)

2 La T3 incrementa el consumo de oxiacutegeno mediante el aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa (bomba sodio-potasio) sobre todo en los tejidos responsables del consumo basal de oxiacutegeno (es decir hiacutegado rintildeoacuten corazoacuten y muacutesculo esqueleacutetico) El aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa es secundario al incremento de la siacutentesis de esta enzima por consiguiente el aumento del consumo de oxiacutegeno probablemente tambieacuten estaacute relacionado con la fijacioacuten nuclear de hormonas tiroideas No obstante no se ha descartado un efecto directo de la T3 sobre la mitocondria Se cree que la T3 es la hormona tiroidea activa aunque la misma T4 pueda ser bioloacutegicamente activa

Efectos fisioloacutegicos

Desarrollo normal del sistema nervioso central en el feto Funcionamiento normal del sistema nervioso central Su falta enlentece

su funcionamiento

Generacioacuten de calor

Efectos cronotroacutepico e inotroacutepico en el sistema cardiovascular

Aumenta el nuacutemero de receptores para catecolaminas y amplifica la respuesta postreceptor en el sistema simpaacutetico3

Aumenta la eritropoyetina

Regula el metabolismo oacuteseo

Permite la relajacioacuten muscular

Interviene en los niveles de produccioacuten de hormonas gonadotrofinas y somatotropa o GH

Permite la correcta respuesta del centro respiratorio a la hipoxia e hipercapnia

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ENDOCRINOLOGIA

Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma

Las hormonas tiroideas circulan unidas a proteiacutenas plasmaacuteticas Un porcentaje bajo de T4 y T3 circula libremente por la sangre y es de este porcentaje bajo de hormona que depende la accioacuten hormonal sobre los receptores celulares

Las proteiacutenas a las que se unen las hormonas tiroideas son

Globulina transportadora de tiroxina o TBG (del ingleacutes Thyroxin Binding Globulin)

Prealbuacutemina transportadora de tiroxina o TBPA (del ingleacutes Thyroxin Binding Pre Albumin)

Albuacutemina

Ya que existen factores que afectan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas mencionadas modificando la cantidad de hormona libre es muy importante medir la hormona libre en el plasma para evaluar la condicioacuten fisiopatoloacutegica en estudio

Por ejemplo los siguientes faacutermacos compiten con las hormonas tiroideas por su unioacuten con las proteiacutenas transportadoras

Salicilatos Hidantoiacutenas

Algunos antiinflamatorios no esteroideos como el Diclofenaco y el aacutecido mefenaacutemico

Furosemida

Por el contrario los siguientes faacutermacos incrementan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas transportadoras

Estroacutegenos Metadona

Clofibrato

Heroiacutena

Tamoxifeno

En el embarazo tambieacuten se modifica la afinidad de las hormonas tiroideas por las proteiacutenas transportadoras aumentando esta unioacuten y disminuyendo la hormona libre

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ENDOCRINOLOGIA

Paratiroides

Las glaacutendulas paratiroides son glaacutendulas endocrinas Situadas en el cuello generalmente localizadas en los polos De la glaacutendula tiroides que producen La hormona paratiroidea o paratohormona Por lo general hay cuatro glaacutendulas paratiroides Dos superiores y dos inferiores pero de forma ocasional puede haber cinco o maacutes Cuando existe alguna glaacutendula adicional eacutesta suele encontrarse en el mediastino en relacioacuten con el timo o dentro de la glaacutendula tiroides

La hormona paratiroidea participa en el control de la homeostasis del calcio y foacutesforo asiacute como en la fisiologiacutea del hueso

El exceso de funcioacuten de las glaacutendulas paratiroides se conoce como hiperparatiroidismo y suele cursar con elevacioacuten de los niveles plasmaacuteticos de calcio y fragilidad oacutesea que condiciona una mayor susceptibilidad a padecer fracturas La funcioacuten insuficiente de las glaacutendulas paratiroides (hipoparatiroidismo) es mucho menos frecuente y generalmente se presenta tras una cirugiacutea sobre la glaacutendula tiroides que conlleva la existencia de hipocalcemia Existen algunas enfermedades mucho maacutes raras que parecen deberse a alteraciones en el receptor de la hormona paratiroidea como la condroplasia metafiseal de Jansen y la condroplasia de Blomstrand

Hormona paratiroidea o parathormona Es secretada por las ceacutelulas principales de la glaacutendula paratiroides es un polipeacuteptido de 84 aminoaacutecidos cuyo peso molecular es de aproximadamente 9500 Daltons Facilita la absorcioacuten del calcio Vitamina D (en su forma natural) y fosfato conjuntamente en el intestino Aumenta la resorcioacuten de los huesos Mediante la produccioacuten de maacutes osteoclastos a partir de las ceacutelulas madre mesenquimatosas de la meacutedula oacutesea y retrasando la conversioacuten de estas en osteoblastos Los osteoclastos absorben el hueso mediante la liberacioacuten de hormonas proteoliacuteticas liberadas por lisosomas y la secrecioacuten de varios aacutecidos entre ellos el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido laacutectico Aumenta la reabsorcioacuten del calcio y reduce la resorcioacuten del fosfato en los tuacutebulos renales provocando que este salga en la orina en mayor concentracioacuten Aumenta la resorcioacuten del calcio en el intestino Induce un incremento en la formacioacuten del 125-dihidroxicolecalciferol (forma activa de la Vitamina D calitriol o Vitamina D3) a partir del 25-hidroxicolecalciferol (calcifediol) en los rintildeones la vitamina D3 luego actuacutea a nivel del epitelio intestinal aumentando la absorcioacuten del calcio aumentando asiacute los

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ENDOCRINOLOGIA

niveles de calcio plasmaacuteticos (valor normal del calcio plasmaacutetico 92-104 mgdl) Luego por un mecanismo de retroaccioacuten o retroalimentacioacuten negativa elevadas concentraciones de calcio plasmaacuteticos inhiben la secrecioacuten de la PTH (Hormona paratiroidea)ademaacutes ayuda a la reabsorcion del calcio por medio de los rintildeones

Calcitonina Secretada por las ceacutelulas parafoliculares en la Tiroides es un polipeacuteptido de 32 aminoaacutecidos con un peso molecular aproximado de 3000 Daltons aproximadamente Tiene una funcioacuten opuesta a la Hormona Paratiroidea disminuye la actividad osteoclaacutestica desacelera la formacioacuten de los osteoclastos y acelera la formacioacuten de osteoblastos (ceacutelulas encargadas de la formacioacuten del hueso)

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ENDOCRINOLOGIA

Glaacutendula suprarrenal

Las glaacutendulas con forma de triaacutengulo que estaacuten situadas encima de los rintildeones cuya funcioacuten es la de regular las respuestas al estreacutes a traveacutes de la siacutentesis de corticosteroides (principalmente cortisol) y catecolaminas (adrenalina sobre todo)

Capas de la glaacutendula suprarrenal

Introduccioacuten

Anatoacutemicamente las glaacutendulas suprarrenales estaacuten separadas situadas en la cara anterosuperior de los rintildeones y estaacuten irrigadas por la sangre que reciben de las suprarrenales (las suprarrenales superiores las suprarrenales medias y las suprarrenales inferiores) Estaacuten formadas por estructuras diferentes que son la meacutedula suprarrenal y la corteza suprarrenal ambas inervadas por el sistema nervioso autoacutenomo Como su nombre sugiere la meacutedula suprarrenal estaacute situada dentro de la glaacutendula rodeada por la corteza suprarrenal que forma la superficie

Meacutedula suprarrenal La suprarrenal o meacutedula adrenal estaacute compuesta principalmente por ceacutelulas cromafines productoras de hormonas siendo el principal oacutergano de conversioacuten del aminoaacutecido tirosina en catecolaminas epinefrina y norepinefrina tambieacuten llamadas adrenalina y noradrenalina respectivamente Las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal derivan embrioloacutegicamente de la cresta neural como neuronas modificadas Realmente estas ceacutelulas son ceacutelulas postganglionares del sistema nervioso simpaacutetico que reciben la inervacioacuten de ceacutelulas preganglionares Como las sinapsis entre fibras pre y postganglionares seon ganglios nerviosos autonoacutemicos la meacutedula suprarrenal puede considerarse como un ganglio nervioso del sistema nervioso simpaacutetico

En respuesta a una situacioacuten estresante como es el ejercicio fiacutesico o un peligro inminente las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal producen catecolaminas a la sangre en una relacioacuten 70 a 30 de epinefrina y norepinefrina respectivamente

Trabajo final Paacutegina 21

ENDOCRINOLOGIA

La epinefrina produce efectos importantes como el aumento de la frecuencia cardiacuteaca vasoconstriccioacuten broncodilatacioacuten y aumento del metabolismo que son respuestas muy fugaces

Corteza suprarrenal

La corteza suprarrenal o corteza adrenal estaacute situada rodeando la circunferencia de la glaacutendula suprarrenal Su funcioacuten es la de regular varios componentes del metabolismo con la produccioacuten de mineralcorticoides y glucocorticoides que incluyen a la aldosterona y cortisol La corteza suprarrenal tambieacuten es un lugar secundario de siacutentesis de androacutegenos

La corteza suprarrenal secreta hormonas esteroideas (de naturaleza lipidica) por lo que sus ceacutelulas presentan abundante REL (reticulo endoplasmaacutetico liso) y mitocondrias con crestas longitudinales al MET Se dispone en tres capas diferentes de tejido basado en los tipos celulares y la funcioacuten que realizan

Zona glomerular Produccioacuten de mineralocorticoides sobre todo aldosterona

Zona fascicular Produccioacuten de glucocorticoides principalmente cortisol cerca del 95

Zona reticular Produccioacuten de androacutegenos incluyendo testosterona

Zona glomerular

Las ceacutelulas de la zona glomerular de la corteza suprarrenal segregan mineralocorticoides como la aldosterona y la desoxicorticosterona en respuesta a un aumento de los niveles de potasio o descenso del flujo de sangre en los rintildeones La aldosterona es liberada a la sangre formando parte del sistema renina-angiotensina que regula la concentracioacuten de electrolitos en la sangre sobre todo de sodio y potasio actuando en el tuacutebulo contorneado distal de la nefrona de los rintildeones

Aumentando la excrecioacuten de potasio Aumentando la reabsorcioacuten de sodio

La Aldosterona es una hormona que ayuda a regular la presioacuten osmoacutetica de mi organismo Por ejemplo si en el plasma sanguiacuteneo hay una escasez de sales ([osmolaridad] baja) se secretaraacute mayor cantidad de Aldosterona para reabsorber maacutes sodio y por consiguiente normalizar los niveles Lo mismo si hay una concentracioacuten muy elevada de sales en la sangre (osmolaridad alta) se secretaraacute menos o se inhibiraacute la secrecioacuten de Aldosterona para no tener que reabsorber el Sodio y por consiguiente eliminarlo normalizando las concentraciones

Zona fascicular

Capa predominante en la corteza suprarrenal cuyas celulas se disponen en hileras separadas por tabiques y capilares Sus ceacutelulas se llaman espongiocitos

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ENDOCRINOLOGIA

porque son voluminosas y contienen numerosos granulos claros dando a su superficie un aspecto de esponja Estas ceacutelulas segregan glucocorticoides como el cortisol o hidrocortisona y la cortisona al ser estimuladas por la hormona adrenocorticotropica (ACTH) La ACTH es producida por la hipoacutefisis en respuesta al factor hipotalaacutemico estimulante de corticotropina (CRH) Estos tres oacuterganos del sistema endocrino forman el eje hipotaacutelamo-hipofisario-suprarrenal

El principal glucocorticoide producido por las glaacutendulas suprarrenales es el cortisol que cumple diferentes funciones en el metabolismo en muacuteltiples ceacutelulas del organismo como

Estimulacioacuten de la produccioacuten de aminoaacutecidos por el cuerpo rompiendo proteiacutenas proteoacutelisis

Estimulacioacuten de la lipoacutelisis es decir rompiendo la grasa

Estimulacioacuten gluconeogeacutenesis la produccioacuten de glucosa a partir de nuevas fuentes como los aminaacutecidos y la glicerina de los aacutecidos grasos

Mantenimiento de la glucosa inhibiendo su liberacioacuten desde el muacutesculo y del tejido adiposo

Los glucocorticoides aumentan las concentraciones de glucosa en sangre pues actuacutean como antagonistas de la insulina e inhiben su liberacioacuten lo que produce una disminucioacuten de la captacioacuten de glucosa por los tejidos esto favorece que aumente la siacutentesis de glucosa en el hiacutegado y aumente la cantidad de glucoacutegeno en este mismo

Los glucocorticoides tambieacuten tienen propiedades antiinflamatorias que estaacuten relacionadas con sus efectos sobre la microcirculacioacuten y la inhibicioacuten de las citocinas pro-inflamatorias (IL-1 e IL-6) prostaglandinas y linfocinas Por lo tanto regulan las respuestas inmunitarias a traveacutes del llamado eje inmunosuprarrenal

Tambieacuten el cortisol tiene efectos importantes sobre la regulacioacuten del agua corporal retrasando la entrada de este liacutequido del espacio extracelular al intracelular Por lo que favorece la eliminacioacuten renal de agua

El cortisol inhibe la secrecioacuten de la propiomelanocortina (precursor de ACTH) de la CRH (Hormona liberadora de Corticotropina producida por las ceacutelulas de la eminencia media del hipotaacutelamo) y de Vasopresina

Zona reticular

Es la maacutes interna y presenta ceacutelulas dispuestas en cordones entrecruzados o anastomosados que segregan esteroides sexuales como estroacutegenos y androacutegenos

Las ceacutelulas de la zona reticular producen una fuente secundaria de androacutegenos como testosterona dihidrotestosterona (DHT) androstendiona y

Trabajo final Paacutegina 23

ENDOCRINOLOGIA

dehidroepiandrosterona (DHEA) Estas hormonas aumentan la masa muscular estimulan el crecimiento celular y ayudan al desarrollo de los caracteres sexuales secundarios

Paacutencreas

El paacutencreas oacutergano que segrega enzimas digestivas que pasan al intestino delgado Estas enzimas ayudan en la ruptura de carbohidratos liacutepidos proteinas y aacutecidos nucleacuteicos en el quimo Tiene forma coacutenica con un proceso uniforme medial e inferior En la especie humana su longitud oscila entre 20 y 30 cm tiene una anchura de unos 4 cm y un grosor de 5 centiacutemetros con un peso 30g La cabeza se localiza en la concavidad del duodeno o asa duodenal formada por la segunda porcioacuten del duodeno

Histologiacutea del paacutencreas

El paacutencreas tiene una parte exocrina y una parte endocrina

La parte exocrina contiene unas glaacutendulas llamadas aacutecinos serosos que son redondos u ovalados con ceacutelulas epiteliales Formados por las celuacutelas acinosas y en parte por las centroacinosas

La parte endocrina se agrupa en islotes de Langerhans que consisten en cuacutemulos de ceacutelulas secretoras de hormonas que producen insulina glucagoacuten y somatostatina Estos tipos de ceacutelulas son los siguientes

Ceacutelula alfa (Alfa cell)

Estas ceacutelulas alfa sintetizan y liberan glucagoacuten El glucagoacuten aumenta el nivel de glucosa sanguiacutenea al estimular la formacioacuten de este carbohidrato a partir del glucoacutegeno almacenado en hepatocitos Tambieacuten ejerce efecto en el metabolismo de proteiacutenas y grasas La liberacioacuten del glucagoacuten es inhibida por la hiperglucemia Representan entre el 10 - 20 del volumen del islote y se distribuyen de forma perifeacuterica

Ceacutelula beta (Beta Cell)

Las ceacutelulas beta producen y liberan insulina hormona que regula el nivel de glucosa en la sangre (facilitando el uso de glucosa por parte de las ceacutelulas y retirando el exceso de glucosa que se almacena en el hiacutegado en forma de glucoacutegeno)

Trabajo final Paacutegina 24

ENDOCRINOLOGIA

En los diabeacuteticos tipo I las ceacutelulas beta han sido dantildeadas y no son capaces de producir la hormona

Ceacutelula delta (Delta Cell)

Las ceacutelulas delta producen somatostatina hormona que se cree que regulariacutea la produccioacuten y liberacioacuten de la insulina por las ceacutelulas beta y la produccioacuten y liberacioacuten de glucagoacuten por las ceacutelulas alfa

Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)

Estas ceacutelulas hacen que el estoacutemago produzca y libere la hormona Grelina

Ceacutelula F (PP CELL)

Estas ceacutelulas producen y liberan Polipeacuteptido Pancreaacutetico

Trabajo final Paacutegina 25

ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

Trabajo final Paacutegina 26

ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

Trabajo final Paacutegina 27

ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

Trabajo final Paacutegina 28

ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

Trabajo final Paacutegina 30

ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

Trabajo final Paacutegina 31

ENDOCRINOLOGIA

Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

Trabajo final Paacutegina 32

ENDOCRINOLOGIA

Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

Trabajo final Paacutegina 33

ENDOCRINOLOGIA

AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

Trabajo final Paacutegina 34

ENDOCRINOLOGIA

Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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ENDOCRINOLOGIA

cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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ENDOCRINOLOGIA

bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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ENDOCRINOLOGIA

Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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ENDOCRINOLOGIA

2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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ENDOCRINOLOGIA

52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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ENDOCRINOLOGIA

BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

Trabajo final Paacutegina 52

ENDOCRINOLOGIA

Trabajo final Paacutegina 53

  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
                                            • a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net
Page 2: Trabajo Final Endocrinologia

ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION A LAS HORMONAS Y A LA ENDOCRINOLOGIA

La endocrinologiacutea es la rama de la medicina encargada del estudio de los desoacuterdenes producidos por alteraciones de las glaacutendulas endocrinas que son aquellas que vierten su producto a la circulacioacuten sanguiacutenea Estas substancias dotadas de gran actividad bioloacutegica regulan todos los procesos metaboacutelicos del organismo y son en consecuencia indispensables para el mantenimiento de la vida

Las hormonas son sustancias segregadas por ceacutelulas especializadas localizadas en glaacutendulas de secrecioacuten interna o glaacutendulas endoacutecrinas (carentes de conductos) o tambieacuten por ceacutelulas epiteliales e intersticiales con el fin de afectar la funcioacuten de otras ceacutelulas Hay hormonas animales y hormonas vegetales como las auxinas aacutecido absciacutesico citoquinina giberelina y el etileno Las hormonas pertenecen al grupo de los mensajeros quiacutemicos que incluye tambieacuten a los neurotransmisores Las hormonas maacutes estudiadas en animales (y humanos) son las producidas por las glaacutendulas endocrinas pero tambieacuten son producidas por casi todos los oacuterganos humanos y animales

La especialidad meacutedica que se encarga del estudio de las enfermedades relacionadas con las hormonas es la endocrinologiacutea

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ENDOCRINOLOGIA

Tipos de hormonas seguacuten su naturaleza quiacutemica

Hormonas peptiacutedicas

Son derivados de aminoaacutecidos (como las hormonas tiroideas) o bien oligopeacuteptidos (como la vasopresina) o polipeacuteptidos (como la hormona del crecimiento) En general este tipo de hormonas no pueden atravesar la membrana plasmaacutetica de la ceacutelula diana por lo cual los receptores para estas hormonas se hallan en la superficie celular Las hormonas tiroideas son una excepcioacuten ya que se unen a receptores especiacuteficos que se hallan en el nuacutecleo

Hormonas lipiacutedicas

Son esteroides (como la testosterona) o eicosanoides (como las prostaglandinas) Dado su caraacutecter lipoacutefilo atraviesan sin problemas la bicapa lipiacutedica de las membranas celulares y sus receptores especiacuteficos se hallan en el interior de la ceacutelula diana

Mecanismo de accioacuten

Las Hormonas tienen la caracteriacutestica de actuar sobre las ceacutelulas diana que deben disponer de una serie de receptores especiacuteficos Hay dos tipos de receptores celulares

Receptores de membrana los usan las hormonas peptiacutedicas Las hormonas peptiacutedicas (1er mensajero) se fija a un receptor proteico que hay en la membrana de la ceacutelula y estimula la actividad de otra proteiacutena (unidad cataliacutetica) que hace pasar el ATP (intracelular) a AMP (2ordm mensajero) que junto con el calcio intracelular activa la enzima proteiacutena quinasa (responsable de producir la fosforilacioacuten de las proteiacutenas de la ceacutelula que produce una accioacuten bioloacutegica determinada) Esta es la teoriacutea o hipoacutetesis de 2ordm mensajero o de Sutherland

Receptores intracelulares los usan las hormonas esteroideas La hormona atraviesa la membrana de la ceacutelula diana por difusioacuten Una vez dentro del citoplasma penetra incluso en el nuacutecleo donde se fija el DNA y hace que se sintetice ARNm que induce a la siacutentesis de nuevas proteiacutenas que se traduciraacuten en una respuesta fisioloacutegica

Farmacologiacutea

Una gran cantidad de hormonas son usadas como medicamentos Las maacutes comuacutenmente usadas son estradiol y progesterona en las piacuteldoras anticonceptivas y en la terapia de reemplazo hormonal la tiroxina en forma de levotiroxina en el tratamiento para el hipotiroidismo los corticoides para enfermedades autoinmunes trastornos respiratorios severos y ciertos cuadros aleacutergicos La insulina es usada por muchos diabeacuteticos Preparaciones locales usadas en otorrinolaringologiacutea frecuentemente contienen equivalentes a la

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ENDOCRINOLOGIA

adrenalina Los esteroides y la vitamina D son componentes de ciertas cremas que se utilizan en dermatologiacutea

Principales glaacutendulas endoacutecrinas y hormonas que producen

Glaacutendula endocrina

hormonas tejido blanco

Acciones principales

Hipotaacutelamo (produccioacuten) Hipoacutefisis neurohipoacutefisis (almacenamiento y liberacioacuten)

Oxitocina Uacutetero Estimula las contracciones

Glaacutendulas mamarias

Estimula la expulsioacuten de leche hacia los conductos

Hormona antidiureacutetica (vasopresina)

Rintildeones (conductos colectores)

Estimula la reabsorcioacuten de agua conserva agua

Hipoacutefisis (produccioacuten) Loacutebulo anterior de la hipoacutefisis

Hormona del crecimiento (GH)

General Estimula el crecimiento al promover la siacutentesis de proteiacutenas

Prolactina Glaacutendulas mamarias

Estimula la produccioacuten de leche

Hormona estimulante del tiroides (TSH)

tiroides Estimula la secrecioacuten de hormonas tiroideas estimula el aumento de tamantildeo del tiroides

Hormona adrenocorticotroacutepica (ACTH)

Corteza suprarrenal

Estimula la secrecioacuten de hormonas corticosuprarrenales

Hormonas gonadotroacutepicas (foliculoestimulante FSH luteinizante LH)

Goacutenadas Estimula el funcionamiento y crecimiento gonadales

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ENDOCRINOLOGIA

Tiroides Tiroxina (T4) y triyodotironina (T3)

General Estimulan el metabolismo esencial para el crecimiento y desarrollo normal

Calcitonina Hueso Reduce la concentracioacuten sanguiacutenea de calcio inhibiendo la degradacioacuten oacutesea por osteoclastos

Glaacutendulas paratiroides

Hormona paratiroidea

Hueso rintildeones tubo digestivo

Incrementa la concentracioacuten sanguiacutenea de calcio estimulando la degradacioacuten oacutesea estimula la reabsorcioacuten de calcio por los rintildeones activa la vitamina D

Islotes de Langerhans del paacutencreas

Insulina General Reduce la concentracioacuten sanguiacutenea de glucosa facilitando la captacioacuten y el empleo de eacutesta por las ceacutelulas estimula la glucogeacutenesis estimula el almacenamiento de grasa y la siacutentesis de proteiacutena

Glucagoacuten Hiacutegado tejido adiposo

Eleva la concentracioacuten sanguiacutenea de la glucosa estimulando la glucogenoacutelisis y la gluconeogeacutenesis moviliza la grasa

Meacutedula suprarrenal

Adrenalina y noradrenalina

Muacutesculo miocardio vasos sanguiacuteneos hiacutegado tejido adiposo

Ayuda al organismo a afrontar el estres incrementa la frecuencia cardiaca la presioacuten arterial la tasa metaboacutelica desviacutea el riego sanguiacuteneo moviliza grasa eleva la concentracioacuten sanguiacutenea de azuacutecar

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ENDOCRINOLOGIA

Corteza suprarrenal

Mineralocorticoides (aldosterona)

Tuacutebulos renales

Mantiene el equilibrio de sodio y fosfato

Glucocorticoides (cortisol)

General Ayuda al organismo a adaptarse al estres a largo plazo eleva la concentracioacuten sanguiacutenea de glucosa moviliza grasa

Glaacutendula pineal Melatonina Goacutenadas ceacutelulas pigmentarias otros tejidos

Influye en los procesos reproductivos en cricetos y otros animales pigmentacioacuten en algunos vertebrados puede controlar biorritmos en algunos animales puede ayudar a controlar el inicio de la pubertad en el ser humano

Ovario Estroacutegenos (estradiol)

General uacutetero

Desarrollo y mantenimiento de caracteres sexuales femeninos estimula el crecimiento del revestimiento uterino

Progesterona Uacutetero mama Estimula el desarrollo del revestimiento uterino

Testiacuteculos Testosterona General estructuras reproductivas

Desarrollo y mantenimiento de caracteres sexuales masculinos promueve la espermatogeacutenesisproduce el crecimiento en la adolescencia

Inhibina Loacutebulo anterior de la hipoacutefisis

Inhibe la liberacioacuten de FSH

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ENDOCRINOLOGIA

Hipoacutefisis anterior y posterior Tiroides Paratiroides Suprarrenales y Paacutencreas

La hipoacutefisis o glaacutendula pituitaria

Es la glaacutendula que controla el resto de las glaacutendulas entre ellas la tiroides Es una glaacutendula compleja que se aloja en un espacio oacuteseo llamado silla turca del hueso esfenoides situada en la base del craacuteneo en la fosa cerebral media que conecta con el hipotaacutelamo a traveacutes del tallo pituitario o tallo hipofisario Tiene un peso aproximado de 05 g

Etimologiacutea

El teacutermino laquohipoacutefisisraquo proviene del griego hipo (lsquodebajorsquo) y fisis (lsquocrecerrsquo)

Partes

La hipoacutefisis consta de tres partes

Loacutebulo anterior o adenohipoacutefisis procede embrioloacutegicamente de un esbozo fariacutengeo (bolsa de Rathke) y es responsable de la secrecioacuten de numerosas hormonas (ver maacutes adelante)

Hipoacutefisis media o pars intermedia produce dos polipeacuteptidos llamados melanotropinas u hormonas estimulantes de los melanocitos que inducen el aumento de la siacutentesis de melanina de las ceacutelulas de la piel

Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo

Adenohipoacutefisis

La adenohipoacutefisis segrega muchas hormonas de las cuales seis son relevantes para la funcioacuten fisioloacutegica adecuada del organismo las cuales son segregadas por 5 tipos de ceacutelulas diferentes Estas ceacutelulas son de origen epitelial y como muchas glaacutendulas endocrinas estaacuten organizadas en lagunas rodeadas de capilares sinusoides fenestrados a los cuales se vierte su secrecioacuten hormonal Los tipos de ceacutelulas se clasificaban antes de acuerdo a su tincioacuten y eran acidoacutefilas basoacutefilas y cromoacutefobas (o que no se tintildeen) Pero en la actualidad se cuenta con teacutecnicas de inmunohistoquiacutemica y se han podido identificar 5 tipos celulares

Ceacutelulas somatoacutetropas que segregan GH (acidoacutefilas) Ceacutelulas lactotropas o mamoacutetropas que segregan PRL (acidoacutefilas)

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ENDOCRINOLOGIA

Ceacutelulas corticoacutetropas que segregan ACTH (basoacutefila)

Ceacutelulas gonadoacutetropas que segregan las gonadotropinas LH y FSH (basoacutefila)

Ceacutelulas tirotropas que secretan la TSH (basoacutefila)

Las ceacutelulas cromoacutefobas son en realidad ceacutelulas desgastadas y pueden haber sido cualquiera de las cinco anteriores

Hormonas de la adenohipoacutefisis

Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)

Prolactina (PRL) u hormona luteotroacutepica Estimula el desarrollo de los acinos mamarios y estimula la traduccioacuten de los genes para las proteiacutenas de la leche

Las demaacutes hormonas son hormonas troacuteficas que tienen su efecto en algunas glaacutendulas endocrinas perifeacutericas

Hormona estimulante del tiroides (TSH) o tirotropina Estimula la produccioacuten de hormonas por parte del tiroides

Hormona estimulante de la corteza suprarrenal (ACTH) o corticotropina Estimula la produccioacuten de hormonas por parte de las glaacutendulas suprarrenales

Hormona luteinizante (LH) Estimulan la produccioacuten de hormonas por parte de las goacutenadas y la ovulacioacuten

Hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Misma funcioacuten que la anterior

La LH y la FSH se denominan gonadotropinas ya que regulan la funcioacuten de las goacutenadas

Neurohipoacutefisis

La neurohipoacutefisis tiene un origen embrioloacutegico diferente al del resto de la hipoacutefisis mediante un crecimiento hacia abajo del hipotaacutelamo por lo que tiene funciones diferentes Se suele dividir a su vez en tres partes eminencia media infundibulo y pars nervosa de las cuales la uacuteltima es la maacutes funcional Las ceacutelulas de la neurohipoacutefisis se conocen como pituicitos y no son maacutes que ceacutelulas gliales de sosteacuten Por tanto la neurohipoacutefisis no es en realidad una glaacutendula secretora ya que se limita a almacenar los productos de secrecioacuten

Trabajo final Paacutegina 8

ENDOCRINOLOGIA

del hipotaacutelamo En efecto los axoplasmas de las neuronas de los nuacutecleos hipotalamicos supraoacuteptico y paraventricular secretan la ADH y la oxitocina respectivamente que se almacenan en las vesiacuteculas de los axones que de eacutel llegan a la neurohipoacutefisis dichas vesiacuteculas se liberan cerca del plexo primario hipofisiario en respuesta impulsos eleacutectricos por parte del hipotaacutelamo

Hormona antidiureacutetica (ADH) o vasopresina Se secreta en estiacutemulo a una disminucioacuten del volumen plasmaacutetico y como consecuencia de la disminucioacuten en la presioacuten arterial que esto ocasiona y su secrecioacuten aumenta la reabsorcioacuten de agua desde los tuacutebulos colectores renales por medio de la translocacioacuten a la membrana de la acuaporina II tambieacuten provoca una fuerte vasoconstriccioacuten por lo que tambieacuten es llamada vasopresina

Oxitocina Estimula la contraccioacuten de las ceacutelulas mioepiteliales de las glaacutendulas mamarias lo que causa la eyeccioacuten de leche por parte de la mama y se estimula por la succioacuten transmitiendo sentildeales al hipotalamo (retroalimentacioacuten) para que secrete mas oxitocina Causa contracciones del musculo liso del uacutetero en el orgasmo y tambieacuten los tiacutepicos espasmos de la etapa final del parto

Regulacioacuten hipotalaacutemica

La hipoacutefisis y el hipotaacutelamo estaacuten conectados por un sistema capilar denominado sistema portal el cual proviene de la arteria caroacutetida interna y del poliacutegono de Willis e irriga primero al hipotaacutelamo formando el plexo capilar primario que drena en los vasos porta hipofisiarios que a su vez forman el plexo capilar hipofisiario

La importancia de este sistema es que transporta las hormonas liberadoras o hipofisiotroacutepicas que secreta el hipotaacutelamo con fines reguladores de la secrecioacuten adenohipofisiaria Estas hormonas son

Somatoliberina (GHRH) Estimula la secrecioacuten de GH por parte de la hipoacutefisis

Corticoliberina (ARH) Estimula la secrecioacuten de ACTH por parte de la hipoacutefisis

Tiroliberina (TRH) Estimula la secrecioacuten de TSH por parte de la hipoacutefisis

Gonadoliberina (LHRH) Estimula la secrecioacuten de LH y FSH por parte de la hipoacutefisis

Hormona inhibidora de la GH (GHIH) o somatostatina Inhibe la secrecioacuten de la GH por parte de la hipoacutefisis

La prolactina estaacute regulada negativamente por dopamina un neurotransmisor

Trabajo final Paacutegina 9

ENDOCRINOLOGIA

Hay que tener en cuenta que la regulacioacuten de la secrecioacuten de las hormonas hipofisiarias se realiza mediante un mecanismo de retroalimentacioacuten negativa el cual se establece entre el hipotaacutelamo la hipofisis y los receptores especiacuteficos para cada hormona localizado en los oacuterganos diana

El proceso se realiza en el momento en que el sistema nervioso central recibe un estiacutemulo el hipotaacutelamo recibe parte de ese estiacutemulo y actuacutea sobre la hipoacutefisis a su vez el hipotaacutelamo secreta las respectivas hormonas en la adenohipoacutefisis o libera las de la neurohipoacutefisis estas se incorporan a la circulacioacuten viajan por medio de la sangre y son captados por receptores especiacuteficos ubicados en los oacuterganos diana un ejemplo es la captacioacuten de la TSH por parte de los loacutebulos tiroideos de la glaacutendula tiroides

En ese momento el oacutergano diana que en todo caso es cualquiera de las glaacutendulas endocrinas comienzan a secretar sus propias hormonas con lo que se enviacutea un estiacutemulo al sistema nervioso especiacuteficamente al hipotaacutelamo o directamente a la hipoacutefisis con lo cual se contrarresta el estiacutemulo inicial

TRASTORNOS ASOCIADOS A LA HIPOFISIS

Condicioacuten Etiologiacutea Hormona

Acromegalia sobreproduccioacuten hormona de crecimiento

Gigantismo sobreproduccioacuten hormona de crecimiento

Deficiencia de la hormona de crecimiento

baja produccioacuten hormona de crecimiento

Siacutendrome de secrecioacuten inadecuada de la hormona antidiureacutetica

sobreproduccioacuten vasopresina

Diabetes insiacutepida baja produccioacuten vasopresina

Siacutendrome de Sheehan baja produccioacuten cualquier hormona hipofisaria

Adenoma hipofisario sobreproduccioacuten cualquier hormona hipofisaria

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ENDOCRINOLOGIA

Hipopituitarismo baja produccioacuten cualquier hormona hipofisaria

HORMONAS DEL HIPOTALAMO

El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta

Suele considerarse el centro integrador del sistema nervioso vegetativo (o sistema nervioso autoacutenomo) dentro del sistema nervioso perifeacuterico Tambieacuten se encarga de realizar funciones de integracioacuten somato-vegetativa

En conjunto con la hipoacutefisis realiza la homeostasis del organismo por medio de un sistema de realimentacioacuten negativa

Anatomiacutea

El dienceacutefalo estaacute constituido por el taacutelamo el hipotaacutelamo el epitaacutelamo y el subtaacutelamo El taacutelamo son dos masas en el medio del cerebro entre los dos hemisferios cerebrales El hipotaacutelamo estaacute debajo del taacutelamo y sus liacutemites estaacuten constituidos por

superior el piso del III ventriacuteculo anterior el quiasma oacuteptico

inferior y lateral subtaacutelamo

posterior liacutenea imaginaria entre los cuerpos mamilares y la comisura posterior del cerebro

Nuacutecleos neuronales

nuacutecleos laterales se relacionan con el hambre preoacuteptico funcioacuten parasimpaacutetica

supraoacuteptico produce hormona antidiureacutetica

paraventricular produce oxitocina

hipotalaacutemico anterior centro de la sed

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ENDOCRINOLOGIA

supraquiasmaacutetico regulacioacuten del ciclo circadiano

ventromedial centro de la saciedad

arcuato interviene en la conducta emocional y actividad endoacutecrina

mamilar funcioacuten simpaacutetica

hipotalaacutemico posterior participan en la memoria

Funciones

El hipotaacutelamo regula el hambre el apetito y la saciedad por medio de hormonas y peacuteptidos como la colecistoquinina el nivel de glucosa y aacutecidos grasos en sangre y el neuropeacuteptido Y entre otros

El hipotaacutelamo anterior o rostral (parasimpaacutetico) disipa (difunde) el calor y el hipotaacutelamo posterior o caudal (simpaacutetico) se encarga de mantener la temperatura corporal constante5 aumentando o disminuyendo la frecuencia respiratoria y la sudoracioacuten

La porcioacuten anterior y posterior del hipotaacutelamo regula el ciclo del suentildeo y de la vigilia (ritmo circadiano)

Hormonas

El hipotaacutelamo en cuanto oacutergano endocrino se ocupa de liberar factores liberadores o inhibidores a la sangre pero tambieacuten es capaz de producir neurohormonas listas para su secrecioacuten

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ENDOCRINOLOGIA

Neurohormonas

El hipotaacutelamo produce en los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares la ADH (hormona antidiureacutetica) o vasopresina la cual se acumula en la neurohipoacutefisis desde donde es secretada La vasopresina regula el balance de agua en el cuerpo actuando sobre los rintildeones Esta hormona se almacena en la hipoacutefisis posterior de donde es liberada La disfuncioacuten del hipotaacutelamo en la produccioacuten de ADH causa diabetes insiacutepida

La oxitocina es tambieacuten producida por el hipotaacutelamo y almacenada y liberada por la neurohipoacutefisis tambieacuten comparte similitudes en su estructura proteiacutenica y llegan a compartir algunas funciones En el caso de los hombres se desconoce su funcionalidad pero se la asocia con los genitales externos y con receptores de la vesiacutecula seminal

En el caso de las mujeres la oxitocina acelera el nuacutemero de contracciones en el parto e influye al uacutetero a que se reacomode despueacutes del parto Tambieacuten incita a las fibras musculares que rodean a las ceacutelulas secretoras de leche de las glaacutendulas mamarias a secretar leche en respuesta al acto de mamar del nintildeo

Factores hipotalaacutemicos

Aparte de las dos hormonas de accioacuten directa mencionadas el hipotaacutelamo secreta diversas hormonas o factores que regulan la secrecioacuten de hormonas hipofisarias

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ENDOCRINOLOGIA

Hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH LHRH o LHRF) Es un decapeacuteptido (una cadena de 10 aminoaacutecidos) que actuacutea sobre la hipoacutefisis estimulando la produccioacuten y la liberacioacuten de la hormona luteinizante (LH) y la hormona foliculoestimulante (FSH) El balance de estas hormonas coordina el ciclo menstrual femenino y la espermatogeacutenesis en los hombres

Hormona liberadora de tirotropina (TRH) Es un tripeacuteptido (moleacutecula compuesta por tres aminoaacutecidos) Estimula la secrecioacuten de prolactina (PRL) y de tirotropina (TSH) por parte de la adenohipoacutefisis

Corte sagital medio del cerebro El punto blanco en frente del hipotaacutelamo es el quiasma oacuteptico debajo del cual estaacute la pituitaria La liacutenea blanca entre la pituitaria y el espacio negro es la silla turca (hueso)

Hormona liberadora de corticotropina (CRH o CRF) Se sintetiza en los nuacutecleos paraventriculares a partir de un precursor polipeptiacutedico de unos 41aminoaacutecidos y posee una vida larga (minutos) Las neuronas secretoras se encuentran en la porcioacuten anterior de los nuacutecleos paraventriculares y sus axones terminan en la capa externa de la eminencia media Estimula la liberacioacuten de adrenocorticotropina (ACTH) y β-endorfina por parte de la adenohipoacutefisis La hormona antidiureacutetica y la angiotensina II potencian el efecto liberador de CRH

Somatocrinina hormona liberadora de somatotropina (STH) o factor liberador de hormona del crecimiento (GRF) Las neuronas productoras de este factor se encuentran en el nuacutecleo arcuato del hipotaacutelamo Se sintetiza a partir de un precursor de 107 o 108 aminoaacutecidos Estimula la liberacioacuten de la hormona del crecimiento hipofisaria (GH)

Somatostatina u hormona inhibidora de la liberacioacuten de somatotropina (GIH) Como su nombre indica inhibe la secrecioacuten de somatotropinay de otras hormonas como la insulina el glucagoacuten el polipeacuteptido pancreaacutetico y la TSH La zona secretora se encuentra en la regioacuten periventricular del hipotaacutelamo Es un tetradecapeacuteptido que se encuentra en el hipotaacutelamo y en las ceacutelulas D de los islotes de Langerhans Su precursor posee 116 aminoaacutecidos Hormona liberadora de corticotropina

PIF (Factor inhibidor de la liberacioacuten de prolactina) Actuacutea en forma constante inhibiendo la secrecioacuten de prolactina hipofisaria Dado que la dopamina inhibe tambieacuten la produccioacuten de prolactina al unirse a las

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ENDOCRINOLOGIA

ceacutelulas lactotropas de la hipoacutefisis durante alguacuten tiempo se pensoacute que se trataba de PIF la dopamina puede ser un PIF secundario Las neuronas secretoras de PIF se encuentran en el nuacutecleo arcuato hipotalaacutemico

Angiotensina II (AII) Es un octapeacuteptido que estimula la accioacuten de la hormona liberadora de corticotropina libera algo de adrenocorticotropina hipofisaria

Hormona tiroidea

Las hormonas tiroideas son producidas por la glaacutendula tiroides Su efecto es el aumento del metabolismo basal lo cual es indispensable para un correcto desarrollo fetal y el funcionamiento adecuado de los sistemas cardiovascular musculoesqueleacutetico hematopoyeacutetico asiacute como para respuestas corporales adecuadas en cuanto a produccioacuten de calor consumo de oxiacutegeno y regulacioacuten de otros sistemas hormonales

Tipos de hormona tiroidea

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ENDOCRINOLOGIA

T4 T3

Existen tres hormonas circulantescirculantesco grande

T4 tetrayodotironina o tiroxina T3 o triyodotironina

T3 reversa Esta es bioloacutegicamente inactiva

Los niveles plasmaacuteticos de estas hormonas se mantienen estables durante toda la vida con excepcioacuten del periacuteodo neonatal y en algunas enfermedades o con el uso de algunos faacutermacos

Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas

Los yoduros que se ingieren en los alimentos y en el agua son concentrados de forma activa por la glaacutendula tiroides convertidos a yodo orgaacutenico por la peroxidasa tiroidea e incorporados a la tirosina en la tiroglobulina intrafolicular contenida en el coloide de la superficie apical de la ceacutelula folicular del tiroides

Las tirosinas son yodadas en un lugar (monoyodotirosina) o en dos (diyodotirosina) y se acoplan para formar las hormonas activas

diyodotirosina + diyodotirosina (r) --gt tetrayodotironina [tiroxina T4] diyodotirosina + monoyodotirosina( r) --gt triyodotironina [T3]

Otra fuente de T3 en el interior de la glaacutendula tiroides es el producto de la monodesyodacioacuten del anillo externo de la T4 por una selenoenzima la desyodasa tipo I (5-D-I) Esta enzima se encuentra tambieacuten en el hiacutegado y los rintildeones La T3 resultante pasa a la circulacioacuten Tambieacuten existe una isoenzima que efectuacutea la misma reaccioacuten llamada desyodasa tipo II que se encuentra en el cerebro y la hipoacutefisis La T3 resultante actuacutea localmente2

La tiroglobulina una glucoproteiacutena que contiene T3 y T4 en su matriz es captada por el foliacuteculo en forma de gotitas de coloide por las ceacutelulas tiroideas

Todas las reacciones necesarias para la formacioacuten de T3 y T4 son influidas y controladas por la hormona estimulante del tiroides (TSH) llamada tambieacuten tirotropina que estimula las ceacutelulas foliculares en la glaacutendula tiroides

Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas se metabolizan principalmente en el hiacutegado Producto de una conjugacioacuten con los aacutecidos glucoroacutenico y sulfuacuterico por medio de un grupo hidroxilo fenoacutelico se genera una forma excretable a traveacutes de la bilis

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ENDOCRINOLOGIA

Una parte de los productos conjugados eliminados por la bilis se hidroliza y se absorbe como hormona activa en el intestino Es un fenoacutemeno conocido como circulacioacuten enterohepaacutetica El resto se elimina por las heces

En la circulacioacuten sanguiacutenea la T4 se metaboliza a T3 y T3 reversa las que a su vez se desyodan produceacutendose diyodotironinas inactivas

Efectos de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas tienen dos efectos fisioloacutegicos principales

1 Aumentan la siacutentesis de proteiacutenas praacutecticamente en todos los tejidos del organismo (La T3 y la T4 penetran en las ceacutelulas donde la T3 que se obtiene de la circulacioacuten y por la conversioacuten de T4 en T3 dentro de la ceacutelula se une a receptores nucleares individuales e influye sobre la formacioacuten de ARNm)

2 La T3 incrementa el consumo de oxiacutegeno mediante el aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa (bomba sodio-potasio) sobre todo en los tejidos responsables del consumo basal de oxiacutegeno (es decir hiacutegado rintildeoacuten corazoacuten y muacutesculo esqueleacutetico) El aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa es secundario al incremento de la siacutentesis de esta enzima por consiguiente el aumento del consumo de oxiacutegeno probablemente tambieacuten estaacute relacionado con la fijacioacuten nuclear de hormonas tiroideas No obstante no se ha descartado un efecto directo de la T3 sobre la mitocondria Se cree que la T3 es la hormona tiroidea activa aunque la misma T4 pueda ser bioloacutegicamente activa

Efectos fisioloacutegicos

Desarrollo normal del sistema nervioso central en el feto Funcionamiento normal del sistema nervioso central Su falta enlentece

su funcionamiento

Generacioacuten de calor

Efectos cronotroacutepico e inotroacutepico en el sistema cardiovascular

Aumenta el nuacutemero de receptores para catecolaminas y amplifica la respuesta postreceptor en el sistema simpaacutetico3

Aumenta la eritropoyetina

Regula el metabolismo oacuteseo

Permite la relajacioacuten muscular

Interviene en los niveles de produccioacuten de hormonas gonadotrofinas y somatotropa o GH

Permite la correcta respuesta del centro respiratorio a la hipoxia e hipercapnia

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ENDOCRINOLOGIA

Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma

Las hormonas tiroideas circulan unidas a proteiacutenas plasmaacuteticas Un porcentaje bajo de T4 y T3 circula libremente por la sangre y es de este porcentaje bajo de hormona que depende la accioacuten hormonal sobre los receptores celulares

Las proteiacutenas a las que se unen las hormonas tiroideas son

Globulina transportadora de tiroxina o TBG (del ingleacutes Thyroxin Binding Globulin)

Prealbuacutemina transportadora de tiroxina o TBPA (del ingleacutes Thyroxin Binding Pre Albumin)

Albuacutemina

Ya que existen factores que afectan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas mencionadas modificando la cantidad de hormona libre es muy importante medir la hormona libre en el plasma para evaluar la condicioacuten fisiopatoloacutegica en estudio

Por ejemplo los siguientes faacutermacos compiten con las hormonas tiroideas por su unioacuten con las proteiacutenas transportadoras

Salicilatos Hidantoiacutenas

Algunos antiinflamatorios no esteroideos como el Diclofenaco y el aacutecido mefenaacutemico

Furosemida

Por el contrario los siguientes faacutermacos incrementan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas transportadoras

Estroacutegenos Metadona

Clofibrato

Heroiacutena

Tamoxifeno

En el embarazo tambieacuten se modifica la afinidad de las hormonas tiroideas por las proteiacutenas transportadoras aumentando esta unioacuten y disminuyendo la hormona libre

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ENDOCRINOLOGIA

Paratiroides

Las glaacutendulas paratiroides son glaacutendulas endocrinas Situadas en el cuello generalmente localizadas en los polos De la glaacutendula tiroides que producen La hormona paratiroidea o paratohormona Por lo general hay cuatro glaacutendulas paratiroides Dos superiores y dos inferiores pero de forma ocasional puede haber cinco o maacutes Cuando existe alguna glaacutendula adicional eacutesta suele encontrarse en el mediastino en relacioacuten con el timo o dentro de la glaacutendula tiroides

La hormona paratiroidea participa en el control de la homeostasis del calcio y foacutesforo asiacute como en la fisiologiacutea del hueso

El exceso de funcioacuten de las glaacutendulas paratiroides se conoce como hiperparatiroidismo y suele cursar con elevacioacuten de los niveles plasmaacuteticos de calcio y fragilidad oacutesea que condiciona una mayor susceptibilidad a padecer fracturas La funcioacuten insuficiente de las glaacutendulas paratiroides (hipoparatiroidismo) es mucho menos frecuente y generalmente se presenta tras una cirugiacutea sobre la glaacutendula tiroides que conlleva la existencia de hipocalcemia Existen algunas enfermedades mucho maacutes raras que parecen deberse a alteraciones en el receptor de la hormona paratiroidea como la condroplasia metafiseal de Jansen y la condroplasia de Blomstrand

Hormona paratiroidea o parathormona Es secretada por las ceacutelulas principales de la glaacutendula paratiroides es un polipeacuteptido de 84 aminoaacutecidos cuyo peso molecular es de aproximadamente 9500 Daltons Facilita la absorcioacuten del calcio Vitamina D (en su forma natural) y fosfato conjuntamente en el intestino Aumenta la resorcioacuten de los huesos Mediante la produccioacuten de maacutes osteoclastos a partir de las ceacutelulas madre mesenquimatosas de la meacutedula oacutesea y retrasando la conversioacuten de estas en osteoblastos Los osteoclastos absorben el hueso mediante la liberacioacuten de hormonas proteoliacuteticas liberadas por lisosomas y la secrecioacuten de varios aacutecidos entre ellos el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido laacutectico Aumenta la reabsorcioacuten del calcio y reduce la resorcioacuten del fosfato en los tuacutebulos renales provocando que este salga en la orina en mayor concentracioacuten Aumenta la resorcioacuten del calcio en el intestino Induce un incremento en la formacioacuten del 125-dihidroxicolecalciferol (forma activa de la Vitamina D calitriol o Vitamina D3) a partir del 25-hidroxicolecalciferol (calcifediol) en los rintildeones la vitamina D3 luego actuacutea a nivel del epitelio intestinal aumentando la absorcioacuten del calcio aumentando asiacute los

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ENDOCRINOLOGIA

niveles de calcio plasmaacuteticos (valor normal del calcio plasmaacutetico 92-104 mgdl) Luego por un mecanismo de retroaccioacuten o retroalimentacioacuten negativa elevadas concentraciones de calcio plasmaacuteticos inhiben la secrecioacuten de la PTH (Hormona paratiroidea)ademaacutes ayuda a la reabsorcion del calcio por medio de los rintildeones

Calcitonina Secretada por las ceacutelulas parafoliculares en la Tiroides es un polipeacuteptido de 32 aminoaacutecidos con un peso molecular aproximado de 3000 Daltons aproximadamente Tiene una funcioacuten opuesta a la Hormona Paratiroidea disminuye la actividad osteoclaacutestica desacelera la formacioacuten de los osteoclastos y acelera la formacioacuten de osteoblastos (ceacutelulas encargadas de la formacioacuten del hueso)

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ENDOCRINOLOGIA

Glaacutendula suprarrenal

Las glaacutendulas con forma de triaacutengulo que estaacuten situadas encima de los rintildeones cuya funcioacuten es la de regular las respuestas al estreacutes a traveacutes de la siacutentesis de corticosteroides (principalmente cortisol) y catecolaminas (adrenalina sobre todo)

Capas de la glaacutendula suprarrenal

Introduccioacuten

Anatoacutemicamente las glaacutendulas suprarrenales estaacuten separadas situadas en la cara anterosuperior de los rintildeones y estaacuten irrigadas por la sangre que reciben de las suprarrenales (las suprarrenales superiores las suprarrenales medias y las suprarrenales inferiores) Estaacuten formadas por estructuras diferentes que son la meacutedula suprarrenal y la corteza suprarrenal ambas inervadas por el sistema nervioso autoacutenomo Como su nombre sugiere la meacutedula suprarrenal estaacute situada dentro de la glaacutendula rodeada por la corteza suprarrenal que forma la superficie

Meacutedula suprarrenal La suprarrenal o meacutedula adrenal estaacute compuesta principalmente por ceacutelulas cromafines productoras de hormonas siendo el principal oacutergano de conversioacuten del aminoaacutecido tirosina en catecolaminas epinefrina y norepinefrina tambieacuten llamadas adrenalina y noradrenalina respectivamente Las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal derivan embrioloacutegicamente de la cresta neural como neuronas modificadas Realmente estas ceacutelulas son ceacutelulas postganglionares del sistema nervioso simpaacutetico que reciben la inervacioacuten de ceacutelulas preganglionares Como las sinapsis entre fibras pre y postganglionares seon ganglios nerviosos autonoacutemicos la meacutedula suprarrenal puede considerarse como un ganglio nervioso del sistema nervioso simpaacutetico

En respuesta a una situacioacuten estresante como es el ejercicio fiacutesico o un peligro inminente las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal producen catecolaminas a la sangre en una relacioacuten 70 a 30 de epinefrina y norepinefrina respectivamente

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ENDOCRINOLOGIA

La epinefrina produce efectos importantes como el aumento de la frecuencia cardiacuteaca vasoconstriccioacuten broncodilatacioacuten y aumento del metabolismo que son respuestas muy fugaces

Corteza suprarrenal

La corteza suprarrenal o corteza adrenal estaacute situada rodeando la circunferencia de la glaacutendula suprarrenal Su funcioacuten es la de regular varios componentes del metabolismo con la produccioacuten de mineralcorticoides y glucocorticoides que incluyen a la aldosterona y cortisol La corteza suprarrenal tambieacuten es un lugar secundario de siacutentesis de androacutegenos

La corteza suprarrenal secreta hormonas esteroideas (de naturaleza lipidica) por lo que sus ceacutelulas presentan abundante REL (reticulo endoplasmaacutetico liso) y mitocondrias con crestas longitudinales al MET Se dispone en tres capas diferentes de tejido basado en los tipos celulares y la funcioacuten que realizan

Zona glomerular Produccioacuten de mineralocorticoides sobre todo aldosterona

Zona fascicular Produccioacuten de glucocorticoides principalmente cortisol cerca del 95

Zona reticular Produccioacuten de androacutegenos incluyendo testosterona

Zona glomerular

Las ceacutelulas de la zona glomerular de la corteza suprarrenal segregan mineralocorticoides como la aldosterona y la desoxicorticosterona en respuesta a un aumento de los niveles de potasio o descenso del flujo de sangre en los rintildeones La aldosterona es liberada a la sangre formando parte del sistema renina-angiotensina que regula la concentracioacuten de electrolitos en la sangre sobre todo de sodio y potasio actuando en el tuacutebulo contorneado distal de la nefrona de los rintildeones

Aumentando la excrecioacuten de potasio Aumentando la reabsorcioacuten de sodio

La Aldosterona es una hormona que ayuda a regular la presioacuten osmoacutetica de mi organismo Por ejemplo si en el plasma sanguiacuteneo hay una escasez de sales ([osmolaridad] baja) se secretaraacute mayor cantidad de Aldosterona para reabsorber maacutes sodio y por consiguiente normalizar los niveles Lo mismo si hay una concentracioacuten muy elevada de sales en la sangre (osmolaridad alta) se secretaraacute menos o se inhibiraacute la secrecioacuten de Aldosterona para no tener que reabsorber el Sodio y por consiguiente eliminarlo normalizando las concentraciones

Zona fascicular

Capa predominante en la corteza suprarrenal cuyas celulas se disponen en hileras separadas por tabiques y capilares Sus ceacutelulas se llaman espongiocitos

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ENDOCRINOLOGIA

porque son voluminosas y contienen numerosos granulos claros dando a su superficie un aspecto de esponja Estas ceacutelulas segregan glucocorticoides como el cortisol o hidrocortisona y la cortisona al ser estimuladas por la hormona adrenocorticotropica (ACTH) La ACTH es producida por la hipoacutefisis en respuesta al factor hipotalaacutemico estimulante de corticotropina (CRH) Estos tres oacuterganos del sistema endocrino forman el eje hipotaacutelamo-hipofisario-suprarrenal

El principal glucocorticoide producido por las glaacutendulas suprarrenales es el cortisol que cumple diferentes funciones en el metabolismo en muacuteltiples ceacutelulas del organismo como

Estimulacioacuten de la produccioacuten de aminoaacutecidos por el cuerpo rompiendo proteiacutenas proteoacutelisis

Estimulacioacuten de la lipoacutelisis es decir rompiendo la grasa

Estimulacioacuten gluconeogeacutenesis la produccioacuten de glucosa a partir de nuevas fuentes como los aminaacutecidos y la glicerina de los aacutecidos grasos

Mantenimiento de la glucosa inhibiendo su liberacioacuten desde el muacutesculo y del tejido adiposo

Los glucocorticoides aumentan las concentraciones de glucosa en sangre pues actuacutean como antagonistas de la insulina e inhiben su liberacioacuten lo que produce una disminucioacuten de la captacioacuten de glucosa por los tejidos esto favorece que aumente la siacutentesis de glucosa en el hiacutegado y aumente la cantidad de glucoacutegeno en este mismo

Los glucocorticoides tambieacuten tienen propiedades antiinflamatorias que estaacuten relacionadas con sus efectos sobre la microcirculacioacuten y la inhibicioacuten de las citocinas pro-inflamatorias (IL-1 e IL-6) prostaglandinas y linfocinas Por lo tanto regulan las respuestas inmunitarias a traveacutes del llamado eje inmunosuprarrenal

Tambieacuten el cortisol tiene efectos importantes sobre la regulacioacuten del agua corporal retrasando la entrada de este liacutequido del espacio extracelular al intracelular Por lo que favorece la eliminacioacuten renal de agua

El cortisol inhibe la secrecioacuten de la propiomelanocortina (precursor de ACTH) de la CRH (Hormona liberadora de Corticotropina producida por las ceacutelulas de la eminencia media del hipotaacutelamo) y de Vasopresina

Zona reticular

Es la maacutes interna y presenta ceacutelulas dispuestas en cordones entrecruzados o anastomosados que segregan esteroides sexuales como estroacutegenos y androacutegenos

Las ceacutelulas de la zona reticular producen una fuente secundaria de androacutegenos como testosterona dihidrotestosterona (DHT) androstendiona y

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ENDOCRINOLOGIA

dehidroepiandrosterona (DHEA) Estas hormonas aumentan la masa muscular estimulan el crecimiento celular y ayudan al desarrollo de los caracteres sexuales secundarios

Paacutencreas

El paacutencreas oacutergano que segrega enzimas digestivas que pasan al intestino delgado Estas enzimas ayudan en la ruptura de carbohidratos liacutepidos proteinas y aacutecidos nucleacuteicos en el quimo Tiene forma coacutenica con un proceso uniforme medial e inferior En la especie humana su longitud oscila entre 20 y 30 cm tiene una anchura de unos 4 cm y un grosor de 5 centiacutemetros con un peso 30g La cabeza se localiza en la concavidad del duodeno o asa duodenal formada por la segunda porcioacuten del duodeno

Histologiacutea del paacutencreas

El paacutencreas tiene una parte exocrina y una parte endocrina

La parte exocrina contiene unas glaacutendulas llamadas aacutecinos serosos que son redondos u ovalados con ceacutelulas epiteliales Formados por las celuacutelas acinosas y en parte por las centroacinosas

La parte endocrina se agrupa en islotes de Langerhans que consisten en cuacutemulos de ceacutelulas secretoras de hormonas que producen insulina glucagoacuten y somatostatina Estos tipos de ceacutelulas son los siguientes

Ceacutelula alfa (Alfa cell)

Estas ceacutelulas alfa sintetizan y liberan glucagoacuten El glucagoacuten aumenta el nivel de glucosa sanguiacutenea al estimular la formacioacuten de este carbohidrato a partir del glucoacutegeno almacenado en hepatocitos Tambieacuten ejerce efecto en el metabolismo de proteiacutenas y grasas La liberacioacuten del glucagoacuten es inhibida por la hiperglucemia Representan entre el 10 - 20 del volumen del islote y se distribuyen de forma perifeacuterica

Ceacutelula beta (Beta Cell)

Las ceacutelulas beta producen y liberan insulina hormona que regula el nivel de glucosa en la sangre (facilitando el uso de glucosa por parte de las ceacutelulas y retirando el exceso de glucosa que se almacena en el hiacutegado en forma de glucoacutegeno)

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ENDOCRINOLOGIA

En los diabeacuteticos tipo I las ceacutelulas beta han sido dantildeadas y no son capaces de producir la hormona

Ceacutelula delta (Delta Cell)

Las ceacutelulas delta producen somatostatina hormona que se cree que regulariacutea la produccioacuten y liberacioacuten de la insulina por las ceacutelulas beta y la produccioacuten y liberacioacuten de glucagoacuten por las ceacutelulas alfa

Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)

Estas ceacutelulas hacen que el estoacutemago produzca y libere la hormona Grelina

Ceacutelula F (PP CELL)

Estas ceacutelulas producen y liberan Polipeacuteptido Pancreaacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

Trabajo final Paacutegina 26

ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

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ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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ENDOCRINOLOGIA

Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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ENDOCRINOLOGIA

Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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ENDOCRINOLOGIA

AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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ENDOCRINOLOGIA

5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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ENDOCRINOLOGIA

como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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ENDOCRINOLOGIA

cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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ENDOCRINOLOGIA

se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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ENDOCRINOLOGIA

bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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ENDOCRINOLOGIA

Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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ENDOCRINOLOGIA

La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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ENDOCRINOLOGIA

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ENDOCRINOLOGIA

Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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ENDOCRINOLOGIA

susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ENDOCRINOLOGIA

ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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ENDOCRINOLOGIA

Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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ENDOCRINOLOGIA

BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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ENDOCRINOLOGIA

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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Page 3: Trabajo Final Endocrinologia

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Tipos de hormonas seguacuten su naturaleza quiacutemica

Hormonas peptiacutedicas

Son derivados de aminoaacutecidos (como las hormonas tiroideas) o bien oligopeacuteptidos (como la vasopresina) o polipeacuteptidos (como la hormona del crecimiento) En general este tipo de hormonas no pueden atravesar la membrana plasmaacutetica de la ceacutelula diana por lo cual los receptores para estas hormonas se hallan en la superficie celular Las hormonas tiroideas son una excepcioacuten ya que se unen a receptores especiacuteficos que se hallan en el nuacutecleo

Hormonas lipiacutedicas

Son esteroides (como la testosterona) o eicosanoides (como las prostaglandinas) Dado su caraacutecter lipoacutefilo atraviesan sin problemas la bicapa lipiacutedica de las membranas celulares y sus receptores especiacuteficos se hallan en el interior de la ceacutelula diana

Mecanismo de accioacuten

Las Hormonas tienen la caracteriacutestica de actuar sobre las ceacutelulas diana que deben disponer de una serie de receptores especiacuteficos Hay dos tipos de receptores celulares

Receptores de membrana los usan las hormonas peptiacutedicas Las hormonas peptiacutedicas (1er mensajero) se fija a un receptor proteico que hay en la membrana de la ceacutelula y estimula la actividad de otra proteiacutena (unidad cataliacutetica) que hace pasar el ATP (intracelular) a AMP (2ordm mensajero) que junto con el calcio intracelular activa la enzima proteiacutena quinasa (responsable de producir la fosforilacioacuten de las proteiacutenas de la ceacutelula que produce una accioacuten bioloacutegica determinada) Esta es la teoriacutea o hipoacutetesis de 2ordm mensajero o de Sutherland

Receptores intracelulares los usan las hormonas esteroideas La hormona atraviesa la membrana de la ceacutelula diana por difusioacuten Una vez dentro del citoplasma penetra incluso en el nuacutecleo donde se fija el DNA y hace que se sintetice ARNm que induce a la siacutentesis de nuevas proteiacutenas que se traduciraacuten en una respuesta fisioloacutegica

Farmacologiacutea

Una gran cantidad de hormonas son usadas como medicamentos Las maacutes comuacutenmente usadas son estradiol y progesterona en las piacuteldoras anticonceptivas y en la terapia de reemplazo hormonal la tiroxina en forma de levotiroxina en el tratamiento para el hipotiroidismo los corticoides para enfermedades autoinmunes trastornos respiratorios severos y ciertos cuadros aleacutergicos La insulina es usada por muchos diabeacuteticos Preparaciones locales usadas en otorrinolaringologiacutea frecuentemente contienen equivalentes a la

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ENDOCRINOLOGIA

adrenalina Los esteroides y la vitamina D son componentes de ciertas cremas que se utilizan en dermatologiacutea

Principales glaacutendulas endoacutecrinas y hormonas que producen

Glaacutendula endocrina

hormonas tejido blanco

Acciones principales

Hipotaacutelamo (produccioacuten) Hipoacutefisis neurohipoacutefisis (almacenamiento y liberacioacuten)

Oxitocina Uacutetero Estimula las contracciones

Glaacutendulas mamarias

Estimula la expulsioacuten de leche hacia los conductos

Hormona antidiureacutetica (vasopresina)

Rintildeones (conductos colectores)

Estimula la reabsorcioacuten de agua conserva agua

Hipoacutefisis (produccioacuten) Loacutebulo anterior de la hipoacutefisis

Hormona del crecimiento (GH)

General Estimula el crecimiento al promover la siacutentesis de proteiacutenas

Prolactina Glaacutendulas mamarias

Estimula la produccioacuten de leche

Hormona estimulante del tiroides (TSH)

tiroides Estimula la secrecioacuten de hormonas tiroideas estimula el aumento de tamantildeo del tiroides

Hormona adrenocorticotroacutepica (ACTH)

Corteza suprarrenal

Estimula la secrecioacuten de hormonas corticosuprarrenales

Hormonas gonadotroacutepicas (foliculoestimulante FSH luteinizante LH)

Goacutenadas Estimula el funcionamiento y crecimiento gonadales

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Tiroides Tiroxina (T4) y triyodotironina (T3)

General Estimulan el metabolismo esencial para el crecimiento y desarrollo normal

Calcitonina Hueso Reduce la concentracioacuten sanguiacutenea de calcio inhibiendo la degradacioacuten oacutesea por osteoclastos

Glaacutendulas paratiroides

Hormona paratiroidea

Hueso rintildeones tubo digestivo

Incrementa la concentracioacuten sanguiacutenea de calcio estimulando la degradacioacuten oacutesea estimula la reabsorcioacuten de calcio por los rintildeones activa la vitamina D

Islotes de Langerhans del paacutencreas

Insulina General Reduce la concentracioacuten sanguiacutenea de glucosa facilitando la captacioacuten y el empleo de eacutesta por las ceacutelulas estimula la glucogeacutenesis estimula el almacenamiento de grasa y la siacutentesis de proteiacutena

Glucagoacuten Hiacutegado tejido adiposo

Eleva la concentracioacuten sanguiacutenea de la glucosa estimulando la glucogenoacutelisis y la gluconeogeacutenesis moviliza la grasa

Meacutedula suprarrenal

Adrenalina y noradrenalina

Muacutesculo miocardio vasos sanguiacuteneos hiacutegado tejido adiposo

Ayuda al organismo a afrontar el estres incrementa la frecuencia cardiaca la presioacuten arterial la tasa metaboacutelica desviacutea el riego sanguiacuteneo moviliza grasa eleva la concentracioacuten sanguiacutenea de azuacutecar

Trabajo final Paacutegina 5

ENDOCRINOLOGIA

Corteza suprarrenal

Mineralocorticoides (aldosterona)

Tuacutebulos renales

Mantiene el equilibrio de sodio y fosfato

Glucocorticoides (cortisol)

General Ayuda al organismo a adaptarse al estres a largo plazo eleva la concentracioacuten sanguiacutenea de glucosa moviliza grasa

Glaacutendula pineal Melatonina Goacutenadas ceacutelulas pigmentarias otros tejidos

Influye en los procesos reproductivos en cricetos y otros animales pigmentacioacuten en algunos vertebrados puede controlar biorritmos en algunos animales puede ayudar a controlar el inicio de la pubertad en el ser humano

Ovario Estroacutegenos (estradiol)

General uacutetero

Desarrollo y mantenimiento de caracteres sexuales femeninos estimula el crecimiento del revestimiento uterino

Progesterona Uacutetero mama Estimula el desarrollo del revestimiento uterino

Testiacuteculos Testosterona General estructuras reproductivas

Desarrollo y mantenimiento de caracteres sexuales masculinos promueve la espermatogeacutenesisproduce el crecimiento en la adolescencia

Inhibina Loacutebulo anterior de la hipoacutefisis

Inhibe la liberacioacuten de FSH

Trabajo final Paacutegina 6

ENDOCRINOLOGIA

Hipoacutefisis anterior y posterior Tiroides Paratiroides Suprarrenales y Paacutencreas

La hipoacutefisis o glaacutendula pituitaria

Es la glaacutendula que controla el resto de las glaacutendulas entre ellas la tiroides Es una glaacutendula compleja que se aloja en un espacio oacuteseo llamado silla turca del hueso esfenoides situada en la base del craacuteneo en la fosa cerebral media que conecta con el hipotaacutelamo a traveacutes del tallo pituitario o tallo hipofisario Tiene un peso aproximado de 05 g

Etimologiacutea

El teacutermino laquohipoacutefisisraquo proviene del griego hipo (lsquodebajorsquo) y fisis (lsquocrecerrsquo)

Partes

La hipoacutefisis consta de tres partes

Loacutebulo anterior o adenohipoacutefisis procede embrioloacutegicamente de un esbozo fariacutengeo (bolsa de Rathke) y es responsable de la secrecioacuten de numerosas hormonas (ver maacutes adelante)

Hipoacutefisis media o pars intermedia produce dos polipeacuteptidos llamados melanotropinas u hormonas estimulantes de los melanocitos que inducen el aumento de la siacutentesis de melanina de las ceacutelulas de la piel

Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo

Adenohipoacutefisis

La adenohipoacutefisis segrega muchas hormonas de las cuales seis son relevantes para la funcioacuten fisioloacutegica adecuada del organismo las cuales son segregadas por 5 tipos de ceacutelulas diferentes Estas ceacutelulas son de origen epitelial y como muchas glaacutendulas endocrinas estaacuten organizadas en lagunas rodeadas de capilares sinusoides fenestrados a los cuales se vierte su secrecioacuten hormonal Los tipos de ceacutelulas se clasificaban antes de acuerdo a su tincioacuten y eran acidoacutefilas basoacutefilas y cromoacutefobas (o que no se tintildeen) Pero en la actualidad se cuenta con teacutecnicas de inmunohistoquiacutemica y se han podido identificar 5 tipos celulares

Ceacutelulas somatoacutetropas que segregan GH (acidoacutefilas) Ceacutelulas lactotropas o mamoacutetropas que segregan PRL (acidoacutefilas)

Trabajo final Paacutegina 7

ENDOCRINOLOGIA

Ceacutelulas corticoacutetropas que segregan ACTH (basoacutefila)

Ceacutelulas gonadoacutetropas que segregan las gonadotropinas LH y FSH (basoacutefila)

Ceacutelulas tirotropas que secretan la TSH (basoacutefila)

Las ceacutelulas cromoacutefobas son en realidad ceacutelulas desgastadas y pueden haber sido cualquiera de las cinco anteriores

Hormonas de la adenohipoacutefisis

Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)

Prolactina (PRL) u hormona luteotroacutepica Estimula el desarrollo de los acinos mamarios y estimula la traduccioacuten de los genes para las proteiacutenas de la leche

Las demaacutes hormonas son hormonas troacuteficas que tienen su efecto en algunas glaacutendulas endocrinas perifeacutericas

Hormona estimulante del tiroides (TSH) o tirotropina Estimula la produccioacuten de hormonas por parte del tiroides

Hormona estimulante de la corteza suprarrenal (ACTH) o corticotropina Estimula la produccioacuten de hormonas por parte de las glaacutendulas suprarrenales

Hormona luteinizante (LH) Estimulan la produccioacuten de hormonas por parte de las goacutenadas y la ovulacioacuten

Hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Misma funcioacuten que la anterior

La LH y la FSH se denominan gonadotropinas ya que regulan la funcioacuten de las goacutenadas

Neurohipoacutefisis

La neurohipoacutefisis tiene un origen embrioloacutegico diferente al del resto de la hipoacutefisis mediante un crecimiento hacia abajo del hipotaacutelamo por lo que tiene funciones diferentes Se suele dividir a su vez en tres partes eminencia media infundibulo y pars nervosa de las cuales la uacuteltima es la maacutes funcional Las ceacutelulas de la neurohipoacutefisis se conocen como pituicitos y no son maacutes que ceacutelulas gliales de sosteacuten Por tanto la neurohipoacutefisis no es en realidad una glaacutendula secretora ya que se limita a almacenar los productos de secrecioacuten

Trabajo final Paacutegina 8

ENDOCRINOLOGIA

del hipotaacutelamo En efecto los axoplasmas de las neuronas de los nuacutecleos hipotalamicos supraoacuteptico y paraventricular secretan la ADH y la oxitocina respectivamente que se almacenan en las vesiacuteculas de los axones que de eacutel llegan a la neurohipoacutefisis dichas vesiacuteculas se liberan cerca del plexo primario hipofisiario en respuesta impulsos eleacutectricos por parte del hipotaacutelamo

Hormona antidiureacutetica (ADH) o vasopresina Se secreta en estiacutemulo a una disminucioacuten del volumen plasmaacutetico y como consecuencia de la disminucioacuten en la presioacuten arterial que esto ocasiona y su secrecioacuten aumenta la reabsorcioacuten de agua desde los tuacutebulos colectores renales por medio de la translocacioacuten a la membrana de la acuaporina II tambieacuten provoca una fuerte vasoconstriccioacuten por lo que tambieacuten es llamada vasopresina

Oxitocina Estimula la contraccioacuten de las ceacutelulas mioepiteliales de las glaacutendulas mamarias lo que causa la eyeccioacuten de leche por parte de la mama y se estimula por la succioacuten transmitiendo sentildeales al hipotalamo (retroalimentacioacuten) para que secrete mas oxitocina Causa contracciones del musculo liso del uacutetero en el orgasmo y tambieacuten los tiacutepicos espasmos de la etapa final del parto

Regulacioacuten hipotalaacutemica

La hipoacutefisis y el hipotaacutelamo estaacuten conectados por un sistema capilar denominado sistema portal el cual proviene de la arteria caroacutetida interna y del poliacutegono de Willis e irriga primero al hipotaacutelamo formando el plexo capilar primario que drena en los vasos porta hipofisiarios que a su vez forman el plexo capilar hipofisiario

La importancia de este sistema es que transporta las hormonas liberadoras o hipofisiotroacutepicas que secreta el hipotaacutelamo con fines reguladores de la secrecioacuten adenohipofisiaria Estas hormonas son

Somatoliberina (GHRH) Estimula la secrecioacuten de GH por parte de la hipoacutefisis

Corticoliberina (ARH) Estimula la secrecioacuten de ACTH por parte de la hipoacutefisis

Tiroliberina (TRH) Estimula la secrecioacuten de TSH por parte de la hipoacutefisis

Gonadoliberina (LHRH) Estimula la secrecioacuten de LH y FSH por parte de la hipoacutefisis

Hormona inhibidora de la GH (GHIH) o somatostatina Inhibe la secrecioacuten de la GH por parte de la hipoacutefisis

La prolactina estaacute regulada negativamente por dopamina un neurotransmisor

Trabajo final Paacutegina 9

ENDOCRINOLOGIA

Hay que tener en cuenta que la regulacioacuten de la secrecioacuten de las hormonas hipofisiarias se realiza mediante un mecanismo de retroalimentacioacuten negativa el cual se establece entre el hipotaacutelamo la hipofisis y los receptores especiacuteficos para cada hormona localizado en los oacuterganos diana

El proceso se realiza en el momento en que el sistema nervioso central recibe un estiacutemulo el hipotaacutelamo recibe parte de ese estiacutemulo y actuacutea sobre la hipoacutefisis a su vez el hipotaacutelamo secreta las respectivas hormonas en la adenohipoacutefisis o libera las de la neurohipoacutefisis estas se incorporan a la circulacioacuten viajan por medio de la sangre y son captados por receptores especiacuteficos ubicados en los oacuterganos diana un ejemplo es la captacioacuten de la TSH por parte de los loacutebulos tiroideos de la glaacutendula tiroides

En ese momento el oacutergano diana que en todo caso es cualquiera de las glaacutendulas endocrinas comienzan a secretar sus propias hormonas con lo que se enviacutea un estiacutemulo al sistema nervioso especiacuteficamente al hipotaacutelamo o directamente a la hipoacutefisis con lo cual se contrarresta el estiacutemulo inicial

TRASTORNOS ASOCIADOS A LA HIPOFISIS

Condicioacuten Etiologiacutea Hormona

Acromegalia sobreproduccioacuten hormona de crecimiento

Gigantismo sobreproduccioacuten hormona de crecimiento

Deficiencia de la hormona de crecimiento

baja produccioacuten hormona de crecimiento

Siacutendrome de secrecioacuten inadecuada de la hormona antidiureacutetica

sobreproduccioacuten vasopresina

Diabetes insiacutepida baja produccioacuten vasopresina

Siacutendrome de Sheehan baja produccioacuten cualquier hormona hipofisaria

Adenoma hipofisario sobreproduccioacuten cualquier hormona hipofisaria

Trabajo final Paacutegina 10

ENDOCRINOLOGIA

Hipopituitarismo baja produccioacuten cualquier hormona hipofisaria

HORMONAS DEL HIPOTALAMO

El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta

Suele considerarse el centro integrador del sistema nervioso vegetativo (o sistema nervioso autoacutenomo) dentro del sistema nervioso perifeacuterico Tambieacuten se encarga de realizar funciones de integracioacuten somato-vegetativa

En conjunto con la hipoacutefisis realiza la homeostasis del organismo por medio de un sistema de realimentacioacuten negativa

Anatomiacutea

El dienceacutefalo estaacute constituido por el taacutelamo el hipotaacutelamo el epitaacutelamo y el subtaacutelamo El taacutelamo son dos masas en el medio del cerebro entre los dos hemisferios cerebrales El hipotaacutelamo estaacute debajo del taacutelamo y sus liacutemites estaacuten constituidos por

superior el piso del III ventriacuteculo anterior el quiasma oacuteptico

inferior y lateral subtaacutelamo

posterior liacutenea imaginaria entre los cuerpos mamilares y la comisura posterior del cerebro

Nuacutecleos neuronales

nuacutecleos laterales se relacionan con el hambre preoacuteptico funcioacuten parasimpaacutetica

supraoacuteptico produce hormona antidiureacutetica

paraventricular produce oxitocina

hipotalaacutemico anterior centro de la sed

Trabajo final Paacutegina 11

ENDOCRINOLOGIA

supraquiasmaacutetico regulacioacuten del ciclo circadiano

ventromedial centro de la saciedad

arcuato interviene en la conducta emocional y actividad endoacutecrina

mamilar funcioacuten simpaacutetica

hipotalaacutemico posterior participan en la memoria

Funciones

El hipotaacutelamo regula el hambre el apetito y la saciedad por medio de hormonas y peacuteptidos como la colecistoquinina el nivel de glucosa y aacutecidos grasos en sangre y el neuropeacuteptido Y entre otros

El hipotaacutelamo anterior o rostral (parasimpaacutetico) disipa (difunde) el calor y el hipotaacutelamo posterior o caudal (simpaacutetico) se encarga de mantener la temperatura corporal constante5 aumentando o disminuyendo la frecuencia respiratoria y la sudoracioacuten

La porcioacuten anterior y posterior del hipotaacutelamo regula el ciclo del suentildeo y de la vigilia (ritmo circadiano)

Hormonas

El hipotaacutelamo en cuanto oacutergano endocrino se ocupa de liberar factores liberadores o inhibidores a la sangre pero tambieacuten es capaz de producir neurohormonas listas para su secrecioacuten

Trabajo final Paacutegina 12

ENDOCRINOLOGIA

Neurohormonas

El hipotaacutelamo produce en los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares la ADH (hormona antidiureacutetica) o vasopresina la cual se acumula en la neurohipoacutefisis desde donde es secretada La vasopresina regula el balance de agua en el cuerpo actuando sobre los rintildeones Esta hormona se almacena en la hipoacutefisis posterior de donde es liberada La disfuncioacuten del hipotaacutelamo en la produccioacuten de ADH causa diabetes insiacutepida

La oxitocina es tambieacuten producida por el hipotaacutelamo y almacenada y liberada por la neurohipoacutefisis tambieacuten comparte similitudes en su estructura proteiacutenica y llegan a compartir algunas funciones En el caso de los hombres se desconoce su funcionalidad pero se la asocia con los genitales externos y con receptores de la vesiacutecula seminal

En el caso de las mujeres la oxitocina acelera el nuacutemero de contracciones en el parto e influye al uacutetero a que se reacomode despueacutes del parto Tambieacuten incita a las fibras musculares que rodean a las ceacutelulas secretoras de leche de las glaacutendulas mamarias a secretar leche en respuesta al acto de mamar del nintildeo

Factores hipotalaacutemicos

Aparte de las dos hormonas de accioacuten directa mencionadas el hipotaacutelamo secreta diversas hormonas o factores que regulan la secrecioacuten de hormonas hipofisarias

Trabajo final Paacutegina 13

ENDOCRINOLOGIA

Hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH LHRH o LHRF) Es un decapeacuteptido (una cadena de 10 aminoaacutecidos) que actuacutea sobre la hipoacutefisis estimulando la produccioacuten y la liberacioacuten de la hormona luteinizante (LH) y la hormona foliculoestimulante (FSH) El balance de estas hormonas coordina el ciclo menstrual femenino y la espermatogeacutenesis en los hombres

Hormona liberadora de tirotropina (TRH) Es un tripeacuteptido (moleacutecula compuesta por tres aminoaacutecidos) Estimula la secrecioacuten de prolactina (PRL) y de tirotropina (TSH) por parte de la adenohipoacutefisis

Corte sagital medio del cerebro El punto blanco en frente del hipotaacutelamo es el quiasma oacuteptico debajo del cual estaacute la pituitaria La liacutenea blanca entre la pituitaria y el espacio negro es la silla turca (hueso)

Hormona liberadora de corticotropina (CRH o CRF) Se sintetiza en los nuacutecleos paraventriculares a partir de un precursor polipeptiacutedico de unos 41aminoaacutecidos y posee una vida larga (minutos) Las neuronas secretoras se encuentran en la porcioacuten anterior de los nuacutecleos paraventriculares y sus axones terminan en la capa externa de la eminencia media Estimula la liberacioacuten de adrenocorticotropina (ACTH) y β-endorfina por parte de la adenohipoacutefisis La hormona antidiureacutetica y la angiotensina II potencian el efecto liberador de CRH

Somatocrinina hormona liberadora de somatotropina (STH) o factor liberador de hormona del crecimiento (GRF) Las neuronas productoras de este factor se encuentran en el nuacutecleo arcuato del hipotaacutelamo Se sintetiza a partir de un precursor de 107 o 108 aminoaacutecidos Estimula la liberacioacuten de la hormona del crecimiento hipofisaria (GH)

Somatostatina u hormona inhibidora de la liberacioacuten de somatotropina (GIH) Como su nombre indica inhibe la secrecioacuten de somatotropinay de otras hormonas como la insulina el glucagoacuten el polipeacuteptido pancreaacutetico y la TSH La zona secretora se encuentra en la regioacuten periventricular del hipotaacutelamo Es un tetradecapeacuteptido que se encuentra en el hipotaacutelamo y en las ceacutelulas D de los islotes de Langerhans Su precursor posee 116 aminoaacutecidos Hormona liberadora de corticotropina

PIF (Factor inhibidor de la liberacioacuten de prolactina) Actuacutea en forma constante inhibiendo la secrecioacuten de prolactina hipofisaria Dado que la dopamina inhibe tambieacuten la produccioacuten de prolactina al unirse a las

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ENDOCRINOLOGIA

ceacutelulas lactotropas de la hipoacutefisis durante alguacuten tiempo se pensoacute que se trataba de PIF la dopamina puede ser un PIF secundario Las neuronas secretoras de PIF se encuentran en el nuacutecleo arcuato hipotalaacutemico

Angiotensina II (AII) Es un octapeacuteptido que estimula la accioacuten de la hormona liberadora de corticotropina libera algo de adrenocorticotropina hipofisaria

Hormona tiroidea

Las hormonas tiroideas son producidas por la glaacutendula tiroides Su efecto es el aumento del metabolismo basal lo cual es indispensable para un correcto desarrollo fetal y el funcionamiento adecuado de los sistemas cardiovascular musculoesqueleacutetico hematopoyeacutetico asiacute como para respuestas corporales adecuadas en cuanto a produccioacuten de calor consumo de oxiacutegeno y regulacioacuten de otros sistemas hormonales

Tipos de hormona tiroidea

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ENDOCRINOLOGIA

T4 T3

Existen tres hormonas circulantescirculantesco grande

T4 tetrayodotironina o tiroxina T3 o triyodotironina

T3 reversa Esta es bioloacutegicamente inactiva

Los niveles plasmaacuteticos de estas hormonas se mantienen estables durante toda la vida con excepcioacuten del periacuteodo neonatal y en algunas enfermedades o con el uso de algunos faacutermacos

Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas

Los yoduros que se ingieren en los alimentos y en el agua son concentrados de forma activa por la glaacutendula tiroides convertidos a yodo orgaacutenico por la peroxidasa tiroidea e incorporados a la tirosina en la tiroglobulina intrafolicular contenida en el coloide de la superficie apical de la ceacutelula folicular del tiroides

Las tirosinas son yodadas en un lugar (monoyodotirosina) o en dos (diyodotirosina) y se acoplan para formar las hormonas activas

diyodotirosina + diyodotirosina (r) --gt tetrayodotironina [tiroxina T4] diyodotirosina + monoyodotirosina( r) --gt triyodotironina [T3]

Otra fuente de T3 en el interior de la glaacutendula tiroides es el producto de la monodesyodacioacuten del anillo externo de la T4 por una selenoenzima la desyodasa tipo I (5-D-I) Esta enzima se encuentra tambieacuten en el hiacutegado y los rintildeones La T3 resultante pasa a la circulacioacuten Tambieacuten existe una isoenzima que efectuacutea la misma reaccioacuten llamada desyodasa tipo II que se encuentra en el cerebro y la hipoacutefisis La T3 resultante actuacutea localmente2

La tiroglobulina una glucoproteiacutena que contiene T3 y T4 en su matriz es captada por el foliacuteculo en forma de gotitas de coloide por las ceacutelulas tiroideas

Todas las reacciones necesarias para la formacioacuten de T3 y T4 son influidas y controladas por la hormona estimulante del tiroides (TSH) llamada tambieacuten tirotropina que estimula las ceacutelulas foliculares en la glaacutendula tiroides

Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas se metabolizan principalmente en el hiacutegado Producto de una conjugacioacuten con los aacutecidos glucoroacutenico y sulfuacuterico por medio de un grupo hidroxilo fenoacutelico se genera una forma excretable a traveacutes de la bilis

Trabajo final Paacutegina 16

ENDOCRINOLOGIA

Una parte de los productos conjugados eliminados por la bilis se hidroliza y se absorbe como hormona activa en el intestino Es un fenoacutemeno conocido como circulacioacuten enterohepaacutetica El resto se elimina por las heces

En la circulacioacuten sanguiacutenea la T4 se metaboliza a T3 y T3 reversa las que a su vez se desyodan produceacutendose diyodotironinas inactivas

Efectos de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas tienen dos efectos fisioloacutegicos principales

1 Aumentan la siacutentesis de proteiacutenas praacutecticamente en todos los tejidos del organismo (La T3 y la T4 penetran en las ceacutelulas donde la T3 que se obtiene de la circulacioacuten y por la conversioacuten de T4 en T3 dentro de la ceacutelula se une a receptores nucleares individuales e influye sobre la formacioacuten de ARNm)

2 La T3 incrementa el consumo de oxiacutegeno mediante el aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa (bomba sodio-potasio) sobre todo en los tejidos responsables del consumo basal de oxiacutegeno (es decir hiacutegado rintildeoacuten corazoacuten y muacutesculo esqueleacutetico) El aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa es secundario al incremento de la siacutentesis de esta enzima por consiguiente el aumento del consumo de oxiacutegeno probablemente tambieacuten estaacute relacionado con la fijacioacuten nuclear de hormonas tiroideas No obstante no se ha descartado un efecto directo de la T3 sobre la mitocondria Se cree que la T3 es la hormona tiroidea activa aunque la misma T4 pueda ser bioloacutegicamente activa

Efectos fisioloacutegicos

Desarrollo normal del sistema nervioso central en el feto Funcionamiento normal del sistema nervioso central Su falta enlentece

su funcionamiento

Generacioacuten de calor

Efectos cronotroacutepico e inotroacutepico en el sistema cardiovascular

Aumenta el nuacutemero de receptores para catecolaminas y amplifica la respuesta postreceptor en el sistema simpaacutetico3

Aumenta la eritropoyetina

Regula el metabolismo oacuteseo

Permite la relajacioacuten muscular

Interviene en los niveles de produccioacuten de hormonas gonadotrofinas y somatotropa o GH

Permite la correcta respuesta del centro respiratorio a la hipoxia e hipercapnia

Trabajo final Paacutegina 17

ENDOCRINOLOGIA

Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma

Las hormonas tiroideas circulan unidas a proteiacutenas plasmaacuteticas Un porcentaje bajo de T4 y T3 circula libremente por la sangre y es de este porcentaje bajo de hormona que depende la accioacuten hormonal sobre los receptores celulares

Las proteiacutenas a las que se unen las hormonas tiroideas son

Globulina transportadora de tiroxina o TBG (del ingleacutes Thyroxin Binding Globulin)

Prealbuacutemina transportadora de tiroxina o TBPA (del ingleacutes Thyroxin Binding Pre Albumin)

Albuacutemina

Ya que existen factores que afectan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas mencionadas modificando la cantidad de hormona libre es muy importante medir la hormona libre en el plasma para evaluar la condicioacuten fisiopatoloacutegica en estudio

Por ejemplo los siguientes faacutermacos compiten con las hormonas tiroideas por su unioacuten con las proteiacutenas transportadoras

Salicilatos Hidantoiacutenas

Algunos antiinflamatorios no esteroideos como el Diclofenaco y el aacutecido mefenaacutemico

Furosemida

Por el contrario los siguientes faacutermacos incrementan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas transportadoras

Estroacutegenos Metadona

Clofibrato

Heroiacutena

Tamoxifeno

En el embarazo tambieacuten se modifica la afinidad de las hormonas tiroideas por las proteiacutenas transportadoras aumentando esta unioacuten y disminuyendo la hormona libre

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ENDOCRINOLOGIA

Paratiroides

Las glaacutendulas paratiroides son glaacutendulas endocrinas Situadas en el cuello generalmente localizadas en los polos De la glaacutendula tiroides que producen La hormona paratiroidea o paratohormona Por lo general hay cuatro glaacutendulas paratiroides Dos superiores y dos inferiores pero de forma ocasional puede haber cinco o maacutes Cuando existe alguna glaacutendula adicional eacutesta suele encontrarse en el mediastino en relacioacuten con el timo o dentro de la glaacutendula tiroides

La hormona paratiroidea participa en el control de la homeostasis del calcio y foacutesforo asiacute como en la fisiologiacutea del hueso

El exceso de funcioacuten de las glaacutendulas paratiroides se conoce como hiperparatiroidismo y suele cursar con elevacioacuten de los niveles plasmaacuteticos de calcio y fragilidad oacutesea que condiciona una mayor susceptibilidad a padecer fracturas La funcioacuten insuficiente de las glaacutendulas paratiroides (hipoparatiroidismo) es mucho menos frecuente y generalmente se presenta tras una cirugiacutea sobre la glaacutendula tiroides que conlleva la existencia de hipocalcemia Existen algunas enfermedades mucho maacutes raras que parecen deberse a alteraciones en el receptor de la hormona paratiroidea como la condroplasia metafiseal de Jansen y la condroplasia de Blomstrand

Hormona paratiroidea o parathormona Es secretada por las ceacutelulas principales de la glaacutendula paratiroides es un polipeacuteptido de 84 aminoaacutecidos cuyo peso molecular es de aproximadamente 9500 Daltons Facilita la absorcioacuten del calcio Vitamina D (en su forma natural) y fosfato conjuntamente en el intestino Aumenta la resorcioacuten de los huesos Mediante la produccioacuten de maacutes osteoclastos a partir de las ceacutelulas madre mesenquimatosas de la meacutedula oacutesea y retrasando la conversioacuten de estas en osteoblastos Los osteoclastos absorben el hueso mediante la liberacioacuten de hormonas proteoliacuteticas liberadas por lisosomas y la secrecioacuten de varios aacutecidos entre ellos el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido laacutectico Aumenta la reabsorcioacuten del calcio y reduce la resorcioacuten del fosfato en los tuacutebulos renales provocando que este salga en la orina en mayor concentracioacuten Aumenta la resorcioacuten del calcio en el intestino Induce un incremento en la formacioacuten del 125-dihidroxicolecalciferol (forma activa de la Vitamina D calitriol o Vitamina D3) a partir del 25-hidroxicolecalciferol (calcifediol) en los rintildeones la vitamina D3 luego actuacutea a nivel del epitelio intestinal aumentando la absorcioacuten del calcio aumentando asiacute los

Trabajo final Paacutegina 19

ENDOCRINOLOGIA

niveles de calcio plasmaacuteticos (valor normal del calcio plasmaacutetico 92-104 mgdl) Luego por un mecanismo de retroaccioacuten o retroalimentacioacuten negativa elevadas concentraciones de calcio plasmaacuteticos inhiben la secrecioacuten de la PTH (Hormona paratiroidea)ademaacutes ayuda a la reabsorcion del calcio por medio de los rintildeones

Calcitonina Secretada por las ceacutelulas parafoliculares en la Tiroides es un polipeacuteptido de 32 aminoaacutecidos con un peso molecular aproximado de 3000 Daltons aproximadamente Tiene una funcioacuten opuesta a la Hormona Paratiroidea disminuye la actividad osteoclaacutestica desacelera la formacioacuten de los osteoclastos y acelera la formacioacuten de osteoblastos (ceacutelulas encargadas de la formacioacuten del hueso)

Trabajo final Paacutegina 20

ENDOCRINOLOGIA

Glaacutendula suprarrenal

Las glaacutendulas con forma de triaacutengulo que estaacuten situadas encima de los rintildeones cuya funcioacuten es la de regular las respuestas al estreacutes a traveacutes de la siacutentesis de corticosteroides (principalmente cortisol) y catecolaminas (adrenalina sobre todo)

Capas de la glaacutendula suprarrenal

Introduccioacuten

Anatoacutemicamente las glaacutendulas suprarrenales estaacuten separadas situadas en la cara anterosuperior de los rintildeones y estaacuten irrigadas por la sangre que reciben de las suprarrenales (las suprarrenales superiores las suprarrenales medias y las suprarrenales inferiores) Estaacuten formadas por estructuras diferentes que son la meacutedula suprarrenal y la corteza suprarrenal ambas inervadas por el sistema nervioso autoacutenomo Como su nombre sugiere la meacutedula suprarrenal estaacute situada dentro de la glaacutendula rodeada por la corteza suprarrenal que forma la superficie

Meacutedula suprarrenal La suprarrenal o meacutedula adrenal estaacute compuesta principalmente por ceacutelulas cromafines productoras de hormonas siendo el principal oacutergano de conversioacuten del aminoaacutecido tirosina en catecolaminas epinefrina y norepinefrina tambieacuten llamadas adrenalina y noradrenalina respectivamente Las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal derivan embrioloacutegicamente de la cresta neural como neuronas modificadas Realmente estas ceacutelulas son ceacutelulas postganglionares del sistema nervioso simpaacutetico que reciben la inervacioacuten de ceacutelulas preganglionares Como las sinapsis entre fibras pre y postganglionares seon ganglios nerviosos autonoacutemicos la meacutedula suprarrenal puede considerarse como un ganglio nervioso del sistema nervioso simpaacutetico

En respuesta a una situacioacuten estresante como es el ejercicio fiacutesico o un peligro inminente las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal producen catecolaminas a la sangre en una relacioacuten 70 a 30 de epinefrina y norepinefrina respectivamente

Trabajo final Paacutegina 21

ENDOCRINOLOGIA

La epinefrina produce efectos importantes como el aumento de la frecuencia cardiacuteaca vasoconstriccioacuten broncodilatacioacuten y aumento del metabolismo que son respuestas muy fugaces

Corteza suprarrenal

La corteza suprarrenal o corteza adrenal estaacute situada rodeando la circunferencia de la glaacutendula suprarrenal Su funcioacuten es la de regular varios componentes del metabolismo con la produccioacuten de mineralcorticoides y glucocorticoides que incluyen a la aldosterona y cortisol La corteza suprarrenal tambieacuten es un lugar secundario de siacutentesis de androacutegenos

La corteza suprarrenal secreta hormonas esteroideas (de naturaleza lipidica) por lo que sus ceacutelulas presentan abundante REL (reticulo endoplasmaacutetico liso) y mitocondrias con crestas longitudinales al MET Se dispone en tres capas diferentes de tejido basado en los tipos celulares y la funcioacuten que realizan

Zona glomerular Produccioacuten de mineralocorticoides sobre todo aldosterona

Zona fascicular Produccioacuten de glucocorticoides principalmente cortisol cerca del 95

Zona reticular Produccioacuten de androacutegenos incluyendo testosterona

Zona glomerular

Las ceacutelulas de la zona glomerular de la corteza suprarrenal segregan mineralocorticoides como la aldosterona y la desoxicorticosterona en respuesta a un aumento de los niveles de potasio o descenso del flujo de sangre en los rintildeones La aldosterona es liberada a la sangre formando parte del sistema renina-angiotensina que regula la concentracioacuten de electrolitos en la sangre sobre todo de sodio y potasio actuando en el tuacutebulo contorneado distal de la nefrona de los rintildeones

Aumentando la excrecioacuten de potasio Aumentando la reabsorcioacuten de sodio

La Aldosterona es una hormona que ayuda a regular la presioacuten osmoacutetica de mi organismo Por ejemplo si en el plasma sanguiacuteneo hay una escasez de sales ([osmolaridad] baja) se secretaraacute mayor cantidad de Aldosterona para reabsorber maacutes sodio y por consiguiente normalizar los niveles Lo mismo si hay una concentracioacuten muy elevada de sales en la sangre (osmolaridad alta) se secretaraacute menos o se inhibiraacute la secrecioacuten de Aldosterona para no tener que reabsorber el Sodio y por consiguiente eliminarlo normalizando las concentraciones

Zona fascicular

Capa predominante en la corteza suprarrenal cuyas celulas se disponen en hileras separadas por tabiques y capilares Sus ceacutelulas se llaman espongiocitos

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ENDOCRINOLOGIA

porque son voluminosas y contienen numerosos granulos claros dando a su superficie un aspecto de esponja Estas ceacutelulas segregan glucocorticoides como el cortisol o hidrocortisona y la cortisona al ser estimuladas por la hormona adrenocorticotropica (ACTH) La ACTH es producida por la hipoacutefisis en respuesta al factor hipotalaacutemico estimulante de corticotropina (CRH) Estos tres oacuterganos del sistema endocrino forman el eje hipotaacutelamo-hipofisario-suprarrenal

El principal glucocorticoide producido por las glaacutendulas suprarrenales es el cortisol que cumple diferentes funciones en el metabolismo en muacuteltiples ceacutelulas del organismo como

Estimulacioacuten de la produccioacuten de aminoaacutecidos por el cuerpo rompiendo proteiacutenas proteoacutelisis

Estimulacioacuten de la lipoacutelisis es decir rompiendo la grasa

Estimulacioacuten gluconeogeacutenesis la produccioacuten de glucosa a partir de nuevas fuentes como los aminaacutecidos y la glicerina de los aacutecidos grasos

Mantenimiento de la glucosa inhibiendo su liberacioacuten desde el muacutesculo y del tejido adiposo

Los glucocorticoides aumentan las concentraciones de glucosa en sangre pues actuacutean como antagonistas de la insulina e inhiben su liberacioacuten lo que produce una disminucioacuten de la captacioacuten de glucosa por los tejidos esto favorece que aumente la siacutentesis de glucosa en el hiacutegado y aumente la cantidad de glucoacutegeno en este mismo

Los glucocorticoides tambieacuten tienen propiedades antiinflamatorias que estaacuten relacionadas con sus efectos sobre la microcirculacioacuten y la inhibicioacuten de las citocinas pro-inflamatorias (IL-1 e IL-6) prostaglandinas y linfocinas Por lo tanto regulan las respuestas inmunitarias a traveacutes del llamado eje inmunosuprarrenal

Tambieacuten el cortisol tiene efectos importantes sobre la regulacioacuten del agua corporal retrasando la entrada de este liacutequido del espacio extracelular al intracelular Por lo que favorece la eliminacioacuten renal de agua

El cortisol inhibe la secrecioacuten de la propiomelanocortina (precursor de ACTH) de la CRH (Hormona liberadora de Corticotropina producida por las ceacutelulas de la eminencia media del hipotaacutelamo) y de Vasopresina

Zona reticular

Es la maacutes interna y presenta ceacutelulas dispuestas en cordones entrecruzados o anastomosados que segregan esteroides sexuales como estroacutegenos y androacutegenos

Las ceacutelulas de la zona reticular producen una fuente secundaria de androacutegenos como testosterona dihidrotestosterona (DHT) androstendiona y

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ENDOCRINOLOGIA

dehidroepiandrosterona (DHEA) Estas hormonas aumentan la masa muscular estimulan el crecimiento celular y ayudan al desarrollo de los caracteres sexuales secundarios

Paacutencreas

El paacutencreas oacutergano que segrega enzimas digestivas que pasan al intestino delgado Estas enzimas ayudan en la ruptura de carbohidratos liacutepidos proteinas y aacutecidos nucleacuteicos en el quimo Tiene forma coacutenica con un proceso uniforme medial e inferior En la especie humana su longitud oscila entre 20 y 30 cm tiene una anchura de unos 4 cm y un grosor de 5 centiacutemetros con un peso 30g La cabeza se localiza en la concavidad del duodeno o asa duodenal formada por la segunda porcioacuten del duodeno

Histologiacutea del paacutencreas

El paacutencreas tiene una parte exocrina y una parte endocrina

La parte exocrina contiene unas glaacutendulas llamadas aacutecinos serosos que son redondos u ovalados con ceacutelulas epiteliales Formados por las celuacutelas acinosas y en parte por las centroacinosas

La parte endocrina se agrupa en islotes de Langerhans que consisten en cuacutemulos de ceacutelulas secretoras de hormonas que producen insulina glucagoacuten y somatostatina Estos tipos de ceacutelulas son los siguientes

Ceacutelula alfa (Alfa cell)

Estas ceacutelulas alfa sintetizan y liberan glucagoacuten El glucagoacuten aumenta el nivel de glucosa sanguiacutenea al estimular la formacioacuten de este carbohidrato a partir del glucoacutegeno almacenado en hepatocitos Tambieacuten ejerce efecto en el metabolismo de proteiacutenas y grasas La liberacioacuten del glucagoacuten es inhibida por la hiperglucemia Representan entre el 10 - 20 del volumen del islote y se distribuyen de forma perifeacuterica

Ceacutelula beta (Beta Cell)

Las ceacutelulas beta producen y liberan insulina hormona que regula el nivel de glucosa en la sangre (facilitando el uso de glucosa por parte de las ceacutelulas y retirando el exceso de glucosa que se almacena en el hiacutegado en forma de glucoacutegeno)

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ENDOCRINOLOGIA

En los diabeacuteticos tipo I las ceacutelulas beta han sido dantildeadas y no son capaces de producir la hormona

Ceacutelula delta (Delta Cell)

Las ceacutelulas delta producen somatostatina hormona que se cree que regulariacutea la produccioacuten y liberacioacuten de la insulina por las ceacutelulas beta y la produccioacuten y liberacioacuten de glucagoacuten por las ceacutelulas alfa

Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)

Estas ceacutelulas hacen que el estoacutemago produzca y libere la hormona Grelina

Ceacutelula F (PP CELL)

Estas ceacutelulas producen y liberan Polipeacuteptido Pancreaacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

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ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

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ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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ENDOCRINOLOGIA

Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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ENDOCRINOLOGIA

Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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ENDOCRINOLOGIA

5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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ENDOCRINOLOGIA

como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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ENDOCRINOLOGIA

52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

Trabajo final Paacutegina 51

ENDOCRINOLOGIA

BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

Trabajo final Paacutegina 52

ENDOCRINOLOGIA

Trabajo final Paacutegina 53

  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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Page 4: Trabajo Final Endocrinologia

ENDOCRINOLOGIA

adrenalina Los esteroides y la vitamina D son componentes de ciertas cremas que se utilizan en dermatologiacutea

Principales glaacutendulas endoacutecrinas y hormonas que producen

Glaacutendula endocrina

hormonas tejido blanco

Acciones principales

Hipotaacutelamo (produccioacuten) Hipoacutefisis neurohipoacutefisis (almacenamiento y liberacioacuten)

Oxitocina Uacutetero Estimula las contracciones

Glaacutendulas mamarias

Estimula la expulsioacuten de leche hacia los conductos

Hormona antidiureacutetica (vasopresina)

Rintildeones (conductos colectores)

Estimula la reabsorcioacuten de agua conserva agua

Hipoacutefisis (produccioacuten) Loacutebulo anterior de la hipoacutefisis

Hormona del crecimiento (GH)

General Estimula el crecimiento al promover la siacutentesis de proteiacutenas

Prolactina Glaacutendulas mamarias

Estimula la produccioacuten de leche

Hormona estimulante del tiroides (TSH)

tiroides Estimula la secrecioacuten de hormonas tiroideas estimula el aumento de tamantildeo del tiroides

Hormona adrenocorticotroacutepica (ACTH)

Corteza suprarrenal

Estimula la secrecioacuten de hormonas corticosuprarrenales

Hormonas gonadotroacutepicas (foliculoestimulante FSH luteinizante LH)

Goacutenadas Estimula el funcionamiento y crecimiento gonadales

Trabajo final Paacutegina 4

ENDOCRINOLOGIA

Tiroides Tiroxina (T4) y triyodotironina (T3)

General Estimulan el metabolismo esencial para el crecimiento y desarrollo normal

Calcitonina Hueso Reduce la concentracioacuten sanguiacutenea de calcio inhibiendo la degradacioacuten oacutesea por osteoclastos

Glaacutendulas paratiroides

Hormona paratiroidea

Hueso rintildeones tubo digestivo

Incrementa la concentracioacuten sanguiacutenea de calcio estimulando la degradacioacuten oacutesea estimula la reabsorcioacuten de calcio por los rintildeones activa la vitamina D

Islotes de Langerhans del paacutencreas

Insulina General Reduce la concentracioacuten sanguiacutenea de glucosa facilitando la captacioacuten y el empleo de eacutesta por las ceacutelulas estimula la glucogeacutenesis estimula el almacenamiento de grasa y la siacutentesis de proteiacutena

Glucagoacuten Hiacutegado tejido adiposo

Eleva la concentracioacuten sanguiacutenea de la glucosa estimulando la glucogenoacutelisis y la gluconeogeacutenesis moviliza la grasa

Meacutedula suprarrenal

Adrenalina y noradrenalina

Muacutesculo miocardio vasos sanguiacuteneos hiacutegado tejido adiposo

Ayuda al organismo a afrontar el estres incrementa la frecuencia cardiaca la presioacuten arterial la tasa metaboacutelica desviacutea el riego sanguiacuteneo moviliza grasa eleva la concentracioacuten sanguiacutenea de azuacutecar

Trabajo final Paacutegina 5

ENDOCRINOLOGIA

Corteza suprarrenal

Mineralocorticoides (aldosterona)

Tuacutebulos renales

Mantiene el equilibrio de sodio y fosfato

Glucocorticoides (cortisol)

General Ayuda al organismo a adaptarse al estres a largo plazo eleva la concentracioacuten sanguiacutenea de glucosa moviliza grasa

Glaacutendula pineal Melatonina Goacutenadas ceacutelulas pigmentarias otros tejidos

Influye en los procesos reproductivos en cricetos y otros animales pigmentacioacuten en algunos vertebrados puede controlar biorritmos en algunos animales puede ayudar a controlar el inicio de la pubertad en el ser humano

Ovario Estroacutegenos (estradiol)

General uacutetero

Desarrollo y mantenimiento de caracteres sexuales femeninos estimula el crecimiento del revestimiento uterino

Progesterona Uacutetero mama Estimula el desarrollo del revestimiento uterino

Testiacuteculos Testosterona General estructuras reproductivas

Desarrollo y mantenimiento de caracteres sexuales masculinos promueve la espermatogeacutenesisproduce el crecimiento en la adolescencia

Inhibina Loacutebulo anterior de la hipoacutefisis

Inhibe la liberacioacuten de FSH

Trabajo final Paacutegina 6

ENDOCRINOLOGIA

Hipoacutefisis anterior y posterior Tiroides Paratiroides Suprarrenales y Paacutencreas

La hipoacutefisis o glaacutendula pituitaria

Es la glaacutendula que controla el resto de las glaacutendulas entre ellas la tiroides Es una glaacutendula compleja que se aloja en un espacio oacuteseo llamado silla turca del hueso esfenoides situada en la base del craacuteneo en la fosa cerebral media que conecta con el hipotaacutelamo a traveacutes del tallo pituitario o tallo hipofisario Tiene un peso aproximado de 05 g

Etimologiacutea

El teacutermino laquohipoacutefisisraquo proviene del griego hipo (lsquodebajorsquo) y fisis (lsquocrecerrsquo)

Partes

La hipoacutefisis consta de tres partes

Loacutebulo anterior o adenohipoacutefisis procede embrioloacutegicamente de un esbozo fariacutengeo (bolsa de Rathke) y es responsable de la secrecioacuten de numerosas hormonas (ver maacutes adelante)

Hipoacutefisis media o pars intermedia produce dos polipeacuteptidos llamados melanotropinas u hormonas estimulantes de los melanocitos que inducen el aumento de la siacutentesis de melanina de las ceacutelulas de la piel

Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo

Adenohipoacutefisis

La adenohipoacutefisis segrega muchas hormonas de las cuales seis son relevantes para la funcioacuten fisioloacutegica adecuada del organismo las cuales son segregadas por 5 tipos de ceacutelulas diferentes Estas ceacutelulas son de origen epitelial y como muchas glaacutendulas endocrinas estaacuten organizadas en lagunas rodeadas de capilares sinusoides fenestrados a los cuales se vierte su secrecioacuten hormonal Los tipos de ceacutelulas se clasificaban antes de acuerdo a su tincioacuten y eran acidoacutefilas basoacutefilas y cromoacutefobas (o que no se tintildeen) Pero en la actualidad se cuenta con teacutecnicas de inmunohistoquiacutemica y se han podido identificar 5 tipos celulares

Ceacutelulas somatoacutetropas que segregan GH (acidoacutefilas) Ceacutelulas lactotropas o mamoacutetropas que segregan PRL (acidoacutefilas)

Trabajo final Paacutegina 7

ENDOCRINOLOGIA

Ceacutelulas corticoacutetropas que segregan ACTH (basoacutefila)

Ceacutelulas gonadoacutetropas que segregan las gonadotropinas LH y FSH (basoacutefila)

Ceacutelulas tirotropas que secretan la TSH (basoacutefila)

Las ceacutelulas cromoacutefobas son en realidad ceacutelulas desgastadas y pueden haber sido cualquiera de las cinco anteriores

Hormonas de la adenohipoacutefisis

Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)

Prolactina (PRL) u hormona luteotroacutepica Estimula el desarrollo de los acinos mamarios y estimula la traduccioacuten de los genes para las proteiacutenas de la leche

Las demaacutes hormonas son hormonas troacuteficas que tienen su efecto en algunas glaacutendulas endocrinas perifeacutericas

Hormona estimulante del tiroides (TSH) o tirotropina Estimula la produccioacuten de hormonas por parte del tiroides

Hormona estimulante de la corteza suprarrenal (ACTH) o corticotropina Estimula la produccioacuten de hormonas por parte de las glaacutendulas suprarrenales

Hormona luteinizante (LH) Estimulan la produccioacuten de hormonas por parte de las goacutenadas y la ovulacioacuten

Hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Misma funcioacuten que la anterior

La LH y la FSH se denominan gonadotropinas ya que regulan la funcioacuten de las goacutenadas

Neurohipoacutefisis

La neurohipoacutefisis tiene un origen embrioloacutegico diferente al del resto de la hipoacutefisis mediante un crecimiento hacia abajo del hipotaacutelamo por lo que tiene funciones diferentes Se suele dividir a su vez en tres partes eminencia media infundibulo y pars nervosa de las cuales la uacuteltima es la maacutes funcional Las ceacutelulas de la neurohipoacutefisis se conocen como pituicitos y no son maacutes que ceacutelulas gliales de sosteacuten Por tanto la neurohipoacutefisis no es en realidad una glaacutendula secretora ya que se limita a almacenar los productos de secrecioacuten

Trabajo final Paacutegina 8

ENDOCRINOLOGIA

del hipotaacutelamo En efecto los axoplasmas de las neuronas de los nuacutecleos hipotalamicos supraoacuteptico y paraventricular secretan la ADH y la oxitocina respectivamente que se almacenan en las vesiacuteculas de los axones que de eacutel llegan a la neurohipoacutefisis dichas vesiacuteculas se liberan cerca del plexo primario hipofisiario en respuesta impulsos eleacutectricos por parte del hipotaacutelamo

Hormona antidiureacutetica (ADH) o vasopresina Se secreta en estiacutemulo a una disminucioacuten del volumen plasmaacutetico y como consecuencia de la disminucioacuten en la presioacuten arterial que esto ocasiona y su secrecioacuten aumenta la reabsorcioacuten de agua desde los tuacutebulos colectores renales por medio de la translocacioacuten a la membrana de la acuaporina II tambieacuten provoca una fuerte vasoconstriccioacuten por lo que tambieacuten es llamada vasopresina

Oxitocina Estimula la contraccioacuten de las ceacutelulas mioepiteliales de las glaacutendulas mamarias lo que causa la eyeccioacuten de leche por parte de la mama y se estimula por la succioacuten transmitiendo sentildeales al hipotalamo (retroalimentacioacuten) para que secrete mas oxitocina Causa contracciones del musculo liso del uacutetero en el orgasmo y tambieacuten los tiacutepicos espasmos de la etapa final del parto

Regulacioacuten hipotalaacutemica

La hipoacutefisis y el hipotaacutelamo estaacuten conectados por un sistema capilar denominado sistema portal el cual proviene de la arteria caroacutetida interna y del poliacutegono de Willis e irriga primero al hipotaacutelamo formando el plexo capilar primario que drena en los vasos porta hipofisiarios que a su vez forman el plexo capilar hipofisiario

La importancia de este sistema es que transporta las hormonas liberadoras o hipofisiotroacutepicas que secreta el hipotaacutelamo con fines reguladores de la secrecioacuten adenohipofisiaria Estas hormonas son

Somatoliberina (GHRH) Estimula la secrecioacuten de GH por parte de la hipoacutefisis

Corticoliberina (ARH) Estimula la secrecioacuten de ACTH por parte de la hipoacutefisis

Tiroliberina (TRH) Estimula la secrecioacuten de TSH por parte de la hipoacutefisis

Gonadoliberina (LHRH) Estimula la secrecioacuten de LH y FSH por parte de la hipoacutefisis

Hormona inhibidora de la GH (GHIH) o somatostatina Inhibe la secrecioacuten de la GH por parte de la hipoacutefisis

La prolactina estaacute regulada negativamente por dopamina un neurotransmisor

Trabajo final Paacutegina 9

ENDOCRINOLOGIA

Hay que tener en cuenta que la regulacioacuten de la secrecioacuten de las hormonas hipofisiarias se realiza mediante un mecanismo de retroalimentacioacuten negativa el cual se establece entre el hipotaacutelamo la hipofisis y los receptores especiacuteficos para cada hormona localizado en los oacuterganos diana

El proceso se realiza en el momento en que el sistema nervioso central recibe un estiacutemulo el hipotaacutelamo recibe parte de ese estiacutemulo y actuacutea sobre la hipoacutefisis a su vez el hipotaacutelamo secreta las respectivas hormonas en la adenohipoacutefisis o libera las de la neurohipoacutefisis estas se incorporan a la circulacioacuten viajan por medio de la sangre y son captados por receptores especiacuteficos ubicados en los oacuterganos diana un ejemplo es la captacioacuten de la TSH por parte de los loacutebulos tiroideos de la glaacutendula tiroides

En ese momento el oacutergano diana que en todo caso es cualquiera de las glaacutendulas endocrinas comienzan a secretar sus propias hormonas con lo que se enviacutea un estiacutemulo al sistema nervioso especiacuteficamente al hipotaacutelamo o directamente a la hipoacutefisis con lo cual se contrarresta el estiacutemulo inicial

TRASTORNOS ASOCIADOS A LA HIPOFISIS

Condicioacuten Etiologiacutea Hormona

Acromegalia sobreproduccioacuten hormona de crecimiento

Gigantismo sobreproduccioacuten hormona de crecimiento

Deficiencia de la hormona de crecimiento

baja produccioacuten hormona de crecimiento

Siacutendrome de secrecioacuten inadecuada de la hormona antidiureacutetica

sobreproduccioacuten vasopresina

Diabetes insiacutepida baja produccioacuten vasopresina

Siacutendrome de Sheehan baja produccioacuten cualquier hormona hipofisaria

Adenoma hipofisario sobreproduccioacuten cualquier hormona hipofisaria

Trabajo final Paacutegina 10

ENDOCRINOLOGIA

Hipopituitarismo baja produccioacuten cualquier hormona hipofisaria

HORMONAS DEL HIPOTALAMO

El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta

Suele considerarse el centro integrador del sistema nervioso vegetativo (o sistema nervioso autoacutenomo) dentro del sistema nervioso perifeacuterico Tambieacuten se encarga de realizar funciones de integracioacuten somato-vegetativa

En conjunto con la hipoacutefisis realiza la homeostasis del organismo por medio de un sistema de realimentacioacuten negativa

Anatomiacutea

El dienceacutefalo estaacute constituido por el taacutelamo el hipotaacutelamo el epitaacutelamo y el subtaacutelamo El taacutelamo son dos masas en el medio del cerebro entre los dos hemisferios cerebrales El hipotaacutelamo estaacute debajo del taacutelamo y sus liacutemites estaacuten constituidos por

superior el piso del III ventriacuteculo anterior el quiasma oacuteptico

inferior y lateral subtaacutelamo

posterior liacutenea imaginaria entre los cuerpos mamilares y la comisura posterior del cerebro

Nuacutecleos neuronales

nuacutecleos laterales se relacionan con el hambre preoacuteptico funcioacuten parasimpaacutetica

supraoacuteptico produce hormona antidiureacutetica

paraventricular produce oxitocina

hipotalaacutemico anterior centro de la sed

Trabajo final Paacutegina 11

ENDOCRINOLOGIA

supraquiasmaacutetico regulacioacuten del ciclo circadiano

ventromedial centro de la saciedad

arcuato interviene en la conducta emocional y actividad endoacutecrina

mamilar funcioacuten simpaacutetica

hipotalaacutemico posterior participan en la memoria

Funciones

El hipotaacutelamo regula el hambre el apetito y la saciedad por medio de hormonas y peacuteptidos como la colecistoquinina el nivel de glucosa y aacutecidos grasos en sangre y el neuropeacuteptido Y entre otros

El hipotaacutelamo anterior o rostral (parasimpaacutetico) disipa (difunde) el calor y el hipotaacutelamo posterior o caudal (simpaacutetico) se encarga de mantener la temperatura corporal constante5 aumentando o disminuyendo la frecuencia respiratoria y la sudoracioacuten

La porcioacuten anterior y posterior del hipotaacutelamo regula el ciclo del suentildeo y de la vigilia (ritmo circadiano)

Hormonas

El hipotaacutelamo en cuanto oacutergano endocrino se ocupa de liberar factores liberadores o inhibidores a la sangre pero tambieacuten es capaz de producir neurohormonas listas para su secrecioacuten

Trabajo final Paacutegina 12

ENDOCRINOLOGIA

Neurohormonas

El hipotaacutelamo produce en los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares la ADH (hormona antidiureacutetica) o vasopresina la cual se acumula en la neurohipoacutefisis desde donde es secretada La vasopresina regula el balance de agua en el cuerpo actuando sobre los rintildeones Esta hormona se almacena en la hipoacutefisis posterior de donde es liberada La disfuncioacuten del hipotaacutelamo en la produccioacuten de ADH causa diabetes insiacutepida

La oxitocina es tambieacuten producida por el hipotaacutelamo y almacenada y liberada por la neurohipoacutefisis tambieacuten comparte similitudes en su estructura proteiacutenica y llegan a compartir algunas funciones En el caso de los hombres se desconoce su funcionalidad pero se la asocia con los genitales externos y con receptores de la vesiacutecula seminal

En el caso de las mujeres la oxitocina acelera el nuacutemero de contracciones en el parto e influye al uacutetero a que se reacomode despueacutes del parto Tambieacuten incita a las fibras musculares que rodean a las ceacutelulas secretoras de leche de las glaacutendulas mamarias a secretar leche en respuesta al acto de mamar del nintildeo

Factores hipotalaacutemicos

Aparte de las dos hormonas de accioacuten directa mencionadas el hipotaacutelamo secreta diversas hormonas o factores que regulan la secrecioacuten de hormonas hipofisarias

Trabajo final Paacutegina 13

ENDOCRINOLOGIA

Hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH LHRH o LHRF) Es un decapeacuteptido (una cadena de 10 aminoaacutecidos) que actuacutea sobre la hipoacutefisis estimulando la produccioacuten y la liberacioacuten de la hormona luteinizante (LH) y la hormona foliculoestimulante (FSH) El balance de estas hormonas coordina el ciclo menstrual femenino y la espermatogeacutenesis en los hombres

Hormona liberadora de tirotropina (TRH) Es un tripeacuteptido (moleacutecula compuesta por tres aminoaacutecidos) Estimula la secrecioacuten de prolactina (PRL) y de tirotropina (TSH) por parte de la adenohipoacutefisis

Corte sagital medio del cerebro El punto blanco en frente del hipotaacutelamo es el quiasma oacuteptico debajo del cual estaacute la pituitaria La liacutenea blanca entre la pituitaria y el espacio negro es la silla turca (hueso)

Hormona liberadora de corticotropina (CRH o CRF) Se sintetiza en los nuacutecleos paraventriculares a partir de un precursor polipeptiacutedico de unos 41aminoaacutecidos y posee una vida larga (minutos) Las neuronas secretoras se encuentran en la porcioacuten anterior de los nuacutecleos paraventriculares y sus axones terminan en la capa externa de la eminencia media Estimula la liberacioacuten de adrenocorticotropina (ACTH) y β-endorfina por parte de la adenohipoacutefisis La hormona antidiureacutetica y la angiotensina II potencian el efecto liberador de CRH

Somatocrinina hormona liberadora de somatotropina (STH) o factor liberador de hormona del crecimiento (GRF) Las neuronas productoras de este factor se encuentran en el nuacutecleo arcuato del hipotaacutelamo Se sintetiza a partir de un precursor de 107 o 108 aminoaacutecidos Estimula la liberacioacuten de la hormona del crecimiento hipofisaria (GH)

Somatostatina u hormona inhibidora de la liberacioacuten de somatotropina (GIH) Como su nombre indica inhibe la secrecioacuten de somatotropinay de otras hormonas como la insulina el glucagoacuten el polipeacuteptido pancreaacutetico y la TSH La zona secretora se encuentra en la regioacuten periventricular del hipotaacutelamo Es un tetradecapeacuteptido que se encuentra en el hipotaacutelamo y en las ceacutelulas D de los islotes de Langerhans Su precursor posee 116 aminoaacutecidos Hormona liberadora de corticotropina

PIF (Factor inhibidor de la liberacioacuten de prolactina) Actuacutea en forma constante inhibiendo la secrecioacuten de prolactina hipofisaria Dado que la dopamina inhibe tambieacuten la produccioacuten de prolactina al unirse a las

Trabajo final Paacutegina 14

ENDOCRINOLOGIA

ceacutelulas lactotropas de la hipoacutefisis durante alguacuten tiempo se pensoacute que se trataba de PIF la dopamina puede ser un PIF secundario Las neuronas secretoras de PIF se encuentran en el nuacutecleo arcuato hipotalaacutemico

Angiotensina II (AII) Es un octapeacuteptido que estimula la accioacuten de la hormona liberadora de corticotropina libera algo de adrenocorticotropina hipofisaria

Hormona tiroidea

Las hormonas tiroideas son producidas por la glaacutendula tiroides Su efecto es el aumento del metabolismo basal lo cual es indispensable para un correcto desarrollo fetal y el funcionamiento adecuado de los sistemas cardiovascular musculoesqueleacutetico hematopoyeacutetico asiacute como para respuestas corporales adecuadas en cuanto a produccioacuten de calor consumo de oxiacutegeno y regulacioacuten de otros sistemas hormonales

Tipos de hormona tiroidea

Trabajo final Paacutegina 15

ENDOCRINOLOGIA

T4 T3

Existen tres hormonas circulantescirculantesco grande

T4 tetrayodotironina o tiroxina T3 o triyodotironina

T3 reversa Esta es bioloacutegicamente inactiva

Los niveles plasmaacuteticos de estas hormonas se mantienen estables durante toda la vida con excepcioacuten del periacuteodo neonatal y en algunas enfermedades o con el uso de algunos faacutermacos

Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas

Los yoduros que se ingieren en los alimentos y en el agua son concentrados de forma activa por la glaacutendula tiroides convertidos a yodo orgaacutenico por la peroxidasa tiroidea e incorporados a la tirosina en la tiroglobulina intrafolicular contenida en el coloide de la superficie apical de la ceacutelula folicular del tiroides

Las tirosinas son yodadas en un lugar (monoyodotirosina) o en dos (diyodotirosina) y se acoplan para formar las hormonas activas

diyodotirosina + diyodotirosina (r) --gt tetrayodotironina [tiroxina T4] diyodotirosina + monoyodotirosina( r) --gt triyodotironina [T3]

Otra fuente de T3 en el interior de la glaacutendula tiroides es el producto de la monodesyodacioacuten del anillo externo de la T4 por una selenoenzima la desyodasa tipo I (5-D-I) Esta enzima se encuentra tambieacuten en el hiacutegado y los rintildeones La T3 resultante pasa a la circulacioacuten Tambieacuten existe una isoenzima que efectuacutea la misma reaccioacuten llamada desyodasa tipo II que se encuentra en el cerebro y la hipoacutefisis La T3 resultante actuacutea localmente2

La tiroglobulina una glucoproteiacutena que contiene T3 y T4 en su matriz es captada por el foliacuteculo en forma de gotitas de coloide por las ceacutelulas tiroideas

Todas las reacciones necesarias para la formacioacuten de T3 y T4 son influidas y controladas por la hormona estimulante del tiroides (TSH) llamada tambieacuten tirotropina que estimula las ceacutelulas foliculares en la glaacutendula tiroides

Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas se metabolizan principalmente en el hiacutegado Producto de una conjugacioacuten con los aacutecidos glucoroacutenico y sulfuacuterico por medio de un grupo hidroxilo fenoacutelico se genera una forma excretable a traveacutes de la bilis

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ENDOCRINOLOGIA

Una parte de los productos conjugados eliminados por la bilis se hidroliza y se absorbe como hormona activa en el intestino Es un fenoacutemeno conocido como circulacioacuten enterohepaacutetica El resto se elimina por las heces

En la circulacioacuten sanguiacutenea la T4 se metaboliza a T3 y T3 reversa las que a su vez se desyodan produceacutendose diyodotironinas inactivas

Efectos de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas tienen dos efectos fisioloacutegicos principales

1 Aumentan la siacutentesis de proteiacutenas praacutecticamente en todos los tejidos del organismo (La T3 y la T4 penetran en las ceacutelulas donde la T3 que se obtiene de la circulacioacuten y por la conversioacuten de T4 en T3 dentro de la ceacutelula se une a receptores nucleares individuales e influye sobre la formacioacuten de ARNm)

2 La T3 incrementa el consumo de oxiacutegeno mediante el aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa (bomba sodio-potasio) sobre todo en los tejidos responsables del consumo basal de oxiacutegeno (es decir hiacutegado rintildeoacuten corazoacuten y muacutesculo esqueleacutetico) El aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa es secundario al incremento de la siacutentesis de esta enzima por consiguiente el aumento del consumo de oxiacutegeno probablemente tambieacuten estaacute relacionado con la fijacioacuten nuclear de hormonas tiroideas No obstante no se ha descartado un efecto directo de la T3 sobre la mitocondria Se cree que la T3 es la hormona tiroidea activa aunque la misma T4 pueda ser bioloacutegicamente activa

Efectos fisioloacutegicos

Desarrollo normal del sistema nervioso central en el feto Funcionamiento normal del sistema nervioso central Su falta enlentece

su funcionamiento

Generacioacuten de calor

Efectos cronotroacutepico e inotroacutepico en el sistema cardiovascular

Aumenta el nuacutemero de receptores para catecolaminas y amplifica la respuesta postreceptor en el sistema simpaacutetico3

Aumenta la eritropoyetina

Regula el metabolismo oacuteseo

Permite la relajacioacuten muscular

Interviene en los niveles de produccioacuten de hormonas gonadotrofinas y somatotropa o GH

Permite la correcta respuesta del centro respiratorio a la hipoxia e hipercapnia

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ENDOCRINOLOGIA

Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma

Las hormonas tiroideas circulan unidas a proteiacutenas plasmaacuteticas Un porcentaje bajo de T4 y T3 circula libremente por la sangre y es de este porcentaje bajo de hormona que depende la accioacuten hormonal sobre los receptores celulares

Las proteiacutenas a las que se unen las hormonas tiroideas son

Globulina transportadora de tiroxina o TBG (del ingleacutes Thyroxin Binding Globulin)

Prealbuacutemina transportadora de tiroxina o TBPA (del ingleacutes Thyroxin Binding Pre Albumin)

Albuacutemina

Ya que existen factores que afectan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas mencionadas modificando la cantidad de hormona libre es muy importante medir la hormona libre en el plasma para evaluar la condicioacuten fisiopatoloacutegica en estudio

Por ejemplo los siguientes faacutermacos compiten con las hormonas tiroideas por su unioacuten con las proteiacutenas transportadoras

Salicilatos Hidantoiacutenas

Algunos antiinflamatorios no esteroideos como el Diclofenaco y el aacutecido mefenaacutemico

Furosemida

Por el contrario los siguientes faacutermacos incrementan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas transportadoras

Estroacutegenos Metadona

Clofibrato

Heroiacutena

Tamoxifeno

En el embarazo tambieacuten se modifica la afinidad de las hormonas tiroideas por las proteiacutenas transportadoras aumentando esta unioacuten y disminuyendo la hormona libre

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ENDOCRINOLOGIA

Paratiroides

Las glaacutendulas paratiroides son glaacutendulas endocrinas Situadas en el cuello generalmente localizadas en los polos De la glaacutendula tiroides que producen La hormona paratiroidea o paratohormona Por lo general hay cuatro glaacutendulas paratiroides Dos superiores y dos inferiores pero de forma ocasional puede haber cinco o maacutes Cuando existe alguna glaacutendula adicional eacutesta suele encontrarse en el mediastino en relacioacuten con el timo o dentro de la glaacutendula tiroides

La hormona paratiroidea participa en el control de la homeostasis del calcio y foacutesforo asiacute como en la fisiologiacutea del hueso

El exceso de funcioacuten de las glaacutendulas paratiroides se conoce como hiperparatiroidismo y suele cursar con elevacioacuten de los niveles plasmaacuteticos de calcio y fragilidad oacutesea que condiciona una mayor susceptibilidad a padecer fracturas La funcioacuten insuficiente de las glaacutendulas paratiroides (hipoparatiroidismo) es mucho menos frecuente y generalmente se presenta tras una cirugiacutea sobre la glaacutendula tiroides que conlleva la existencia de hipocalcemia Existen algunas enfermedades mucho maacutes raras que parecen deberse a alteraciones en el receptor de la hormona paratiroidea como la condroplasia metafiseal de Jansen y la condroplasia de Blomstrand

Hormona paratiroidea o parathormona Es secretada por las ceacutelulas principales de la glaacutendula paratiroides es un polipeacuteptido de 84 aminoaacutecidos cuyo peso molecular es de aproximadamente 9500 Daltons Facilita la absorcioacuten del calcio Vitamina D (en su forma natural) y fosfato conjuntamente en el intestino Aumenta la resorcioacuten de los huesos Mediante la produccioacuten de maacutes osteoclastos a partir de las ceacutelulas madre mesenquimatosas de la meacutedula oacutesea y retrasando la conversioacuten de estas en osteoblastos Los osteoclastos absorben el hueso mediante la liberacioacuten de hormonas proteoliacuteticas liberadas por lisosomas y la secrecioacuten de varios aacutecidos entre ellos el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido laacutectico Aumenta la reabsorcioacuten del calcio y reduce la resorcioacuten del fosfato en los tuacutebulos renales provocando que este salga en la orina en mayor concentracioacuten Aumenta la resorcioacuten del calcio en el intestino Induce un incremento en la formacioacuten del 125-dihidroxicolecalciferol (forma activa de la Vitamina D calitriol o Vitamina D3) a partir del 25-hidroxicolecalciferol (calcifediol) en los rintildeones la vitamina D3 luego actuacutea a nivel del epitelio intestinal aumentando la absorcioacuten del calcio aumentando asiacute los

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ENDOCRINOLOGIA

niveles de calcio plasmaacuteticos (valor normal del calcio plasmaacutetico 92-104 mgdl) Luego por un mecanismo de retroaccioacuten o retroalimentacioacuten negativa elevadas concentraciones de calcio plasmaacuteticos inhiben la secrecioacuten de la PTH (Hormona paratiroidea)ademaacutes ayuda a la reabsorcion del calcio por medio de los rintildeones

Calcitonina Secretada por las ceacutelulas parafoliculares en la Tiroides es un polipeacuteptido de 32 aminoaacutecidos con un peso molecular aproximado de 3000 Daltons aproximadamente Tiene una funcioacuten opuesta a la Hormona Paratiroidea disminuye la actividad osteoclaacutestica desacelera la formacioacuten de los osteoclastos y acelera la formacioacuten de osteoblastos (ceacutelulas encargadas de la formacioacuten del hueso)

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ENDOCRINOLOGIA

Glaacutendula suprarrenal

Las glaacutendulas con forma de triaacutengulo que estaacuten situadas encima de los rintildeones cuya funcioacuten es la de regular las respuestas al estreacutes a traveacutes de la siacutentesis de corticosteroides (principalmente cortisol) y catecolaminas (adrenalina sobre todo)

Capas de la glaacutendula suprarrenal

Introduccioacuten

Anatoacutemicamente las glaacutendulas suprarrenales estaacuten separadas situadas en la cara anterosuperior de los rintildeones y estaacuten irrigadas por la sangre que reciben de las suprarrenales (las suprarrenales superiores las suprarrenales medias y las suprarrenales inferiores) Estaacuten formadas por estructuras diferentes que son la meacutedula suprarrenal y la corteza suprarrenal ambas inervadas por el sistema nervioso autoacutenomo Como su nombre sugiere la meacutedula suprarrenal estaacute situada dentro de la glaacutendula rodeada por la corteza suprarrenal que forma la superficie

Meacutedula suprarrenal La suprarrenal o meacutedula adrenal estaacute compuesta principalmente por ceacutelulas cromafines productoras de hormonas siendo el principal oacutergano de conversioacuten del aminoaacutecido tirosina en catecolaminas epinefrina y norepinefrina tambieacuten llamadas adrenalina y noradrenalina respectivamente Las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal derivan embrioloacutegicamente de la cresta neural como neuronas modificadas Realmente estas ceacutelulas son ceacutelulas postganglionares del sistema nervioso simpaacutetico que reciben la inervacioacuten de ceacutelulas preganglionares Como las sinapsis entre fibras pre y postganglionares seon ganglios nerviosos autonoacutemicos la meacutedula suprarrenal puede considerarse como un ganglio nervioso del sistema nervioso simpaacutetico

En respuesta a una situacioacuten estresante como es el ejercicio fiacutesico o un peligro inminente las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal producen catecolaminas a la sangre en una relacioacuten 70 a 30 de epinefrina y norepinefrina respectivamente

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ENDOCRINOLOGIA

La epinefrina produce efectos importantes como el aumento de la frecuencia cardiacuteaca vasoconstriccioacuten broncodilatacioacuten y aumento del metabolismo que son respuestas muy fugaces

Corteza suprarrenal

La corteza suprarrenal o corteza adrenal estaacute situada rodeando la circunferencia de la glaacutendula suprarrenal Su funcioacuten es la de regular varios componentes del metabolismo con la produccioacuten de mineralcorticoides y glucocorticoides que incluyen a la aldosterona y cortisol La corteza suprarrenal tambieacuten es un lugar secundario de siacutentesis de androacutegenos

La corteza suprarrenal secreta hormonas esteroideas (de naturaleza lipidica) por lo que sus ceacutelulas presentan abundante REL (reticulo endoplasmaacutetico liso) y mitocondrias con crestas longitudinales al MET Se dispone en tres capas diferentes de tejido basado en los tipos celulares y la funcioacuten que realizan

Zona glomerular Produccioacuten de mineralocorticoides sobre todo aldosterona

Zona fascicular Produccioacuten de glucocorticoides principalmente cortisol cerca del 95

Zona reticular Produccioacuten de androacutegenos incluyendo testosterona

Zona glomerular

Las ceacutelulas de la zona glomerular de la corteza suprarrenal segregan mineralocorticoides como la aldosterona y la desoxicorticosterona en respuesta a un aumento de los niveles de potasio o descenso del flujo de sangre en los rintildeones La aldosterona es liberada a la sangre formando parte del sistema renina-angiotensina que regula la concentracioacuten de electrolitos en la sangre sobre todo de sodio y potasio actuando en el tuacutebulo contorneado distal de la nefrona de los rintildeones

Aumentando la excrecioacuten de potasio Aumentando la reabsorcioacuten de sodio

La Aldosterona es una hormona que ayuda a regular la presioacuten osmoacutetica de mi organismo Por ejemplo si en el plasma sanguiacuteneo hay una escasez de sales ([osmolaridad] baja) se secretaraacute mayor cantidad de Aldosterona para reabsorber maacutes sodio y por consiguiente normalizar los niveles Lo mismo si hay una concentracioacuten muy elevada de sales en la sangre (osmolaridad alta) se secretaraacute menos o se inhibiraacute la secrecioacuten de Aldosterona para no tener que reabsorber el Sodio y por consiguiente eliminarlo normalizando las concentraciones

Zona fascicular

Capa predominante en la corteza suprarrenal cuyas celulas se disponen en hileras separadas por tabiques y capilares Sus ceacutelulas se llaman espongiocitos

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ENDOCRINOLOGIA

porque son voluminosas y contienen numerosos granulos claros dando a su superficie un aspecto de esponja Estas ceacutelulas segregan glucocorticoides como el cortisol o hidrocortisona y la cortisona al ser estimuladas por la hormona adrenocorticotropica (ACTH) La ACTH es producida por la hipoacutefisis en respuesta al factor hipotalaacutemico estimulante de corticotropina (CRH) Estos tres oacuterganos del sistema endocrino forman el eje hipotaacutelamo-hipofisario-suprarrenal

El principal glucocorticoide producido por las glaacutendulas suprarrenales es el cortisol que cumple diferentes funciones en el metabolismo en muacuteltiples ceacutelulas del organismo como

Estimulacioacuten de la produccioacuten de aminoaacutecidos por el cuerpo rompiendo proteiacutenas proteoacutelisis

Estimulacioacuten de la lipoacutelisis es decir rompiendo la grasa

Estimulacioacuten gluconeogeacutenesis la produccioacuten de glucosa a partir de nuevas fuentes como los aminaacutecidos y la glicerina de los aacutecidos grasos

Mantenimiento de la glucosa inhibiendo su liberacioacuten desde el muacutesculo y del tejido adiposo

Los glucocorticoides aumentan las concentraciones de glucosa en sangre pues actuacutean como antagonistas de la insulina e inhiben su liberacioacuten lo que produce una disminucioacuten de la captacioacuten de glucosa por los tejidos esto favorece que aumente la siacutentesis de glucosa en el hiacutegado y aumente la cantidad de glucoacutegeno en este mismo

Los glucocorticoides tambieacuten tienen propiedades antiinflamatorias que estaacuten relacionadas con sus efectos sobre la microcirculacioacuten y la inhibicioacuten de las citocinas pro-inflamatorias (IL-1 e IL-6) prostaglandinas y linfocinas Por lo tanto regulan las respuestas inmunitarias a traveacutes del llamado eje inmunosuprarrenal

Tambieacuten el cortisol tiene efectos importantes sobre la regulacioacuten del agua corporal retrasando la entrada de este liacutequido del espacio extracelular al intracelular Por lo que favorece la eliminacioacuten renal de agua

El cortisol inhibe la secrecioacuten de la propiomelanocortina (precursor de ACTH) de la CRH (Hormona liberadora de Corticotropina producida por las ceacutelulas de la eminencia media del hipotaacutelamo) y de Vasopresina

Zona reticular

Es la maacutes interna y presenta ceacutelulas dispuestas en cordones entrecruzados o anastomosados que segregan esteroides sexuales como estroacutegenos y androacutegenos

Las ceacutelulas de la zona reticular producen una fuente secundaria de androacutegenos como testosterona dihidrotestosterona (DHT) androstendiona y

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ENDOCRINOLOGIA

dehidroepiandrosterona (DHEA) Estas hormonas aumentan la masa muscular estimulan el crecimiento celular y ayudan al desarrollo de los caracteres sexuales secundarios

Paacutencreas

El paacutencreas oacutergano que segrega enzimas digestivas que pasan al intestino delgado Estas enzimas ayudan en la ruptura de carbohidratos liacutepidos proteinas y aacutecidos nucleacuteicos en el quimo Tiene forma coacutenica con un proceso uniforme medial e inferior En la especie humana su longitud oscila entre 20 y 30 cm tiene una anchura de unos 4 cm y un grosor de 5 centiacutemetros con un peso 30g La cabeza se localiza en la concavidad del duodeno o asa duodenal formada por la segunda porcioacuten del duodeno

Histologiacutea del paacutencreas

El paacutencreas tiene una parte exocrina y una parte endocrina

La parte exocrina contiene unas glaacutendulas llamadas aacutecinos serosos que son redondos u ovalados con ceacutelulas epiteliales Formados por las celuacutelas acinosas y en parte por las centroacinosas

La parte endocrina se agrupa en islotes de Langerhans que consisten en cuacutemulos de ceacutelulas secretoras de hormonas que producen insulina glucagoacuten y somatostatina Estos tipos de ceacutelulas son los siguientes

Ceacutelula alfa (Alfa cell)

Estas ceacutelulas alfa sintetizan y liberan glucagoacuten El glucagoacuten aumenta el nivel de glucosa sanguiacutenea al estimular la formacioacuten de este carbohidrato a partir del glucoacutegeno almacenado en hepatocitos Tambieacuten ejerce efecto en el metabolismo de proteiacutenas y grasas La liberacioacuten del glucagoacuten es inhibida por la hiperglucemia Representan entre el 10 - 20 del volumen del islote y se distribuyen de forma perifeacuterica

Ceacutelula beta (Beta Cell)

Las ceacutelulas beta producen y liberan insulina hormona que regula el nivel de glucosa en la sangre (facilitando el uso de glucosa por parte de las ceacutelulas y retirando el exceso de glucosa que se almacena en el hiacutegado en forma de glucoacutegeno)

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ENDOCRINOLOGIA

En los diabeacuteticos tipo I las ceacutelulas beta han sido dantildeadas y no son capaces de producir la hormona

Ceacutelula delta (Delta Cell)

Las ceacutelulas delta producen somatostatina hormona que se cree que regulariacutea la produccioacuten y liberacioacuten de la insulina por las ceacutelulas beta y la produccioacuten y liberacioacuten de glucagoacuten por las ceacutelulas alfa

Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)

Estas ceacutelulas hacen que el estoacutemago produzca y libere la hormona Grelina

Ceacutelula F (PP CELL)

Estas ceacutelulas producen y liberan Polipeacuteptido Pancreaacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

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ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

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ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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ENDOCRINOLOGIA

susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ENDOCRINOLOGIA

ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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ENDOCRINOLOGIA

Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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ENDOCRINOLOGIA

2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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ENDOCRINOLOGIA

52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

Trabajo final Paacutegina 51

ENDOCRINOLOGIA

BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

httpwwwcirujanosdechileclRevistaPDF20Cirujanos202005_02RevCir205(14)AVpdf

httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

Trabajo final Paacutegina 52

ENDOCRINOLOGIA

Trabajo final Paacutegina 53

  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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Page 5: Trabajo Final Endocrinologia

ENDOCRINOLOGIA

Tiroides Tiroxina (T4) y triyodotironina (T3)

General Estimulan el metabolismo esencial para el crecimiento y desarrollo normal

Calcitonina Hueso Reduce la concentracioacuten sanguiacutenea de calcio inhibiendo la degradacioacuten oacutesea por osteoclastos

Glaacutendulas paratiroides

Hormona paratiroidea

Hueso rintildeones tubo digestivo

Incrementa la concentracioacuten sanguiacutenea de calcio estimulando la degradacioacuten oacutesea estimula la reabsorcioacuten de calcio por los rintildeones activa la vitamina D

Islotes de Langerhans del paacutencreas

Insulina General Reduce la concentracioacuten sanguiacutenea de glucosa facilitando la captacioacuten y el empleo de eacutesta por las ceacutelulas estimula la glucogeacutenesis estimula el almacenamiento de grasa y la siacutentesis de proteiacutena

Glucagoacuten Hiacutegado tejido adiposo

Eleva la concentracioacuten sanguiacutenea de la glucosa estimulando la glucogenoacutelisis y la gluconeogeacutenesis moviliza la grasa

Meacutedula suprarrenal

Adrenalina y noradrenalina

Muacutesculo miocardio vasos sanguiacuteneos hiacutegado tejido adiposo

Ayuda al organismo a afrontar el estres incrementa la frecuencia cardiaca la presioacuten arterial la tasa metaboacutelica desviacutea el riego sanguiacuteneo moviliza grasa eleva la concentracioacuten sanguiacutenea de azuacutecar

Trabajo final Paacutegina 5

ENDOCRINOLOGIA

Corteza suprarrenal

Mineralocorticoides (aldosterona)

Tuacutebulos renales

Mantiene el equilibrio de sodio y fosfato

Glucocorticoides (cortisol)

General Ayuda al organismo a adaptarse al estres a largo plazo eleva la concentracioacuten sanguiacutenea de glucosa moviliza grasa

Glaacutendula pineal Melatonina Goacutenadas ceacutelulas pigmentarias otros tejidos

Influye en los procesos reproductivos en cricetos y otros animales pigmentacioacuten en algunos vertebrados puede controlar biorritmos en algunos animales puede ayudar a controlar el inicio de la pubertad en el ser humano

Ovario Estroacutegenos (estradiol)

General uacutetero

Desarrollo y mantenimiento de caracteres sexuales femeninos estimula el crecimiento del revestimiento uterino

Progesterona Uacutetero mama Estimula el desarrollo del revestimiento uterino

Testiacuteculos Testosterona General estructuras reproductivas

Desarrollo y mantenimiento de caracteres sexuales masculinos promueve la espermatogeacutenesisproduce el crecimiento en la adolescencia

Inhibina Loacutebulo anterior de la hipoacutefisis

Inhibe la liberacioacuten de FSH

Trabajo final Paacutegina 6

ENDOCRINOLOGIA

Hipoacutefisis anterior y posterior Tiroides Paratiroides Suprarrenales y Paacutencreas

La hipoacutefisis o glaacutendula pituitaria

Es la glaacutendula que controla el resto de las glaacutendulas entre ellas la tiroides Es una glaacutendula compleja que se aloja en un espacio oacuteseo llamado silla turca del hueso esfenoides situada en la base del craacuteneo en la fosa cerebral media que conecta con el hipotaacutelamo a traveacutes del tallo pituitario o tallo hipofisario Tiene un peso aproximado de 05 g

Etimologiacutea

El teacutermino laquohipoacutefisisraquo proviene del griego hipo (lsquodebajorsquo) y fisis (lsquocrecerrsquo)

Partes

La hipoacutefisis consta de tres partes

Loacutebulo anterior o adenohipoacutefisis procede embrioloacutegicamente de un esbozo fariacutengeo (bolsa de Rathke) y es responsable de la secrecioacuten de numerosas hormonas (ver maacutes adelante)

Hipoacutefisis media o pars intermedia produce dos polipeacuteptidos llamados melanotropinas u hormonas estimulantes de los melanocitos que inducen el aumento de la siacutentesis de melanina de las ceacutelulas de la piel

Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo

Adenohipoacutefisis

La adenohipoacutefisis segrega muchas hormonas de las cuales seis son relevantes para la funcioacuten fisioloacutegica adecuada del organismo las cuales son segregadas por 5 tipos de ceacutelulas diferentes Estas ceacutelulas son de origen epitelial y como muchas glaacutendulas endocrinas estaacuten organizadas en lagunas rodeadas de capilares sinusoides fenestrados a los cuales se vierte su secrecioacuten hormonal Los tipos de ceacutelulas se clasificaban antes de acuerdo a su tincioacuten y eran acidoacutefilas basoacutefilas y cromoacutefobas (o que no se tintildeen) Pero en la actualidad se cuenta con teacutecnicas de inmunohistoquiacutemica y se han podido identificar 5 tipos celulares

Ceacutelulas somatoacutetropas que segregan GH (acidoacutefilas) Ceacutelulas lactotropas o mamoacutetropas que segregan PRL (acidoacutefilas)

Trabajo final Paacutegina 7

ENDOCRINOLOGIA

Ceacutelulas corticoacutetropas que segregan ACTH (basoacutefila)

Ceacutelulas gonadoacutetropas que segregan las gonadotropinas LH y FSH (basoacutefila)

Ceacutelulas tirotropas que secretan la TSH (basoacutefila)

Las ceacutelulas cromoacutefobas son en realidad ceacutelulas desgastadas y pueden haber sido cualquiera de las cinco anteriores

Hormonas de la adenohipoacutefisis

Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)

Prolactina (PRL) u hormona luteotroacutepica Estimula el desarrollo de los acinos mamarios y estimula la traduccioacuten de los genes para las proteiacutenas de la leche

Las demaacutes hormonas son hormonas troacuteficas que tienen su efecto en algunas glaacutendulas endocrinas perifeacutericas

Hormona estimulante del tiroides (TSH) o tirotropina Estimula la produccioacuten de hormonas por parte del tiroides

Hormona estimulante de la corteza suprarrenal (ACTH) o corticotropina Estimula la produccioacuten de hormonas por parte de las glaacutendulas suprarrenales

Hormona luteinizante (LH) Estimulan la produccioacuten de hormonas por parte de las goacutenadas y la ovulacioacuten

Hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Misma funcioacuten que la anterior

La LH y la FSH se denominan gonadotropinas ya que regulan la funcioacuten de las goacutenadas

Neurohipoacutefisis

La neurohipoacutefisis tiene un origen embrioloacutegico diferente al del resto de la hipoacutefisis mediante un crecimiento hacia abajo del hipotaacutelamo por lo que tiene funciones diferentes Se suele dividir a su vez en tres partes eminencia media infundibulo y pars nervosa de las cuales la uacuteltima es la maacutes funcional Las ceacutelulas de la neurohipoacutefisis se conocen como pituicitos y no son maacutes que ceacutelulas gliales de sosteacuten Por tanto la neurohipoacutefisis no es en realidad una glaacutendula secretora ya que se limita a almacenar los productos de secrecioacuten

Trabajo final Paacutegina 8

ENDOCRINOLOGIA

del hipotaacutelamo En efecto los axoplasmas de las neuronas de los nuacutecleos hipotalamicos supraoacuteptico y paraventricular secretan la ADH y la oxitocina respectivamente que se almacenan en las vesiacuteculas de los axones que de eacutel llegan a la neurohipoacutefisis dichas vesiacuteculas se liberan cerca del plexo primario hipofisiario en respuesta impulsos eleacutectricos por parte del hipotaacutelamo

Hormona antidiureacutetica (ADH) o vasopresina Se secreta en estiacutemulo a una disminucioacuten del volumen plasmaacutetico y como consecuencia de la disminucioacuten en la presioacuten arterial que esto ocasiona y su secrecioacuten aumenta la reabsorcioacuten de agua desde los tuacutebulos colectores renales por medio de la translocacioacuten a la membrana de la acuaporina II tambieacuten provoca una fuerte vasoconstriccioacuten por lo que tambieacuten es llamada vasopresina

Oxitocina Estimula la contraccioacuten de las ceacutelulas mioepiteliales de las glaacutendulas mamarias lo que causa la eyeccioacuten de leche por parte de la mama y se estimula por la succioacuten transmitiendo sentildeales al hipotalamo (retroalimentacioacuten) para que secrete mas oxitocina Causa contracciones del musculo liso del uacutetero en el orgasmo y tambieacuten los tiacutepicos espasmos de la etapa final del parto

Regulacioacuten hipotalaacutemica

La hipoacutefisis y el hipotaacutelamo estaacuten conectados por un sistema capilar denominado sistema portal el cual proviene de la arteria caroacutetida interna y del poliacutegono de Willis e irriga primero al hipotaacutelamo formando el plexo capilar primario que drena en los vasos porta hipofisiarios que a su vez forman el plexo capilar hipofisiario

La importancia de este sistema es que transporta las hormonas liberadoras o hipofisiotroacutepicas que secreta el hipotaacutelamo con fines reguladores de la secrecioacuten adenohipofisiaria Estas hormonas son

Somatoliberina (GHRH) Estimula la secrecioacuten de GH por parte de la hipoacutefisis

Corticoliberina (ARH) Estimula la secrecioacuten de ACTH por parte de la hipoacutefisis

Tiroliberina (TRH) Estimula la secrecioacuten de TSH por parte de la hipoacutefisis

Gonadoliberina (LHRH) Estimula la secrecioacuten de LH y FSH por parte de la hipoacutefisis

Hormona inhibidora de la GH (GHIH) o somatostatina Inhibe la secrecioacuten de la GH por parte de la hipoacutefisis

La prolactina estaacute regulada negativamente por dopamina un neurotransmisor

Trabajo final Paacutegina 9

ENDOCRINOLOGIA

Hay que tener en cuenta que la regulacioacuten de la secrecioacuten de las hormonas hipofisiarias se realiza mediante un mecanismo de retroalimentacioacuten negativa el cual se establece entre el hipotaacutelamo la hipofisis y los receptores especiacuteficos para cada hormona localizado en los oacuterganos diana

El proceso se realiza en el momento en que el sistema nervioso central recibe un estiacutemulo el hipotaacutelamo recibe parte de ese estiacutemulo y actuacutea sobre la hipoacutefisis a su vez el hipotaacutelamo secreta las respectivas hormonas en la adenohipoacutefisis o libera las de la neurohipoacutefisis estas se incorporan a la circulacioacuten viajan por medio de la sangre y son captados por receptores especiacuteficos ubicados en los oacuterganos diana un ejemplo es la captacioacuten de la TSH por parte de los loacutebulos tiroideos de la glaacutendula tiroides

En ese momento el oacutergano diana que en todo caso es cualquiera de las glaacutendulas endocrinas comienzan a secretar sus propias hormonas con lo que se enviacutea un estiacutemulo al sistema nervioso especiacuteficamente al hipotaacutelamo o directamente a la hipoacutefisis con lo cual se contrarresta el estiacutemulo inicial

TRASTORNOS ASOCIADOS A LA HIPOFISIS

Condicioacuten Etiologiacutea Hormona

Acromegalia sobreproduccioacuten hormona de crecimiento

Gigantismo sobreproduccioacuten hormona de crecimiento

Deficiencia de la hormona de crecimiento

baja produccioacuten hormona de crecimiento

Siacutendrome de secrecioacuten inadecuada de la hormona antidiureacutetica

sobreproduccioacuten vasopresina

Diabetes insiacutepida baja produccioacuten vasopresina

Siacutendrome de Sheehan baja produccioacuten cualquier hormona hipofisaria

Adenoma hipofisario sobreproduccioacuten cualquier hormona hipofisaria

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ENDOCRINOLOGIA

Hipopituitarismo baja produccioacuten cualquier hormona hipofisaria

HORMONAS DEL HIPOTALAMO

El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta

Suele considerarse el centro integrador del sistema nervioso vegetativo (o sistema nervioso autoacutenomo) dentro del sistema nervioso perifeacuterico Tambieacuten se encarga de realizar funciones de integracioacuten somato-vegetativa

En conjunto con la hipoacutefisis realiza la homeostasis del organismo por medio de un sistema de realimentacioacuten negativa

Anatomiacutea

El dienceacutefalo estaacute constituido por el taacutelamo el hipotaacutelamo el epitaacutelamo y el subtaacutelamo El taacutelamo son dos masas en el medio del cerebro entre los dos hemisferios cerebrales El hipotaacutelamo estaacute debajo del taacutelamo y sus liacutemites estaacuten constituidos por

superior el piso del III ventriacuteculo anterior el quiasma oacuteptico

inferior y lateral subtaacutelamo

posterior liacutenea imaginaria entre los cuerpos mamilares y la comisura posterior del cerebro

Nuacutecleos neuronales

nuacutecleos laterales se relacionan con el hambre preoacuteptico funcioacuten parasimpaacutetica

supraoacuteptico produce hormona antidiureacutetica

paraventricular produce oxitocina

hipotalaacutemico anterior centro de la sed

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ENDOCRINOLOGIA

supraquiasmaacutetico regulacioacuten del ciclo circadiano

ventromedial centro de la saciedad

arcuato interviene en la conducta emocional y actividad endoacutecrina

mamilar funcioacuten simpaacutetica

hipotalaacutemico posterior participan en la memoria

Funciones

El hipotaacutelamo regula el hambre el apetito y la saciedad por medio de hormonas y peacuteptidos como la colecistoquinina el nivel de glucosa y aacutecidos grasos en sangre y el neuropeacuteptido Y entre otros

El hipotaacutelamo anterior o rostral (parasimpaacutetico) disipa (difunde) el calor y el hipotaacutelamo posterior o caudal (simpaacutetico) se encarga de mantener la temperatura corporal constante5 aumentando o disminuyendo la frecuencia respiratoria y la sudoracioacuten

La porcioacuten anterior y posterior del hipotaacutelamo regula el ciclo del suentildeo y de la vigilia (ritmo circadiano)

Hormonas

El hipotaacutelamo en cuanto oacutergano endocrino se ocupa de liberar factores liberadores o inhibidores a la sangre pero tambieacuten es capaz de producir neurohormonas listas para su secrecioacuten

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ENDOCRINOLOGIA

Neurohormonas

El hipotaacutelamo produce en los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares la ADH (hormona antidiureacutetica) o vasopresina la cual se acumula en la neurohipoacutefisis desde donde es secretada La vasopresina regula el balance de agua en el cuerpo actuando sobre los rintildeones Esta hormona se almacena en la hipoacutefisis posterior de donde es liberada La disfuncioacuten del hipotaacutelamo en la produccioacuten de ADH causa diabetes insiacutepida

La oxitocina es tambieacuten producida por el hipotaacutelamo y almacenada y liberada por la neurohipoacutefisis tambieacuten comparte similitudes en su estructura proteiacutenica y llegan a compartir algunas funciones En el caso de los hombres se desconoce su funcionalidad pero se la asocia con los genitales externos y con receptores de la vesiacutecula seminal

En el caso de las mujeres la oxitocina acelera el nuacutemero de contracciones en el parto e influye al uacutetero a que se reacomode despueacutes del parto Tambieacuten incita a las fibras musculares que rodean a las ceacutelulas secretoras de leche de las glaacutendulas mamarias a secretar leche en respuesta al acto de mamar del nintildeo

Factores hipotalaacutemicos

Aparte de las dos hormonas de accioacuten directa mencionadas el hipotaacutelamo secreta diversas hormonas o factores que regulan la secrecioacuten de hormonas hipofisarias

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ENDOCRINOLOGIA

Hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH LHRH o LHRF) Es un decapeacuteptido (una cadena de 10 aminoaacutecidos) que actuacutea sobre la hipoacutefisis estimulando la produccioacuten y la liberacioacuten de la hormona luteinizante (LH) y la hormona foliculoestimulante (FSH) El balance de estas hormonas coordina el ciclo menstrual femenino y la espermatogeacutenesis en los hombres

Hormona liberadora de tirotropina (TRH) Es un tripeacuteptido (moleacutecula compuesta por tres aminoaacutecidos) Estimula la secrecioacuten de prolactina (PRL) y de tirotropina (TSH) por parte de la adenohipoacutefisis

Corte sagital medio del cerebro El punto blanco en frente del hipotaacutelamo es el quiasma oacuteptico debajo del cual estaacute la pituitaria La liacutenea blanca entre la pituitaria y el espacio negro es la silla turca (hueso)

Hormona liberadora de corticotropina (CRH o CRF) Se sintetiza en los nuacutecleos paraventriculares a partir de un precursor polipeptiacutedico de unos 41aminoaacutecidos y posee una vida larga (minutos) Las neuronas secretoras se encuentran en la porcioacuten anterior de los nuacutecleos paraventriculares y sus axones terminan en la capa externa de la eminencia media Estimula la liberacioacuten de adrenocorticotropina (ACTH) y β-endorfina por parte de la adenohipoacutefisis La hormona antidiureacutetica y la angiotensina II potencian el efecto liberador de CRH

Somatocrinina hormona liberadora de somatotropina (STH) o factor liberador de hormona del crecimiento (GRF) Las neuronas productoras de este factor se encuentran en el nuacutecleo arcuato del hipotaacutelamo Se sintetiza a partir de un precursor de 107 o 108 aminoaacutecidos Estimula la liberacioacuten de la hormona del crecimiento hipofisaria (GH)

Somatostatina u hormona inhibidora de la liberacioacuten de somatotropina (GIH) Como su nombre indica inhibe la secrecioacuten de somatotropinay de otras hormonas como la insulina el glucagoacuten el polipeacuteptido pancreaacutetico y la TSH La zona secretora se encuentra en la regioacuten periventricular del hipotaacutelamo Es un tetradecapeacuteptido que se encuentra en el hipotaacutelamo y en las ceacutelulas D de los islotes de Langerhans Su precursor posee 116 aminoaacutecidos Hormona liberadora de corticotropina

PIF (Factor inhibidor de la liberacioacuten de prolactina) Actuacutea en forma constante inhibiendo la secrecioacuten de prolactina hipofisaria Dado que la dopamina inhibe tambieacuten la produccioacuten de prolactina al unirse a las

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ENDOCRINOLOGIA

ceacutelulas lactotropas de la hipoacutefisis durante alguacuten tiempo se pensoacute que se trataba de PIF la dopamina puede ser un PIF secundario Las neuronas secretoras de PIF se encuentran en el nuacutecleo arcuato hipotalaacutemico

Angiotensina II (AII) Es un octapeacuteptido que estimula la accioacuten de la hormona liberadora de corticotropina libera algo de adrenocorticotropina hipofisaria

Hormona tiroidea

Las hormonas tiroideas son producidas por la glaacutendula tiroides Su efecto es el aumento del metabolismo basal lo cual es indispensable para un correcto desarrollo fetal y el funcionamiento adecuado de los sistemas cardiovascular musculoesqueleacutetico hematopoyeacutetico asiacute como para respuestas corporales adecuadas en cuanto a produccioacuten de calor consumo de oxiacutegeno y regulacioacuten de otros sistemas hormonales

Tipos de hormona tiroidea

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ENDOCRINOLOGIA

T4 T3

Existen tres hormonas circulantescirculantesco grande

T4 tetrayodotironina o tiroxina T3 o triyodotironina

T3 reversa Esta es bioloacutegicamente inactiva

Los niveles plasmaacuteticos de estas hormonas se mantienen estables durante toda la vida con excepcioacuten del periacuteodo neonatal y en algunas enfermedades o con el uso de algunos faacutermacos

Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas

Los yoduros que se ingieren en los alimentos y en el agua son concentrados de forma activa por la glaacutendula tiroides convertidos a yodo orgaacutenico por la peroxidasa tiroidea e incorporados a la tirosina en la tiroglobulina intrafolicular contenida en el coloide de la superficie apical de la ceacutelula folicular del tiroides

Las tirosinas son yodadas en un lugar (monoyodotirosina) o en dos (diyodotirosina) y se acoplan para formar las hormonas activas

diyodotirosina + diyodotirosina (r) --gt tetrayodotironina [tiroxina T4] diyodotirosina + monoyodotirosina( r) --gt triyodotironina [T3]

Otra fuente de T3 en el interior de la glaacutendula tiroides es el producto de la monodesyodacioacuten del anillo externo de la T4 por una selenoenzima la desyodasa tipo I (5-D-I) Esta enzima se encuentra tambieacuten en el hiacutegado y los rintildeones La T3 resultante pasa a la circulacioacuten Tambieacuten existe una isoenzima que efectuacutea la misma reaccioacuten llamada desyodasa tipo II que se encuentra en el cerebro y la hipoacutefisis La T3 resultante actuacutea localmente2

La tiroglobulina una glucoproteiacutena que contiene T3 y T4 en su matriz es captada por el foliacuteculo en forma de gotitas de coloide por las ceacutelulas tiroideas

Todas las reacciones necesarias para la formacioacuten de T3 y T4 son influidas y controladas por la hormona estimulante del tiroides (TSH) llamada tambieacuten tirotropina que estimula las ceacutelulas foliculares en la glaacutendula tiroides

Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas se metabolizan principalmente en el hiacutegado Producto de una conjugacioacuten con los aacutecidos glucoroacutenico y sulfuacuterico por medio de un grupo hidroxilo fenoacutelico se genera una forma excretable a traveacutes de la bilis

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ENDOCRINOLOGIA

Una parte de los productos conjugados eliminados por la bilis se hidroliza y se absorbe como hormona activa en el intestino Es un fenoacutemeno conocido como circulacioacuten enterohepaacutetica El resto se elimina por las heces

En la circulacioacuten sanguiacutenea la T4 se metaboliza a T3 y T3 reversa las que a su vez se desyodan produceacutendose diyodotironinas inactivas

Efectos de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas tienen dos efectos fisioloacutegicos principales

1 Aumentan la siacutentesis de proteiacutenas praacutecticamente en todos los tejidos del organismo (La T3 y la T4 penetran en las ceacutelulas donde la T3 que se obtiene de la circulacioacuten y por la conversioacuten de T4 en T3 dentro de la ceacutelula se une a receptores nucleares individuales e influye sobre la formacioacuten de ARNm)

2 La T3 incrementa el consumo de oxiacutegeno mediante el aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa (bomba sodio-potasio) sobre todo en los tejidos responsables del consumo basal de oxiacutegeno (es decir hiacutegado rintildeoacuten corazoacuten y muacutesculo esqueleacutetico) El aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa es secundario al incremento de la siacutentesis de esta enzima por consiguiente el aumento del consumo de oxiacutegeno probablemente tambieacuten estaacute relacionado con la fijacioacuten nuclear de hormonas tiroideas No obstante no se ha descartado un efecto directo de la T3 sobre la mitocondria Se cree que la T3 es la hormona tiroidea activa aunque la misma T4 pueda ser bioloacutegicamente activa

Efectos fisioloacutegicos

Desarrollo normal del sistema nervioso central en el feto Funcionamiento normal del sistema nervioso central Su falta enlentece

su funcionamiento

Generacioacuten de calor

Efectos cronotroacutepico e inotroacutepico en el sistema cardiovascular

Aumenta el nuacutemero de receptores para catecolaminas y amplifica la respuesta postreceptor en el sistema simpaacutetico3

Aumenta la eritropoyetina

Regula el metabolismo oacuteseo

Permite la relajacioacuten muscular

Interviene en los niveles de produccioacuten de hormonas gonadotrofinas y somatotropa o GH

Permite la correcta respuesta del centro respiratorio a la hipoxia e hipercapnia

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ENDOCRINOLOGIA

Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma

Las hormonas tiroideas circulan unidas a proteiacutenas plasmaacuteticas Un porcentaje bajo de T4 y T3 circula libremente por la sangre y es de este porcentaje bajo de hormona que depende la accioacuten hormonal sobre los receptores celulares

Las proteiacutenas a las que se unen las hormonas tiroideas son

Globulina transportadora de tiroxina o TBG (del ingleacutes Thyroxin Binding Globulin)

Prealbuacutemina transportadora de tiroxina o TBPA (del ingleacutes Thyroxin Binding Pre Albumin)

Albuacutemina

Ya que existen factores que afectan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas mencionadas modificando la cantidad de hormona libre es muy importante medir la hormona libre en el plasma para evaluar la condicioacuten fisiopatoloacutegica en estudio

Por ejemplo los siguientes faacutermacos compiten con las hormonas tiroideas por su unioacuten con las proteiacutenas transportadoras

Salicilatos Hidantoiacutenas

Algunos antiinflamatorios no esteroideos como el Diclofenaco y el aacutecido mefenaacutemico

Furosemida

Por el contrario los siguientes faacutermacos incrementan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas transportadoras

Estroacutegenos Metadona

Clofibrato

Heroiacutena

Tamoxifeno

En el embarazo tambieacuten se modifica la afinidad de las hormonas tiroideas por las proteiacutenas transportadoras aumentando esta unioacuten y disminuyendo la hormona libre

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Paratiroides

Las glaacutendulas paratiroides son glaacutendulas endocrinas Situadas en el cuello generalmente localizadas en los polos De la glaacutendula tiroides que producen La hormona paratiroidea o paratohormona Por lo general hay cuatro glaacutendulas paratiroides Dos superiores y dos inferiores pero de forma ocasional puede haber cinco o maacutes Cuando existe alguna glaacutendula adicional eacutesta suele encontrarse en el mediastino en relacioacuten con el timo o dentro de la glaacutendula tiroides

La hormona paratiroidea participa en el control de la homeostasis del calcio y foacutesforo asiacute como en la fisiologiacutea del hueso

El exceso de funcioacuten de las glaacutendulas paratiroides se conoce como hiperparatiroidismo y suele cursar con elevacioacuten de los niveles plasmaacuteticos de calcio y fragilidad oacutesea que condiciona una mayor susceptibilidad a padecer fracturas La funcioacuten insuficiente de las glaacutendulas paratiroides (hipoparatiroidismo) es mucho menos frecuente y generalmente se presenta tras una cirugiacutea sobre la glaacutendula tiroides que conlleva la existencia de hipocalcemia Existen algunas enfermedades mucho maacutes raras que parecen deberse a alteraciones en el receptor de la hormona paratiroidea como la condroplasia metafiseal de Jansen y la condroplasia de Blomstrand

Hormona paratiroidea o parathormona Es secretada por las ceacutelulas principales de la glaacutendula paratiroides es un polipeacuteptido de 84 aminoaacutecidos cuyo peso molecular es de aproximadamente 9500 Daltons Facilita la absorcioacuten del calcio Vitamina D (en su forma natural) y fosfato conjuntamente en el intestino Aumenta la resorcioacuten de los huesos Mediante la produccioacuten de maacutes osteoclastos a partir de las ceacutelulas madre mesenquimatosas de la meacutedula oacutesea y retrasando la conversioacuten de estas en osteoblastos Los osteoclastos absorben el hueso mediante la liberacioacuten de hormonas proteoliacuteticas liberadas por lisosomas y la secrecioacuten de varios aacutecidos entre ellos el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido laacutectico Aumenta la reabsorcioacuten del calcio y reduce la resorcioacuten del fosfato en los tuacutebulos renales provocando que este salga en la orina en mayor concentracioacuten Aumenta la resorcioacuten del calcio en el intestino Induce un incremento en la formacioacuten del 125-dihidroxicolecalciferol (forma activa de la Vitamina D calitriol o Vitamina D3) a partir del 25-hidroxicolecalciferol (calcifediol) en los rintildeones la vitamina D3 luego actuacutea a nivel del epitelio intestinal aumentando la absorcioacuten del calcio aumentando asiacute los

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ENDOCRINOLOGIA

niveles de calcio plasmaacuteticos (valor normal del calcio plasmaacutetico 92-104 mgdl) Luego por un mecanismo de retroaccioacuten o retroalimentacioacuten negativa elevadas concentraciones de calcio plasmaacuteticos inhiben la secrecioacuten de la PTH (Hormona paratiroidea)ademaacutes ayuda a la reabsorcion del calcio por medio de los rintildeones

Calcitonina Secretada por las ceacutelulas parafoliculares en la Tiroides es un polipeacuteptido de 32 aminoaacutecidos con un peso molecular aproximado de 3000 Daltons aproximadamente Tiene una funcioacuten opuesta a la Hormona Paratiroidea disminuye la actividad osteoclaacutestica desacelera la formacioacuten de los osteoclastos y acelera la formacioacuten de osteoblastos (ceacutelulas encargadas de la formacioacuten del hueso)

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ENDOCRINOLOGIA

Glaacutendula suprarrenal

Las glaacutendulas con forma de triaacutengulo que estaacuten situadas encima de los rintildeones cuya funcioacuten es la de regular las respuestas al estreacutes a traveacutes de la siacutentesis de corticosteroides (principalmente cortisol) y catecolaminas (adrenalina sobre todo)

Capas de la glaacutendula suprarrenal

Introduccioacuten

Anatoacutemicamente las glaacutendulas suprarrenales estaacuten separadas situadas en la cara anterosuperior de los rintildeones y estaacuten irrigadas por la sangre que reciben de las suprarrenales (las suprarrenales superiores las suprarrenales medias y las suprarrenales inferiores) Estaacuten formadas por estructuras diferentes que son la meacutedula suprarrenal y la corteza suprarrenal ambas inervadas por el sistema nervioso autoacutenomo Como su nombre sugiere la meacutedula suprarrenal estaacute situada dentro de la glaacutendula rodeada por la corteza suprarrenal que forma la superficie

Meacutedula suprarrenal La suprarrenal o meacutedula adrenal estaacute compuesta principalmente por ceacutelulas cromafines productoras de hormonas siendo el principal oacutergano de conversioacuten del aminoaacutecido tirosina en catecolaminas epinefrina y norepinefrina tambieacuten llamadas adrenalina y noradrenalina respectivamente Las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal derivan embrioloacutegicamente de la cresta neural como neuronas modificadas Realmente estas ceacutelulas son ceacutelulas postganglionares del sistema nervioso simpaacutetico que reciben la inervacioacuten de ceacutelulas preganglionares Como las sinapsis entre fibras pre y postganglionares seon ganglios nerviosos autonoacutemicos la meacutedula suprarrenal puede considerarse como un ganglio nervioso del sistema nervioso simpaacutetico

En respuesta a una situacioacuten estresante como es el ejercicio fiacutesico o un peligro inminente las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal producen catecolaminas a la sangre en una relacioacuten 70 a 30 de epinefrina y norepinefrina respectivamente

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ENDOCRINOLOGIA

La epinefrina produce efectos importantes como el aumento de la frecuencia cardiacuteaca vasoconstriccioacuten broncodilatacioacuten y aumento del metabolismo que son respuestas muy fugaces

Corteza suprarrenal

La corteza suprarrenal o corteza adrenal estaacute situada rodeando la circunferencia de la glaacutendula suprarrenal Su funcioacuten es la de regular varios componentes del metabolismo con la produccioacuten de mineralcorticoides y glucocorticoides que incluyen a la aldosterona y cortisol La corteza suprarrenal tambieacuten es un lugar secundario de siacutentesis de androacutegenos

La corteza suprarrenal secreta hormonas esteroideas (de naturaleza lipidica) por lo que sus ceacutelulas presentan abundante REL (reticulo endoplasmaacutetico liso) y mitocondrias con crestas longitudinales al MET Se dispone en tres capas diferentes de tejido basado en los tipos celulares y la funcioacuten que realizan

Zona glomerular Produccioacuten de mineralocorticoides sobre todo aldosterona

Zona fascicular Produccioacuten de glucocorticoides principalmente cortisol cerca del 95

Zona reticular Produccioacuten de androacutegenos incluyendo testosterona

Zona glomerular

Las ceacutelulas de la zona glomerular de la corteza suprarrenal segregan mineralocorticoides como la aldosterona y la desoxicorticosterona en respuesta a un aumento de los niveles de potasio o descenso del flujo de sangre en los rintildeones La aldosterona es liberada a la sangre formando parte del sistema renina-angiotensina que regula la concentracioacuten de electrolitos en la sangre sobre todo de sodio y potasio actuando en el tuacutebulo contorneado distal de la nefrona de los rintildeones

Aumentando la excrecioacuten de potasio Aumentando la reabsorcioacuten de sodio

La Aldosterona es una hormona que ayuda a regular la presioacuten osmoacutetica de mi organismo Por ejemplo si en el plasma sanguiacuteneo hay una escasez de sales ([osmolaridad] baja) se secretaraacute mayor cantidad de Aldosterona para reabsorber maacutes sodio y por consiguiente normalizar los niveles Lo mismo si hay una concentracioacuten muy elevada de sales en la sangre (osmolaridad alta) se secretaraacute menos o se inhibiraacute la secrecioacuten de Aldosterona para no tener que reabsorber el Sodio y por consiguiente eliminarlo normalizando las concentraciones

Zona fascicular

Capa predominante en la corteza suprarrenal cuyas celulas se disponen en hileras separadas por tabiques y capilares Sus ceacutelulas se llaman espongiocitos

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ENDOCRINOLOGIA

porque son voluminosas y contienen numerosos granulos claros dando a su superficie un aspecto de esponja Estas ceacutelulas segregan glucocorticoides como el cortisol o hidrocortisona y la cortisona al ser estimuladas por la hormona adrenocorticotropica (ACTH) La ACTH es producida por la hipoacutefisis en respuesta al factor hipotalaacutemico estimulante de corticotropina (CRH) Estos tres oacuterganos del sistema endocrino forman el eje hipotaacutelamo-hipofisario-suprarrenal

El principal glucocorticoide producido por las glaacutendulas suprarrenales es el cortisol que cumple diferentes funciones en el metabolismo en muacuteltiples ceacutelulas del organismo como

Estimulacioacuten de la produccioacuten de aminoaacutecidos por el cuerpo rompiendo proteiacutenas proteoacutelisis

Estimulacioacuten de la lipoacutelisis es decir rompiendo la grasa

Estimulacioacuten gluconeogeacutenesis la produccioacuten de glucosa a partir de nuevas fuentes como los aminaacutecidos y la glicerina de los aacutecidos grasos

Mantenimiento de la glucosa inhibiendo su liberacioacuten desde el muacutesculo y del tejido adiposo

Los glucocorticoides aumentan las concentraciones de glucosa en sangre pues actuacutean como antagonistas de la insulina e inhiben su liberacioacuten lo que produce una disminucioacuten de la captacioacuten de glucosa por los tejidos esto favorece que aumente la siacutentesis de glucosa en el hiacutegado y aumente la cantidad de glucoacutegeno en este mismo

Los glucocorticoides tambieacuten tienen propiedades antiinflamatorias que estaacuten relacionadas con sus efectos sobre la microcirculacioacuten y la inhibicioacuten de las citocinas pro-inflamatorias (IL-1 e IL-6) prostaglandinas y linfocinas Por lo tanto regulan las respuestas inmunitarias a traveacutes del llamado eje inmunosuprarrenal

Tambieacuten el cortisol tiene efectos importantes sobre la regulacioacuten del agua corporal retrasando la entrada de este liacutequido del espacio extracelular al intracelular Por lo que favorece la eliminacioacuten renal de agua

El cortisol inhibe la secrecioacuten de la propiomelanocortina (precursor de ACTH) de la CRH (Hormona liberadora de Corticotropina producida por las ceacutelulas de la eminencia media del hipotaacutelamo) y de Vasopresina

Zona reticular

Es la maacutes interna y presenta ceacutelulas dispuestas en cordones entrecruzados o anastomosados que segregan esteroides sexuales como estroacutegenos y androacutegenos

Las ceacutelulas de la zona reticular producen una fuente secundaria de androacutegenos como testosterona dihidrotestosterona (DHT) androstendiona y

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ENDOCRINOLOGIA

dehidroepiandrosterona (DHEA) Estas hormonas aumentan la masa muscular estimulan el crecimiento celular y ayudan al desarrollo de los caracteres sexuales secundarios

Paacutencreas

El paacutencreas oacutergano que segrega enzimas digestivas que pasan al intestino delgado Estas enzimas ayudan en la ruptura de carbohidratos liacutepidos proteinas y aacutecidos nucleacuteicos en el quimo Tiene forma coacutenica con un proceso uniforme medial e inferior En la especie humana su longitud oscila entre 20 y 30 cm tiene una anchura de unos 4 cm y un grosor de 5 centiacutemetros con un peso 30g La cabeza se localiza en la concavidad del duodeno o asa duodenal formada por la segunda porcioacuten del duodeno

Histologiacutea del paacutencreas

El paacutencreas tiene una parte exocrina y una parte endocrina

La parte exocrina contiene unas glaacutendulas llamadas aacutecinos serosos que son redondos u ovalados con ceacutelulas epiteliales Formados por las celuacutelas acinosas y en parte por las centroacinosas

La parte endocrina se agrupa en islotes de Langerhans que consisten en cuacutemulos de ceacutelulas secretoras de hormonas que producen insulina glucagoacuten y somatostatina Estos tipos de ceacutelulas son los siguientes

Ceacutelula alfa (Alfa cell)

Estas ceacutelulas alfa sintetizan y liberan glucagoacuten El glucagoacuten aumenta el nivel de glucosa sanguiacutenea al estimular la formacioacuten de este carbohidrato a partir del glucoacutegeno almacenado en hepatocitos Tambieacuten ejerce efecto en el metabolismo de proteiacutenas y grasas La liberacioacuten del glucagoacuten es inhibida por la hiperglucemia Representan entre el 10 - 20 del volumen del islote y se distribuyen de forma perifeacuterica

Ceacutelula beta (Beta Cell)

Las ceacutelulas beta producen y liberan insulina hormona que regula el nivel de glucosa en la sangre (facilitando el uso de glucosa por parte de las ceacutelulas y retirando el exceso de glucosa que se almacena en el hiacutegado en forma de glucoacutegeno)

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ENDOCRINOLOGIA

En los diabeacuteticos tipo I las ceacutelulas beta han sido dantildeadas y no son capaces de producir la hormona

Ceacutelula delta (Delta Cell)

Las ceacutelulas delta producen somatostatina hormona que se cree que regulariacutea la produccioacuten y liberacioacuten de la insulina por las ceacutelulas beta y la produccioacuten y liberacioacuten de glucagoacuten por las ceacutelulas alfa

Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)

Estas ceacutelulas hacen que el estoacutemago produzca y libere la hormona Grelina

Ceacutelula F (PP CELL)

Estas ceacutelulas producen y liberan Polipeacuteptido Pancreaacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

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ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

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ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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ENDOCRINOLOGIA

Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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ENDOCRINOLOGIA

Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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ENDOCRINOLOGIA

5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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ENDOCRINOLOGIA

como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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ENDOCRINOLOGIA

cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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ENDOCRINOLOGIA

Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ENDOCRINOLOGIA

ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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ENDOCRINOLOGIA

BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

httpwwwcirujanosdechileclRevistaPDF20Cirujanos202005_02RevCir205(14)AVpdf

httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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Page 6: Trabajo Final Endocrinologia

ENDOCRINOLOGIA

Corteza suprarrenal

Mineralocorticoides (aldosterona)

Tuacutebulos renales

Mantiene el equilibrio de sodio y fosfato

Glucocorticoides (cortisol)

General Ayuda al organismo a adaptarse al estres a largo plazo eleva la concentracioacuten sanguiacutenea de glucosa moviliza grasa

Glaacutendula pineal Melatonina Goacutenadas ceacutelulas pigmentarias otros tejidos

Influye en los procesos reproductivos en cricetos y otros animales pigmentacioacuten en algunos vertebrados puede controlar biorritmos en algunos animales puede ayudar a controlar el inicio de la pubertad en el ser humano

Ovario Estroacutegenos (estradiol)

General uacutetero

Desarrollo y mantenimiento de caracteres sexuales femeninos estimula el crecimiento del revestimiento uterino

Progesterona Uacutetero mama Estimula el desarrollo del revestimiento uterino

Testiacuteculos Testosterona General estructuras reproductivas

Desarrollo y mantenimiento de caracteres sexuales masculinos promueve la espermatogeacutenesisproduce el crecimiento en la adolescencia

Inhibina Loacutebulo anterior de la hipoacutefisis

Inhibe la liberacioacuten de FSH

Trabajo final Paacutegina 6

ENDOCRINOLOGIA

Hipoacutefisis anterior y posterior Tiroides Paratiroides Suprarrenales y Paacutencreas

La hipoacutefisis o glaacutendula pituitaria

Es la glaacutendula que controla el resto de las glaacutendulas entre ellas la tiroides Es una glaacutendula compleja que se aloja en un espacio oacuteseo llamado silla turca del hueso esfenoides situada en la base del craacuteneo en la fosa cerebral media que conecta con el hipotaacutelamo a traveacutes del tallo pituitario o tallo hipofisario Tiene un peso aproximado de 05 g

Etimologiacutea

El teacutermino laquohipoacutefisisraquo proviene del griego hipo (lsquodebajorsquo) y fisis (lsquocrecerrsquo)

Partes

La hipoacutefisis consta de tres partes

Loacutebulo anterior o adenohipoacutefisis procede embrioloacutegicamente de un esbozo fariacutengeo (bolsa de Rathke) y es responsable de la secrecioacuten de numerosas hormonas (ver maacutes adelante)

Hipoacutefisis media o pars intermedia produce dos polipeacuteptidos llamados melanotropinas u hormonas estimulantes de los melanocitos que inducen el aumento de la siacutentesis de melanina de las ceacutelulas de la piel

Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo

Adenohipoacutefisis

La adenohipoacutefisis segrega muchas hormonas de las cuales seis son relevantes para la funcioacuten fisioloacutegica adecuada del organismo las cuales son segregadas por 5 tipos de ceacutelulas diferentes Estas ceacutelulas son de origen epitelial y como muchas glaacutendulas endocrinas estaacuten organizadas en lagunas rodeadas de capilares sinusoides fenestrados a los cuales se vierte su secrecioacuten hormonal Los tipos de ceacutelulas se clasificaban antes de acuerdo a su tincioacuten y eran acidoacutefilas basoacutefilas y cromoacutefobas (o que no se tintildeen) Pero en la actualidad se cuenta con teacutecnicas de inmunohistoquiacutemica y se han podido identificar 5 tipos celulares

Ceacutelulas somatoacutetropas que segregan GH (acidoacutefilas) Ceacutelulas lactotropas o mamoacutetropas que segregan PRL (acidoacutefilas)

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ENDOCRINOLOGIA

Ceacutelulas corticoacutetropas que segregan ACTH (basoacutefila)

Ceacutelulas gonadoacutetropas que segregan las gonadotropinas LH y FSH (basoacutefila)

Ceacutelulas tirotropas que secretan la TSH (basoacutefila)

Las ceacutelulas cromoacutefobas son en realidad ceacutelulas desgastadas y pueden haber sido cualquiera de las cinco anteriores

Hormonas de la adenohipoacutefisis

Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)

Prolactina (PRL) u hormona luteotroacutepica Estimula el desarrollo de los acinos mamarios y estimula la traduccioacuten de los genes para las proteiacutenas de la leche

Las demaacutes hormonas son hormonas troacuteficas que tienen su efecto en algunas glaacutendulas endocrinas perifeacutericas

Hormona estimulante del tiroides (TSH) o tirotropina Estimula la produccioacuten de hormonas por parte del tiroides

Hormona estimulante de la corteza suprarrenal (ACTH) o corticotropina Estimula la produccioacuten de hormonas por parte de las glaacutendulas suprarrenales

Hormona luteinizante (LH) Estimulan la produccioacuten de hormonas por parte de las goacutenadas y la ovulacioacuten

Hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Misma funcioacuten que la anterior

La LH y la FSH se denominan gonadotropinas ya que regulan la funcioacuten de las goacutenadas

Neurohipoacutefisis

La neurohipoacutefisis tiene un origen embrioloacutegico diferente al del resto de la hipoacutefisis mediante un crecimiento hacia abajo del hipotaacutelamo por lo que tiene funciones diferentes Se suele dividir a su vez en tres partes eminencia media infundibulo y pars nervosa de las cuales la uacuteltima es la maacutes funcional Las ceacutelulas de la neurohipoacutefisis se conocen como pituicitos y no son maacutes que ceacutelulas gliales de sosteacuten Por tanto la neurohipoacutefisis no es en realidad una glaacutendula secretora ya que se limita a almacenar los productos de secrecioacuten

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ENDOCRINOLOGIA

del hipotaacutelamo En efecto los axoplasmas de las neuronas de los nuacutecleos hipotalamicos supraoacuteptico y paraventricular secretan la ADH y la oxitocina respectivamente que se almacenan en las vesiacuteculas de los axones que de eacutel llegan a la neurohipoacutefisis dichas vesiacuteculas se liberan cerca del plexo primario hipofisiario en respuesta impulsos eleacutectricos por parte del hipotaacutelamo

Hormona antidiureacutetica (ADH) o vasopresina Se secreta en estiacutemulo a una disminucioacuten del volumen plasmaacutetico y como consecuencia de la disminucioacuten en la presioacuten arterial que esto ocasiona y su secrecioacuten aumenta la reabsorcioacuten de agua desde los tuacutebulos colectores renales por medio de la translocacioacuten a la membrana de la acuaporina II tambieacuten provoca una fuerte vasoconstriccioacuten por lo que tambieacuten es llamada vasopresina

Oxitocina Estimula la contraccioacuten de las ceacutelulas mioepiteliales de las glaacutendulas mamarias lo que causa la eyeccioacuten de leche por parte de la mama y se estimula por la succioacuten transmitiendo sentildeales al hipotalamo (retroalimentacioacuten) para que secrete mas oxitocina Causa contracciones del musculo liso del uacutetero en el orgasmo y tambieacuten los tiacutepicos espasmos de la etapa final del parto

Regulacioacuten hipotalaacutemica

La hipoacutefisis y el hipotaacutelamo estaacuten conectados por un sistema capilar denominado sistema portal el cual proviene de la arteria caroacutetida interna y del poliacutegono de Willis e irriga primero al hipotaacutelamo formando el plexo capilar primario que drena en los vasos porta hipofisiarios que a su vez forman el plexo capilar hipofisiario

La importancia de este sistema es que transporta las hormonas liberadoras o hipofisiotroacutepicas que secreta el hipotaacutelamo con fines reguladores de la secrecioacuten adenohipofisiaria Estas hormonas son

Somatoliberina (GHRH) Estimula la secrecioacuten de GH por parte de la hipoacutefisis

Corticoliberina (ARH) Estimula la secrecioacuten de ACTH por parte de la hipoacutefisis

Tiroliberina (TRH) Estimula la secrecioacuten de TSH por parte de la hipoacutefisis

Gonadoliberina (LHRH) Estimula la secrecioacuten de LH y FSH por parte de la hipoacutefisis

Hormona inhibidora de la GH (GHIH) o somatostatina Inhibe la secrecioacuten de la GH por parte de la hipoacutefisis

La prolactina estaacute regulada negativamente por dopamina un neurotransmisor

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ENDOCRINOLOGIA

Hay que tener en cuenta que la regulacioacuten de la secrecioacuten de las hormonas hipofisiarias se realiza mediante un mecanismo de retroalimentacioacuten negativa el cual se establece entre el hipotaacutelamo la hipofisis y los receptores especiacuteficos para cada hormona localizado en los oacuterganos diana

El proceso se realiza en el momento en que el sistema nervioso central recibe un estiacutemulo el hipotaacutelamo recibe parte de ese estiacutemulo y actuacutea sobre la hipoacutefisis a su vez el hipotaacutelamo secreta las respectivas hormonas en la adenohipoacutefisis o libera las de la neurohipoacutefisis estas se incorporan a la circulacioacuten viajan por medio de la sangre y son captados por receptores especiacuteficos ubicados en los oacuterganos diana un ejemplo es la captacioacuten de la TSH por parte de los loacutebulos tiroideos de la glaacutendula tiroides

En ese momento el oacutergano diana que en todo caso es cualquiera de las glaacutendulas endocrinas comienzan a secretar sus propias hormonas con lo que se enviacutea un estiacutemulo al sistema nervioso especiacuteficamente al hipotaacutelamo o directamente a la hipoacutefisis con lo cual se contrarresta el estiacutemulo inicial

TRASTORNOS ASOCIADOS A LA HIPOFISIS

Condicioacuten Etiologiacutea Hormona

Acromegalia sobreproduccioacuten hormona de crecimiento

Gigantismo sobreproduccioacuten hormona de crecimiento

Deficiencia de la hormona de crecimiento

baja produccioacuten hormona de crecimiento

Siacutendrome de secrecioacuten inadecuada de la hormona antidiureacutetica

sobreproduccioacuten vasopresina

Diabetes insiacutepida baja produccioacuten vasopresina

Siacutendrome de Sheehan baja produccioacuten cualquier hormona hipofisaria

Adenoma hipofisario sobreproduccioacuten cualquier hormona hipofisaria

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ENDOCRINOLOGIA

Hipopituitarismo baja produccioacuten cualquier hormona hipofisaria

HORMONAS DEL HIPOTALAMO

El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta

Suele considerarse el centro integrador del sistema nervioso vegetativo (o sistema nervioso autoacutenomo) dentro del sistema nervioso perifeacuterico Tambieacuten se encarga de realizar funciones de integracioacuten somato-vegetativa

En conjunto con la hipoacutefisis realiza la homeostasis del organismo por medio de un sistema de realimentacioacuten negativa

Anatomiacutea

El dienceacutefalo estaacute constituido por el taacutelamo el hipotaacutelamo el epitaacutelamo y el subtaacutelamo El taacutelamo son dos masas en el medio del cerebro entre los dos hemisferios cerebrales El hipotaacutelamo estaacute debajo del taacutelamo y sus liacutemites estaacuten constituidos por

superior el piso del III ventriacuteculo anterior el quiasma oacuteptico

inferior y lateral subtaacutelamo

posterior liacutenea imaginaria entre los cuerpos mamilares y la comisura posterior del cerebro

Nuacutecleos neuronales

nuacutecleos laterales se relacionan con el hambre preoacuteptico funcioacuten parasimpaacutetica

supraoacuteptico produce hormona antidiureacutetica

paraventricular produce oxitocina

hipotalaacutemico anterior centro de la sed

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ENDOCRINOLOGIA

supraquiasmaacutetico regulacioacuten del ciclo circadiano

ventromedial centro de la saciedad

arcuato interviene en la conducta emocional y actividad endoacutecrina

mamilar funcioacuten simpaacutetica

hipotalaacutemico posterior participan en la memoria

Funciones

El hipotaacutelamo regula el hambre el apetito y la saciedad por medio de hormonas y peacuteptidos como la colecistoquinina el nivel de glucosa y aacutecidos grasos en sangre y el neuropeacuteptido Y entre otros

El hipotaacutelamo anterior o rostral (parasimpaacutetico) disipa (difunde) el calor y el hipotaacutelamo posterior o caudal (simpaacutetico) se encarga de mantener la temperatura corporal constante5 aumentando o disminuyendo la frecuencia respiratoria y la sudoracioacuten

La porcioacuten anterior y posterior del hipotaacutelamo regula el ciclo del suentildeo y de la vigilia (ritmo circadiano)

Hormonas

El hipotaacutelamo en cuanto oacutergano endocrino se ocupa de liberar factores liberadores o inhibidores a la sangre pero tambieacuten es capaz de producir neurohormonas listas para su secrecioacuten

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ENDOCRINOLOGIA

Neurohormonas

El hipotaacutelamo produce en los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares la ADH (hormona antidiureacutetica) o vasopresina la cual se acumula en la neurohipoacutefisis desde donde es secretada La vasopresina regula el balance de agua en el cuerpo actuando sobre los rintildeones Esta hormona se almacena en la hipoacutefisis posterior de donde es liberada La disfuncioacuten del hipotaacutelamo en la produccioacuten de ADH causa diabetes insiacutepida

La oxitocina es tambieacuten producida por el hipotaacutelamo y almacenada y liberada por la neurohipoacutefisis tambieacuten comparte similitudes en su estructura proteiacutenica y llegan a compartir algunas funciones En el caso de los hombres se desconoce su funcionalidad pero se la asocia con los genitales externos y con receptores de la vesiacutecula seminal

En el caso de las mujeres la oxitocina acelera el nuacutemero de contracciones en el parto e influye al uacutetero a que se reacomode despueacutes del parto Tambieacuten incita a las fibras musculares que rodean a las ceacutelulas secretoras de leche de las glaacutendulas mamarias a secretar leche en respuesta al acto de mamar del nintildeo

Factores hipotalaacutemicos

Aparte de las dos hormonas de accioacuten directa mencionadas el hipotaacutelamo secreta diversas hormonas o factores que regulan la secrecioacuten de hormonas hipofisarias

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ENDOCRINOLOGIA

Hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH LHRH o LHRF) Es un decapeacuteptido (una cadena de 10 aminoaacutecidos) que actuacutea sobre la hipoacutefisis estimulando la produccioacuten y la liberacioacuten de la hormona luteinizante (LH) y la hormona foliculoestimulante (FSH) El balance de estas hormonas coordina el ciclo menstrual femenino y la espermatogeacutenesis en los hombres

Hormona liberadora de tirotropina (TRH) Es un tripeacuteptido (moleacutecula compuesta por tres aminoaacutecidos) Estimula la secrecioacuten de prolactina (PRL) y de tirotropina (TSH) por parte de la adenohipoacutefisis

Corte sagital medio del cerebro El punto blanco en frente del hipotaacutelamo es el quiasma oacuteptico debajo del cual estaacute la pituitaria La liacutenea blanca entre la pituitaria y el espacio negro es la silla turca (hueso)

Hormona liberadora de corticotropina (CRH o CRF) Se sintetiza en los nuacutecleos paraventriculares a partir de un precursor polipeptiacutedico de unos 41aminoaacutecidos y posee una vida larga (minutos) Las neuronas secretoras se encuentran en la porcioacuten anterior de los nuacutecleos paraventriculares y sus axones terminan en la capa externa de la eminencia media Estimula la liberacioacuten de adrenocorticotropina (ACTH) y β-endorfina por parte de la adenohipoacutefisis La hormona antidiureacutetica y la angiotensina II potencian el efecto liberador de CRH

Somatocrinina hormona liberadora de somatotropina (STH) o factor liberador de hormona del crecimiento (GRF) Las neuronas productoras de este factor se encuentran en el nuacutecleo arcuato del hipotaacutelamo Se sintetiza a partir de un precursor de 107 o 108 aminoaacutecidos Estimula la liberacioacuten de la hormona del crecimiento hipofisaria (GH)

Somatostatina u hormona inhibidora de la liberacioacuten de somatotropina (GIH) Como su nombre indica inhibe la secrecioacuten de somatotropinay de otras hormonas como la insulina el glucagoacuten el polipeacuteptido pancreaacutetico y la TSH La zona secretora se encuentra en la regioacuten periventricular del hipotaacutelamo Es un tetradecapeacuteptido que se encuentra en el hipotaacutelamo y en las ceacutelulas D de los islotes de Langerhans Su precursor posee 116 aminoaacutecidos Hormona liberadora de corticotropina

PIF (Factor inhibidor de la liberacioacuten de prolactina) Actuacutea en forma constante inhibiendo la secrecioacuten de prolactina hipofisaria Dado que la dopamina inhibe tambieacuten la produccioacuten de prolactina al unirse a las

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ENDOCRINOLOGIA

ceacutelulas lactotropas de la hipoacutefisis durante alguacuten tiempo se pensoacute que se trataba de PIF la dopamina puede ser un PIF secundario Las neuronas secretoras de PIF se encuentran en el nuacutecleo arcuato hipotalaacutemico

Angiotensina II (AII) Es un octapeacuteptido que estimula la accioacuten de la hormona liberadora de corticotropina libera algo de adrenocorticotropina hipofisaria

Hormona tiroidea

Las hormonas tiroideas son producidas por la glaacutendula tiroides Su efecto es el aumento del metabolismo basal lo cual es indispensable para un correcto desarrollo fetal y el funcionamiento adecuado de los sistemas cardiovascular musculoesqueleacutetico hematopoyeacutetico asiacute como para respuestas corporales adecuadas en cuanto a produccioacuten de calor consumo de oxiacutegeno y regulacioacuten de otros sistemas hormonales

Tipos de hormona tiroidea

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ENDOCRINOLOGIA

T4 T3

Existen tres hormonas circulantescirculantesco grande

T4 tetrayodotironina o tiroxina T3 o triyodotironina

T3 reversa Esta es bioloacutegicamente inactiva

Los niveles plasmaacuteticos de estas hormonas se mantienen estables durante toda la vida con excepcioacuten del periacuteodo neonatal y en algunas enfermedades o con el uso de algunos faacutermacos

Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas

Los yoduros que se ingieren en los alimentos y en el agua son concentrados de forma activa por la glaacutendula tiroides convertidos a yodo orgaacutenico por la peroxidasa tiroidea e incorporados a la tirosina en la tiroglobulina intrafolicular contenida en el coloide de la superficie apical de la ceacutelula folicular del tiroides

Las tirosinas son yodadas en un lugar (monoyodotirosina) o en dos (diyodotirosina) y se acoplan para formar las hormonas activas

diyodotirosina + diyodotirosina (r) --gt tetrayodotironina [tiroxina T4] diyodotirosina + monoyodotirosina( r) --gt triyodotironina [T3]

Otra fuente de T3 en el interior de la glaacutendula tiroides es el producto de la monodesyodacioacuten del anillo externo de la T4 por una selenoenzima la desyodasa tipo I (5-D-I) Esta enzima se encuentra tambieacuten en el hiacutegado y los rintildeones La T3 resultante pasa a la circulacioacuten Tambieacuten existe una isoenzima que efectuacutea la misma reaccioacuten llamada desyodasa tipo II que se encuentra en el cerebro y la hipoacutefisis La T3 resultante actuacutea localmente2

La tiroglobulina una glucoproteiacutena que contiene T3 y T4 en su matriz es captada por el foliacuteculo en forma de gotitas de coloide por las ceacutelulas tiroideas

Todas las reacciones necesarias para la formacioacuten de T3 y T4 son influidas y controladas por la hormona estimulante del tiroides (TSH) llamada tambieacuten tirotropina que estimula las ceacutelulas foliculares en la glaacutendula tiroides

Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas se metabolizan principalmente en el hiacutegado Producto de una conjugacioacuten con los aacutecidos glucoroacutenico y sulfuacuterico por medio de un grupo hidroxilo fenoacutelico se genera una forma excretable a traveacutes de la bilis

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ENDOCRINOLOGIA

Una parte de los productos conjugados eliminados por la bilis se hidroliza y se absorbe como hormona activa en el intestino Es un fenoacutemeno conocido como circulacioacuten enterohepaacutetica El resto se elimina por las heces

En la circulacioacuten sanguiacutenea la T4 se metaboliza a T3 y T3 reversa las que a su vez se desyodan produceacutendose diyodotironinas inactivas

Efectos de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas tienen dos efectos fisioloacutegicos principales

1 Aumentan la siacutentesis de proteiacutenas praacutecticamente en todos los tejidos del organismo (La T3 y la T4 penetran en las ceacutelulas donde la T3 que se obtiene de la circulacioacuten y por la conversioacuten de T4 en T3 dentro de la ceacutelula se une a receptores nucleares individuales e influye sobre la formacioacuten de ARNm)

2 La T3 incrementa el consumo de oxiacutegeno mediante el aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa (bomba sodio-potasio) sobre todo en los tejidos responsables del consumo basal de oxiacutegeno (es decir hiacutegado rintildeoacuten corazoacuten y muacutesculo esqueleacutetico) El aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa es secundario al incremento de la siacutentesis de esta enzima por consiguiente el aumento del consumo de oxiacutegeno probablemente tambieacuten estaacute relacionado con la fijacioacuten nuclear de hormonas tiroideas No obstante no se ha descartado un efecto directo de la T3 sobre la mitocondria Se cree que la T3 es la hormona tiroidea activa aunque la misma T4 pueda ser bioloacutegicamente activa

Efectos fisioloacutegicos

Desarrollo normal del sistema nervioso central en el feto Funcionamiento normal del sistema nervioso central Su falta enlentece

su funcionamiento

Generacioacuten de calor

Efectos cronotroacutepico e inotroacutepico en el sistema cardiovascular

Aumenta el nuacutemero de receptores para catecolaminas y amplifica la respuesta postreceptor en el sistema simpaacutetico3

Aumenta la eritropoyetina

Regula el metabolismo oacuteseo

Permite la relajacioacuten muscular

Interviene en los niveles de produccioacuten de hormonas gonadotrofinas y somatotropa o GH

Permite la correcta respuesta del centro respiratorio a la hipoxia e hipercapnia

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ENDOCRINOLOGIA

Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma

Las hormonas tiroideas circulan unidas a proteiacutenas plasmaacuteticas Un porcentaje bajo de T4 y T3 circula libremente por la sangre y es de este porcentaje bajo de hormona que depende la accioacuten hormonal sobre los receptores celulares

Las proteiacutenas a las que se unen las hormonas tiroideas son

Globulina transportadora de tiroxina o TBG (del ingleacutes Thyroxin Binding Globulin)

Prealbuacutemina transportadora de tiroxina o TBPA (del ingleacutes Thyroxin Binding Pre Albumin)

Albuacutemina

Ya que existen factores que afectan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas mencionadas modificando la cantidad de hormona libre es muy importante medir la hormona libre en el plasma para evaluar la condicioacuten fisiopatoloacutegica en estudio

Por ejemplo los siguientes faacutermacos compiten con las hormonas tiroideas por su unioacuten con las proteiacutenas transportadoras

Salicilatos Hidantoiacutenas

Algunos antiinflamatorios no esteroideos como el Diclofenaco y el aacutecido mefenaacutemico

Furosemida

Por el contrario los siguientes faacutermacos incrementan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas transportadoras

Estroacutegenos Metadona

Clofibrato

Heroiacutena

Tamoxifeno

En el embarazo tambieacuten se modifica la afinidad de las hormonas tiroideas por las proteiacutenas transportadoras aumentando esta unioacuten y disminuyendo la hormona libre

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ENDOCRINOLOGIA

Paratiroides

Las glaacutendulas paratiroides son glaacutendulas endocrinas Situadas en el cuello generalmente localizadas en los polos De la glaacutendula tiroides que producen La hormona paratiroidea o paratohormona Por lo general hay cuatro glaacutendulas paratiroides Dos superiores y dos inferiores pero de forma ocasional puede haber cinco o maacutes Cuando existe alguna glaacutendula adicional eacutesta suele encontrarse en el mediastino en relacioacuten con el timo o dentro de la glaacutendula tiroides

La hormona paratiroidea participa en el control de la homeostasis del calcio y foacutesforo asiacute como en la fisiologiacutea del hueso

El exceso de funcioacuten de las glaacutendulas paratiroides se conoce como hiperparatiroidismo y suele cursar con elevacioacuten de los niveles plasmaacuteticos de calcio y fragilidad oacutesea que condiciona una mayor susceptibilidad a padecer fracturas La funcioacuten insuficiente de las glaacutendulas paratiroides (hipoparatiroidismo) es mucho menos frecuente y generalmente se presenta tras una cirugiacutea sobre la glaacutendula tiroides que conlleva la existencia de hipocalcemia Existen algunas enfermedades mucho maacutes raras que parecen deberse a alteraciones en el receptor de la hormona paratiroidea como la condroplasia metafiseal de Jansen y la condroplasia de Blomstrand

Hormona paratiroidea o parathormona Es secretada por las ceacutelulas principales de la glaacutendula paratiroides es un polipeacuteptido de 84 aminoaacutecidos cuyo peso molecular es de aproximadamente 9500 Daltons Facilita la absorcioacuten del calcio Vitamina D (en su forma natural) y fosfato conjuntamente en el intestino Aumenta la resorcioacuten de los huesos Mediante la produccioacuten de maacutes osteoclastos a partir de las ceacutelulas madre mesenquimatosas de la meacutedula oacutesea y retrasando la conversioacuten de estas en osteoblastos Los osteoclastos absorben el hueso mediante la liberacioacuten de hormonas proteoliacuteticas liberadas por lisosomas y la secrecioacuten de varios aacutecidos entre ellos el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido laacutectico Aumenta la reabsorcioacuten del calcio y reduce la resorcioacuten del fosfato en los tuacutebulos renales provocando que este salga en la orina en mayor concentracioacuten Aumenta la resorcioacuten del calcio en el intestino Induce un incremento en la formacioacuten del 125-dihidroxicolecalciferol (forma activa de la Vitamina D calitriol o Vitamina D3) a partir del 25-hidroxicolecalciferol (calcifediol) en los rintildeones la vitamina D3 luego actuacutea a nivel del epitelio intestinal aumentando la absorcioacuten del calcio aumentando asiacute los

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ENDOCRINOLOGIA

niveles de calcio plasmaacuteticos (valor normal del calcio plasmaacutetico 92-104 mgdl) Luego por un mecanismo de retroaccioacuten o retroalimentacioacuten negativa elevadas concentraciones de calcio plasmaacuteticos inhiben la secrecioacuten de la PTH (Hormona paratiroidea)ademaacutes ayuda a la reabsorcion del calcio por medio de los rintildeones

Calcitonina Secretada por las ceacutelulas parafoliculares en la Tiroides es un polipeacuteptido de 32 aminoaacutecidos con un peso molecular aproximado de 3000 Daltons aproximadamente Tiene una funcioacuten opuesta a la Hormona Paratiroidea disminuye la actividad osteoclaacutestica desacelera la formacioacuten de los osteoclastos y acelera la formacioacuten de osteoblastos (ceacutelulas encargadas de la formacioacuten del hueso)

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ENDOCRINOLOGIA

Glaacutendula suprarrenal

Las glaacutendulas con forma de triaacutengulo que estaacuten situadas encima de los rintildeones cuya funcioacuten es la de regular las respuestas al estreacutes a traveacutes de la siacutentesis de corticosteroides (principalmente cortisol) y catecolaminas (adrenalina sobre todo)

Capas de la glaacutendula suprarrenal

Introduccioacuten

Anatoacutemicamente las glaacutendulas suprarrenales estaacuten separadas situadas en la cara anterosuperior de los rintildeones y estaacuten irrigadas por la sangre que reciben de las suprarrenales (las suprarrenales superiores las suprarrenales medias y las suprarrenales inferiores) Estaacuten formadas por estructuras diferentes que son la meacutedula suprarrenal y la corteza suprarrenal ambas inervadas por el sistema nervioso autoacutenomo Como su nombre sugiere la meacutedula suprarrenal estaacute situada dentro de la glaacutendula rodeada por la corteza suprarrenal que forma la superficie

Meacutedula suprarrenal La suprarrenal o meacutedula adrenal estaacute compuesta principalmente por ceacutelulas cromafines productoras de hormonas siendo el principal oacutergano de conversioacuten del aminoaacutecido tirosina en catecolaminas epinefrina y norepinefrina tambieacuten llamadas adrenalina y noradrenalina respectivamente Las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal derivan embrioloacutegicamente de la cresta neural como neuronas modificadas Realmente estas ceacutelulas son ceacutelulas postganglionares del sistema nervioso simpaacutetico que reciben la inervacioacuten de ceacutelulas preganglionares Como las sinapsis entre fibras pre y postganglionares seon ganglios nerviosos autonoacutemicos la meacutedula suprarrenal puede considerarse como un ganglio nervioso del sistema nervioso simpaacutetico

En respuesta a una situacioacuten estresante como es el ejercicio fiacutesico o un peligro inminente las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal producen catecolaminas a la sangre en una relacioacuten 70 a 30 de epinefrina y norepinefrina respectivamente

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ENDOCRINOLOGIA

La epinefrina produce efectos importantes como el aumento de la frecuencia cardiacuteaca vasoconstriccioacuten broncodilatacioacuten y aumento del metabolismo que son respuestas muy fugaces

Corteza suprarrenal

La corteza suprarrenal o corteza adrenal estaacute situada rodeando la circunferencia de la glaacutendula suprarrenal Su funcioacuten es la de regular varios componentes del metabolismo con la produccioacuten de mineralcorticoides y glucocorticoides que incluyen a la aldosterona y cortisol La corteza suprarrenal tambieacuten es un lugar secundario de siacutentesis de androacutegenos

La corteza suprarrenal secreta hormonas esteroideas (de naturaleza lipidica) por lo que sus ceacutelulas presentan abundante REL (reticulo endoplasmaacutetico liso) y mitocondrias con crestas longitudinales al MET Se dispone en tres capas diferentes de tejido basado en los tipos celulares y la funcioacuten que realizan

Zona glomerular Produccioacuten de mineralocorticoides sobre todo aldosterona

Zona fascicular Produccioacuten de glucocorticoides principalmente cortisol cerca del 95

Zona reticular Produccioacuten de androacutegenos incluyendo testosterona

Zona glomerular

Las ceacutelulas de la zona glomerular de la corteza suprarrenal segregan mineralocorticoides como la aldosterona y la desoxicorticosterona en respuesta a un aumento de los niveles de potasio o descenso del flujo de sangre en los rintildeones La aldosterona es liberada a la sangre formando parte del sistema renina-angiotensina que regula la concentracioacuten de electrolitos en la sangre sobre todo de sodio y potasio actuando en el tuacutebulo contorneado distal de la nefrona de los rintildeones

Aumentando la excrecioacuten de potasio Aumentando la reabsorcioacuten de sodio

La Aldosterona es una hormona que ayuda a regular la presioacuten osmoacutetica de mi organismo Por ejemplo si en el plasma sanguiacuteneo hay una escasez de sales ([osmolaridad] baja) se secretaraacute mayor cantidad de Aldosterona para reabsorber maacutes sodio y por consiguiente normalizar los niveles Lo mismo si hay una concentracioacuten muy elevada de sales en la sangre (osmolaridad alta) se secretaraacute menos o se inhibiraacute la secrecioacuten de Aldosterona para no tener que reabsorber el Sodio y por consiguiente eliminarlo normalizando las concentraciones

Zona fascicular

Capa predominante en la corteza suprarrenal cuyas celulas se disponen en hileras separadas por tabiques y capilares Sus ceacutelulas se llaman espongiocitos

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ENDOCRINOLOGIA

porque son voluminosas y contienen numerosos granulos claros dando a su superficie un aspecto de esponja Estas ceacutelulas segregan glucocorticoides como el cortisol o hidrocortisona y la cortisona al ser estimuladas por la hormona adrenocorticotropica (ACTH) La ACTH es producida por la hipoacutefisis en respuesta al factor hipotalaacutemico estimulante de corticotropina (CRH) Estos tres oacuterganos del sistema endocrino forman el eje hipotaacutelamo-hipofisario-suprarrenal

El principal glucocorticoide producido por las glaacutendulas suprarrenales es el cortisol que cumple diferentes funciones en el metabolismo en muacuteltiples ceacutelulas del organismo como

Estimulacioacuten de la produccioacuten de aminoaacutecidos por el cuerpo rompiendo proteiacutenas proteoacutelisis

Estimulacioacuten de la lipoacutelisis es decir rompiendo la grasa

Estimulacioacuten gluconeogeacutenesis la produccioacuten de glucosa a partir de nuevas fuentes como los aminaacutecidos y la glicerina de los aacutecidos grasos

Mantenimiento de la glucosa inhibiendo su liberacioacuten desde el muacutesculo y del tejido adiposo

Los glucocorticoides aumentan las concentraciones de glucosa en sangre pues actuacutean como antagonistas de la insulina e inhiben su liberacioacuten lo que produce una disminucioacuten de la captacioacuten de glucosa por los tejidos esto favorece que aumente la siacutentesis de glucosa en el hiacutegado y aumente la cantidad de glucoacutegeno en este mismo

Los glucocorticoides tambieacuten tienen propiedades antiinflamatorias que estaacuten relacionadas con sus efectos sobre la microcirculacioacuten y la inhibicioacuten de las citocinas pro-inflamatorias (IL-1 e IL-6) prostaglandinas y linfocinas Por lo tanto regulan las respuestas inmunitarias a traveacutes del llamado eje inmunosuprarrenal

Tambieacuten el cortisol tiene efectos importantes sobre la regulacioacuten del agua corporal retrasando la entrada de este liacutequido del espacio extracelular al intracelular Por lo que favorece la eliminacioacuten renal de agua

El cortisol inhibe la secrecioacuten de la propiomelanocortina (precursor de ACTH) de la CRH (Hormona liberadora de Corticotropina producida por las ceacutelulas de la eminencia media del hipotaacutelamo) y de Vasopresina

Zona reticular

Es la maacutes interna y presenta ceacutelulas dispuestas en cordones entrecruzados o anastomosados que segregan esteroides sexuales como estroacutegenos y androacutegenos

Las ceacutelulas de la zona reticular producen una fuente secundaria de androacutegenos como testosterona dihidrotestosterona (DHT) androstendiona y

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ENDOCRINOLOGIA

dehidroepiandrosterona (DHEA) Estas hormonas aumentan la masa muscular estimulan el crecimiento celular y ayudan al desarrollo de los caracteres sexuales secundarios

Paacutencreas

El paacutencreas oacutergano que segrega enzimas digestivas que pasan al intestino delgado Estas enzimas ayudan en la ruptura de carbohidratos liacutepidos proteinas y aacutecidos nucleacuteicos en el quimo Tiene forma coacutenica con un proceso uniforme medial e inferior En la especie humana su longitud oscila entre 20 y 30 cm tiene una anchura de unos 4 cm y un grosor de 5 centiacutemetros con un peso 30g La cabeza se localiza en la concavidad del duodeno o asa duodenal formada por la segunda porcioacuten del duodeno

Histologiacutea del paacutencreas

El paacutencreas tiene una parte exocrina y una parte endocrina

La parte exocrina contiene unas glaacutendulas llamadas aacutecinos serosos que son redondos u ovalados con ceacutelulas epiteliales Formados por las celuacutelas acinosas y en parte por las centroacinosas

La parte endocrina se agrupa en islotes de Langerhans que consisten en cuacutemulos de ceacutelulas secretoras de hormonas que producen insulina glucagoacuten y somatostatina Estos tipos de ceacutelulas son los siguientes

Ceacutelula alfa (Alfa cell)

Estas ceacutelulas alfa sintetizan y liberan glucagoacuten El glucagoacuten aumenta el nivel de glucosa sanguiacutenea al estimular la formacioacuten de este carbohidrato a partir del glucoacutegeno almacenado en hepatocitos Tambieacuten ejerce efecto en el metabolismo de proteiacutenas y grasas La liberacioacuten del glucagoacuten es inhibida por la hiperglucemia Representan entre el 10 - 20 del volumen del islote y se distribuyen de forma perifeacuterica

Ceacutelula beta (Beta Cell)

Las ceacutelulas beta producen y liberan insulina hormona que regula el nivel de glucosa en la sangre (facilitando el uso de glucosa por parte de las ceacutelulas y retirando el exceso de glucosa que se almacena en el hiacutegado en forma de glucoacutegeno)

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ENDOCRINOLOGIA

En los diabeacuteticos tipo I las ceacutelulas beta han sido dantildeadas y no son capaces de producir la hormona

Ceacutelula delta (Delta Cell)

Las ceacutelulas delta producen somatostatina hormona que se cree que regulariacutea la produccioacuten y liberacioacuten de la insulina por las ceacutelulas beta y la produccioacuten y liberacioacuten de glucagoacuten por las ceacutelulas alfa

Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)

Estas ceacutelulas hacen que el estoacutemago produzca y libere la hormona Grelina

Ceacutelula F (PP CELL)

Estas ceacutelulas producen y liberan Polipeacuteptido Pancreaacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

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ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

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ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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ENDOCRINOLOGIA

Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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ENDOCRINOLOGIA

Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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ENDOCRINOLOGIA

AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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ENDOCRINOLOGIA

5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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ENDOCRINOLOGIA

como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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ENDOCRINOLOGIA

cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
                                            • a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net
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ENDOCRINOLOGIA

Hipoacutefisis anterior y posterior Tiroides Paratiroides Suprarrenales y Paacutencreas

La hipoacutefisis o glaacutendula pituitaria

Es la glaacutendula que controla el resto de las glaacutendulas entre ellas la tiroides Es una glaacutendula compleja que se aloja en un espacio oacuteseo llamado silla turca del hueso esfenoides situada en la base del craacuteneo en la fosa cerebral media que conecta con el hipotaacutelamo a traveacutes del tallo pituitario o tallo hipofisario Tiene un peso aproximado de 05 g

Etimologiacutea

El teacutermino laquohipoacutefisisraquo proviene del griego hipo (lsquodebajorsquo) y fisis (lsquocrecerrsquo)

Partes

La hipoacutefisis consta de tres partes

Loacutebulo anterior o adenohipoacutefisis procede embrioloacutegicamente de un esbozo fariacutengeo (bolsa de Rathke) y es responsable de la secrecioacuten de numerosas hormonas (ver maacutes adelante)

Hipoacutefisis media o pars intermedia produce dos polipeacuteptidos llamados melanotropinas u hormonas estimulantes de los melanocitos que inducen el aumento de la siacutentesis de melanina de las ceacutelulas de la piel

Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo

Adenohipoacutefisis

La adenohipoacutefisis segrega muchas hormonas de las cuales seis son relevantes para la funcioacuten fisioloacutegica adecuada del organismo las cuales son segregadas por 5 tipos de ceacutelulas diferentes Estas ceacutelulas son de origen epitelial y como muchas glaacutendulas endocrinas estaacuten organizadas en lagunas rodeadas de capilares sinusoides fenestrados a los cuales se vierte su secrecioacuten hormonal Los tipos de ceacutelulas se clasificaban antes de acuerdo a su tincioacuten y eran acidoacutefilas basoacutefilas y cromoacutefobas (o que no se tintildeen) Pero en la actualidad se cuenta con teacutecnicas de inmunohistoquiacutemica y se han podido identificar 5 tipos celulares

Ceacutelulas somatoacutetropas que segregan GH (acidoacutefilas) Ceacutelulas lactotropas o mamoacutetropas que segregan PRL (acidoacutefilas)

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ENDOCRINOLOGIA

Ceacutelulas corticoacutetropas que segregan ACTH (basoacutefila)

Ceacutelulas gonadoacutetropas que segregan las gonadotropinas LH y FSH (basoacutefila)

Ceacutelulas tirotropas que secretan la TSH (basoacutefila)

Las ceacutelulas cromoacutefobas son en realidad ceacutelulas desgastadas y pueden haber sido cualquiera de las cinco anteriores

Hormonas de la adenohipoacutefisis

Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)

Prolactina (PRL) u hormona luteotroacutepica Estimula el desarrollo de los acinos mamarios y estimula la traduccioacuten de los genes para las proteiacutenas de la leche

Las demaacutes hormonas son hormonas troacuteficas que tienen su efecto en algunas glaacutendulas endocrinas perifeacutericas

Hormona estimulante del tiroides (TSH) o tirotropina Estimula la produccioacuten de hormonas por parte del tiroides

Hormona estimulante de la corteza suprarrenal (ACTH) o corticotropina Estimula la produccioacuten de hormonas por parte de las glaacutendulas suprarrenales

Hormona luteinizante (LH) Estimulan la produccioacuten de hormonas por parte de las goacutenadas y la ovulacioacuten

Hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Misma funcioacuten que la anterior

La LH y la FSH se denominan gonadotropinas ya que regulan la funcioacuten de las goacutenadas

Neurohipoacutefisis

La neurohipoacutefisis tiene un origen embrioloacutegico diferente al del resto de la hipoacutefisis mediante un crecimiento hacia abajo del hipotaacutelamo por lo que tiene funciones diferentes Se suele dividir a su vez en tres partes eminencia media infundibulo y pars nervosa de las cuales la uacuteltima es la maacutes funcional Las ceacutelulas de la neurohipoacutefisis se conocen como pituicitos y no son maacutes que ceacutelulas gliales de sosteacuten Por tanto la neurohipoacutefisis no es en realidad una glaacutendula secretora ya que se limita a almacenar los productos de secrecioacuten

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ENDOCRINOLOGIA

del hipotaacutelamo En efecto los axoplasmas de las neuronas de los nuacutecleos hipotalamicos supraoacuteptico y paraventricular secretan la ADH y la oxitocina respectivamente que se almacenan en las vesiacuteculas de los axones que de eacutel llegan a la neurohipoacutefisis dichas vesiacuteculas se liberan cerca del plexo primario hipofisiario en respuesta impulsos eleacutectricos por parte del hipotaacutelamo

Hormona antidiureacutetica (ADH) o vasopresina Se secreta en estiacutemulo a una disminucioacuten del volumen plasmaacutetico y como consecuencia de la disminucioacuten en la presioacuten arterial que esto ocasiona y su secrecioacuten aumenta la reabsorcioacuten de agua desde los tuacutebulos colectores renales por medio de la translocacioacuten a la membrana de la acuaporina II tambieacuten provoca una fuerte vasoconstriccioacuten por lo que tambieacuten es llamada vasopresina

Oxitocina Estimula la contraccioacuten de las ceacutelulas mioepiteliales de las glaacutendulas mamarias lo que causa la eyeccioacuten de leche por parte de la mama y se estimula por la succioacuten transmitiendo sentildeales al hipotalamo (retroalimentacioacuten) para que secrete mas oxitocina Causa contracciones del musculo liso del uacutetero en el orgasmo y tambieacuten los tiacutepicos espasmos de la etapa final del parto

Regulacioacuten hipotalaacutemica

La hipoacutefisis y el hipotaacutelamo estaacuten conectados por un sistema capilar denominado sistema portal el cual proviene de la arteria caroacutetida interna y del poliacutegono de Willis e irriga primero al hipotaacutelamo formando el plexo capilar primario que drena en los vasos porta hipofisiarios que a su vez forman el plexo capilar hipofisiario

La importancia de este sistema es que transporta las hormonas liberadoras o hipofisiotroacutepicas que secreta el hipotaacutelamo con fines reguladores de la secrecioacuten adenohipofisiaria Estas hormonas son

Somatoliberina (GHRH) Estimula la secrecioacuten de GH por parte de la hipoacutefisis

Corticoliberina (ARH) Estimula la secrecioacuten de ACTH por parte de la hipoacutefisis

Tiroliberina (TRH) Estimula la secrecioacuten de TSH por parte de la hipoacutefisis

Gonadoliberina (LHRH) Estimula la secrecioacuten de LH y FSH por parte de la hipoacutefisis

Hormona inhibidora de la GH (GHIH) o somatostatina Inhibe la secrecioacuten de la GH por parte de la hipoacutefisis

La prolactina estaacute regulada negativamente por dopamina un neurotransmisor

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ENDOCRINOLOGIA

Hay que tener en cuenta que la regulacioacuten de la secrecioacuten de las hormonas hipofisiarias se realiza mediante un mecanismo de retroalimentacioacuten negativa el cual se establece entre el hipotaacutelamo la hipofisis y los receptores especiacuteficos para cada hormona localizado en los oacuterganos diana

El proceso se realiza en el momento en que el sistema nervioso central recibe un estiacutemulo el hipotaacutelamo recibe parte de ese estiacutemulo y actuacutea sobre la hipoacutefisis a su vez el hipotaacutelamo secreta las respectivas hormonas en la adenohipoacutefisis o libera las de la neurohipoacutefisis estas se incorporan a la circulacioacuten viajan por medio de la sangre y son captados por receptores especiacuteficos ubicados en los oacuterganos diana un ejemplo es la captacioacuten de la TSH por parte de los loacutebulos tiroideos de la glaacutendula tiroides

En ese momento el oacutergano diana que en todo caso es cualquiera de las glaacutendulas endocrinas comienzan a secretar sus propias hormonas con lo que se enviacutea un estiacutemulo al sistema nervioso especiacuteficamente al hipotaacutelamo o directamente a la hipoacutefisis con lo cual se contrarresta el estiacutemulo inicial

TRASTORNOS ASOCIADOS A LA HIPOFISIS

Condicioacuten Etiologiacutea Hormona

Acromegalia sobreproduccioacuten hormona de crecimiento

Gigantismo sobreproduccioacuten hormona de crecimiento

Deficiencia de la hormona de crecimiento

baja produccioacuten hormona de crecimiento

Siacutendrome de secrecioacuten inadecuada de la hormona antidiureacutetica

sobreproduccioacuten vasopresina

Diabetes insiacutepida baja produccioacuten vasopresina

Siacutendrome de Sheehan baja produccioacuten cualquier hormona hipofisaria

Adenoma hipofisario sobreproduccioacuten cualquier hormona hipofisaria

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ENDOCRINOLOGIA

Hipopituitarismo baja produccioacuten cualquier hormona hipofisaria

HORMONAS DEL HIPOTALAMO

El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta

Suele considerarse el centro integrador del sistema nervioso vegetativo (o sistema nervioso autoacutenomo) dentro del sistema nervioso perifeacuterico Tambieacuten se encarga de realizar funciones de integracioacuten somato-vegetativa

En conjunto con la hipoacutefisis realiza la homeostasis del organismo por medio de un sistema de realimentacioacuten negativa

Anatomiacutea

El dienceacutefalo estaacute constituido por el taacutelamo el hipotaacutelamo el epitaacutelamo y el subtaacutelamo El taacutelamo son dos masas en el medio del cerebro entre los dos hemisferios cerebrales El hipotaacutelamo estaacute debajo del taacutelamo y sus liacutemites estaacuten constituidos por

superior el piso del III ventriacuteculo anterior el quiasma oacuteptico

inferior y lateral subtaacutelamo

posterior liacutenea imaginaria entre los cuerpos mamilares y la comisura posterior del cerebro

Nuacutecleos neuronales

nuacutecleos laterales se relacionan con el hambre preoacuteptico funcioacuten parasimpaacutetica

supraoacuteptico produce hormona antidiureacutetica

paraventricular produce oxitocina

hipotalaacutemico anterior centro de la sed

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ENDOCRINOLOGIA

supraquiasmaacutetico regulacioacuten del ciclo circadiano

ventromedial centro de la saciedad

arcuato interviene en la conducta emocional y actividad endoacutecrina

mamilar funcioacuten simpaacutetica

hipotalaacutemico posterior participan en la memoria

Funciones

El hipotaacutelamo regula el hambre el apetito y la saciedad por medio de hormonas y peacuteptidos como la colecistoquinina el nivel de glucosa y aacutecidos grasos en sangre y el neuropeacuteptido Y entre otros

El hipotaacutelamo anterior o rostral (parasimpaacutetico) disipa (difunde) el calor y el hipotaacutelamo posterior o caudal (simpaacutetico) se encarga de mantener la temperatura corporal constante5 aumentando o disminuyendo la frecuencia respiratoria y la sudoracioacuten

La porcioacuten anterior y posterior del hipotaacutelamo regula el ciclo del suentildeo y de la vigilia (ritmo circadiano)

Hormonas

El hipotaacutelamo en cuanto oacutergano endocrino se ocupa de liberar factores liberadores o inhibidores a la sangre pero tambieacuten es capaz de producir neurohormonas listas para su secrecioacuten

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ENDOCRINOLOGIA

Neurohormonas

El hipotaacutelamo produce en los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares la ADH (hormona antidiureacutetica) o vasopresina la cual se acumula en la neurohipoacutefisis desde donde es secretada La vasopresina regula el balance de agua en el cuerpo actuando sobre los rintildeones Esta hormona se almacena en la hipoacutefisis posterior de donde es liberada La disfuncioacuten del hipotaacutelamo en la produccioacuten de ADH causa diabetes insiacutepida

La oxitocina es tambieacuten producida por el hipotaacutelamo y almacenada y liberada por la neurohipoacutefisis tambieacuten comparte similitudes en su estructura proteiacutenica y llegan a compartir algunas funciones En el caso de los hombres se desconoce su funcionalidad pero se la asocia con los genitales externos y con receptores de la vesiacutecula seminal

En el caso de las mujeres la oxitocina acelera el nuacutemero de contracciones en el parto e influye al uacutetero a que se reacomode despueacutes del parto Tambieacuten incita a las fibras musculares que rodean a las ceacutelulas secretoras de leche de las glaacutendulas mamarias a secretar leche en respuesta al acto de mamar del nintildeo

Factores hipotalaacutemicos

Aparte de las dos hormonas de accioacuten directa mencionadas el hipotaacutelamo secreta diversas hormonas o factores que regulan la secrecioacuten de hormonas hipofisarias

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ENDOCRINOLOGIA

Hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH LHRH o LHRF) Es un decapeacuteptido (una cadena de 10 aminoaacutecidos) que actuacutea sobre la hipoacutefisis estimulando la produccioacuten y la liberacioacuten de la hormona luteinizante (LH) y la hormona foliculoestimulante (FSH) El balance de estas hormonas coordina el ciclo menstrual femenino y la espermatogeacutenesis en los hombres

Hormona liberadora de tirotropina (TRH) Es un tripeacuteptido (moleacutecula compuesta por tres aminoaacutecidos) Estimula la secrecioacuten de prolactina (PRL) y de tirotropina (TSH) por parte de la adenohipoacutefisis

Corte sagital medio del cerebro El punto blanco en frente del hipotaacutelamo es el quiasma oacuteptico debajo del cual estaacute la pituitaria La liacutenea blanca entre la pituitaria y el espacio negro es la silla turca (hueso)

Hormona liberadora de corticotropina (CRH o CRF) Se sintetiza en los nuacutecleos paraventriculares a partir de un precursor polipeptiacutedico de unos 41aminoaacutecidos y posee una vida larga (minutos) Las neuronas secretoras se encuentran en la porcioacuten anterior de los nuacutecleos paraventriculares y sus axones terminan en la capa externa de la eminencia media Estimula la liberacioacuten de adrenocorticotropina (ACTH) y β-endorfina por parte de la adenohipoacutefisis La hormona antidiureacutetica y la angiotensina II potencian el efecto liberador de CRH

Somatocrinina hormona liberadora de somatotropina (STH) o factor liberador de hormona del crecimiento (GRF) Las neuronas productoras de este factor se encuentran en el nuacutecleo arcuato del hipotaacutelamo Se sintetiza a partir de un precursor de 107 o 108 aminoaacutecidos Estimula la liberacioacuten de la hormona del crecimiento hipofisaria (GH)

Somatostatina u hormona inhibidora de la liberacioacuten de somatotropina (GIH) Como su nombre indica inhibe la secrecioacuten de somatotropinay de otras hormonas como la insulina el glucagoacuten el polipeacuteptido pancreaacutetico y la TSH La zona secretora se encuentra en la regioacuten periventricular del hipotaacutelamo Es un tetradecapeacuteptido que se encuentra en el hipotaacutelamo y en las ceacutelulas D de los islotes de Langerhans Su precursor posee 116 aminoaacutecidos Hormona liberadora de corticotropina

PIF (Factor inhibidor de la liberacioacuten de prolactina) Actuacutea en forma constante inhibiendo la secrecioacuten de prolactina hipofisaria Dado que la dopamina inhibe tambieacuten la produccioacuten de prolactina al unirse a las

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ENDOCRINOLOGIA

ceacutelulas lactotropas de la hipoacutefisis durante alguacuten tiempo se pensoacute que se trataba de PIF la dopamina puede ser un PIF secundario Las neuronas secretoras de PIF se encuentran en el nuacutecleo arcuato hipotalaacutemico

Angiotensina II (AII) Es un octapeacuteptido que estimula la accioacuten de la hormona liberadora de corticotropina libera algo de adrenocorticotropina hipofisaria

Hormona tiroidea

Las hormonas tiroideas son producidas por la glaacutendula tiroides Su efecto es el aumento del metabolismo basal lo cual es indispensable para un correcto desarrollo fetal y el funcionamiento adecuado de los sistemas cardiovascular musculoesqueleacutetico hematopoyeacutetico asiacute como para respuestas corporales adecuadas en cuanto a produccioacuten de calor consumo de oxiacutegeno y regulacioacuten de otros sistemas hormonales

Tipos de hormona tiroidea

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ENDOCRINOLOGIA

T4 T3

Existen tres hormonas circulantescirculantesco grande

T4 tetrayodotironina o tiroxina T3 o triyodotironina

T3 reversa Esta es bioloacutegicamente inactiva

Los niveles plasmaacuteticos de estas hormonas se mantienen estables durante toda la vida con excepcioacuten del periacuteodo neonatal y en algunas enfermedades o con el uso de algunos faacutermacos

Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas

Los yoduros que se ingieren en los alimentos y en el agua son concentrados de forma activa por la glaacutendula tiroides convertidos a yodo orgaacutenico por la peroxidasa tiroidea e incorporados a la tirosina en la tiroglobulina intrafolicular contenida en el coloide de la superficie apical de la ceacutelula folicular del tiroides

Las tirosinas son yodadas en un lugar (monoyodotirosina) o en dos (diyodotirosina) y se acoplan para formar las hormonas activas

diyodotirosina + diyodotirosina (r) --gt tetrayodotironina [tiroxina T4] diyodotirosina + monoyodotirosina( r) --gt triyodotironina [T3]

Otra fuente de T3 en el interior de la glaacutendula tiroides es el producto de la monodesyodacioacuten del anillo externo de la T4 por una selenoenzima la desyodasa tipo I (5-D-I) Esta enzima se encuentra tambieacuten en el hiacutegado y los rintildeones La T3 resultante pasa a la circulacioacuten Tambieacuten existe una isoenzima que efectuacutea la misma reaccioacuten llamada desyodasa tipo II que se encuentra en el cerebro y la hipoacutefisis La T3 resultante actuacutea localmente2

La tiroglobulina una glucoproteiacutena que contiene T3 y T4 en su matriz es captada por el foliacuteculo en forma de gotitas de coloide por las ceacutelulas tiroideas

Todas las reacciones necesarias para la formacioacuten de T3 y T4 son influidas y controladas por la hormona estimulante del tiroides (TSH) llamada tambieacuten tirotropina que estimula las ceacutelulas foliculares en la glaacutendula tiroides

Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas se metabolizan principalmente en el hiacutegado Producto de una conjugacioacuten con los aacutecidos glucoroacutenico y sulfuacuterico por medio de un grupo hidroxilo fenoacutelico se genera una forma excretable a traveacutes de la bilis

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ENDOCRINOLOGIA

Una parte de los productos conjugados eliminados por la bilis se hidroliza y se absorbe como hormona activa en el intestino Es un fenoacutemeno conocido como circulacioacuten enterohepaacutetica El resto se elimina por las heces

En la circulacioacuten sanguiacutenea la T4 se metaboliza a T3 y T3 reversa las que a su vez se desyodan produceacutendose diyodotironinas inactivas

Efectos de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas tienen dos efectos fisioloacutegicos principales

1 Aumentan la siacutentesis de proteiacutenas praacutecticamente en todos los tejidos del organismo (La T3 y la T4 penetran en las ceacutelulas donde la T3 que se obtiene de la circulacioacuten y por la conversioacuten de T4 en T3 dentro de la ceacutelula se une a receptores nucleares individuales e influye sobre la formacioacuten de ARNm)

2 La T3 incrementa el consumo de oxiacutegeno mediante el aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa (bomba sodio-potasio) sobre todo en los tejidos responsables del consumo basal de oxiacutegeno (es decir hiacutegado rintildeoacuten corazoacuten y muacutesculo esqueleacutetico) El aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa es secundario al incremento de la siacutentesis de esta enzima por consiguiente el aumento del consumo de oxiacutegeno probablemente tambieacuten estaacute relacionado con la fijacioacuten nuclear de hormonas tiroideas No obstante no se ha descartado un efecto directo de la T3 sobre la mitocondria Se cree que la T3 es la hormona tiroidea activa aunque la misma T4 pueda ser bioloacutegicamente activa

Efectos fisioloacutegicos

Desarrollo normal del sistema nervioso central en el feto Funcionamiento normal del sistema nervioso central Su falta enlentece

su funcionamiento

Generacioacuten de calor

Efectos cronotroacutepico e inotroacutepico en el sistema cardiovascular

Aumenta el nuacutemero de receptores para catecolaminas y amplifica la respuesta postreceptor en el sistema simpaacutetico3

Aumenta la eritropoyetina

Regula el metabolismo oacuteseo

Permite la relajacioacuten muscular

Interviene en los niveles de produccioacuten de hormonas gonadotrofinas y somatotropa o GH

Permite la correcta respuesta del centro respiratorio a la hipoxia e hipercapnia

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ENDOCRINOLOGIA

Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma

Las hormonas tiroideas circulan unidas a proteiacutenas plasmaacuteticas Un porcentaje bajo de T4 y T3 circula libremente por la sangre y es de este porcentaje bajo de hormona que depende la accioacuten hormonal sobre los receptores celulares

Las proteiacutenas a las que se unen las hormonas tiroideas son

Globulina transportadora de tiroxina o TBG (del ingleacutes Thyroxin Binding Globulin)

Prealbuacutemina transportadora de tiroxina o TBPA (del ingleacutes Thyroxin Binding Pre Albumin)

Albuacutemina

Ya que existen factores que afectan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas mencionadas modificando la cantidad de hormona libre es muy importante medir la hormona libre en el plasma para evaluar la condicioacuten fisiopatoloacutegica en estudio

Por ejemplo los siguientes faacutermacos compiten con las hormonas tiroideas por su unioacuten con las proteiacutenas transportadoras

Salicilatos Hidantoiacutenas

Algunos antiinflamatorios no esteroideos como el Diclofenaco y el aacutecido mefenaacutemico

Furosemida

Por el contrario los siguientes faacutermacos incrementan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas transportadoras

Estroacutegenos Metadona

Clofibrato

Heroiacutena

Tamoxifeno

En el embarazo tambieacuten se modifica la afinidad de las hormonas tiroideas por las proteiacutenas transportadoras aumentando esta unioacuten y disminuyendo la hormona libre

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ENDOCRINOLOGIA

Paratiroides

Las glaacutendulas paratiroides son glaacutendulas endocrinas Situadas en el cuello generalmente localizadas en los polos De la glaacutendula tiroides que producen La hormona paratiroidea o paratohormona Por lo general hay cuatro glaacutendulas paratiroides Dos superiores y dos inferiores pero de forma ocasional puede haber cinco o maacutes Cuando existe alguna glaacutendula adicional eacutesta suele encontrarse en el mediastino en relacioacuten con el timo o dentro de la glaacutendula tiroides

La hormona paratiroidea participa en el control de la homeostasis del calcio y foacutesforo asiacute como en la fisiologiacutea del hueso

El exceso de funcioacuten de las glaacutendulas paratiroides se conoce como hiperparatiroidismo y suele cursar con elevacioacuten de los niveles plasmaacuteticos de calcio y fragilidad oacutesea que condiciona una mayor susceptibilidad a padecer fracturas La funcioacuten insuficiente de las glaacutendulas paratiroides (hipoparatiroidismo) es mucho menos frecuente y generalmente se presenta tras una cirugiacutea sobre la glaacutendula tiroides que conlleva la existencia de hipocalcemia Existen algunas enfermedades mucho maacutes raras que parecen deberse a alteraciones en el receptor de la hormona paratiroidea como la condroplasia metafiseal de Jansen y la condroplasia de Blomstrand

Hormona paratiroidea o parathormona Es secretada por las ceacutelulas principales de la glaacutendula paratiroides es un polipeacuteptido de 84 aminoaacutecidos cuyo peso molecular es de aproximadamente 9500 Daltons Facilita la absorcioacuten del calcio Vitamina D (en su forma natural) y fosfato conjuntamente en el intestino Aumenta la resorcioacuten de los huesos Mediante la produccioacuten de maacutes osteoclastos a partir de las ceacutelulas madre mesenquimatosas de la meacutedula oacutesea y retrasando la conversioacuten de estas en osteoblastos Los osteoclastos absorben el hueso mediante la liberacioacuten de hormonas proteoliacuteticas liberadas por lisosomas y la secrecioacuten de varios aacutecidos entre ellos el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido laacutectico Aumenta la reabsorcioacuten del calcio y reduce la resorcioacuten del fosfato en los tuacutebulos renales provocando que este salga en la orina en mayor concentracioacuten Aumenta la resorcioacuten del calcio en el intestino Induce un incremento en la formacioacuten del 125-dihidroxicolecalciferol (forma activa de la Vitamina D calitriol o Vitamina D3) a partir del 25-hidroxicolecalciferol (calcifediol) en los rintildeones la vitamina D3 luego actuacutea a nivel del epitelio intestinal aumentando la absorcioacuten del calcio aumentando asiacute los

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ENDOCRINOLOGIA

niveles de calcio plasmaacuteticos (valor normal del calcio plasmaacutetico 92-104 mgdl) Luego por un mecanismo de retroaccioacuten o retroalimentacioacuten negativa elevadas concentraciones de calcio plasmaacuteticos inhiben la secrecioacuten de la PTH (Hormona paratiroidea)ademaacutes ayuda a la reabsorcion del calcio por medio de los rintildeones

Calcitonina Secretada por las ceacutelulas parafoliculares en la Tiroides es un polipeacuteptido de 32 aminoaacutecidos con un peso molecular aproximado de 3000 Daltons aproximadamente Tiene una funcioacuten opuesta a la Hormona Paratiroidea disminuye la actividad osteoclaacutestica desacelera la formacioacuten de los osteoclastos y acelera la formacioacuten de osteoblastos (ceacutelulas encargadas de la formacioacuten del hueso)

Trabajo final Paacutegina 20

ENDOCRINOLOGIA

Glaacutendula suprarrenal

Las glaacutendulas con forma de triaacutengulo que estaacuten situadas encima de los rintildeones cuya funcioacuten es la de regular las respuestas al estreacutes a traveacutes de la siacutentesis de corticosteroides (principalmente cortisol) y catecolaminas (adrenalina sobre todo)

Capas de la glaacutendula suprarrenal

Introduccioacuten

Anatoacutemicamente las glaacutendulas suprarrenales estaacuten separadas situadas en la cara anterosuperior de los rintildeones y estaacuten irrigadas por la sangre que reciben de las suprarrenales (las suprarrenales superiores las suprarrenales medias y las suprarrenales inferiores) Estaacuten formadas por estructuras diferentes que son la meacutedula suprarrenal y la corteza suprarrenal ambas inervadas por el sistema nervioso autoacutenomo Como su nombre sugiere la meacutedula suprarrenal estaacute situada dentro de la glaacutendula rodeada por la corteza suprarrenal que forma la superficie

Meacutedula suprarrenal La suprarrenal o meacutedula adrenal estaacute compuesta principalmente por ceacutelulas cromafines productoras de hormonas siendo el principal oacutergano de conversioacuten del aminoaacutecido tirosina en catecolaminas epinefrina y norepinefrina tambieacuten llamadas adrenalina y noradrenalina respectivamente Las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal derivan embrioloacutegicamente de la cresta neural como neuronas modificadas Realmente estas ceacutelulas son ceacutelulas postganglionares del sistema nervioso simpaacutetico que reciben la inervacioacuten de ceacutelulas preganglionares Como las sinapsis entre fibras pre y postganglionares seon ganglios nerviosos autonoacutemicos la meacutedula suprarrenal puede considerarse como un ganglio nervioso del sistema nervioso simpaacutetico

En respuesta a una situacioacuten estresante como es el ejercicio fiacutesico o un peligro inminente las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal producen catecolaminas a la sangre en una relacioacuten 70 a 30 de epinefrina y norepinefrina respectivamente

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ENDOCRINOLOGIA

La epinefrina produce efectos importantes como el aumento de la frecuencia cardiacuteaca vasoconstriccioacuten broncodilatacioacuten y aumento del metabolismo que son respuestas muy fugaces

Corteza suprarrenal

La corteza suprarrenal o corteza adrenal estaacute situada rodeando la circunferencia de la glaacutendula suprarrenal Su funcioacuten es la de regular varios componentes del metabolismo con la produccioacuten de mineralcorticoides y glucocorticoides que incluyen a la aldosterona y cortisol La corteza suprarrenal tambieacuten es un lugar secundario de siacutentesis de androacutegenos

La corteza suprarrenal secreta hormonas esteroideas (de naturaleza lipidica) por lo que sus ceacutelulas presentan abundante REL (reticulo endoplasmaacutetico liso) y mitocondrias con crestas longitudinales al MET Se dispone en tres capas diferentes de tejido basado en los tipos celulares y la funcioacuten que realizan

Zona glomerular Produccioacuten de mineralocorticoides sobre todo aldosterona

Zona fascicular Produccioacuten de glucocorticoides principalmente cortisol cerca del 95

Zona reticular Produccioacuten de androacutegenos incluyendo testosterona

Zona glomerular

Las ceacutelulas de la zona glomerular de la corteza suprarrenal segregan mineralocorticoides como la aldosterona y la desoxicorticosterona en respuesta a un aumento de los niveles de potasio o descenso del flujo de sangre en los rintildeones La aldosterona es liberada a la sangre formando parte del sistema renina-angiotensina que regula la concentracioacuten de electrolitos en la sangre sobre todo de sodio y potasio actuando en el tuacutebulo contorneado distal de la nefrona de los rintildeones

Aumentando la excrecioacuten de potasio Aumentando la reabsorcioacuten de sodio

La Aldosterona es una hormona que ayuda a regular la presioacuten osmoacutetica de mi organismo Por ejemplo si en el plasma sanguiacuteneo hay una escasez de sales ([osmolaridad] baja) se secretaraacute mayor cantidad de Aldosterona para reabsorber maacutes sodio y por consiguiente normalizar los niveles Lo mismo si hay una concentracioacuten muy elevada de sales en la sangre (osmolaridad alta) se secretaraacute menos o se inhibiraacute la secrecioacuten de Aldosterona para no tener que reabsorber el Sodio y por consiguiente eliminarlo normalizando las concentraciones

Zona fascicular

Capa predominante en la corteza suprarrenal cuyas celulas se disponen en hileras separadas por tabiques y capilares Sus ceacutelulas se llaman espongiocitos

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ENDOCRINOLOGIA

porque son voluminosas y contienen numerosos granulos claros dando a su superficie un aspecto de esponja Estas ceacutelulas segregan glucocorticoides como el cortisol o hidrocortisona y la cortisona al ser estimuladas por la hormona adrenocorticotropica (ACTH) La ACTH es producida por la hipoacutefisis en respuesta al factor hipotalaacutemico estimulante de corticotropina (CRH) Estos tres oacuterganos del sistema endocrino forman el eje hipotaacutelamo-hipofisario-suprarrenal

El principal glucocorticoide producido por las glaacutendulas suprarrenales es el cortisol que cumple diferentes funciones en el metabolismo en muacuteltiples ceacutelulas del organismo como

Estimulacioacuten de la produccioacuten de aminoaacutecidos por el cuerpo rompiendo proteiacutenas proteoacutelisis

Estimulacioacuten de la lipoacutelisis es decir rompiendo la grasa

Estimulacioacuten gluconeogeacutenesis la produccioacuten de glucosa a partir de nuevas fuentes como los aminaacutecidos y la glicerina de los aacutecidos grasos

Mantenimiento de la glucosa inhibiendo su liberacioacuten desde el muacutesculo y del tejido adiposo

Los glucocorticoides aumentan las concentraciones de glucosa en sangre pues actuacutean como antagonistas de la insulina e inhiben su liberacioacuten lo que produce una disminucioacuten de la captacioacuten de glucosa por los tejidos esto favorece que aumente la siacutentesis de glucosa en el hiacutegado y aumente la cantidad de glucoacutegeno en este mismo

Los glucocorticoides tambieacuten tienen propiedades antiinflamatorias que estaacuten relacionadas con sus efectos sobre la microcirculacioacuten y la inhibicioacuten de las citocinas pro-inflamatorias (IL-1 e IL-6) prostaglandinas y linfocinas Por lo tanto regulan las respuestas inmunitarias a traveacutes del llamado eje inmunosuprarrenal

Tambieacuten el cortisol tiene efectos importantes sobre la regulacioacuten del agua corporal retrasando la entrada de este liacutequido del espacio extracelular al intracelular Por lo que favorece la eliminacioacuten renal de agua

El cortisol inhibe la secrecioacuten de la propiomelanocortina (precursor de ACTH) de la CRH (Hormona liberadora de Corticotropina producida por las ceacutelulas de la eminencia media del hipotaacutelamo) y de Vasopresina

Zona reticular

Es la maacutes interna y presenta ceacutelulas dispuestas en cordones entrecruzados o anastomosados que segregan esteroides sexuales como estroacutegenos y androacutegenos

Las ceacutelulas de la zona reticular producen una fuente secundaria de androacutegenos como testosterona dihidrotestosterona (DHT) androstendiona y

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ENDOCRINOLOGIA

dehidroepiandrosterona (DHEA) Estas hormonas aumentan la masa muscular estimulan el crecimiento celular y ayudan al desarrollo de los caracteres sexuales secundarios

Paacutencreas

El paacutencreas oacutergano que segrega enzimas digestivas que pasan al intestino delgado Estas enzimas ayudan en la ruptura de carbohidratos liacutepidos proteinas y aacutecidos nucleacuteicos en el quimo Tiene forma coacutenica con un proceso uniforme medial e inferior En la especie humana su longitud oscila entre 20 y 30 cm tiene una anchura de unos 4 cm y un grosor de 5 centiacutemetros con un peso 30g La cabeza se localiza en la concavidad del duodeno o asa duodenal formada por la segunda porcioacuten del duodeno

Histologiacutea del paacutencreas

El paacutencreas tiene una parte exocrina y una parte endocrina

La parte exocrina contiene unas glaacutendulas llamadas aacutecinos serosos que son redondos u ovalados con ceacutelulas epiteliales Formados por las celuacutelas acinosas y en parte por las centroacinosas

La parte endocrina se agrupa en islotes de Langerhans que consisten en cuacutemulos de ceacutelulas secretoras de hormonas que producen insulina glucagoacuten y somatostatina Estos tipos de ceacutelulas son los siguientes

Ceacutelula alfa (Alfa cell)

Estas ceacutelulas alfa sintetizan y liberan glucagoacuten El glucagoacuten aumenta el nivel de glucosa sanguiacutenea al estimular la formacioacuten de este carbohidrato a partir del glucoacutegeno almacenado en hepatocitos Tambieacuten ejerce efecto en el metabolismo de proteiacutenas y grasas La liberacioacuten del glucagoacuten es inhibida por la hiperglucemia Representan entre el 10 - 20 del volumen del islote y se distribuyen de forma perifeacuterica

Ceacutelula beta (Beta Cell)

Las ceacutelulas beta producen y liberan insulina hormona que regula el nivel de glucosa en la sangre (facilitando el uso de glucosa por parte de las ceacutelulas y retirando el exceso de glucosa que se almacena en el hiacutegado en forma de glucoacutegeno)

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ENDOCRINOLOGIA

En los diabeacuteticos tipo I las ceacutelulas beta han sido dantildeadas y no son capaces de producir la hormona

Ceacutelula delta (Delta Cell)

Las ceacutelulas delta producen somatostatina hormona que se cree que regulariacutea la produccioacuten y liberacioacuten de la insulina por las ceacutelulas beta y la produccioacuten y liberacioacuten de glucagoacuten por las ceacutelulas alfa

Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)

Estas ceacutelulas hacen que el estoacutemago produzca y libere la hormona Grelina

Ceacutelula F (PP CELL)

Estas ceacutelulas producen y liberan Polipeacuteptido Pancreaacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

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ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

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ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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ENDOCRINOLOGIA

Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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ENDOCRINOLOGIA

Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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ENDOCRINOLOGIA

5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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ENDOCRINOLOGIA

52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

Trabajo final Paacutegina 51

ENDOCRINOLOGIA

BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

Trabajo final Paacutegina 52

ENDOCRINOLOGIA

Trabajo final Paacutegina 53

  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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Page 8: Trabajo Final Endocrinologia

ENDOCRINOLOGIA

Ceacutelulas corticoacutetropas que segregan ACTH (basoacutefila)

Ceacutelulas gonadoacutetropas que segregan las gonadotropinas LH y FSH (basoacutefila)

Ceacutelulas tirotropas que secretan la TSH (basoacutefila)

Las ceacutelulas cromoacutefobas son en realidad ceacutelulas desgastadas y pueden haber sido cualquiera de las cinco anteriores

Hormonas de la adenohipoacutefisis

Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)

Prolactina (PRL) u hormona luteotroacutepica Estimula el desarrollo de los acinos mamarios y estimula la traduccioacuten de los genes para las proteiacutenas de la leche

Las demaacutes hormonas son hormonas troacuteficas que tienen su efecto en algunas glaacutendulas endocrinas perifeacutericas

Hormona estimulante del tiroides (TSH) o tirotropina Estimula la produccioacuten de hormonas por parte del tiroides

Hormona estimulante de la corteza suprarrenal (ACTH) o corticotropina Estimula la produccioacuten de hormonas por parte de las glaacutendulas suprarrenales

Hormona luteinizante (LH) Estimulan la produccioacuten de hormonas por parte de las goacutenadas y la ovulacioacuten

Hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Misma funcioacuten que la anterior

La LH y la FSH se denominan gonadotropinas ya que regulan la funcioacuten de las goacutenadas

Neurohipoacutefisis

La neurohipoacutefisis tiene un origen embrioloacutegico diferente al del resto de la hipoacutefisis mediante un crecimiento hacia abajo del hipotaacutelamo por lo que tiene funciones diferentes Se suele dividir a su vez en tres partes eminencia media infundibulo y pars nervosa de las cuales la uacuteltima es la maacutes funcional Las ceacutelulas de la neurohipoacutefisis se conocen como pituicitos y no son maacutes que ceacutelulas gliales de sosteacuten Por tanto la neurohipoacutefisis no es en realidad una glaacutendula secretora ya que se limita a almacenar los productos de secrecioacuten

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ENDOCRINOLOGIA

del hipotaacutelamo En efecto los axoplasmas de las neuronas de los nuacutecleos hipotalamicos supraoacuteptico y paraventricular secretan la ADH y la oxitocina respectivamente que se almacenan en las vesiacuteculas de los axones que de eacutel llegan a la neurohipoacutefisis dichas vesiacuteculas se liberan cerca del plexo primario hipofisiario en respuesta impulsos eleacutectricos por parte del hipotaacutelamo

Hormona antidiureacutetica (ADH) o vasopresina Se secreta en estiacutemulo a una disminucioacuten del volumen plasmaacutetico y como consecuencia de la disminucioacuten en la presioacuten arterial que esto ocasiona y su secrecioacuten aumenta la reabsorcioacuten de agua desde los tuacutebulos colectores renales por medio de la translocacioacuten a la membrana de la acuaporina II tambieacuten provoca una fuerte vasoconstriccioacuten por lo que tambieacuten es llamada vasopresina

Oxitocina Estimula la contraccioacuten de las ceacutelulas mioepiteliales de las glaacutendulas mamarias lo que causa la eyeccioacuten de leche por parte de la mama y se estimula por la succioacuten transmitiendo sentildeales al hipotalamo (retroalimentacioacuten) para que secrete mas oxitocina Causa contracciones del musculo liso del uacutetero en el orgasmo y tambieacuten los tiacutepicos espasmos de la etapa final del parto

Regulacioacuten hipotalaacutemica

La hipoacutefisis y el hipotaacutelamo estaacuten conectados por un sistema capilar denominado sistema portal el cual proviene de la arteria caroacutetida interna y del poliacutegono de Willis e irriga primero al hipotaacutelamo formando el plexo capilar primario que drena en los vasos porta hipofisiarios que a su vez forman el plexo capilar hipofisiario

La importancia de este sistema es que transporta las hormonas liberadoras o hipofisiotroacutepicas que secreta el hipotaacutelamo con fines reguladores de la secrecioacuten adenohipofisiaria Estas hormonas son

Somatoliberina (GHRH) Estimula la secrecioacuten de GH por parte de la hipoacutefisis

Corticoliberina (ARH) Estimula la secrecioacuten de ACTH por parte de la hipoacutefisis

Tiroliberina (TRH) Estimula la secrecioacuten de TSH por parte de la hipoacutefisis

Gonadoliberina (LHRH) Estimula la secrecioacuten de LH y FSH por parte de la hipoacutefisis

Hormona inhibidora de la GH (GHIH) o somatostatina Inhibe la secrecioacuten de la GH por parte de la hipoacutefisis

La prolactina estaacute regulada negativamente por dopamina un neurotransmisor

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ENDOCRINOLOGIA

Hay que tener en cuenta que la regulacioacuten de la secrecioacuten de las hormonas hipofisiarias se realiza mediante un mecanismo de retroalimentacioacuten negativa el cual se establece entre el hipotaacutelamo la hipofisis y los receptores especiacuteficos para cada hormona localizado en los oacuterganos diana

El proceso se realiza en el momento en que el sistema nervioso central recibe un estiacutemulo el hipotaacutelamo recibe parte de ese estiacutemulo y actuacutea sobre la hipoacutefisis a su vez el hipotaacutelamo secreta las respectivas hormonas en la adenohipoacutefisis o libera las de la neurohipoacutefisis estas se incorporan a la circulacioacuten viajan por medio de la sangre y son captados por receptores especiacuteficos ubicados en los oacuterganos diana un ejemplo es la captacioacuten de la TSH por parte de los loacutebulos tiroideos de la glaacutendula tiroides

En ese momento el oacutergano diana que en todo caso es cualquiera de las glaacutendulas endocrinas comienzan a secretar sus propias hormonas con lo que se enviacutea un estiacutemulo al sistema nervioso especiacuteficamente al hipotaacutelamo o directamente a la hipoacutefisis con lo cual se contrarresta el estiacutemulo inicial

TRASTORNOS ASOCIADOS A LA HIPOFISIS

Condicioacuten Etiologiacutea Hormona

Acromegalia sobreproduccioacuten hormona de crecimiento

Gigantismo sobreproduccioacuten hormona de crecimiento

Deficiencia de la hormona de crecimiento

baja produccioacuten hormona de crecimiento

Siacutendrome de secrecioacuten inadecuada de la hormona antidiureacutetica

sobreproduccioacuten vasopresina

Diabetes insiacutepida baja produccioacuten vasopresina

Siacutendrome de Sheehan baja produccioacuten cualquier hormona hipofisaria

Adenoma hipofisario sobreproduccioacuten cualquier hormona hipofisaria

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ENDOCRINOLOGIA

Hipopituitarismo baja produccioacuten cualquier hormona hipofisaria

HORMONAS DEL HIPOTALAMO

El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta

Suele considerarse el centro integrador del sistema nervioso vegetativo (o sistema nervioso autoacutenomo) dentro del sistema nervioso perifeacuterico Tambieacuten se encarga de realizar funciones de integracioacuten somato-vegetativa

En conjunto con la hipoacutefisis realiza la homeostasis del organismo por medio de un sistema de realimentacioacuten negativa

Anatomiacutea

El dienceacutefalo estaacute constituido por el taacutelamo el hipotaacutelamo el epitaacutelamo y el subtaacutelamo El taacutelamo son dos masas en el medio del cerebro entre los dos hemisferios cerebrales El hipotaacutelamo estaacute debajo del taacutelamo y sus liacutemites estaacuten constituidos por

superior el piso del III ventriacuteculo anterior el quiasma oacuteptico

inferior y lateral subtaacutelamo

posterior liacutenea imaginaria entre los cuerpos mamilares y la comisura posterior del cerebro

Nuacutecleos neuronales

nuacutecleos laterales se relacionan con el hambre preoacuteptico funcioacuten parasimpaacutetica

supraoacuteptico produce hormona antidiureacutetica

paraventricular produce oxitocina

hipotalaacutemico anterior centro de la sed

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ENDOCRINOLOGIA

supraquiasmaacutetico regulacioacuten del ciclo circadiano

ventromedial centro de la saciedad

arcuato interviene en la conducta emocional y actividad endoacutecrina

mamilar funcioacuten simpaacutetica

hipotalaacutemico posterior participan en la memoria

Funciones

El hipotaacutelamo regula el hambre el apetito y la saciedad por medio de hormonas y peacuteptidos como la colecistoquinina el nivel de glucosa y aacutecidos grasos en sangre y el neuropeacuteptido Y entre otros

El hipotaacutelamo anterior o rostral (parasimpaacutetico) disipa (difunde) el calor y el hipotaacutelamo posterior o caudal (simpaacutetico) se encarga de mantener la temperatura corporal constante5 aumentando o disminuyendo la frecuencia respiratoria y la sudoracioacuten

La porcioacuten anterior y posterior del hipotaacutelamo regula el ciclo del suentildeo y de la vigilia (ritmo circadiano)

Hormonas

El hipotaacutelamo en cuanto oacutergano endocrino se ocupa de liberar factores liberadores o inhibidores a la sangre pero tambieacuten es capaz de producir neurohormonas listas para su secrecioacuten

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ENDOCRINOLOGIA

Neurohormonas

El hipotaacutelamo produce en los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares la ADH (hormona antidiureacutetica) o vasopresina la cual se acumula en la neurohipoacutefisis desde donde es secretada La vasopresina regula el balance de agua en el cuerpo actuando sobre los rintildeones Esta hormona se almacena en la hipoacutefisis posterior de donde es liberada La disfuncioacuten del hipotaacutelamo en la produccioacuten de ADH causa diabetes insiacutepida

La oxitocina es tambieacuten producida por el hipotaacutelamo y almacenada y liberada por la neurohipoacutefisis tambieacuten comparte similitudes en su estructura proteiacutenica y llegan a compartir algunas funciones En el caso de los hombres se desconoce su funcionalidad pero se la asocia con los genitales externos y con receptores de la vesiacutecula seminal

En el caso de las mujeres la oxitocina acelera el nuacutemero de contracciones en el parto e influye al uacutetero a que se reacomode despueacutes del parto Tambieacuten incita a las fibras musculares que rodean a las ceacutelulas secretoras de leche de las glaacutendulas mamarias a secretar leche en respuesta al acto de mamar del nintildeo

Factores hipotalaacutemicos

Aparte de las dos hormonas de accioacuten directa mencionadas el hipotaacutelamo secreta diversas hormonas o factores que regulan la secrecioacuten de hormonas hipofisarias

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ENDOCRINOLOGIA

Hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH LHRH o LHRF) Es un decapeacuteptido (una cadena de 10 aminoaacutecidos) que actuacutea sobre la hipoacutefisis estimulando la produccioacuten y la liberacioacuten de la hormona luteinizante (LH) y la hormona foliculoestimulante (FSH) El balance de estas hormonas coordina el ciclo menstrual femenino y la espermatogeacutenesis en los hombres

Hormona liberadora de tirotropina (TRH) Es un tripeacuteptido (moleacutecula compuesta por tres aminoaacutecidos) Estimula la secrecioacuten de prolactina (PRL) y de tirotropina (TSH) por parte de la adenohipoacutefisis

Corte sagital medio del cerebro El punto blanco en frente del hipotaacutelamo es el quiasma oacuteptico debajo del cual estaacute la pituitaria La liacutenea blanca entre la pituitaria y el espacio negro es la silla turca (hueso)

Hormona liberadora de corticotropina (CRH o CRF) Se sintetiza en los nuacutecleos paraventriculares a partir de un precursor polipeptiacutedico de unos 41aminoaacutecidos y posee una vida larga (minutos) Las neuronas secretoras se encuentran en la porcioacuten anterior de los nuacutecleos paraventriculares y sus axones terminan en la capa externa de la eminencia media Estimula la liberacioacuten de adrenocorticotropina (ACTH) y β-endorfina por parte de la adenohipoacutefisis La hormona antidiureacutetica y la angiotensina II potencian el efecto liberador de CRH

Somatocrinina hormona liberadora de somatotropina (STH) o factor liberador de hormona del crecimiento (GRF) Las neuronas productoras de este factor se encuentran en el nuacutecleo arcuato del hipotaacutelamo Se sintetiza a partir de un precursor de 107 o 108 aminoaacutecidos Estimula la liberacioacuten de la hormona del crecimiento hipofisaria (GH)

Somatostatina u hormona inhibidora de la liberacioacuten de somatotropina (GIH) Como su nombre indica inhibe la secrecioacuten de somatotropinay de otras hormonas como la insulina el glucagoacuten el polipeacuteptido pancreaacutetico y la TSH La zona secretora se encuentra en la regioacuten periventricular del hipotaacutelamo Es un tetradecapeacuteptido que se encuentra en el hipotaacutelamo y en las ceacutelulas D de los islotes de Langerhans Su precursor posee 116 aminoaacutecidos Hormona liberadora de corticotropina

PIF (Factor inhibidor de la liberacioacuten de prolactina) Actuacutea en forma constante inhibiendo la secrecioacuten de prolactina hipofisaria Dado que la dopamina inhibe tambieacuten la produccioacuten de prolactina al unirse a las

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ENDOCRINOLOGIA

ceacutelulas lactotropas de la hipoacutefisis durante alguacuten tiempo se pensoacute que se trataba de PIF la dopamina puede ser un PIF secundario Las neuronas secretoras de PIF se encuentran en el nuacutecleo arcuato hipotalaacutemico

Angiotensina II (AII) Es un octapeacuteptido que estimula la accioacuten de la hormona liberadora de corticotropina libera algo de adrenocorticotropina hipofisaria

Hormona tiroidea

Las hormonas tiroideas son producidas por la glaacutendula tiroides Su efecto es el aumento del metabolismo basal lo cual es indispensable para un correcto desarrollo fetal y el funcionamiento adecuado de los sistemas cardiovascular musculoesqueleacutetico hematopoyeacutetico asiacute como para respuestas corporales adecuadas en cuanto a produccioacuten de calor consumo de oxiacutegeno y regulacioacuten de otros sistemas hormonales

Tipos de hormona tiroidea

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ENDOCRINOLOGIA

T4 T3

Existen tres hormonas circulantescirculantesco grande

T4 tetrayodotironina o tiroxina T3 o triyodotironina

T3 reversa Esta es bioloacutegicamente inactiva

Los niveles plasmaacuteticos de estas hormonas se mantienen estables durante toda la vida con excepcioacuten del periacuteodo neonatal y en algunas enfermedades o con el uso de algunos faacutermacos

Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas

Los yoduros que se ingieren en los alimentos y en el agua son concentrados de forma activa por la glaacutendula tiroides convertidos a yodo orgaacutenico por la peroxidasa tiroidea e incorporados a la tirosina en la tiroglobulina intrafolicular contenida en el coloide de la superficie apical de la ceacutelula folicular del tiroides

Las tirosinas son yodadas en un lugar (monoyodotirosina) o en dos (diyodotirosina) y se acoplan para formar las hormonas activas

diyodotirosina + diyodotirosina (r) --gt tetrayodotironina [tiroxina T4] diyodotirosina + monoyodotirosina( r) --gt triyodotironina [T3]

Otra fuente de T3 en el interior de la glaacutendula tiroides es el producto de la monodesyodacioacuten del anillo externo de la T4 por una selenoenzima la desyodasa tipo I (5-D-I) Esta enzima se encuentra tambieacuten en el hiacutegado y los rintildeones La T3 resultante pasa a la circulacioacuten Tambieacuten existe una isoenzima que efectuacutea la misma reaccioacuten llamada desyodasa tipo II que se encuentra en el cerebro y la hipoacutefisis La T3 resultante actuacutea localmente2

La tiroglobulina una glucoproteiacutena que contiene T3 y T4 en su matriz es captada por el foliacuteculo en forma de gotitas de coloide por las ceacutelulas tiroideas

Todas las reacciones necesarias para la formacioacuten de T3 y T4 son influidas y controladas por la hormona estimulante del tiroides (TSH) llamada tambieacuten tirotropina que estimula las ceacutelulas foliculares en la glaacutendula tiroides

Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas se metabolizan principalmente en el hiacutegado Producto de una conjugacioacuten con los aacutecidos glucoroacutenico y sulfuacuterico por medio de un grupo hidroxilo fenoacutelico se genera una forma excretable a traveacutes de la bilis

Trabajo final Paacutegina 16

ENDOCRINOLOGIA

Una parte de los productos conjugados eliminados por la bilis se hidroliza y se absorbe como hormona activa en el intestino Es un fenoacutemeno conocido como circulacioacuten enterohepaacutetica El resto se elimina por las heces

En la circulacioacuten sanguiacutenea la T4 se metaboliza a T3 y T3 reversa las que a su vez se desyodan produceacutendose diyodotironinas inactivas

Efectos de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas tienen dos efectos fisioloacutegicos principales

1 Aumentan la siacutentesis de proteiacutenas praacutecticamente en todos los tejidos del organismo (La T3 y la T4 penetran en las ceacutelulas donde la T3 que se obtiene de la circulacioacuten y por la conversioacuten de T4 en T3 dentro de la ceacutelula se une a receptores nucleares individuales e influye sobre la formacioacuten de ARNm)

2 La T3 incrementa el consumo de oxiacutegeno mediante el aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa (bomba sodio-potasio) sobre todo en los tejidos responsables del consumo basal de oxiacutegeno (es decir hiacutegado rintildeoacuten corazoacuten y muacutesculo esqueleacutetico) El aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa es secundario al incremento de la siacutentesis de esta enzima por consiguiente el aumento del consumo de oxiacutegeno probablemente tambieacuten estaacute relacionado con la fijacioacuten nuclear de hormonas tiroideas No obstante no se ha descartado un efecto directo de la T3 sobre la mitocondria Se cree que la T3 es la hormona tiroidea activa aunque la misma T4 pueda ser bioloacutegicamente activa

Efectos fisioloacutegicos

Desarrollo normal del sistema nervioso central en el feto Funcionamiento normal del sistema nervioso central Su falta enlentece

su funcionamiento

Generacioacuten de calor

Efectos cronotroacutepico e inotroacutepico en el sistema cardiovascular

Aumenta el nuacutemero de receptores para catecolaminas y amplifica la respuesta postreceptor en el sistema simpaacutetico3

Aumenta la eritropoyetina

Regula el metabolismo oacuteseo

Permite la relajacioacuten muscular

Interviene en los niveles de produccioacuten de hormonas gonadotrofinas y somatotropa o GH

Permite la correcta respuesta del centro respiratorio a la hipoxia e hipercapnia

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ENDOCRINOLOGIA

Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma

Las hormonas tiroideas circulan unidas a proteiacutenas plasmaacuteticas Un porcentaje bajo de T4 y T3 circula libremente por la sangre y es de este porcentaje bajo de hormona que depende la accioacuten hormonal sobre los receptores celulares

Las proteiacutenas a las que se unen las hormonas tiroideas son

Globulina transportadora de tiroxina o TBG (del ingleacutes Thyroxin Binding Globulin)

Prealbuacutemina transportadora de tiroxina o TBPA (del ingleacutes Thyroxin Binding Pre Albumin)

Albuacutemina

Ya que existen factores que afectan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas mencionadas modificando la cantidad de hormona libre es muy importante medir la hormona libre en el plasma para evaluar la condicioacuten fisiopatoloacutegica en estudio

Por ejemplo los siguientes faacutermacos compiten con las hormonas tiroideas por su unioacuten con las proteiacutenas transportadoras

Salicilatos Hidantoiacutenas

Algunos antiinflamatorios no esteroideos como el Diclofenaco y el aacutecido mefenaacutemico

Furosemida

Por el contrario los siguientes faacutermacos incrementan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas transportadoras

Estroacutegenos Metadona

Clofibrato

Heroiacutena

Tamoxifeno

En el embarazo tambieacuten se modifica la afinidad de las hormonas tiroideas por las proteiacutenas transportadoras aumentando esta unioacuten y disminuyendo la hormona libre

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ENDOCRINOLOGIA

Paratiroides

Las glaacutendulas paratiroides son glaacutendulas endocrinas Situadas en el cuello generalmente localizadas en los polos De la glaacutendula tiroides que producen La hormona paratiroidea o paratohormona Por lo general hay cuatro glaacutendulas paratiroides Dos superiores y dos inferiores pero de forma ocasional puede haber cinco o maacutes Cuando existe alguna glaacutendula adicional eacutesta suele encontrarse en el mediastino en relacioacuten con el timo o dentro de la glaacutendula tiroides

La hormona paratiroidea participa en el control de la homeostasis del calcio y foacutesforo asiacute como en la fisiologiacutea del hueso

El exceso de funcioacuten de las glaacutendulas paratiroides se conoce como hiperparatiroidismo y suele cursar con elevacioacuten de los niveles plasmaacuteticos de calcio y fragilidad oacutesea que condiciona una mayor susceptibilidad a padecer fracturas La funcioacuten insuficiente de las glaacutendulas paratiroides (hipoparatiroidismo) es mucho menos frecuente y generalmente se presenta tras una cirugiacutea sobre la glaacutendula tiroides que conlleva la existencia de hipocalcemia Existen algunas enfermedades mucho maacutes raras que parecen deberse a alteraciones en el receptor de la hormona paratiroidea como la condroplasia metafiseal de Jansen y la condroplasia de Blomstrand

Hormona paratiroidea o parathormona Es secretada por las ceacutelulas principales de la glaacutendula paratiroides es un polipeacuteptido de 84 aminoaacutecidos cuyo peso molecular es de aproximadamente 9500 Daltons Facilita la absorcioacuten del calcio Vitamina D (en su forma natural) y fosfato conjuntamente en el intestino Aumenta la resorcioacuten de los huesos Mediante la produccioacuten de maacutes osteoclastos a partir de las ceacutelulas madre mesenquimatosas de la meacutedula oacutesea y retrasando la conversioacuten de estas en osteoblastos Los osteoclastos absorben el hueso mediante la liberacioacuten de hormonas proteoliacuteticas liberadas por lisosomas y la secrecioacuten de varios aacutecidos entre ellos el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido laacutectico Aumenta la reabsorcioacuten del calcio y reduce la resorcioacuten del fosfato en los tuacutebulos renales provocando que este salga en la orina en mayor concentracioacuten Aumenta la resorcioacuten del calcio en el intestino Induce un incremento en la formacioacuten del 125-dihidroxicolecalciferol (forma activa de la Vitamina D calitriol o Vitamina D3) a partir del 25-hidroxicolecalciferol (calcifediol) en los rintildeones la vitamina D3 luego actuacutea a nivel del epitelio intestinal aumentando la absorcioacuten del calcio aumentando asiacute los

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niveles de calcio plasmaacuteticos (valor normal del calcio plasmaacutetico 92-104 mgdl) Luego por un mecanismo de retroaccioacuten o retroalimentacioacuten negativa elevadas concentraciones de calcio plasmaacuteticos inhiben la secrecioacuten de la PTH (Hormona paratiroidea)ademaacutes ayuda a la reabsorcion del calcio por medio de los rintildeones

Calcitonina Secretada por las ceacutelulas parafoliculares en la Tiroides es un polipeacuteptido de 32 aminoaacutecidos con un peso molecular aproximado de 3000 Daltons aproximadamente Tiene una funcioacuten opuesta a la Hormona Paratiroidea disminuye la actividad osteoclaacutestica desacelera la formacioacuten de los osteoclastos y acelera la formacioacuten de osteoblastos (ceacutelulas encargadas de la formacioacuten del hueso)

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Glaacutendula suprarrenal

Las glaacutendulas con forma de triaacutengulo que estaacuten situadas encima de los rintildeones cuya funcioacuten es la de regular las respuestas al estreacutes a traveacutes de la siacutentesis de corticosteroides (principalmente cortisol) y catecolaminas (adrenalina sobre todo)

Capas de la glaacutendula suprarrenal

Introduccioacuten

Anatoacutemicamente las glaacutendulas suprarrenales estaacuten separadas situadas en la cara anterosuperior de los rintildeones y estaacuten irrigadas por la sangre que reciben de las suprarrenales (las suprarrenales superiores las suprarrenales medias y las suprarrenales inferiores) Estaacuten formadas por estructuras diferentes que son la meacutedula suprarrenal y la corteza suprarrenal ambas inervadas por el sistema nervioso autoacutenomo Como su nombre sugiere la meacutedula suprarrenal estaacute situada dentro de la glaacutendula rodeada por la corteza suprarrenal que forma la superficie

Meacutedula suprarrenal La suprarrenal o meacutedula adrenal estaacute compuesta principalmente por ceacutelulas cromafines productoras de hormonas siendo el principal oacutergano de conversioacuten del aminoaacutecido tirosina en catecolaminas epinefrina y norepinefrina tambieacuten llamadas adrenalina y noradrenalina respectivamente Las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal derivan embrioloacutegicamente de la cresta neural como neuronas modificadas Realmente estas ceacutelulas son ceacutelulas postganglionares del sistema nervioso simpaacutetico que reciben la inervacioacuten de ceacutelulas preganglionares Como las sinapsis entre fibras pre y postganglionares seon ganglios nerviosos autonoacutemicos la meacutedula suprarrenal puede considerarse como un ganglio nervioso del sistema nervioso simpaacutetico

En respuesta a una situacioacuten estresante como es el ejercicio fiacutesico o un peligro inminente las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal producen catecolaminas a la sangre en una relacioacuten 70 a 30 de epinefrina y norepinefrina respectivamente

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ENDOCRINOLOGIA

La epinefrina produce efectos importantes como el aumento de la frecuencia cardiacuteaca vasoconstriccioacuten broncodilatacioacuten y aumento del metabolismo que son respuestas muy fugaces

Corteza suprarrenal

La corteza suprarrenal o corteza adrenal estaacute situada rodeando la circunferencia de la glaacutendula suprarrenal Su funcioacuten es la de regular varios componentes del metabolismo con la produccioacuten de mineralcorticoides y glucocorticoides que incluyen a la aldosterona y cortisol La corteza suprarrenal tambieacuten es un lugar secundario de siacutentesis de androacutegenos

La corteza suprarrenal secreta hormonas esteroideas (de naturaleza lipidica) por lo que sus ceacutelulas presentan abundante REL (reticulo endoplasmaacutetico liso) y mitocondrias con crestas longitudinales al MET Se dispone en tres capas diferentes de tejido basado en los tipos celulares y la funcioacuten que realizan

Zona glomerular Produccioacuten de mineralocorticoides sobre todo aldosterona

Zona fascicular Produccioacuten de glucocorticoides principalmente cortisol cerca del 95

Zona reticular Produccioacuten de androacutegenos incluyendo testosterona

Zona glomerular

Las ceacutelulas de la zona glomerular de la corteza suprarrenal segregan mineralocorticoides como la aldosterona y la desoxicorticosterona en respuesta a un aumento de los niveles de potasio o descenso del flujo de sangre en los rintildeones La aldosterona es liberada a la sangre formando parte del sistema renina-angiotensina que regula la concentracioacuten de electrolitos en la sangre sobre todo de sodio y potasio actuando en el tuacutebulo contorneado distal de la nefrona de los rintildeones

Aumentando la excrecioacuten de potasio Aumentando la reabsorcioacuten de sodio

La Aldosterona es una hormona que ayuda a regular la presioacuten osmoacutetica de mi organismo Por ejemplo si en el plasma sanguiacuteneo hay una escasez de sales ([osmolaridad] baja) se secretaraacute mayor cantidad de Aldosterona para reabsorber maacutes sodio y por consiguiente normalizar los niveles Lo mismo si hay una concentracioacuten muy elevada de sales en la sangre (osmolaridad alta) se secretaraacute menos o se inhibiraacute la secrecioacuten de Aldosterona para no tener que reabsorber el Sodio y por consiguiente eliminarlo normalizando las concentraciones

Zona fascicular

Capa predominante en la corteza suprarrenal cuyas celulas se disponen en hileras separadas por tabiques y capilares Sus ceacutelulas se llaman espongiocitos

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porque son voluminosas y contienen numerosos granulos claros dando a su superficie un aspecto de esponja Estas ceacutelulas segregan glucocorticoides como el cortisol o hidrocortisona y la cortisona al ser estimuladas por la hormona adrenocorticotropica (ACTH) La ACTH es producida por la hipoacutefisis en respuesta al factor hipotalaacutemico estimulante de corticotropina (CRH) Estos tres oacuterganos del sistema endocrino forman el eje hipotaacutelamo-hipofisario-suprarrenal

El principal glucocorticoide producido por las glaacutendulas suprarrenales es el cortisol que cumple diferentes funciones en el metabolismo en muacuteltiples ceacutelulas del organismo como

Estimulacioacuten de la produccioacuten de aminoaacutecidos por el cuerpo rompiendo proteiacutenas proteoacutelisis

Estimulacioacuten de la lipoacutelisis es decir rompiendo la grasa

Estimulacioacuten gluconeogeacutenesis la produccioacuten de glucosa a partir de nuevas fuentes como los aminaacutecidos y la glicerina de los aacutecidos grasos

Mantenimiento de la glucosa inhibiendo su liberacioacuten desde el muacutesculo y del tejido adiposo

Los glucocorticoides aumentan las concentraciones de glucosa en sangre pues actuacutean como antagonistas de la insulina e inhiben su liberacioacuten lo que produce una disminucioacuten de la captacioacuten de glucosa por los tejidos esto favorece que aumente la siacutentesis de glucosa en el hiacutegado y aumente la cantidad de glucoacutegeno en este mismo

Los glucocorticoides tambieacuten tienen propiedades antiinflamatorias que estaacuten relacionadas con sus efectos sobre la microcirculacioacuten y la inhibicioacuten de las citocinas pro-inflamatorias (IL-1 e IL-6) prostaglandinas y linfocinas Por lo tanto regulan las respuestas inmunitarias a traveacutes del llamado eje inmunosuprarrenal

Tambieacuten el cortisol tiene efectos importantes sobre la regulacioacuten del agua corporal retrasando la entrada de este liacutequido del espacio extracelular al intracelular Por lo que favorece la eliminacioacuten renal de agua

El cortisol inhibe la secrecioacuten de la propiomelanocortina (precursor de ACTH) de la CRH (Hormona liberadora de Corticotropina producida por las ceacutelulas de la eminencia media del hipotaacutelamo) y de Vasopresina

Zona reticular

Es la maacutes interna y presenta ceacutelulas dispuestas en cordones entrecruzados o anastomosados que segregan esteroides sexuales como estroacutegenos y androacutegenos

Las ceacutelulas de la zona reticular producen una fuente secundaria de androacutegenos como testosterona dihidrotestosterona (DHT) androstendiona y

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dehidroepiandrosterona (DHEA) Estas hormonas aumentan la masa muscular estimulan el crecimiento celular y ayudan al desarrollo de los caracteres sexuales secundarios

Paacutencreas

El paacutencreas oacutergano que segrega enzimas digestivas que pasan al intestino delgado Estas enzimas ayudan en la ruptura de carbohidratos liacutepidos proteinas y aacutecidos nucleacuteicos en el quimo Tiene forma coacutenica con un proceso uniforme medial e inferior En la especie humana su longitud oscila entre 20 y 30 cm tiene una anchura de unos 4 cm y un grosor de 5 centiacutemetros con un peso 30g La cabeza se localiza en la concavidad del duodeno o asa duodenal formada por la segunda porcioacuten del duodeno

Histologiacutea del paacutencreas

El paacutencreas tiene una parte exocrina y una parte endocrina

La parte exocrina contiene unas glaacutendulas llamadas aacutecinos serosos que son redondos u ovalados con ceacutelulas epiteliales Formados por las celuacutelas acinosas y en parte por las centroacinosas

La parte endocrina se agrupa en islotes de Langerhans que consisten en cuacutemulos de ceacutelulas secretoras de hormonas que producen insulina glucagoacuten y somatostatina Estos tipos de ceacutelulas son los siguientes

Ceacutelula alfa (Alfa cell)

Estas ceacutelulas alfa sintetizan y liberan glucagoacuten El glucagoacuten aumenta el nivel de glucosa sanguiacutenea al estimular la formacioacuten de este carbohidrato a partir del glucoacutegeno almacenado en hepatocitos Tambieacuten ejerce efecto en el metabolismo de proteiacutenas y grasas La liberacioacuten del glucagoacuten es inhibida por la hiperglucemia Representan entre el 10 - 20 del volumen del islote y se distribuyen de forma perifeacuterica

Ceacutelula beta (Beta Cell)

Las ceacutelulas beta producen y liberan insulina hormona que regula el nivel de glucosa en la sangre (facilitando el uso de glucosa por parte de las ceacutelulas y retirando el exceso de glucosa que se almacena en el hiacutegado en forma de glucoacutegeno)

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ENDOCRINOLOGIA

En los diabeacuteticos tipo I las ceacutelulas beta han sido dantildeadas y no son capaces de producir la hormona

Ceacutelula delta (Delta Cell)

Las ceacutelulas delta producen somatostatina hormona que se cree que regulariacutea la produccioacuten y liberacioacuten de la insulina por las ceacutelulas beta y la produccioacuten y liberacioacuten de glucagoacuten por las ceacutelulas alfa

Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)

Estas ceacutelulas hacen que el estoacutemago produzca y libere la hormona Grelina

Ceacutelula F (PP CELL)

Estas ceacutelulas producen y liberan Polipeacuteptido Pancreaacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

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ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

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ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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ENDOCRINOLOGIA

Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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ENDOCRINOLOGIA

Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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ENDOCRINOLOGIA

AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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ENDOCRINOLOGIA

5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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ENDOCRINOLOGIA

2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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ENDOCRINOLOGIA

52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

Trabajo final Paacutegina 51

ENDOCRINOLOGIA

BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

Trabajo final Paacutegina 52

ENDOCRINOLOGIA

Trabajo final Paacutegina 53

  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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Page 9: Trabajo Final Endocrinologia

ENDOCRINOLOGIA

del hipotaacutelamo En efecto los axoplasmas de las neuronas de los nuacutecleos hipotalamicos supraoacuteptico y paraventricular secretan la ADH y la oxitocina respectivamente que se almacenan en las vesiacuteculas de los axones que de eacutel llegan a la neurohipoacutefisis dichas vesiacuteculas se liberan cerca del plexo primario hipofisiario en respuesta impulsos eleacutectricos por parte del hipotaacutelamo

Hormona antidiureacutetica (ADH) o vasopresina Se secreta en estiacutemulo a una disminucioacuten del volumen plasmaacutetico y como consecuencia de la disminucioacuten en la presioacuten arterial que esto ocasiona y su secrecioacuten aumenta la reabsorcioacuten de agua desde los tuacutebulos colectores renales por medio de la translocacioacuten a la membrana de la acuaporina II tambieacuten provoca una fuerte vasoconstriccioacuten por lo que tambieacuten es llamada vasopresina

Oxitocina Estimula la contraccioacuten de las ceacutelulas mioepiteliales de las glaacutendulas mamarias lo que causa la eyeccioacuten de leche por parte de la mama y se estimula por la succioacuten transmitiendo sentildeales al hipotalamo (retroalimentacioacuten) para que secrete mas oxitocina Causa contracciones del musculo liso del uacutetero en el orgasmo y tambieacuten los tiacutepicos espasmos de la etapa final del parto

Regulacioacuten hipotalaacutemica

La hipoacutefisis y el hipotaacutelamo estaacuten conectados por un sistema capilar denominado sistema portal el cual proviene de la arteria caroacutetida interna y del poliacutegono de Willis e irriga primero al hipotaacutelamo formando el plexo capilar primario que drena en los vasos porta hipofisiarios que a su vez forman el plexo capilar hipofisiario

La importancia de este sistema es que transporta las hormonas liberadoras o hipofisiotroacutepicas que secreta el hipotaacutelamo con fines reguladores de la secrecioacuten adenohipofisiaria Estas hormonas son

Somatoliberina (GHRH) Estimula la secrecioacuten de GH por parte de la hipoacutefisis

Corticoliberina (ARH) Estimula la secrecioacuten de ACTH por parte de la hipoacutefisis

Tiroliberina (TRH) Estimula la secrecioacuten de TSH por parte de la hipoacutefisis

Gonadoliberina (LHRH) Estimula la secrecioacuten de LH y FSH por parte de la hipoacutefisis

Hormona inhibidora de la GH (GHIH) o somatostatina Inhibe la secrecioacuten de la GH por parte de la hipoacutefisis

La prolactina estaacute regulada negativamente por dopamina un neurotransmisor

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ENDOCRINOLOGIA

Hay que tener en cuenta que la regulacioacuten de la secrecioacuten de las hormonas hipofisiarias se realiza mediante un mecanismo de retroalimentacioacuten negativa el cual se establece entre el hipotaacutelamo la hipofisis y los receptores especiacuteficos para cada hormona localizado en los oacuterganos diana

El proceso se realiza en el momento en que el sistema nervioso central recibe un estiacutemulo el hipotaacutelamo recibe parte de ese estiacutemulo y actuacutea sobre la hipoacutefisis a su vez el hipotaacutelamo secreta las respectivas hormonas en la adenohipoacutefisis o libera las de la neurohipoacutefisis estas se incorporan a la circulacioacuten viajan por medio de la sangre y son captados por receptores especiacuteficos ubicados en los oacuterganos diana un ejemplo es la captacioacuten de la TSH por parte de los loacutebulos tiroideos de la glaacutendula tiroides

En ese momento el oacutergano diana que en todo caso es cualquiera de las glaacutendulas endocrinas comienzan a secretar sus propias hormonas con lo que se enviacutea un estiacutemulo al sistema nervioso especiacuteficamente al hipotaacutelamo o directamente a la hipoacutefisis con lo cual se contrarresta el estiacutemulo inicial

TRASTORNOS ASOCIADOS A LA HIPOFISIS

Condicioacuten Etiologiacutea Hormona

Acromegalia sobreproduccioacuten hormona de crecimiento

Gigantismo sobreproduccioacuten hormona de crecimiento

Deficiencia de la hormona de crecimiento

baja produccioacuten hormona de crecimiento

Siacutendrome de secrecioacuten inadecuada de la hormona antidiureacutetica

sobreproduccioacuten vasopresina

Diabetes insiacutepida baja produccioacuten vasopresina

Siacutendrome de Sheehan baja produccioacuten cualquier hormona hipofisaria

Adenoma hipofisario sobreproduccioacuten cualquier hormona hipofisaria

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ENDOCRINOLOGIA

Hipopituitarismo baja produccioacuten cualquier hormona hipofisaria

HORMONAS DEL HIPOTALAMO

El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta

Suele considerarse el centro integrador del sistema nervioso vegetativo (o sistema nervioso autoacutenomo) dentro del sistema nervioso perifeacuterico Tambieacuten se encarga de realizar funciones de integracioacuten somato-vegetativa

En conjunto con la hipoacutefisis realiza la homeostasis del organismo por medio de un sistema de realimentacioacuten negativa

Anatomiacutea

El dienceacutefalo estaacute constituido por el taacutelamo el hipotaacutelamo el epitaacutelamo y el subtaacutelamo El taacutelamo son dos masas en el medio del cerebro entre los dos hemisferios cerebrales El hipotaacutelamo estaacute debajo del taacutelamo y sus liacutemites estaacuten constituidos por

superior el piso del III ventriacuteculo anterior el quiasma oacuteptico

inferior y lateral subtaacutelamo

posterior liacutenea imaginaria entre los cuerpos mamilares y la comisura posterior del cerebro

Nuacutecleos neuronales

nuacutecleos laterales se relacionan con el hambre preoacuteptico funcioacuten parasimpaacutetica

supraoacuteptico produce hormona antidiureacutetica

paraventricular produce oxitocina

hipotalaacutemico anterior centro de la sed

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ENDOCRINOLOGIA

supraquiasmaacutetico regulacioacuten del ciclo circadiano

ventromedial centro de la saciedad

arcuato interviene en la conducta emocional y actividad endoacutecrina

mamilar funcioacuten simpaacutetica

hipotalaacutemico posterior participan en la memoria

Funciones

El hipotaacutelamo regula el hambre el apetito y la saciedad por medio de hormonas y peacuteptidos como la colecistoquinina el nivel de glucosa y aacutecidos grasos en sangre y el neuropeacuteptido Y entre otros

El hipotaacutelamo anterior o rostral (parasimpaacutetico) disipa (difunde) el calor y el hipotaacutelamo posterior o caudal (simpaacutetico) se encarga de mantener la temperatura corporal constante5 aumentando o disminuyendo la frecuencia respiratoria y la sudoracioacuten

La porcioacuten anterior y posterior del hipotaacutelamo regula el ciclo del suentildeo y de la vigilia (ritmo circadiano)

Hormonas

El hipotaacutelamo en cuanto oacutergano endocrino se ocupa de liberar factores liberadores o inhibidores a la sangre pero tambieacuten es capaz de producir neurohormonas listas para su secrecioacuten

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ENDOCRINOLOGIA

Neurohormonas

El hipotaacutelamo produce en los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares la ADH (hormona antidiureacutetica) o vasopresina la cual se acumula en la neurohipoacutefisis desde donde es secretada La vasopresina regula el balance de agua en el cuerpo actuando sobre los rintildeones Esta hormona se almacena en la hipoacutefisis posterior de donde es liberada La disfuncioacuten del hipotaacutelamo en la produccioacuten de ADH causa diabetes insiacutepida

La oxitocina es tambieacuten producida por el hipotaacutelamo y almacenada y liberada por la neurohipoacutefisis tambieacuten comparte similitudes en su estructura proteiacutenica y llegan a compartir algunas funciones En el caso de los hombres se desconoce su funcionalidad pero se la asocia con los genitales externos y con receptores de la vesiacutecula seminal

En el caso de las mujeres la oxitocina acelera el nuacutemero de contracciones en el parto e influye al uacutetero a que se reacomode despueacutes del parto Tambieacuten incita a las fibras musculares que rodean a las ceacutelulas secretoras de leche de las glaacutendulas mamarias a secretar leche en respuesta al acto de mamar del nintildeo

Factores hipotalaacutemicos

Aparte de las dos hormonas de accioacuten directa mencionadas el hipotaacutelamo secreta diversas hormonas o factores que regulan la secrecioacuten de hormonas hipofisarias

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ENDOCRINOLOGIA

Hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH LHRH o LHRF) Es un decapeacuteptido (una cadena de 10 aminoaacutecidos) que actuacutea sobre la hipoacutefisis estimulando la produccioacuten y la liberacioacuten de la hormona luteinizante (LH) y la hormona foliculoestimulante (FSH) El balance de estas hormonas coordina el ciclo menstrual femenino y la espermatogeacutenesis en los hombres

Hormona liberadora de tirotropina (TRH) Es un tripeacuteptido (moleacutecula compuesta por tres aminoaacutecidos) Estimula la secrecioacuten de prolactina (PRL) y de tirotropina (TSH) por parte de la adenohipoacutefisis

Corte sagital medio del cerebro El punto blanco en frente del hipotaacutelamo es el quiasma oacuteptico debajo del cual estaacute la pituitaria La liacutenea blanca entre la pituitaria y el espacio negro es la silla turca (hueso)

Hormona liberadora de corticotropina (CRH o CRF) Se sintetiza en los nuacutecleos paraventriculares a partir de un precursor polipeptiacutedico de unos 41aminoaacutecidos y posee una vida larga (minutos) Las neuronas secretoras se encuentran en la porcioacuten anterior de los nuacutecleos paraventriculares y sus axones terminan en la capa externa de la eminencia media Estimula la liberacioacuten de adrenocorticotropina (ACTH) y β-endorfina por parte de la adenohipoacutefisis La hormona antidiureacutetica y la angiotensina II potencian el efecto liberador de CRH

Somatocrinina hormona liberadora de somatotropina (STH) o factor liberador de hormona del crecimiento (GRF) Las neuronas productoras de este factor se encuentran en el nuacutecleo arcuato del hipotaacutelamo Se sintetiza a partir de un precursor de 107 o 108 aminoaacutecidos Estimula la liberacioacuten de la hormona del crecimiento hipofisaria (GH)

Somatostatina u hormona inhibidora de la liberacioacuten de somatotropina (GIH) Como su nombre indica inhibe la secrecioacuten de somatotropinay de otras hormonas como la insulina el glucagoacuten el polipeacuteptido pancreaacutetico y la TSH La zona secretora se encuentra en la regioacuten periventricular del hipotaacutelamo Es un tetradecapeacuteptido que se encuentra en el hipotaacutelamo y en las ceacutelulas D de los islotes de Langerhans Su precursor posee 116 aminoaacutecidos Hormona liberadora de corticotropina

PIF (Factor inhibidor de la liberacioacuten de prolactina) Actuacutea en forma constante inhibiendo la secrecioacuten de prolactina hipofisaria Dado que la dopamina inhibe tambieacuten la produccioacuten de prolactina al unirse a las

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ENDOCRINOLOGIA

ceacutelulas lactotropas de la hipoacutefisis durante alguacuten tiempo se pensoacute que se trataba de PIF la dopamina puede ser un PIF secundario Las neuronas secretoras de PIF se encuentran en el nuacutecleo arcuato hipotalaacutemico

Angiotensina II (AII) Es un octapeacuteptido que estimula la accioacuten de la hormona liberadora de corticotropina libera algo de adrenocorticotropina hipofisaria

Hormona tiroidea

Las hormonas tiroideas son producidas por la glaacutendula tiroides Su efecto es el aumento del metabolismo basal lo cual es indispensable para un correcto desarrollo fetal y el funcionamiento adecuado de los sistemas cardiovascular musculoesqueleacutetico hematopoyeacutetico asiacute como para respuestas corporales adecuadas en cuanto a produccioacuten de calor consumo de oxiacutegeno y regulacioacuten de otros sistemas hormonales

Tipos de hormona tiroidea

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ENDOCRINOLOGIA

T4 T3

Existen tres hormonas circulantescirculantesco grande

T4 tetrayodotironina o tiroxina T3 o triyodotironina

T3 reversa Esta es bioloacutegicamente inactiva

Los niveles plasmaacuteticos de estas hormonas se mantienen estables durante toda la vida con excepcioacuten del periacuteodo neonatal y en algunas enfermedades o con el uso de algunos faacutermacos

Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas

Los yoduros que se ingieren en los alimentos y en el agua son concentrados de forma activa por la glaacutendula tiroides convertidos a yodo orgaacutenico por la peroxidasa tiroidea e incorporados a la tirosina en la tiroglobulina intrafolicular contenida en el coloide de la superficie apical de la ceacutelula folicular del tiroides

Las tirosinas son yodadas en un lugar (monoyodotirosina) o en dos (diyodotirosina) y se acoplan para formar las hormonas activas

diyodotirosina + diyodotirosina (r) --gt tetrayodotironina [tiroxina T4] diyodotirosina + monoyodotirosina( r) --gt triyodotironina [T3]

Otra fuente de T3 en el interior de la glaacutendula tiroides es el producto de la monodesyodacioacuten del anillo externo de la T4 por una selenoenzima la desyodasa tipo I (5-D-I) Esta enzima se encuentra tambieacuten en el hiacutegado y los rintildeones La T3 resultante pasa a la circulacioacuten Tambieacuten existe una isoenzima que efectuacutea la misma reaccioacuten llamada desyodasa tipo II que se encuentra en el cerebro y la hipoacutefisis La T3 resultante actuacutea localmente2

La tiroglobulina una glucoproteiacutena que contiene T3 y T4 en su matriz es captada por el foliacuteculo en forma de gotitas de coloide por las ceacutelulas tiroideas

Todas las reacciones necesarias para la formacioacuten de T3 y T4 son influidas y controladas por la hormona estimulante del tiroides (TSH) llamada tambieacuten tirotropina que estimula las ceacutelulas foliculares en la glaacutendula tiroides

Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas se metabolizan principalmente en el hiacutegado Producto de una conjugacioacuten con los aacutecidos glucoroacutenico y sulfuacuterico por medio de un grupo hidroxilo fenoacutelico se genera una forma excretable a traveacutes de la bilis

Trabajo final Paacutegina 16

ENDOCRINOLOGIA

Una parte de los productos conjugados eliminados por la bilis se hidroliza y se absorbe como hormona activa en el intestino Es un fenoacutemeno conocido como circulacioacuten enterohepaacutetica El resto se elimina por las heces

En la circulacioacuten sanguiacutenea la T4 se metaboliza a T3 y T3 reversa las que a su vez se desyodan produceacutendose diyodotironinas inactivas

Efectos de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas tienen dos efectos fisioloacutegicos principales

1 Aumentan la siacutentesis de proteiacutenas praacutecticamente en todos los tejidos del organismo (La T3 y la T4 penetran en las ceacutelulas donde la T3 que se obtiene de la circulacioacuten y por la conversioacuten de T4 en T3 dentro de la ceacutelula se une a receptores nucleares individuales e influye sobre la formacioacuten de ARNm)

2 La T3 incrementa el consumo de oxiacutegeno mediante el aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa (bomba sodio-potasio) sobre todo en los tejidos responsables del consumo basal de oxiacutegeno (es decir hiacutegado rintildeoacuten corazoacuten y muacutesculo esqueleacutetico) El aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa es secundario al incremento de la siacutentesis de esta enzima por consiguiente el aumento del consumo de oxiacutegeno probablemente tambieacuten estaacute relacionado con la fijacioacuten nuclear de hormonas tiroideas No obstante no se ha descartado un efecto directo de la T3 sobre la mitocondria Se cree que la T3 es la hormona tiroidea activa aunque la misma T4 pueda ser bioloacutegicamente activa

Efectos fisioloacutegicos

Desarrollo normal del sistema nervioso central en el feto Funcionamiento normal del sistema nervioso central Su falta enlentece

su funcionamiento

Generacioacuten de calor

Efectos cronotroacutepico e inotroacutepico en el sistema cardiovascular

Aumenta el nuacutemero de receptores para catecolaminas y amplifica la respuesta postreceptor en el sistema simpaacutetico3

Aumenta la eritropoyetina

Regula el metabolismo oacuteseo

Permite la relajacioacuten muscular

Interviene en los niveles de produccioacuten de hormonas gonadotrofinas y somatotropa o GH

Permite la correcta respuesta del centro respiratorio a la hipoxia e hipercapnia

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ENDOCRINOLOGIA

Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma

Las hormonas tiroideas circulan unidas a proteiacutenas plasmaacuteticas Un porcentaje bajo de T4 y T3 circula libremente por la sangre y es de este porcentaje bajo de hormona que depende la accioacuten hormonal sobre los receptores celulares

Las proteiacutenas a las que se unen las hormonas tiroideas son

Globulina transportadora de tiroxina o TBG (del ingleacutes Thyroxin Binding Globulin)

Prealbuacutemina transportadora de tiroxina o TBPA (del ingleacutes Thyroxin Binding Pre Albumin)

Albuacutemina

Ya que existen factores que afectan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas mencionadas modificando la cantidad de hormona libre es muy importante medir la hormona libre en el plasma para evaluar la condicioacuten fisiopatoloacutegica en estudio

Por ejemplo los siguientes faacutermacos compiten con las hormonas tiroideas por su unioacuten con las proteiacutenas transportadoras

Salicilatos Hidantoiacutenas

Algunos antiinflamatorios no esteroideos como el Diclofenaco y el aacutecido mefenaacutemico

Furosemida

Por el contrario los siguientes faacutermacos incrementan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas transportadoras

Estroacutegenos Metadona

Clofibrato

Heroiacutena

Tamoxifeno

En el embarazo tambieacuten se modifica la afinidad de las hormonas tiroideas por las proteiacutenas transportadoras aumentando esta unioacuten y disminuyendo la hormona libre

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Paratiroides

Las glaacutendulas paratiroides son glaacutendulas endocrinas Situadas en el cuello generalmente localizadas en los polos De la glaacutendula tiroides que producen La hormona paratiroidea o paratohormona Por lo general hay cuatro glaacutendulas paratiroides Dos superiores y dos inferiores pero de forma ocasional puede haber cinco o maacutes Cuando existe alguna glaacutendula adicional eacutesta suele encontrarse en el mediastino en relacioacuten con el timo o dentro de la glaacutendula tiroides

La hormona paratiroidea participa en el control de la homeostasis del calcio y foacutesforo asiacute como en la fisiologiacutea del hueso

El exceso de funcioacuten de las glaacutendulas paratiroides se conoce como hiperparatiroidismo y suele cursar con elevacioacuten de los niveles plasmaacuteticos de calcio y fragilidad oacutesea que condiciona una mayor susceptibilidad a padecer fracturas La funcioacuten insuficiente de las glaacutendulas paratiroides (hipoparatiroidismo) es mucho menos frecuente y generalmente se presenta tras una cirugiacutea sobre la glaacutendula tiroides que conlleva la existencia de hipocalcemia Existen algunas enfermedades mucho maacutes raras que parecen deberse a alteraciones en el receptor de la hormona paratiroidea como la condroplasia metafiseal de Jansen y la condroplasia de Blomstrand

Hormona paratiroidea o parathormona Es secretada por las ceacutelulas principales de la glaacutendula paratiroides es un polipeacuteptido de 84 aminoaacutecidos cuyo peso molecular es de aproximadamente 9500 Daltons Facilita la absorcioacuten del calcio Vitamina D (en su forma natural) y fosfato conjuntamente en el intestino Aumenta la resorcioacuten de los huesos Mediante la produccioacuten de maacutes osteoclastos a partir de las ceacutelulas madre mesenquimatosas de la meacutedula oacutesea y retrasando la conversioacuten de estas en osteoblastos Los osteoclastos absorben el hueso mediante la liberacioacuten de hormonas proteoliacuteticas liberadas por lisosomas y la secrecioacuten de varios aacutecidos entre ellos el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido laacutectico Aumenta la reabsorcioacuten del calcio y reduce la resorcioacuten del fosfato en los tuacutebulos renales provocando que este salga en la orina en mayor concentracioacuten Aumenta la resorcioacuten del calcio en el intestino Induce un incremento en la formacioacuten del 125-dihidroxicolecalciferol (forma activa de la Vitamina D calitriol o Vitamina D3) a partir del 25-hidroxicolecalciferol (calcifediol) en los rintildeones la vitamina D3 luego actuacutea a nivel del epitelio intestinal aumentando la absorcioacuten del calcio aumentando asiacute los

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niveles de calcio plasmaacuteticos (valor normal del calcio plasmaacutetico 92-104 mgdl) Luego por un mecanismo de retroaccioacuten o retroalimentacioacuten negativa elevadas concentraciones de calcio plasmaacuteticos inhiben la secrecioacuten de la PTH (Hormona paratiroidea)ademaacutes ayuda a la reabsorcion del calcio por medio de los rintildeones

Calcitonina Secretada por las ceacutelulas parafoliculares en la Tiroides es un polipeacuteptido de 32 aminoaacutecidos con un peso molecular aproximado de 3000 Daltons aproximadamente Tiene una funcioacuten opuesta a la Hormona Paratiroidea disminuye la actividad osteoclaacutestica desacelera la formacioacuten de los osteoclastos y acelera la formacioacuten de osteoblastos (ceacutelulas encargadas de la formacioacuten del hueso)

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Glaacutendula suprarrenal

Las glaacutendulas con forma de triaacutengulo que estaacuten situadas encima de los rintildeones cuya funcioacuten es la de regular las respuestas al estreacutes a traveacutes de la siacutentesis de corticosteroides (principalmente cortisol) y catecolaminas (adrenalina sobre todo)

Capas de la glaacutendula suprarrenal

Introduccioacuten

Anatoacutemicamente las glaacutendulas suprarrenales estaacuten separadas situadas en la cara anterosuperior de los rintildeones y estaacuten irrigadas por la sangre que reciben de las suprarrenales (las suprarrenales superiores las suprarrenales medias y las suprarrenales inferiores) Estaacuten formadas por estructuras diferentes que son la meacutedula suprarrenal y la corteza suprarrenal ambas inervadas por el sistema nervioso autoacutenomo Como su nombre sugiere la meacutedula suprarrenal estaacute situada dentro de la glaacutendula rodeada por la corteza suprarrenal que forma la superficie

Meacutedula suprarrenal La suprarrenal o meacutedula adrenal estaacute compuesta principalmente por ceacutelulas cromafines productoras de hormonas siendo el principal oacutergano de conversioacuten del aminoaacutecido tirosina en catecolaminas epinefrina y norepinefrina tambieacuten llamadas adrenalina y noradrenalina respectivamente Las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal derivan embrioloacutegicamente de la cresta neural como neuronas modificadas Realmente estas ceacutelulas son ceacutelulas postganglionares del sistema nervioso simpaacutetico que reciben la inervacioacuten de ceacutelulas preganglionares Como las sinapsis entre fibras pre y postganglionares seon ganglios nerviosos autonoacutemicos la meacutedula suprarrenal puede considerarse como un ganglio nervioso del sistema nervioso simpaacutetico

En respuesta a una situacioacuten estresante como es el ejercicio fiacutesico o un peligro inminente las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal producen catecolaminas a la sangre en una relacioacuten 70 a 30 de epinefrina y norepinefrina respectivamente

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La epinefrina produce efectos importantes como el aumento de la frecuencia cardiacuteaca vasoconstriccioacuten broncodilatacioacuten y aumento del metabolismo que son respuestas muy fugaces

Corteza suprarrenal

La corteza suprarrenal o corteza adrenal estaacute situada rodeando la circunferencia de la glaacutendula suprarrenal Su funcioacuten es la de regular varios componentes del metabolismo con la produccioacuten de mineralcorticoides y glucocorticoides que incluyen a la aldosterona y cortisol La corteza suprarrenal tambieacuten es un lugar secundario de siacutentesis de androacutegenos

La corteza suprarrenal secreta hormonas esteroideas (de naturaleza lipidica) por lo que sus ceacutelulas presentan abundante REL (reticulo endoplasmaacutetico liso) y mitocondrias con crestas longitudinales al MET Se dispone en tres capas diferentes de tejido basado en los tipos celulares y la funcioacuten que realizan

Zona glomerular Produccioacuten de mineralocorticoides sobre todo aldosterona

Zona fascicular Produccioacuten de glucocorticoides principalmente cortisol cerca del 95

Zona reticular Produccioacuten de androacutegenos incluyendo testosterona

Zona glomerular

Las ceacutelulas de la zona glomerular de la corteza suprarrenal segregan mineralocorticoides como la aldosterona y la desoxicorticosterona en respuesta a un aumento de los niveles de potasio o descenso del flujo de sangre en los rintildeones La aldosterona es liberada a la sangre formando parte del sistema renina-angiotensina que regula la concentracioacuten de electrolitos en la sangre sobre todo de sodio y potasio actuando en el tuacutebulo contorneado distal de la nefrona de los rintildeones

Aumentando la excrecioacuten de potasio Aumentando la reabsorcioacuten de sodio

La Aldosterona es una hormona que ayuda a regular la presioacuten osmoacutetica de mi organismo Por ejemplo si en el plasma sanguiacuteneo hay una escasez de sales ([osmolaridad] baja) se secretaraacute mayor cantidad de Aldosterona para reabsorber maacutes sodio y por consiguiente normalizar los niveles Lo mismo si hay una concentracioacuten muy elevada de sales en la sangre (osmolaridad alta) se secretaraacute menos o se inhibiraacute la secrecioacuten de Aldosterona para no tener que reabsorber el Sodio y por consiguiente eliminarlo normalizando las concentraciones

Zona fascicular

Capa predominante en la corteza suprarrenal cuyas celulas se disponen en hileras separadas por tabiques y capilares Sus ceacutelulas se llaman espongiocitos

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porque son voluminosas y contienen numerosos granulos claros dando a su superficie un aspecto de esponja Estas ceacutelulas segregan glucocorticoides como el cortisol o hidrocortisona y la cortisona al ser estimuladas por la hormona adrenocorticotropica (ACTH) La ACTH es producida por la hipoacutefisis en respuesta al factor hipotalaacutemico estimulante de corticotropina (CRH) Estos tres oacuterganos del sistema endocrino forman el eje hipotaacutelamo-hipofisario-suprarrenal

El principal glucocorticoide producido por las glaacutendulas suprarrenales es el cortisol que cumple diferentes funciones en el metabolismo en muacuteltiples ceacutelulas del organismo como

Estimulacioacuten de la produccioacuten de aminoaacutecidos por el cuerpo rompiendo proteiacutenas proteoacutelisis

Estimulacioacuten de la lipoacutelisis es decir rompiendo la grasa

Estimulacioacuten gluconeogeacutenesis la produccioacuten de glucosa a partir de nuevas fuentes como los aminaacutecidos y la glicerina de los aacutecidos grasos

Mantenimiento de la glucosa inhibiendo su liberacioacuten desde el muacutesculo y del tejido adiposo

Los glucocorticoides aumentan las concentraciones de glucosa en sangre pues actuacutean como antagonistas de la insulina e inhiben su liberacioacuten lo que produce una disminucioacuten de la captacioacuten de glucosa por los tejidos esto favorece que aumente la siacutentesis de glucosa en el hiacutegado y aumente la cantidad de glucoacutegeno en este mismo

Los glucocorticoides tambieacuten tienen propiedades antiinflamatorias que estaacuten relacionadas con sus efectos sobre la microcirculacioacuten y la inhibicioacuten de las citocinas pro-inflamatorias (IL-1 e IL-6) prostaglandinas y linfocinas Por lo tanto regulan las respuestas inmunitarias a traveacutes del llamado eje inmunosuprarrenal

Tambieacuten el cortisol tiene efectos importantes sobre la regulacioacuten del agua corporal retrasando la entrada de este liacutequido del espacio extracelular al intracelular Por lo que favorece la eliminacioacuten renal de agua

El cortisol inhibe la secrecioacuten de la propiomelanocortina (precursor de ACTH) de la CRH (Hormona liberadora de Corticotropina producida por las ceacutelulas de la eminencia media del hipotaacutelamo) y de Vasopresina

Zona reticular

Es la maacutes interna y presenta ceacutelulas dispuestas en cordones entrecruzados o anastomosados que segregan esteroides sexuales como estroacutegenos y androacutegenos

Las ceacutelulas de la zona reticular producen una fuente secundaria de androacutegenos como testosterona dihidrotestosterona (DHT) androstendiona y

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dehidroepiandrosterona (DHEA) Estas hormonas aumentan la masa muscular estimulan el crecimiento celular y ayudan al desarrollo de los caracteres sexuales secundarios

Paacutencreas

El paacutencreas oacutergano que segrega enzimas digestivas que pasan al intestino delgado Estas enzimas ayudan en la ruptura de carbohidratos liacutepidos proteinas y aacutecidos nucleacuteicos en el quimo Tiene forma coacutenica con un proceso uniforme medial e inferior En la especie humana su longitud oscila entre 20 y 30 cm tiene una anchura de unos 4 cm y un grosor de 5 centiacutemetros con un peso 30g La cabeza se localiza en la concavidad del duodeno o asa duodenal formada por la segunda porcioacuten del duodeno

Histologiacutea del paacutencreas

El paacutencreas tiene una parte exocrina y una parte endocrina

La parte exocrina contiene unas glaacutendulas llamadas aacutecinos serosos que son redondos u ovalados con ceacutelulas epiteliales Formados por las celuacutelas acinosas y en parte por las centroacinosas

La parte endocrina se agrupa en islotes de Langerhans que consisten en cuacutemulos de ceacutelulas secretoras de hormonas que producen insulina glucagoacuten y somatostatina Estos tipos de ceacutelulas son los siguientes

Ceacutelula alfa (Alfa cell)

Estas ceacutelulas alfa sintetizan y liberan glucagoacuten El glucagoacuten aumenta el nivel de glucosa sanguiacutenea al estimular la formacioacuten de este carbohidrato a partir del glucoacutegeno almacenado en hepatocitos Tambieacuten ejerce efecto en el metabolismo de proteiacutenas y grasas La liberacioacuten del glucagoacuten es inhibida por la hiperglucemia Representan entre el 10 - 20 del volumen del islote y se distribuyen de forma perifeacuterica

Ceacutelula beta (Beta Cell)

Las ceacutelulas beta producen y liberan insulina hormona que regula el nivel de glucosa en la sangre (facilitando el uso de glucosa por parte de las ceacutelulas y retirando el exceso de glucosa que se almacena en el hiacutegado en forma de glucoacutegeno)

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ENDOCRINOLOGIA

En los diabeacuteticos tipo I las ceacutelulas beta han sido dantildeadas y no son capaces de producir la hormona

Ceacutelula delta (Delta Cell)

Las ceacutelulas delta producen somatostatina hormona que se cree que regulariacutea la produccioacuten y liberacioacuten de la insulina por las ceacutelulas beta y la produccioacuten y liberacioacuten de glucagoacuten por las ceacutelulas alfa

Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)

Estas ceacutelulas hacen que el estoacutemago produzca y libere la hormona Grelina

Ceacutelula F (PP CELL)

Estas ceacutelulas producen y liberan Polipeacuteptido Pancreaacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

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ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

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ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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ENDOCRINOLOGIA

Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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ENDOCRINOLOGIA

Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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ENDOCRINOLOGIA

AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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ENDOCRINOLOGIA

Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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ENDOCRINOLOGIA

2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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ENDOCRINOLOGIA

52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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ENDOCRINOLOGIA

BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

Trabajo final Paacutegina 52

ENDOCRINOLOGIA

Trabajo final Paacutegina 53

  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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ENDOCRINOLOGIA

Hay que tener en cuenta que la regulacioacuten de la secrecioacuten de las hormonas hipofisiarias se realiza mediante un mecanismo de retroalimentacioacuten negativa el cual se establece entre el hipotaacutelamo la hipofisis y los receptores especiacuteficos para cada hormona localizado en los oacuterganos diana

El proceso se realiza en el momento en que el sistema nervioso central recibe un estiacutemulo el hipotaacutelamo recibe parte de ese estiacutemulo y actuacutea sobre la hipoacutefisis a su vez el hipotaacutelamo secreta las respectivas hormonas en la adenohipoacutefisis o libera las de la neurohipoacutefisis estas se incorporan a la circulacioacuten viajan por medio de la sangre y son captados por receptores especiacuteficos ubicados en los oacuterganos diana un ejemplo es la captacioacuten de la TSH por parte de los loacutebulos tiroideos de la glaacutendula tiroides

En ese momento el oacutergano diana que en todo caso es cualquiera de las glaacutendulas endocrinas comienzan a secretar sus propias hormonas con lo que se enviacutea un estiacutemulo al sistema nervioso especiacuteficamente al hipotaacutelamo o directamente a la hipoacutefisis con lo cual se contrarresta el estiacutemulo inicial

TRASTORNOS ASOCIADOS A LA HIPOFISIS

Condicioacuten Etiologiacutea Hormona

Acromegalia sobreproduccioacuten hormona de crecimiento

Gigantismo sobreproduccioacuten hormona de crecimiento

Deficiencia de la hormona de crecimiento

baja produccioacuten hormona de crecimiento

Siacutendrome de secrecioacuten inadecuada de la hormona antidiureacutetica

sobreproduccioacuten vasopresina

Diabetes insiacutepida baja produccioacuten vasopresina

Siacutendrome de Sheehan baja produccioacuten cualquier hormona hipofisaria

Adenoma hipofisario sobreproduccioacuten cualquier hormona hipofisaria

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ENDOCRINOLOGIA

Hipopituitarismo baja produccioacuten cualquier hormona hipofisaria

HORMONAS DEL HIPOTALAMO

El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta

Suele considerarse el centro integrador del sistema nervioso vegetativo (o sistema nervioso autoacutenomo) dentro del sistema nervioso perifeacuterico Tambieacuten se encarga de realizar funciones de integracioacuten somato-vegetativa

En conjunto con la hipoacutefisis realiza la homeostasis del organismo por medio de un sistema de realimentacioacuten negativa

Anatomiacutea

El dienceacutefalo estaacute constituido por el taacutelamo el hipotaacutelamo el epitaacutelamo y el subtaacutelamo El taacutelamo son dos masas en el medio del cerebro entre los dos hemisferios cerebrales El hipotaacutelamo estaacute debajo del taacutelamo y sus liacutemites estaacuten constituidos por

superior el piso del III ventriacuteculo anterior el quiasma oacuteptico

inferior y lateral subtaacutelamo

posterior liacutenea imaginaria entre los cuerpos mamilares y la comisura posterior del cerebro

Nuacutecleos neuronales

nuacutecleos laterales se relacionan con el hambre preoacuteptico funcioacuten parasimpaacutetica

supraoacuteptico produce hormona antidiureacutetica

paraventricular produce oxitocina

hipotalaacutemico anterior centro de la sed

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ENDOCRINOLOGIA

supraquiasmaacutetico regulacioacuten del ciclo circadiano

ventromedial centro de la saciedad

arcuato interviene en la conducta emocional y actividad endoacutecrina

mamilar funcioacuten simpaacutetica

hipotalaacutemico posterior participan en la memoria

Funciones

El hipotaacutelamo regula el hambre el apetito y la saciedad por medio de hormonas y peacuteptidos como la colecistoquinina el nivel de glucosa y aacutecidos grasos en sangre y el neuropeacuteptido Y entre otros

El hipotaacutelamo anterior o rostral (parasimpaacutetico) disipa (difunde) el calor y el hipotaacutelamo posterior o caudal (simpaacutetico) se encarga de mantener la temperatura corporal constante5 aumentando o disminuyendo la frecuencia respiratoria y la sudoracioacuten

La porcioacuten anterior y posterior del hipotaacutelamo regula el ciclo del suentildeo y de la vigilia (ritmo circadiano)

Hormonas

El hipotaacutelamo en cuanto oacutergano endocrino se ocupa de liberar factores liberadores o inhibidores a la sangre pero tambieacuten es capaz de producir neurohormonas listas para su secrecioacuten

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ENDOCRINOLOGIA

Neurohormonas

El hipotaacutelamo produce en los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares la ADH (hormona antidiureacutetica) o vasopresina la cual se acumula en la neurohipoacutefisis desde donde es secretada La vasopresina regula el balance de agua en el cuerpo actuando sobre los rintildeones Esta hormona se almacena en la hipoacutefisis posterior de donde es liberada La disfuncioacuten del hipotaacutelamo en la produccioacuten de ADH causa diabetes insiacutepida

La oxitocina es tambieacuten producida por el hipotaacutelamo y almacenada y liberada por la neurohipoacutefisis tambieacuten comparte similitudes en su estructura proteiacutenica y llegan a compartir algunas funciones En el caso de los hombres se desconoce su funcionalidad pero se la asocia con los genitales externos y con receptores de la vesiacutecula seminal

En el caso de las mujeres la oxitocina acelera el nuacutemero de contracciones en el parto e influye al uacutetero a que se reacomode despueacutes del parto Tambieacuten incita a las fibras musculares que rodean a las ceacutelulas secretoras de leche de las glaacutendulas mamarias a secretar leche en respuesta al acto de mamar del nintildeo

Factores hipotalaacutemicos

Aparte de las dos hormonas de accioacuten directa mencionadas el hipotaacutelamo secreta diversas hormonas o factores que regulan la secrecioacuten de hormonas hipofisarias

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ENDOCRINOLOGIA

Hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH LHRH o LHRF) Es un decapeacuteptido (una cadena de 10 aminoaacutecidos) que actuacutea sobre la hipoacutefisis estimulando la produccioacuten y la liberacioacuten de la hormona luteinizante (LH) y la hormona foliculoestimulante (FSH) El balance de estas hormonas coordina el ciclo menstrual femenino y la espermatogeacutenesis en los hombres

Hormona liberadora de tirotropina (TRH) Es un tripeacuteptido (moleacutecula compuesta por tres aminoaacutecidos) Estimula la secrecioacuten de prolactina (PRL) y de tirotropina (TSH) por parte de la adenohipoacutefisis

Corte sagital medio del cerebro El punto blanco en frente del hipotaacutelamo es el quiasma oacuteptico debajo del cual estaacute la pituitaria La liacutenea blanca entre la pituitaria y el espacio negro es la silla turca (hueso)

Hormona liberadora de corticotropina (CRH o CRF) Se sintetiza en los nuacutecleos paraventriculares a partir de un precursor polipeptiacutedico de unos 41aminoaacutecidos y posee una vida larga (minutos) Las neuronas secretoras se encuentran en la porcioacuten anterior de los nuacutecleos paraventriculares y sus axones terminan en la capa externa de la eminencia media Estimula la liberacioacuten de adrenocorticotropina (ACTH) y β-endorfina por parte de la adenohipoacutefisis La hormona antidiureacutetica y la angiotensina II potencian el efecto liberador de CRH

Somatocrinina hormona liberadora de somatotropina (STH) o factor liberador de hormona del crecimiento (GRF) Las neuronas productoras de este factor se encuentran en el nuacutecleo arcuato del hipotaacutelamo Se sintetiza a partir de un precursor de 107 o 108 aminoaacutecidos Estimula la liberacioacuten de la hormona del crecimiento hipofisaria (GH)

Somatostatina u hormona inhibidora de la liberacioacuten de somatotropina (GIH) Como su nombre indica inhibe la secrecioacuten de somatotropinay de otras hormonas como la insulina el glucagoacuten el polipeacuteptido pancreaacutetico y la TSH La zona secretora se encuentra en la regioacuten periventricular del hipotaacutelamo Es un tetradecapeacuteptido que se encuentra en el hipotaacutelamo y en las ceacutelulas D de los islotes de Langerhans Su precursor posee 116 aminoaacutecidos Hormona liberadora de corticotropina

PIF (Factor inhibidor de la liberacioacuten de prolactina) Actuacutea en forma constante inhibiendo la secrecioacuten de prolactina hipofisaria Dado que la dopamina inhibe tambieacuten la produccioacuten de prolactina al unirse a las

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ENDOCRINOLOGIA

ceacutelulas lactotropas de la hipoacutefisis durante alguacuten tiempo se pensoacute que se trataba de PIF la dopamina puede ser un PIF secundario Las neuronas secretoras de PIF se encuentran en el nuacutecleo arcuato hipotalaacutemico

Angiotensina II (AII) Es un octapeacuteptido que estimula la accioacuten de la hormona liberadora de corticotropina libera algo de adrenocorticotropina hipofisaria

Hormona tiroidea

Las hormonas tiroideas son producidas por la glaacutendula tiroides Su efecto es el aumento del metabolismo basal lo cual es indispensable para un correcto desarrollo fetal y el funcionamiento adecuado de los sistemas cardiovascular musculoesqueleacutetico hematopoyeacutetico asiacute como para respuestas corporales adecuadas en cuanto a produccioacuten de calor consumo de oxiacutegeno y regulacioacuten de otros sistemas hormonales

Tipos de hormona tiroidea

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ENDOCRINOLOGIA

T4 T3

Existen tres hormonas circulantescirculantesco grande

T4 tetrayodotironina o tiroxina T3 o triyodotironina

T3 reversa Esta es bioloacutegicamente inactiva

Los niveles plasmaacuteticos de estas hormonas se mantienen estables durante toda la vida con excepcioacuten del periacuteodo neonatal y en algunas enfermedades o con el uso de algunos faacutermacos

Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas

Los yoduros que se ingieren en los alimentos y en el agua son concentrados de forma activa por la glaacutendula tiroides convertidos a yodo orgaacutenico por la peroxidasa tiroidea e incorporados a la tirosina en la tiroglobulina intrafolicular contenida en el coloide de la superficie apical de la ceacutelula folicular del tiroides

Las tirosinas son yodadas en un lugar (monoyodotirosina) o en dos (diyodotirosina) y se acoplan para formar las hormonas activas

diyodotirosina + diyodotirosina (r) --gt tetrayodotironina [tiroxina T4] diyodotirosina + monoyodotirosina( r) --gt triyodotironina [T3]

Otra fuente de T3 en el interior de la glaacutendula tiroides es el producto de la monodesyodacioacuten del anillo externo de la T4 por una selenoenzima la desyodasa tipo I (5-D-I) Esta enzima se encuentra tambieacuten en el hiacutegado y los rintildeones La T3 resultante pasa a la circulacioacuten Tambieacuten existe una isoenzima que efectuacutea la misma reaccioacuten llamada desyodasa tipo II que se encuentra en el cerebro y la hipoacutefisis La T3 resultante actuacutea localmente2

La tiroglobulina una glucoproteiacutena que contiene T3 y T4 en su matriz es captada por el foliacuteculo en forma de gotitas de coloide por las ceacutelulas tiroideas

Todas las reacciones necesarias para la formacioacuten de T3 y T4 son influidas y controladas por la hormona estimulante del tiroides (TSH) llamada tambieacuten tirotropina que estimula las ceacutelulas foliculares en la glaacutendula tiroides

Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas se metabolizan principalmente en el hiacutegado Producto de una conjugacioacuten con los aacutecidos glucoroacutenico y sulfuacuterico por medio de un grupo hidroxilo fenoacutelico se genera una forma excretable a traveacutes de la bilis

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ENDOCRINOLOGIA

Una parte de los productos conjugados eliminados por la bilis se hidroliza y se absorbe como hormona activa en el intestino Es un fenoacutemeno conocido como circulacioacuten enterohepaacutetica El resto se elimina por las heces

En la circulacioacuten sanguiacutenea la T4 se metaboliza a T3 y T3 reversa las que a su vez se desyodan produceacutendose diyodotironinas inactivas

Efectos de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas tienen dos efectos fisioloacutegicos principales

1 Aumentan la siacutentesis de proteiacutenas praacutecticamente en todos los tejidos del organismo (La T3 y la T4 penetran en las ceacutelulas donde la T3 que se obtiene de la circulacioacuten y por la conversioacuten de T4 en T3 dentro de la ceacutelula se une a receptores nucleares individuales e influye sobre la formacioacuten de ARNm)

2 La T3 incrementa el consumo de oxiacutegeno mediante el aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa (bomba sodio-potasio) sobre todo en los tejidos responsables del consumo basal de oxiacutegeno (es decir hiacutegado rintildeoacuten corazoacuten y muacutesculo esqueleacutetico) El aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa es secundario al incremento de la siacutentesis de esta enzima por consiguiente el aumento del consumo de oxiacutegeno probablemente tambieacuten estaacute relacionado con la fijacioacuten nuclear de hormonas tiroideas No obstante no se ha descartado un efecto directo de la T3 sobre la mitocondria Se cree que la T3 es la hormona tiroidea activa aunque la misma T4 pueda ser bioloacutegicamente activa

Efectos fisioloacutegicos

Desarrollo normal del sistema nervioso central en el feto Funcionamiento normal del sistema nervioso central Su falta enlentece

su funcionamiento

Generacioacuten de calor

Efectos cronotroacutepico e inotroacutepico en el sistema cardiovascular

Aumenta el nuacutemero de receptores para catecolaminas y amplifica la respuesta postreceptor en el sistema simpaacutetico3

Aumenta la eritropoyetina

Regula el metabolismo oacuteseo

Permite la relajacioacuten muscular

Interviene en los niveles de produccioacuten de hormonas gonadotrofinas y somatotropa o GH

Permite la correcta respuesta del centro respiratorio a la hipoxia e hipercapnia

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ENDOCRINOLOGIA

Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma

Las hormonas tiroideas circulan unidas a proteiacutenas plasmaacuteticas Un porcentaje bajo de T4 y T3 circula libremente por la sangre y es de este porcentaje bajo de hormona que depende la accioacuten hormonal sobre los receptores celulares

Las proteiacutenas a las que se unen las hormonas tiroideas son

Globulina transportadora de tiroxina o TBG (del ingleacutes Thyroxin Binding Globulin)

Prealbuacutemina transportadora de tiroxina o TBPA (del ingleacutes Thyroxin Binding Pre Albumin)

Albuacutemina

Ya que existen factores que afectan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas mencionadas modificando la cantidad de hormona libre es muy importante medir la hormona libre en el plasma para evaluar la condicioacuten fisiopatoloacutegica en estudio

Por ejemplo los siguientes faacutermacos compiten con las hormonas tiroideas por su unioacuten con las proteiacutenas transportadoras

Salicilatos Hidantoiacutenas

Algunos antiinflamatorios no esteroideos como el Diclofenaco y el aacutecido mefenaacutemico

Furosemida

Por el contrario los siguientes faacutermacos incrementan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas transportadoras

Estroacutegenos Metadona

Clofibrato

Heroiacutena

Tamoxifeno

En el embarazo tambieacuten se modifica la afinidad de las hormonas tiroideas por las proteiacutenas transportadoras aumentando esta unioacuten y disminuyendo la hormona libre

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ENDOCRINOLOGIA

Paratiroides

Las glaacutendulas paratiroides son glaacutendulas endocrinas Situadas en el cuello generalmente localizadas en los polos De la glaacutendula tiroides que producen La hormona paratiroidea o paratohormona Por lo general hay cuatro glaacutendulas paratiroides Dos superiores y dos inferiores pero de forma ocasional puede haber cinco o maacutes Cuando existe alguna glaacutendula adicional eacutesta suele encontrarse en el mediastino en relacioacuten con el timo o dentro de la glaacutendula tiroides

La hormona paratiroidea participa en el control de la homeostasis del calcio y foacutesforo asiacute como en la fisiologiacutea del hueso

El exceso de funcioacuten de las glaacutendulas paratiroides se conoce como hiperparatiroidismo y suele cursar con elevacioacuten de los niveles plasmaacuteticos de calcio y fragilidad oacutesea que condiciona una mayor susceptibilidad a padecer fracturas La funcioacuten insuficiente de las glaacutendulas paratiroides (hipoparatiroidismo) es mucho menos frecuente y generalmente se presenta tras una cirugiacutea sobre la glaacutendula tiroides que conlleva la existencia de hipocalcemia Existen algunas enfermedades mucho maacutes raras que parecen deberse a alteraciones en el receptor de la hormona paratiroidea como la condroplasia metafiseal de Jansen y la condroplasia de Blomstrand

Hormona paratiroidea o parathormona Es secretada por las ceacutelulas principales de la glaacutendula paratiroides es un polipeacuteptido de 84 aminoaacutecidos cuyo peso molecular es de aproximadamente 9500 Daltons Facilita la absorcioacuten del calcio Vitamina D (en su forma natural) y fosfato conjuntamente en el intestino Aumenta la resorcioacuten de los huesos Mediante la produccioacuten de maacutes osteoclastos a partir de las ceacutelulas madre mesenquimatosas de la meacutedula oacutesea y retrasando la conversioacuten de estas en osteoblastos Los osteoclastos absorben el hueso mediante la liberacioacuten de hormonas proteoliacuteticas liberadas por lisosomas y la secrecioacuten de varios aacutecidos entre ellos el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido laacutectico Aumenta la reabsorcioacuten del calcio y reduce la resorcioacuten del fosfato en los tuacutebulos renales provocando que este salga en la orina en mayor concentracioacuten Aumenta la resorcioacuten del calcio en el intestino Induce un incremento en la formacioacuten del 125-dihidroxicolecalciferol (forma activa de la Vitamina D calitriol o Vitamina D3) a partir del 25-hidroxicolecalciferol (calcifediol) en los rintildeones la vitamina D3 luego actuacutea a nivel del epitelio intestinal aumentando la absorcioacuten del calcio aumentando asiacute los

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ENDOCRINOLOGIA

niveles de calcio plasmaacuteticos (valor normal del calcio plasmaacutetico 92-104 mgdl) Luego por un mecanismo de retroaccioacuten o retroalimentacioacuten negativa elevadas concentraciones de calcio plasmaacuteticos inhiben la secrecioacuten de la PTH (Hormona paratiroidea)ademaacutes ayuda a la reabsorcion del calcio por medio de los rintildeones

Calcitonina Secretada por las ceacutelulas parafoliculares en la Tiroides es un polipeacuteptido de 32 aminoaacutecidos con un peso molecular aproximado de 3000 Daltons aproximadamente Tiene una funcioacuten opuesta a la Hormona Paratiroidea disminuye la actividad osteoclaacutestica desacelera la formacioacuten de los osteoclastos y acelera la formacioacuten de osteoblastos (ceacutelulas encargadas de la formacioacuten del hueso)

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ENDOCRINOLOGIA

Glaacutendula suprarrenal

Las glaacutendulas con forma de triaacutengulo que estaacuten situadas encima de los rintildeones cuya funcioacuten es la de regular las respuestas al estreacutes a traveacutes de la siacutentesis de corticosteroides (principalmente cortisol) y catecolaminas (adrenalina sobre todo)

Capas de la glaacutendula suprarrenal

Introduccioacuten

Anatoacutemicamente las glaacutendulas suprarrenales estaacuten separadas situadas en la cara anterosuperior de los rintildeones y estaacuten irrigadas por la sangre que reciben de las suprarrenales (las suprarrenales superiores las suprarrenales medias y las suprarrenales inferiores) Estaacuten formadas por estructuras diferentes que son la meacutedula suprarrenal y la corteza suprarrenal ambas inervadas por el sistema nervioso autoacutenomo Como su nombre sugiere la meacutedula suprarrenal estaacute situada dentro de la glaacutendula rodeada por la corteza suprarrenal que forma la superficie

Meacutedula suprarrenal La suprarrenal o meacutedula adrenal estaacute compuesta principalmente por ceacutelulas cromafines productoras de hormonas siendo el principal oacutergano de conversioacuten del aminoaacutecido tirosina en catecolaminas epinefrina y norepinefrina tambieacuten llamadas adrenalina y noradrenalina respectivamente Las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal derivan embrioloacutegicamente de la cresta neural como neuronas modificadas Realmente estas ceacutelulas son ceacutelulas postganglionares del sistema nervioso simpaacutetico que reciben la inervacioacuten de ceacutelulas preganglionares Como las sinapsis entre fibras pre y postganglionares seon ganglios nerviosos autonoacutemicos la meacutedula suprarrenal puede considerarse como un ganglio nervioso del sistema nervioso simpaacutetico

En respuesta a una situacioacuten estresante como es el ejercicio fiacutesico o un peligro inminente las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal producen catecolaminas a la sangre en una relacioacuten 70 a 30 de epinefrina y norepinefrina respectivamente

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ENDOCRINOLOGIA

La epinefrina produce efectos importantes como el aumento de la frecuencia cardiacuteaca vasoconstriccioacuten broncodilatacioacuten y aumento del metabolismo que son respuestas muy fugaces

Corteza suprarrenal

La corteza suprarrenal o corteza adrenal estaacute situada rodeando la circunferencia de la glaacutendula suprarrenal Su funcioacuten es la de regular varios componentes del metabolismo con la produccioacuten de mineralcorticoides y glucocorticoides que incluyen a la aldosterona y cortisol La corteza suprarrenal tambieacuten es un lugar secundario de siacutentesis de androacutegenos

La corteza suprarrenal secreta hormonas esteroideas (de naturaleza lipidica) por lo que sus ceacutelulas presentan abundante REL (reticulo endoplasmaacutetico liso) y mitocondrias con crestas longitudinales al MET Se dispone en tres capas diferentes de tejido basado en los tipos celulares y la funcioacuten que realizan

Zona glomerular Produccioacuten de mineralocorticoides sobre todo aldosterona

Zona fascicular Produccioacuten de glucocorticoides principalmente cortisol cerca del 95

Zona reticular Produccioacuten de androacutegenos incluyendo testosterona

Zona glomerular

Las ceacutelulas de la zona glomerular de la corteza suprarrenal segregan mineralocorticoides como la aldosterona y la desoxicorticosterona en respuesta a un aumento de los niveles de potasio o descenso del flujo de sangre en los rintildeones La aldosterona es liberada a la sangre formando parte del sistema renina-angiotensina que regula la concentracioacuten de electrolitos en la sangre sobre todo de sodio y potasio actuando en el tuacutebulo contorneado distal de la nefrona de los rintildeones

Aumentando la excrecioacuten de potasio Aumentando la reabsorcioacuten de sodio

La Aldosterona es una hormona que ayuda a regular la presioacuten osmoacutetica de mi organismo Por ejemplo si en el plasma sanguiacuteneo hay una escasez de sales ([osmolaridad] baja) se secretaraacute mayor cantidad de Aldosterona para reabsorber maacutes sodio y por consiguiente normalizar los niveles Lo mismo si hay una concentracioacuten muy elevada de sales en la sangre (osmolaridad alta) se secretaraacute menos o se inhibiraacute la secrecioacuten de Aldosterona para no tener que reabsorber el Sodio y por consiguiente eliminarlo normalizando las concentraciones

Zona fascicular

Capa predominante en la corteza suprarrenal cuyas celulas se disponen en hileras separadas por tabiques y capilares Sus ceacutelulas se llaman espongiocitos

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ENDOCRINOLOGIA

porque son voluminosas y contienen numerosos granulos claros dando a su superficie un aspecto de esponja Estas ceacutelulas segregan glucocorticoides como el cortisol o hidrocortisona y la cortisona al ser estimuladas por la hormona adrenocorticotropica (ACTH) La ACTH es producida por la hipoacutefisis en respuesta al factor hipotalaacutemico estimulante de corticotropina (CRH) Estos tres oacuterganos del sistema endocrino forman el eje hipotaacutelamo-hipofisario-suprarrenal

El principal glucocorticoide producido por las glaacutendulas suprarrenales es el cortisol que cumple diferentes funciones en el metabolismo en muacuteltiples ceacutelulas del organismo como

Estimulacioacuten de la produccioacuten de aminoaacutecidos por el cuerpo rompiendo proteiacutenas proteoacutelisis

Estimulacioacuten de la lipoacutelisis es decir rompiendo la grasa

Estimulacioacuten gluconeogeacutenesis la produccioacuten de glucosa a partir de nuevas fuentes como los aminaacutecidos y la glicerina de los aacutecidos grasos

Mantenimiento de la glucosa inhibiendo su liberacioacuten desde el muacutesculo y del tejido adiposo

Los glucocorticoides aumentan las concentraciones de glucosa en sangre pues actuacutean como antagonistas de la insulina e inhiben su liberacioacuten lo que produce una disminucioacuten de la captacioacuten de glucosa por los tejidos esto favorece que aumente la siacutentesis de glucosa en el hiacutegado y aumente la cantidad de glucoacutegeno en este mismo

Los glucocorticoides tambieacuten tienen propiedades antiinflamatorias que estaacuten relacionadas con sus efectos sobre la microcirculacioacuten y la inhibicioacuten de las citocinas pro-inflamatorias (IL-1 e IL-6) prostaglandinas y linfocinas Por lo tanto regulan las respuestas inmunitarias a traveacutes del llamado eje inmunosuprarrenal

Tambieacuten el cortisol tiene efectos importantes sobre la regulacioacuten del agua corporal retrasando la entrada de este liacutequido del espacio extracelular al intracelular Por lo que favorece la eliminacioacuten renal de agua

El cortisol inhibe la secrecioacuten de la propiomelanocortina (precursor de ACTH) de la CRH (Hormona liberadora de Corticotropina producida por las ceacutelulas de la eminencia media del hipotaacutelamo) y de Vasopresina

Zona reticular

Es la maacutes interna y presenta ceacutelulas dispuestas en cordones entrecruzados o anastomosados que segregan esteroides sexuales como estroacutegenos y androacutegenos

Las ceacutelulas de la zona reticular producen una fuente secundaria de androacutegenos como testosterona dihidrotestosterona (DHT) androstendiona y

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ENDOCRINOLOGIA

dehidroepiandrosterona (DHEA) Estas hormonas aumentan la masa muscular estimulan el crecimiento celular y ayudan al desarrollo de los caracteres sexuales secundarios

Paacutencreas

El paacutencreas oacutergano que segrega enzimas digestivas que pasan al intestino delgado Estas enzimas ayudan en la ruptura de carbohidratos liacutepidos proteinas y aacutecidos nucleacuteicos en el quimo Tiene forma coacutenica con un proceso uniforme medial e inferior En la especie humana su longitud oscila entre 20 y 30 cm tiene una anchura de unos 4 cm y un grosor de 5 centiacutemetros con un peso 30g La cabeza se localiza en la concavidad del duodeno o asa duodenal formada por la segunda porcioacuten del duodeno

Histologiacutea del paacutencreas

El paacutencreas tiene una parte exocrina y una parte endocrina

La parte exocrina contiene unas glaacutendulas llamadas aacutecinos serosos que son redondos u ovalados con ceacutelulas epiteliales Formados por las celuacutelas acinosas y en parte por las centroacinosas

La parte endocrina se agrupa en islotes de Langerhans que consisten en cuacutemulos de ceacutelulas secretoras de hormonas que producen insulina glucagoacuten y somatostatina Estos tipos de ceacutelulas son los siguientes

Ceacutelula alfa (Alfa cell)

Estas ceacutelulas alfa sintetizan y liberan glucagoacuten El glucagoacuten aumenta el nivel de glucosa sanguiacutenea al estimular la formacioacuten de este carbohidrato a partir del glucoacutegeno almacenado en hepatocitos Tambieacuten ejerce efecto en el metabolismo de proteiacutenas y grasas La liberacioacuten del glucagoacuten es inhibida por la hiperglucemia Representan entre el 10 - 20 del volumen del islote y se distribuyen de forma perifeacuterica

Ceacutelula beta (Beta Cell)

Las ceacutelulas beta producen y liberan insulina hormona que regula el nivel de glucosa en la sangre (facilitando el uso de glucosa por parte de las ceacutelulas y retirando el exceso de glucosa que se almacena en el hiacutegado en forma de glucoacutegeno)

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ENDOCRINOLOGIA

En los diabeacuteticos tipo I las ceacutelulas beta han sido dantildeadas y no son capaces de producir la hormona

Ceacutelula delta (Delta Cell)

Las ceacutelulas delta producen somatostatina hormona que se cree que regulariacutea la produccioacuten y liberacioacuten de la insulina por las ceacutelulas beta y la produccioacuten y liberacioacuten de glucagoacuten por las ceacutelulas alfa

Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)

Estas ceacutelulas hacen que el estoacutemago produzca y libere la hormona Grelina

Ceacutelula F (PP CELL)

Estas ceacutelulas producen y liberan Polipeacuteptido Pancreaacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

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ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

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ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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ENDOCRINOLOGIA

Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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ENDOCRINOLOGIA

Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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ENDOCRINOLOGIA

AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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ENDOCRINOLOGIA

5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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ENDOCRINOLOGIA

2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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ENDOCRINOLOGIA

52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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ENDOCRINOLOGIA

BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

Trabajo final Paacutegina 52

ENDOCRINOLOGIA

Trabajo final Paacutegina 53

  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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Page 11: Trabajo Final Endocrinologia

ENDOCRINOLOGIA

Hipopituitarismo baja produccioacuten cualquier hormona hipofisaria

HORMONAS DEL HIPOTALAMO

El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta

Suele considerarse el centro integrador del sistema nervioso vegetativo (o sistema nervioso autoacutenomo) dentro del sistema nervioso perifeacuterico Tambieacuten se encarga de realizar funciones de integracioacuten somato-vegetativa

En conjunto con la hipoacutefisis realiza la homeostasis del organismo por medio de un sistema de realimentacioacuten negativa

Anatomiacutea

El dienceacutefalo estaacute constituido por el taacutelamo el hipotaacutelamo el epitaacutelamo y el subtaacutelamo El taacutelamo son dos masas en el medio del cerebro entre los dos hemisferios cerebrales El hipotaacutelamo estaacute debajo del taacutelamo y sus liacutemites estaacuten constituidos por

superior el piso del III ventriacuteculo anterior el quiasma oacuteptico

inferior y lateral subtaacutelamo

posterior liacutenea imaginaria entre los cuerpos mamilares y la comisura posterior del cerebro

Nuacutecleos neuronales

nuacutecleos laterales se relacionan con el hambre preoacuteptico funcioacuten parasimpaacutetica

supraoacuteptico produce hormona antidiureacutetica

paraventricular produce oxitocina

hipotalaacutemico anterior centro de la sed

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ENDOCRINOLOGIA

supraquiasmaacutetico regulacioacuten del ciclo circadiano

ventromedial centro de la saciedad

arcuato interviene en la conducta emocional y actividad endoacutecrina

mamilar funcioacuten simpaacutetica

hipotalaacutemico posterior participan en la memoria

Funciones

El hipotaacutelamo regula el hambre el apetito y la saciedad por medio de hormonas y peacuteptidos como la colecistoquinina el nivel de glucosa y aacutecidos grasos en sangre y el neuropeacuteptido Y entre otros

El hipotaacutelamo anterior o rostral (parasimpaacutetico) disipa (difunde) el calor y el hipotaacutelamo posterior o caudal (simpaacutetico) se encarga de mantener la temperatura corporal constante5 aumentando o disminuyendo la frecuencia respiratoria y la sudoracioacuten

La porcioacuten anterior y posterior del hipotaacutelamo regula el ciclo del suentildeo y de la vigilia (ritmo circadiano)

Hormonas

El hipotaacutelamo en cuanto oacutergano endocrino se ocupa de liberar factores liberadores o inhibidores a la sangre pero tambieacuten es capaz de producir neurohormonas listas para su secrecioacuten

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ENDOCRINOLOGIA

Neurohormonas

El hipotaacutelamo produce en los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares la ADH (hormona antidiureacutetica) o vasopresina la cual se acumula en la neurohipoacutefisis desde donde es secretada La vasopresina regula el balance de agua en el cuerpo actuando sobre los rintildeones Esta hormona se almacena en la hipoacutefisis posterior de donde es liberada La disfuncioacuten del hipotaacutelamo en la produccioacuten de ADH causa diabetes insiacutepida

La oxitocina es tambieacuten producida por el hipotaacutelamo y almacenada y liberada por la neurohipoacutefisis tambieacuten comparte similitudes en su estructura proteiacutenica y llegan a compartir algunas funciones En el caso de los hombres se desconoce su funcionalidad pero se la asocia con los genitales externos y con receptores de la vesiacutecula seminal

En el caso de las mujeres la oxitocina acelera el nuacutemero de contracciones en el parto e influye al uacutetero a que se reacomode despueacutes del parto Tambieacuten incita a las fibras musculares que rodean a las ceacutelulas secretoras de leche de las glaacutendulas mamarias a secretar leche en respuesta al acto de mamar del nintildeo

Factores hipotalaacutemicos

Aparte de las dos hormonas de accioacuten directa mencionadas el hipotaacutelamo secreta diversas hormonas o factores que regulan la secrecioacuten de hormonas hipofisarias

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ENDOCRINOLOGIA

Hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH LHRH o LHRF) Es un decapeacuteptido (una cadena de 10 aminoaacutecidos) que actuacutea sobre la hipoacutefisis estimulando la produccioacuten y la liberacioacuten de la hormona luteinizante (LH) y la hormona foliculoestimulante (FSH) El balance de estas hormonas coordina el ciclo menstrual femenino y la espermatogeacutenesis en los hombres

Hormona liberadora de tirotropina (TRH) Es un tripeacuteptido (moleacutecula compuesta por tres aminoaacutecidos) Estimula la secrecioacuten de prolactina (PRL) y de tirotropina (TSH) por parte de la adenohipoacutefisis

Corte sagital medio del cerebro El punto blanco en frente del hipotaacutelamo es el quiasma oacuteptico debajo del cual estaacute la pituitaria La liacutenea blanca entre la pituitaria y el espacio negro es la silla turca (hueso)

Hormona liberadora de corticotropina (CRH o CRF) Se sintetiza en los nuacutecleos paraventriculares a partir de un precursor polipeptiacutedico de unos 41aminoaacutecidos y posee una vida larga (minutos) Las neuronas secretoras se encuentran en la porcioacuten anterior de los nuacutecleos paraventriculares y sus axones terminan en la capa externa de la eminencia media Estimula la liberacioacuten de adrenocorticotropina (ACTH) y β-endorfina por parte de la adenohipoacutefisis La hormona antidiureacutetica y la angiotensina II potencian el efecto liberador de CRH

Somatocrinina hormona liberadora de somatotropina (STH) o factor liberador de hormona del crecimiento (GRF) Las neuronas productoras de este factor se encuentran en el nuacutecleo arcuato del hipotaacutelamo Se sintetiza a partir de un precursor de 107 o 108 aminoaacutecidos Estimula la liberacioacuten de la hormona del crecimiento hipofisaria (GH)

Somatostatina u hormona inhibidora de la liberacioacuten de somatotropina (GIH) Como su nombre indica inhibe la secrecioacuten de somatotropinay de otras hormonas como la insulina el glucagoacuten el polipeacuteptido pancreaacutetico y la TSH La zona secretora se encuentra en la regioacuten periventricular del hipotaacutelamo Es un tetradecapeacuteptido que se encuentra en el hipotaacutelamo y en las ceacutelulas D de los islotes de Langerhans Su precursor posee 116 aminoaacutecidos Hormona liberadora de corticotropina

PIF (Factor inhibidor de la liberacioacuten de prolactina) Actuacutea en forma constante inhibiendo la secrecioacuten de prolactina hipofisaria Dado que la dopamina inhibe tambieacuten la produccioacuten de prolactina al unirse a las

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ENDOCRINOLOGIA

ceacutelulas lactotropas de la hipoacutefisis durante alguacuten tiempo se pensoacute que se trataba de PIF la dopamina puede ser un PIF secundario Las neuronas secretoras de PIF se encuentran en el nuacutecleo arcuato hipotalaacutemico

Angiotensina II (AII) Es un octapeacuteptido que estimula la accioacuten de la hormona liberadora de corticotropina libera algo de adrenocorticotropina hipofisaria

Hormona tiroidea

Las hormonas tiroideas son producidas por la glaacutendula tiroides Su efecto es el aumento del metabolismo basal lo cual es indispensable para un correcto desarrollo fetal y el funcionamiento adecuado de los sistemas cardiovascular musculoesqueleacutetico hematopoyeacutetico asiacute como para respuestas corporales adecuadas en cuanto a produccioacuten de calor consumo de oxiacutegeno y regulacioacuten de otros sistemas hormonales

Tipos de hormona tiroidea

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ENDOCRINOLOGIA

T4 T3

Existen tres hormonas circulantescirculantesco grande

T4 tetrayodotironina o tiroxina T3 o triyodotironina

T3 reversa Esta es bioloacutegicamente inactiva

Los niveles plasmaacuteticos de estas hormonas se mantienen estables durante toda la vida con excepcioacuten del periacuteodo neonatal y en algunas enfermedades o con el uso de algunos faacutermacos

Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas

Los yoduros que se ingieren en los alimentos y en el agua son concentrados de forma activa por la glaacutendula tiroides convertidos a yodo orgaacutenico por la peroxidasa tiroidea e incorporados a la tirosina en la tiroglobulina intrafolicular contenida en el coloide de la superficie apical de la ceacutelula folicular del tiroides

Las tirosinas son yodadas en un lugar (monoyodotirosina) o en dos (diyodotirosina) y se acoplan para formar las hormonas activas

diyodotirosina + diyodotirosina (r) --gt tetrayodotironina [tiroxina T4] diyodotirosina + monoyodotirosina( r) --gt triyodotironina [T3]

Otra fuente de T3 en el interior de la glaacutendula tiroides es el producto de la monodesyodacioacuten del anillo externo de la T4 por una selenoenzima la desyodasa tipo I (5-D-I) Esta enzima se encuentra tambieacuten en el hiacutegado y los rintildeones La T3 resultante pasa a la circulacioacuten Tambieacuten existe una isoenzima que efectuacutea la misma reaccioacuten llamada desyodasa tipo II que se encuentra en el cerebro y la hipoacutefisis La T3 resultante actuacutea localmente2

La tiroglobulina una glucoproteiacutena que contiene T3 y T4 en su matriz es captada por el foliacuteculo en forma de gotitas de coloide por las ceacutelulas tiroideas

Todas las reacciones necesarias para la formacioacuten de T3 y T4 son influidas y controladas por la hormona estimulante del tiroides (TSH) llamada tambieacuten tirotropina que estimula las ceacutelulas foliculares en la glaacutendula tiroides

Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas se metabolizan principalmente en el hiacutegado Producto de una conjugacioacuten con los aacutecidos glucoroacutenico y sulfuacuterico por medio de un grupo hidroxilo fenoacutelico se genera una forma excretable a traveacutes de la bilis

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ENDOCRINOLOGIA

Una parte de los productos conjugados eliminados por la bilis se hidroliza y se absorbe como hormona activa en el intestino Es un fenoacutemeno conocido como circulacioacuten enterohepaacutetica El resto se elimina por las heces

En la circulacioacuten sanguiacutenea la T4 se metaboliza a T3 y T3 reversa las que a su vez se desyodan produceacutendose diyodotironinas inactivas

Efectos de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas tienen dos efectos fisioloacutegicos principales

1 Aumentan la siacutentesis de proteiacutenas praacutecticamente en todos los tejidos del organismo (La T3 y la T4 penetran en las ceacutelulas donde la T3 que se obtiene de la circulacioacuten y por la conversioacuten de T4 en T3 dentro de la ceacutelula se une a receptores nucleares individuales e influye sobre la formacioacuten de ARNm)

2 La T3 incrementa el consumo de oxiacutegeno mediante el aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa (bomba sodio-potasio) sobre todo en los tejidos responsables del consumo basal de oxiacutegeno (es decir hiacutegado rintildeoacuten corazoacuten y muacutesculo esqueleacutetico) El aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa es secundario al incremento de la siacutentesis de esta enzima por consiguiente el aumento del consumo de oxiacutegeno probablemente tambieacuten estaacute relacionado con la fijacioacuten nuclear de hormonas tiroideas No obstante no se ha descartado un efecto directo de la T3 sobre la mitocondria Se cree que la T3 es la hormona tiroidea activa aunque la misma T4 pueda ser bioloacutegicamente activa

Efectos fisioloacutegicos

Desarrollo normal del sistema nervioso central en el feto Funcionamiento normal del sistema nervioso central Su falta enlentece

su funcionamiento

Generacioacuten de calor

Efectos cronotroacutepico e inotroacutepico en el sistema cardiovascular

Aumenta el nuacutemero de receptores para catecolaminas y amplifica la respuesta postreceptor en el sistema simpaacutetico3

Aumenta la eritropoyetina

Regula el metabolismo oacuteseo

Permite la relajacioacuten muscular

Interviene en los niveles de produccioacuten de hormonas gonadotrofinas y somatotropa o GH

Permite la correcta respuesta del centro respiratorio a la hipoxia e hipercapnia

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ENDOCRINOLOGIA

Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma

Las hormonas tiroideas circulan unidas a proteiacutenas plasmaacuteticas Un porcentaje bajo de T4 y T3 circula libremente por la sangre y es de este porcentaje bajo de hormona que depende la accioacuten hormonal sobre los receptores celulares

Las proteiacutenas a las que se unen las hormonas tiroideas son

Globulina transportadora de tiroxina o TBG (del ingleacutes Thyroxin Binding Globulin)

Prealbuacutemina transportadora de tiroxina o TBPA (del ingleacutes Thyroxin Binding Pre Albumin)

Albuacutemina

Ya que existen factores que afectan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas mencionadas modificando la cantidad de hormona libre es muy importante medir la hormona libre en el plasma para evaluar la condicioacuten fisiopatoloacutegica en estudio

Por ejemplo los siguientes faacutermacos compiten con las hormonas tiroideas por su unioacuten con las proteiacutenas transportadoras

Salicilatos Hidantoiacutenas

Algunos antiinflamatorios no esteroideos como el Diclofenaco y el aacutecido mefenaacutemico

Furosemida

Por el contrario los siguientes faacutermacos incrementan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas transportadoras

Estroacutegenos Metadona

Clofibrato

Heroiacutena

Tamoxifeno

En el embarazo tambieacuten se modifica la afinidad de las hormonas tiroideas por las proteiacutenas transportadoras aumentando esta unioacuten y disminuyendo la hormona libre

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ENDOCRINOLOGIA

Paratiroides

Las glaacutendulas paratiroides son glaacutendulas endocrinas Situadas en el cuello generalmente localizadas en los polos De la glaacutendula tiroides que producen La hormona paratiroidea o paratohormona Por lo general hay cuatro glaacutendulas paratiroides Dos superiores y dos inferiores pero de forma ocasional puede haber cinco o maacutes Cuando existe alguna glaacutendula adicional eacutesta suele encontrarse en el mediastino en relacioacuten con el timo o dentro de la glaacutendula tiroides

La hormona paratiroidea participa en el control de la homeostasis del calcio y foacutesforo asiacute como en la fisiologiacutea del hueso

El exceso de funcioacuten de las glaacutendulas paratiroides se conoce como hiperparatiroidismo y suele cursar con elevacioacuten de los niveles plasmaacuteticos de calcio y fragilidad oacutesea que condiciona una mayor susceptibilidad a padecer fracturas La funcioacuten insuficiente de las glaacutendulas paratiroides (hipoparatiroidismo) es mucho menos frecuente y generalmente se presenta tras una cirugiacutea sobre la glaacutendula tiroides que conlleva la existencia de hipocalcemia Existen algunas enfermedades mucho maacutes raras que parecen deberse a alteraciones en el receptor de la hormona paratiroidea como la condroplasia metafiseal de Jansen y la condroplasia de Blomstrand

Hormona paratiroidea o parathormona Es secretada por las ceacutelulas principales de la glaacutendula paratiroides es un polipeacuteptido de 84 aminoaacutecidos cuyo peso molecular es de aproximadamente 9500 Daltons Facilita la absorcioacuten del calcio Vitamina D (en su forma natural) y fosfato conjuntamente en el intestino Aumenta la resorcioacuten de los huesos Mediante la produccioacuten de maacutes osteoclastos a partir de las ceacutelulas madre mesenquimatosas de la meacutedula oacutesea y retrasando la conversioacuten de estas en osteoblastos Los osteoclastos absorben el hueso mediante la liberacioacuten de hormonas proteoliacuteticas liberadas por lisosomas y la secrecioacuten de varios aacutecidos entre ellos el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido laacutectico Aumenta la reabsorcioacuten del calcio y reduce la resorcioacuten del fosfato en los tuacutebulos renales provocando que este salga en la orina en mayor concentracioacuten Aumenta la resorcioacuten del calcio en el intestino Induce un incremento en la formacioacuten del 125-dihidroxicolecalciferol (forma activa de la Vitamina D calitriol o Vitamina D3) a partir del 25-hidroxicolecalciferol (calcifediol) en los rintildeones la vitamina D3 luego actuacutea a nivel del epitelio intestinal aumentando la absorcioacuten del calcio aumentando asiacute los

Trabajo final Paacutegina 19

ENDOCRINOLOGIA

niveles de calcio plasmaacuteticos (valor normal del calcio plasmaacutetico 92-104 mgdl) Luego por un mecanismo de retroaccioacuten o retroalimentacioacuten negativa elevadas concentraciones de calcio plasmaacuteticos inhiben la secrecioacuten de la PTH (Hormona paratiroidea)ademaacutes ayuda a la reabsorcion del calcio por medio de los rintildeones

Calcitonina Secretada por las ceacutelulas parafoliculares en la Tiroides es un polipeacuteptido de 32 aminoaacutecidos con un peso molecular aproximado de 3000 Daltons aproximadamente Tiene una funcioacuten opuesta a la Hormona Paratiroidea disminuye la actividad osteoclaacutestica desacelera la formacioacuten de los osteoclastos y acelera la formacioacuten de osteoblastos (ceacutelulas encargadas de la formacioacuten del hueso)

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Glaacutendula suprarrenal

Las glaacutendulas con forma de triaacutengulo que estaacuten situadas encima de los rintildeones cuya funcioacuten es la de regular las respuestas al estreacutes a traveacutes de la siacutentesis de corticosteroides (principalmente cortisol) y catecolaminas (adrenalina sobre todo)

Capas de la glaacutendula suprarrenal

Introduccioacuten

Anatoacutemicamente las glaacutendulas suprarrenales estaacuten separadas situadas en la cara anterosuperior de los rintildeones y estaacuten irrigadas por la sangre que reciben de las suprarrenales (las suprarrenales superiores las suprarrenales medias y las suprarrenales inferiores) Estaacuten formadas por estructuras diferentes que son la meacutedula suprarrenal y la corteza suprarrenal ambas inervadas por el sistema nervioso autoacutenomo Como su nombre sugiere la meacutedula suprarrenal estaacute situada dentro de la glaacutendula rodeada por la corteza suprarrenal que forma la superficie

Meacutedula suprarrenal La suprarrenal o meacutedula adrenal estaacute compuesta principalmente por ceacutelulas cromafines productoras de hormonas siendo el principal oacutergano de conversioacuten del aminoaacutecido tirosina en catecolaminas epinefrina y norepinefrina tambieacuten llamadas adrenalina y noradrenalina respectivamente Las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal derivan embrioloacutegicamente de la cresta neural como neuronas modificadas Realmente estas ceacutelulas son ceacutelulas postganglionares del sistema nervioso simpaacutetico que reciben la inervacioacuten de ceacutelulas preganglionares Como las sinapsis entre fibras pre y postganglionares seon ganglios nerviosos autonoacutemicos la meacutedula suprarrenal puede considerarse como un ganglio nervioso del sistema nervioso simpaacutetico

En respuesta a una situacioacuten estresante como es el ejercicio fiacutesico o un peligro inminente las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal producen catecolaminas a la sangre en una relacioacuten 70 a 30 de epinefrina y norepinefrina respectivamente

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ENDOCRINOLOGIA

La epinefrina produce efectos importantes como el aumento de la frecuencia cardiacuteaca vasoconstriccioacuten broncodilatacioacuten y aumento del metabolismo que son respuestas muy fugaces

Corteza suprarrenal

La corteza suprarrenal o corteza adrenal estaacute situada rodeando la circunferencia de la glaacutendula suprarrenal Su funcioacuten es la de regular varios componentes del metabolismo con la produccioacuten de mineralcorticoides y glucocorticoides que incluyen a la aldosterona y cortisol La corteza suprarrenal tambieacuten es un lugar secundario de siacutentesis de androacutegenos

La corteza suprarrenal secreta hormonas esteroideas (de naturaleza lipidica) por lo que sus ceacutelulas presentan abundante REL (reticulo endoplasmaacutetico liso) y mitocondrias con crestas longitudinales al MET Se dispone en tres capas diferentes de tejido basado en los tipos celulares y la funcioacuten que realizan

Zona glomerular Produccioacuten de mineralocorticoides sobre todo aldosterona

Zona fascicular Produccioacuten de glucocorticoides principalmente cortisol cerca del 95

Zona reticular Produccioacuten de androacutegenos incluyendo testosterona

Zona glomerular

Las ceacutelulas de la zona glomerular de la corteza suprarrenal segregan mineralocorticoides como la aldosterona y la desoxicorticosterona en respuesta a un aumento de los niveles de potasio o descenso del flujo de sangre en los rintildeones La aldosterona es liberada a la sangre formando parte del sistema renina-angiotensina que regula la concentracioacuten de electrolitos en la sangre sobre todo de sodio y potasio actuando en el tuacutebulo contorneado distal de la nefrona de los rintildeones

Aumentando la excrecioacuten de potasio Aumentando la reabsorcioacuten de sodio

La Aldosterona es una hormona que ayuda a regular la presioacuten osmoacutetica de mi organismo Por ejemplo si en el plasma sanguiacuteneo hay una escasez de sales ([osmolaridad] baja) se secretaraacute mayor cantidad de Aldosterona para reabsorber maacutes sodio y por consiguiente normalizar los niveles Lo mismo si hay una concentracioacuten muy elevada de sales en la sangre (osmolaridad alta) se secretaraacute menos o se inhibiraacute la secrecioacuten de Aldosterona para no tener que reabsorber el Sodio y por consiguiente eliminarlo normalizando las concentraciones

Zona fascicular

Capa predominante en la corteza suprarrenal cuyas celulas se disponen en hileras separadas por tabiques y capilares Sus ceacutelulas se llaman espongiocitos

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porque son voluminosas y contienen numerosos granulos claros dando a su superficie un aspecto de esponja Estas ceacutelulas segregan glucocorticoides como el cortisol o hidrocortisona y la cortisona al ser estimuladas por la hormona adrenocorticotropica (ACTH) La ACTH es producida por la hipoacutefisis en respuesta al factor hipotalaacutemico estimulante de corticotropina (CRH) Estos tres oacuterganos del sistema endocrino forman el eje hipotaacutelamo-hipofisario-suprarrenal

El principal glucocorticoide producido por las glaacutendulas suprarrenales es el cortisol que cumple diferentes funciones en el metabolismo en muacuteltiples ceacutelulas del organismo como

Estimulacioacuten de la produccioacuten de aminoaacutecidos por el cuerpo rompiendo proteiacutenas proteoacutelisis

Estimulacioacuten de la lipoacutelisis es decir rompiendo la grasa

Estimulacioacuten gluconeogeacutenesis la produccioacuten de glucosa a partir de nuevas fuentes como los aminaacutecidos y la glicerina de los aacutecidos grasos

Mantenimiento de la glucosa inhibiendo su liberacioacuten desde el muacutesculo y del tejido adiposo

Los glucocorticoides aumentan las concentraciones de glucosa en sangre pues actuacutean como antagonistas de la insulina e inhiben su liberacioacuten lo que produce una disminucioacuten de la captacioacuten de glucosa por los tejidos esto favorece que aumente la siacutentesis de glucosa en el hiacutegado y aumente la cantidad de glucoacutegeno en este mismo

Los glucocorticoides tambieacuten tienen propiedades antiinflamatorias que estaacuten relacionadas con sus efectos sobre la microcirculacioacuten y la inhibicioacuten de las citocinas pro-inflamatorias (IL-1 e IL-6) prostaglandinas y linfocinas Por lo tanto regulan las respuestas inmunitarias a traveacutes del llamado eje inmunosuprarrenal

Tambieacuten el cortisol tiene efectos importantes sobre la regulacioacuten del agua corporal retrasando la entrada de este liacutequido del espacio extracelular al intracelular Por lo que favorece la eliminacioacuten renal de agua

El cortisol inhibe la secrecioacuten de la propiomelanocortina (precursor de ACTH) de la CRH (Hormona liberadora de Corticotropina producida por las ceacutelulas de la eminencia media del hipotaacutelamo) y de Vasopresina

Zona reticular

Es la maacutes interna y presenta ceacutelulas dispuestas en cordones entrecruzados o anastomosados que segregan esteroides sexuales como estroacutegenos y androacutegenos

Las ceacutelulas de la zona reticular producen una fuente secundaria de androacutegenos como testosterona dihidrotestosterona (DHT) androstendiona y

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dehidroepiandrosterona (DHEA) Estas hormonas aumentan la masa muscular estimulan el crecimiento celular y ayudan al desarrollo de los caracteres sexuales secundarios

Paacutencreas

El paacutencreas oacutergano que segrega enzimas digestivas que pasan al intestino delgado Estas enzimas ayudan en la ruptura de carbohidratos liacutepidos proteinas y aacutecidos nucleacuteicos en el quimo Tiene forma coacutenica con un proceso uniforme medial e inferior En la especie humana su longitud oscila entre 20 y 30 cm tiene una anchura de unos 4 cm y un grosor de 5 centiacutemetros con un peso 30g La cabeza se localiza en la concavidad del duodeno o asa duodenal formada por la segunda porcioacuten del duodeno

Histologiacutea del paacutencreas

El paacutencreas tiene una parte exocrina y una parte endocrina

La parte exocrina contiene unas glaacutendulas llamadas aacutecinos serosos que son redondos u ovalados con ceacutelulas epiteliales Formados por las celuacutelas acinosas y en parte por las centroacinosas

La parte endocrina se agrupa en islotes de Langerhans que consisten en cuacutemulos de ceacutelulas secretoras de hormonas que producen insulina glucagoacuten y somatostatina Estos tipos de ceacutelulas son los siguientes

Ceacutelula alfa (Alfa cell)

Estas ceacutelulas alfa sintetizan y liberan glucagoacuten El glucagoacuten aumenta el nivel de glucosa sanguiacutenea al estimular la formacioacuten de este carbohidrato a partir del glucoacutegeno almacenado en hepatocitos Tambieacuten ejerce efecto en el metabolismo de proteiacutenas y grasas La liberacioacuten del glucagoacuten es inhibida por la hiperglucemia Representan entre el 10 - 20 del volumen del islote y se distribuyen de forma perifeacuterica

Ceacutelula beta (Beta Cell)

Las ceacutelulas beta producen y liberan insulina hormona que regula el nivel de glucosa en la sangre (facilitando el uso de glucosa por parte de las ceacutelulas y retirando el exceso de glucosa que se almacena en el hiacutegado en forma de glucoacutegeno)

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En los diabeacuteticos tipo I las ceacutelulas beta han sido dantildeadas y no son capaces de producir la hormona

Ceacutelula delta (Delta Cell)

Las ceacutelulas delta producen somatostatina hormona que se cree que regulariacutea la produccioacuten y liberacioacuten de la insulina por las ceacutelulas beta y la produccioacuten y liberacioacuten de glucagoacuten por las ceacutelulas alfa

Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)

Estas ceacutelulas hacen que el estoacutemago produzca y libere la hormona Grelina

Ceacutelula F (PP CELL)

Estas ceacutelulas producen y liberan Polipeacuteptido Pancreaacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

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ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

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ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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ENDOCRINOLOGIA

Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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ENDOCRINOLOGIA

5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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ENDOCRINOLOGIA

2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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ENDOCRINOLOGIA

52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

Trabajo final Paacutegina 51

ENDOCRINOLOGIA

BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

Trabajo final Paacutegina 52

ENDOCRINOLOGIA

Trabajo final Paacutegina 53

  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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Page 12: Trabajo Final Endocrinologia

ENDOCRINOLOGIA

supraquiasmaacutetico regulacioacuten del ciclo circadiano

ventromedial centro de la saciedad

arcuato interviene en la conducta emocional y actividad endoacutecrina

mamilar funcioacuten simpaacutetica

hipotalaacutemico posterior participan en la memoria

Funciones

El hipotaacutelamo regula el hambre el apetito y la saciedad por medio de hormonas y peacuteptidos como la colecistoquinina el nivel de glucosa y aacutecidos grasos en sangre y el neuropeacuteptido Y entre otros

El hipotaacutelamo anterior o rostral (parasimpaacutetico) disipa (difunde) el calor y el hipotaacutelamo posterior o caudal (simpaacutetico) se encarga de mantener la temperatura corporal constante5 aumentando o disminuyendo la frecuencia respiratoria y la sudoracioacuten

La porcioacuten anterior y posterior del hipotaacutelamo regula el ciclo del suentildeo y de la vigilia (ritmo circadiano)

Hormonas

El hipotaacutelamo en cuanto oacutergano endocrino se ocupa de liberar factores liberadores o inhibidores a la sangre pero tambieacuten es capaz de producir neurohormonas listas para su secrecioacuten

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ENDOCRINOLOGIA

Neurohormonas

El hipotaacutelamo produce en los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares la ADH (hormona antidiureacutetica) o vasopresina la cual se acumula en la neurohipoacutefisis desde donde es secretada La vasopresina regula el balance de agua en el cuerpo actuando sobre los rintildeones Esta hormona se almacena en la hipoacutefisis posterior de donde es liberada La disfuncioacuten del hipotaacutelamo en la produccioacuten de ADH causa diabetes insiacutepida

La oxitocina es tambieacuten producida por el hipotaacutelamo y almacenada y liberada por la neurohipoacutefisis tambieacuten comparte similitudes en su estructura proteiacutenica y llegan a compartir algunas funciones En el caso de los hombres se desconoce su funcionalidad pero se la asocia con los genitales externos y con receptores de la vesiacutecula seminal

En el caso de las mujeres la oxitocina acelera el nuacutemero de contracciones en el parto e influye al uacutetero a que se reacomode despueacutes del parto Tambieacuten incita a las fibras musculares que rodean a las ceacutelulas secretoras de leche de las glaacutendulas mamarias a secretar leche en respuesta al acto de mamar del nintildeo

Factores hipotalaacutemicos

Aparte de las dos hormonas de accioacuten directa mencionadas el hipotaacutelamo secreta diversas hormonas o factores que regulan la secrecioacuten de hormonas hipofisarias

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ENDOCRINOLOGIA

Hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH LHRH o LHRF) Es un decapeacuteptido (una cadena de 10 aminoaacutecidos) que actuacutea sobre la hipoacutefisis estimulando la produccioacuten y la liberacioacuten de la hormona luteinizante (LH) y la hormona foliculoestimulante (FSH) El balance de estas hormonas coordina el ciclo menstrual femenino y la espermatogeacutenesis en los hombres

Hormona liberadora de tirotropina (TRH) Es un tripeacuteptido (moleacutecula compuesta por tres aminoaacutecidos) Estimula la secrecioacuten de prolactina (PRL) y de tirotropina (TSH) por parte de la adenohipoacutefisis

Corte sagital medio del cerebro El punto blanco en frente del hipotaacutelamo es el quiasma oacuteptico debajo del cual estaacute la pituitaria La liacutenea blanca entre la pituitaria y el espacio negro es la silla turca (hueso)

Hormona liberadora de corticotropina (CRH o CRF) Se sintetiza en los nuacutecleos paraventriculares a partir de un precursor polipeptiacutedico de unos 41aminoaacutecidos y posee una vida larga (minutos) Las neuronas secretoras se encuentran en la porcioacuten anterior de los nuacutecleos paraventriculares y sus axones terminan en la capa externa de la eminencia media Estimula la liberacioacuten de adrenocorticotropina (ACTH) y β-endorfina por parte de la adenohipoacutefisis La hormona antidiureacutetica y la angiotensina II potencian el efecto liberador de CRH

Somatocrinina hormona liberadora de somatotropina (STH) o factor liberador de hormona del crecimiento (GRF) Las neuronas productoras de este factor se encuentran en el nuacutecleo arcuato del hipotaacutelamo Se sintetiza a partir de un precursor de 107 o 108 aminoaacutecidos Estimula la liberacioacuten de la hormona del crecimiento hipofisaria (GH)

Somatostatina u hormona inhibidora de la liberacioacuten de somatotropina (GIH) Como su nombre indica inhibe la secrecioacuten de somatotropinay de otras hormonas como la insulina el glucagoacuten el polipeacuteptido pancreaacutetico y la TSH La zona secretora se encuentra en la regioacuten periventricular del hipotaacutelamo Es un tetradecapeacuteptido que se encuentra en el hipotaacutelamo y en las ceacutelulas D de los islotes de Langerhans Su precursor posee 116 aminoaacutecidos Hormona liberadora de corticotropina

PIF (Factor inhibidor de la liberacioacuten de prolactina) Actuacutea en forma constante inhibiendo la secrecioacuten de prolactina hipofisaria Dado que la dopamina inhibe tambieacuten la produccioacuten de prolactina al unirse a las

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ENDOCRINOLOGIA

ceacutelulas lactotropas de la hipoacutefisis durante alguacuten tiempo se pensoacute que se trataba de PIF la dopamina puede ser un PIF secundario Las neuronas secretoras de PIF se encuentran en el nuacutecleo arcuato hipotalaacutemico

Angiotensina II (AII) Es un octapeacuteptido que estimula la accioacuten de la hormona liberadora de corticotropina libera algo de adrenocorticotropina hipofisaria

Hormona tiroidea

Las hormonas tiroideas son producidas por la glaacutendula tiroides Su efecto es el aumento del metabolismo basal lo cual es indispensable para un correcto desarrollo fetal y el funcionamiento adecuado de los sistemas cardiovascular musculoesqueleacutetico hematopoyeacutetico asiacute como para respuestas corporales adecuadas en cuanto a produccioacuten de calor consumo de oxiacutegeno y regulacioacuten de otros sistemas hormonales

Tipos de hormona tiroidea

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ENDOCRINOLOGIA

T4 T3

Existen tres hormonas circulantescirculantesco grande

T4 tetrayodotironina o tiroxina T3 o triyodotironina

T3 reversa Esta es bioloacutegicamente inactiva

Los niveles plasmaacuteticos de estas hormonas se mantienen estables durante toda la vida con excepcioacuten del periacuteodo neonatal y en algunas enfermedades o con el uso de algunos faacutermacos

Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas

Los yoduros que se ingieren en los alimentos y en el agua son concentrados de forma activa por la glaacutendula tiroides convertidos a yodo orgaacutenico por la peroxidasa tiroidea e incorporados a la tirosina en la tiroglobulina intrafolicular contenida en el coloide de la superficie apical de la ceacutelula folicular del tiroides

Las tirosinas son yodadas en un lugar (monoyodotirosina) o en dos (diyodotirosina) y se acoplan para formar las hormonas activas

diyodotirosina + diyodotirosina (r) --gt tetrayodotironina [tiroxina T4] diyodotirosina + monoyodotirosina( r) --gt triyodotironina [T3]

Otra fuente de T3 en el interior de la glaacutendula tiroides es el producto de la monodesyodacioacuten del anillo externo de la T4 por una selenoenzima la desyodasa tipo I (5-D-I) Esta enzima se encuentra tambieacuten en el hiacutegado y los rintildeones La T3 resultante pasa a la circulacioacuten Tambieacuten existe una isoenzima que efectuacutea la misma reaccioacuten llamada desyodasa tipo II que se encuentra en el cerebro y la hipoacutefisis La T3 resultante actuacutea localmente2

La tiroglobulina una glucoproteiacutena que contiene T3 y T4 en su matriz es captada por el foliacuteculo en forma de gotitas de coloide por las ceacutelulas tiroideas

Todas las reacciones necesarias para la formacioacuten de T3 y T4 son influidas y controladas por la hormona estimulante del tiroides (TSH) llamada tambieacuten tirotropina que estimula las ceacutelulas foliculares en la glaacutendula tiroides

Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas se metabolizan principalmente en el hiacutegado Producto de una conjugacioacuten con los aacutecidos glucoroacutenico y sulfuacuterico por medio de un grupo hidroxilo fenoacutelico se genera una forma excretable a traveacutes de la bilis

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ENDOCRINOLOGIA

Una parte de los productos conjugados eliminados por la bilis se hidroliza y se absorbe como hormona activa en el intestino Es un fenoacutemeno conocido como circulacioacuten enterohepaacutetica El resto se elimina por las heces

En la circulacioacuten sanguiacutenea la T4 se metaboliza a T3 y T3 reversa las que a su vez se desyodan produceacutendose diyodotironinas inactivas

Efectos de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas tienen dos efectos fisioloacutegicos principales

1 Aumentan la siacutentesis de proteiacutenas praacutecticamente en todos los tejidos del organismo (La T3 y la T4 penetran en las ceacutelulas donde la T3 que se obtiene de la circulacioacuten y por la conversioacuten de T4 en T3 dentro de la ceacutelula se une a receptores nucleares individuales e influye sobre la formacioacuten de ARNm)

2 La T3 incrementa el consumo de oxiacutegeno mediante el aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa (bomba sodio-potasio) sobre todo en los tejidos responsables del consumo basal de oxiacutegeno (es decir hiacutegado rintildeoacuten corazoacuten y muacutesculo esqueleacutetico) El aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa es secundario al incremento de la siacutentesis de esta enzima por consiguiente el aumento del consumo de oxiacutegeno probablemente tambieacuten estaacute relacionado con la fijacioacuten nuclear de hormonas tiroideas No obstante no se ha descartado un efecto directo de la T3 sobre la mitocondria Se cree que la T3 es la hormona tiroidea activa aunque la misma T4 pueda ser bioloacutegicamente activa

Efectos fisioloacutegicos

Desarrollo normal del sistema nervioso central en el feto Funcionamiento normal del sistema nervioso central Su falta enlentece

su funcionamiento

Generacioacuten de calor

Efectos cronotroacutepico e inotroacutepico en el sistema cardiovascular

Aumenta el nuacutemero de receptores para catecolaminas y amplifica la respuesta postreceptor en el sistema simpaacutetico3

Aumenta la eritropoyetina

Regula el metabolismo oacuteseo

Permite la relajacioacuten muscular

Interviene en los niveles de produccioacuten de hormonas gonadotrofinas y somatotropa o GH

Permite la correcta respuesta del centro respiratorio a la hipoxia e hipercapnia

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ENDOCRINOLOGIA

Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma

Las hormonas tiroideas circulan unidas a proteiacutenas plasmaacuteticas Un porcentaje bajo de T4 y T3 circula libremente por la sangre y es de este porcentaje bajo de hormona que depende la accioacuten hormonal sobre los receptores celulares

Las proteiacutenas a las que se unen las hormonas tiroideas son

Globulina transportadora de tiroxina o TBG (del ingleacutes Thyroxin Binding Globulin)

Prealbuacutemina transportadora de tiroxina o TBPA (del ingleacutes Thyroxin Binding Pre Albumin)

Albuacutemina

Ya que existen factores que afectan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas mencionadas modificando la cantidad de hormona libre es muy importante medir la hormona libre en el plasma para evaluar la condicioacuten fisiopatoloacutegica en estudio

Por ejemplo los siguientes faacutermacos compiten con las hormonas tiroideas por su unioacuten con las proteiacutenas transportadoras

Salicilatos Hidantoiacutenas

Algunos antiinflamatorios no esteroideos como el Diclofenaco y el aacutecido mefenaacutemico

Furosemida

Por el contrario los siguientes faacutermacos incrementan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas transportadoras

Estroacutegenos Metadona

Clofibrato

Heroiacutena

Tamoxifeno

En el embarazo tambieacuten se modifica la afinidad de las hormonas tiroideas por las proteiacutenas transportadoras aumentando esta unioacuten y disminuyendo la hormona libre

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ENDOCRINOLOGIA

Paratiroides

Las glaacutendulas paratiroides son glaacutendulas endocrinas Situadas en el cuello generalmente localizadas en los polos De la glaacutendula tiroides que producen La hormona paratiroidea o paratohormona Por lo general hay cuatro glaacutendulas paratiroides Dos superiores y dos inferiores pero de forma ocasional puede haber cinco o maacutes Cuando existe alguna glaacutendula adicional eacutesta suele encontrarse en el mediastino en relacioacuten con el timo o dentro de la glaacutendula tiroides

La hormona paratiroidea participa en el control de la homeostasis del calcio y foacutesforo asiacute como en la fisiologiacutea del hueso

El exceso de funcioacuten de las glaacutendulas paratiroides se conoce como hiperparatiroidismo y suele cursar con elevacioacuten de los niveles plasmaacuteticos de calcio y fragilidad oacutesea que condiciona una mayor susceptibilidad a padecer fracturas La funcioacuten insuficiente de las glaacutendulas paratiroides (hipoparatiroidismo) es mucho menos frecuente y generalmente se presenta tras una cirugiacutea sobre la glaacutendula tiroides que conlleva la existencia de hipocalcemia Existen algunas enfermedades mucho maacutes raras que parecen deberse a alteraciones en el receptor de la hormona paratiroidea como la condroplasia metafiseal de Jansen y la condroplasia de Blomstrand

Hormona paratiroidea o parathormona Es secretada por las ceacutelulas principales de la glaacutendula paratiroides es un polipeacuteptido de 84 aminoaacutecidos cuyo peso molecular es de aproximadamente 9500 Daltons Facilita la absorcioacuten del calcio Vitamina D (en su forma natural) y fosfato conjuntamente en el intestino Aumenta la resorcioacuten de los huesos Mediante la produccioacuten de maacutes osteoclastos a partir de las ceacutelulas madre mesenquimatosas de la meacutedula oacutesea y retrasando la conversioacuten de estas en osteoblastos Los osteoclastos absorben el hueso mediante la liberacioacuten de hormonas proteoliacuteticas liberadas por lisosomas y la secrecioacuten de varios aacutecidos entre ellos el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido laacutectico Aumenta la reabsorcioacuten del calcio y reduce la resorcioacuten del fosfato en los tuacutebulos renales provocando que este salga en la orina en mayor concentracioacuten Aumenta la resorcioacuten del calcio en el intestino Induce un incremento en la formacioacuten del 125-dihidroxicolecalciferol (forma activa de la Vitamina D calitriol o Vitamina D3) a partir del 25-hidroxicolecalciferol (calcifediol) en los rintildeones la vitamina D3 luego actuacutea a nivel del epitelio intestinal aumentando la absorcioacuten del calcio aumentando asiacute los

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ENDOCRINOLOGIA

niveles de calcio plasmaacuteticos (valor normal del calcio plasmaacutetico 92-104 mgdl) Luego por un mecanismo de retroaccioacuten o retroalimentacioacuten negativa elevadas concentraciones de calcio plasmaacuteticos inhiben la secrecioacuten de la PTH (Hormona paratiroidea)ademaacutes ayuda a la reabsorcion del calcio por medio de los rintildeones

Calcitonina Secretada por las ceacutelulas parafoliculares en la Tiroides es un polipeacuteptido de 32 aminoaacutecidos con un peso molecular aproximado de 3000 Daltons aproximadamente Tiene una funcioacuten opuesta a la Hormona Paratiroidea disminuye la actividad osteoclaacutestica desacelera la formacioacuten de los osteoclastos y acelera la formacioacuten de osteoblastos (ceacutelulas encargadas de la formacioacuten del hueso)

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ENDOCRINOLOGIA

Glaacutendula suprarrenal

Las glaacutendulas con forma de triaacutengulo que estaacuten situadas encima de los rintildeones cuya funcioacuten es la de regular las respuestas al estreacutes a traveacutes de la siacutentesis de corticosteroides (principalmente cortisol) y catecolaminas (adrenalina sobre todo)

Capas de la glaacutendula suprarrenal

Introduccioacuten

Anatoacutemicamente las glaacutendulas suprarrenales estaacuten separadas situadas en la cara anterosuperior de los rintildeones y estaacuten irrigadas por la sangre que reciben de las suprarrenales (las suprarrenales superiores las suprarrenales medias y las suprarrenales inferiores) Estaacuten formadas por estructuras diferentes que son la meacutedula suprarrenal y la corteza suprarrenal ambas inervadas por el sistema nervioso autoacutenomo Como su nombre sugiere la meacutedula suprarrenal estaacute situada dentro de la glaacutendula rodeada por la corteza suprarrenal que forma la superficie

Meacutedula suprarrenal La suprarrenal o meacutedula adrenal estaacute compuesta principalmente por ceacutelulas cromafines productoras de hormonas siendo el principal oacutergano de conversioacuten del aminoaacutecido tirosina en catecolaminas epinefrina y norepinefrina tambieacuten llamadas adrenalina y noradrenalina respectivamente Las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal derivan embrioloacutegicamente de la cresta neural como neuronas modificadas Realmente estas ceacutelulas son ceacutelulas postganglionares del sistema nervioso simpaacutetico que reciben la inervacioacuten de ceacutelulas preganglionares Como las sinapsis entre fibras pre y postganglionares seon ganglios nerviosos autonoacutemicos la meacutedula suprarrenal puede considerarse como un ganglio nervioso del sistema nervioso simpaacutetico

En respuesta a una situacioacuten estresante como es el ejercicio fiacutesico o un peligro inminente las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal producen catecolaminas a la sangre en una relacioacuten 70 a 30 de epinefrina y norepinefrina respectivamente

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ENDOCRINOLOGIA

La epinefrina produce efectos importantes como el aumento de la frecuencia cardiacuteaca vasoconstriccioacuten broncodilatacioacuten y aumento del metabolismo que son respuestas muy fugaces

Corteza suprarrenal

La corteza suprarrenal o corteza adrenal estaacute situada rodeando la circunferencia de la glaacutendula suprarrenal Su funcioacuten es la de regular varios componentes del metabolismo con la produccioacuten de mineralcorticoides y glucocorticoides que incluyen a la aldosterona y cortisol La corteza suprarrenal tambieacuten es un lugar secundario de siacutentesis de androacutegenos

La corteza suprarrenal secreta hormonas esteroideas (de naturaleza lipidica) por lo que sus ceacutelulas presentan abundante REL (reticulo endoplasmaacutetico liso) y mitocondrias con crestas longitudinales al MET Se dispone en tres capas diferentes de tejido basado en los tipos celulares y la funcioacuten que realizan

Zona glomerular Produccioacuten de mineralocorticoides sobre todo aldosterona

Zona fascicular Produccioacuten de glucocorticoides principalmente cortisol cerca del 95

Zona reticular Produccioacuten de androacutegenos incluyendo testosterona

Zona glomerular

Las ceacutelulas de la zona glomerular de la corteza suprarrenal segregan mineralocorticoides como la aldosterona y la desoxicorticosterona en respuesta a un aumento de los niveles de potasio o descenso del flujo de sangre en los rintildeones La aldosterona es liberada a la sangre formando parte del sistema renina-angiotensina que regula la concentracioacuten de electrolitos en la sangre sobre todo de sodio y potasio actuando en el tuacutebulo contorneado distal de la nefrona de los rintildeones

Aumentando la excrecioacuten de potasio Aumentando la reabsorcioacuten de sodio

La Aldosterona es una hormona que ayuda a regular la presioacuten osmoacutetica de mi organismo Por ejemplo si en el plasma sanguiacuteneo hay una escasez de sales ([osmolaridad] baja) se secretaraacute mayor cantidad de Aldosterona para reabsorber maacutes sodio y por consiguiente normalizar los niveles Lo mismo si hay una concentracioacuten muy elevada de sales en la sangre (osmolaridad alta) se secretaraacute menos o se inhibiraacute la secrecioacuten de Aldosterona para no tener que reabsorber el Sodio y por consiguiente eliminarlo normalizando las concentraciones

Zona fascicular

Capa predominante en la corteza suprarrenal cuyas celulas se disponen en hileras separadas por tabiques y capilares Sus ceacutelulas se llaman espongiocitos

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ENDOCRINOLOGIA

porque son voluminosas y contienen numerosos granulos claros dando a su superficie un aspecto de esponja Estas ceacutelulas segregan glucocorticoides como el cortisol o hidrocortisona y la cortisona al ser estimuladas por la hormona adrenocorticotropica (ACTH) La ACTH es producida por la hipoacutefisis en respuesta al factor hipotalaacutemico estimulante de corticotropina (CRH) Estos tres oacuterganos del sistema endocrino forman el eje hipotaacutelamo-hipofisario-suprarrenal

El principal glucocorticoide producido por las glaacutendulas suprarrenales es el cortisol que cumple diferentes funciones en el metabolismo en muacuteltiples ceacutelulas del organismo como

Estimulacioacuten de la produccioacuten de aminoaacutecidos por el cuerpo rompiendo proteiacutenas proteoacutelisis

Estimulacioacuten de la lipoacutelisis es decir rompiendo la grasa

Estimulacioacuten gluconeogeacutenesis la produccioacuten de glucosa a partir de nuevas fuentes como los aminaacutecidos y la glicerina de los aacutecidos grasos

Mantenimiento de la glucosa inhibiendo su liberacioacuten desde el muacutesculo y del tejido adiposo

Los glucocorticoides aumentan las concentraciones de glucosa en sangre pues actuacutean como antagonistas de la insulina e inhiben su liberacioacuten lo que produce una disminucioacuten de la captacioacuten de glucosa por los tejidos esto favorece que aumente la siacutentesis de glucosa en el hiacutegado y aumente la cantidad de glucoacutegeno en este mismo

Los glucocorticoides tambieacuten tienen propiedades antiinflamatorias que estaacuten relacionadas con sus efectos sobre la microcirculacioacuten y la inhibicioacuten de las citocinas pro-inflamatorias (IL-1 e IL-6) prostaglandinas y linfocinas Por lo tanto regulan las respuestas inmunitarias a traveacutes del llamado eje inmunosuprarrenal

Tambieacuten el cortisol tiene efectos importantes sobre la regulacioacuten del agua corporal retrasando la entrada de este liacutequido del espacio extracelular al intracelular Por lo que favorece la eliminacioacuten renal de agua

El cortisol inhibe la secrecioacuten de la propiomelanocortina (precursor de ACTH) de la CRH (Hormona liberadora de Corticotropina producida por las ceacutelulas de la eminencia media del hipotaacutelamo) y de Vasopresina

Zona reticular

Es la maacutes interna y presenta ceacutelulas dispuestas en cordones entrecruzados o anastomosados que segregan esteroides sexuales como estroacutegenos y androacutegenos

Las ceacutelulas de la zona reticular producen una fuente secundaria de androacutegenos como testosterona dihidrotestosterona (DHT) androstendiona y

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ENDOCRINOLOGIA

dehidroepiandrosterona (DHEA) Estas hormonas aumentan la masa muscular estimulan el crecimiento celular y ayudan al desarrollo de los caracteres sexuales secundarios

Paacutencreas

El paacutencreas oacutergano que segrega enzimas digestivas que pasan al intestino delgado Estas enzimas ayudan en la ruptura de carbohidratos liacutepidos proteinas y aacutecidos nucleacuteicos en el quimo Tiene forma coacutenica con un proceso uniforme medial e inferior En la especie humana su longitud oscila entre 20 y 30 cm tiene una anchura de unos 4 cm y un grosor de 5 centiacutemetros con un peso 30g La cabeza se localiza en la concavidad del duodeno o asa duodenal formada por la segunda porcioacuten del duodeno

Histologiacutea del paacutencreas

El paacutencreas tiene una parte exocrina y una parte endocrina

La parte exocrina contiene unas glaacutendulas llamadas aacutecinos serosos que son redondos u ovalados con ceacutelulas epiteliales Formados por las celuacutelas acinosas y en parte por las centroacinosas

La parte endocrina se agrupa en islotes de Langerhans que consisten en cuacutemulos de ceacutelulas secretoras de hormonas que producen insulina glucagoacuten y somatostatina Estos tipos de ceacutelulas son los siguientes

Ceacutelula alfa (Alfa cell)

Estas ceacutelulas alfa sintetizan y liberan glucagoacuten El glucagoacuten aumenta el nivel de glucosa sanguiacutenea al estimular la formacioacuten de este carbohidrato a partir del glucoacutegeno almacenado en hepatocitos Tambieacuten ejerce efecto en el metabolismo de proteiacutenas y grasas La liberacioacuten del glucagoacuten es inhibida por la hiperglucemia Representan entre el 10 - 20 del volumen del islote y se distribuyen de forma perifeacuterica

Ceacutelula beta (Beta Cell)

Las ceacutelulas beta producen y liberan insulina hormona que regula el nivel de glucosa en la sangre (facilitando el uso de glucosa por parte de las ceacutelulas y retirando el exceso de glucosa que se almacena en el hiacutegado en forma de glucoacutegeno)

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ENDOCRINOLOGIA

En los diabeacuteticos tipo I las ceacutelulas beta han sido dantildeadas y no son capaces de producir la hormona

Ceacutelula delta (Delta Cell)

Las ceacutelulas delta producen somatostatina hormona que se cree que regulariacutea la produccioacuten y liberacioacuten de la insulina por las ceacutelulas beta y la produccioacuten y liberacioacuten de glucagoacuten por las ceacutelulas alfa

Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)

Estas ceacutelulas hacen que el estoacutemago produzca y libere la hormona Grelina

Ceacutelula F (PP CELL)

Estas ceacutelulas producen y liberan Polipeacuteptido Pancreaacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

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ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

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ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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ENDOCRINOLOGIA

Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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ENDOCRINOLOGIA

Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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ENDOCRINOLOGIA

AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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ENDOCRINOLOGIA

5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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ENDOCRINOLOGIA

52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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ENDOCRINOLOGIA

BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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ENDOCRINOLOGIA

Trabajo final Paacutegina 53

  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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ENDOCRINOLOGIA

Neurohormonas

El hipotaacutelamo produce en los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares la ADH (hormona antidiureacutetica) o vasopresina la cual se acumula en la neurohipoacutefisis desde donde es secretada La vasopresina regula el balance de agua en el cuerpo actuando sobre los rintildeones Esta hormona se almacena en la hipoacutefisis posterior de donde es liberada La disfuncioacuten del hipotaacutelamo en la produccioacuten de ADH causa diabetes insiacutepida

La oxitocina es tambieacuten producida por el hipotaacutelamo y almacenada y liberada por la neurohipoacutefisis tambieacuten comparte similitudes en su estructura proteiacutenica y llegan a compartir algunas funciones En el caso de los hombres se desconoce su funcionalidad pero se la asocia con los genitales externos y con receptores de la vesiacutecula seminal

En el caso de las mujeres la oxitocina acelera el nuacutemero de contracciones en el parto e influye al uacutetero a que se reacomode despueacutes del parto Tambieacuten incita a las fibras musculares que rodean a las ceacutelulas secretoras de leche de las glaacutendulas mamarias a secretar leche en respuesta al acto de mamar del nintildeo

Factores hipotalaacutemicos

Aparte de las dos hormonas de accioacuten directa mencionadas el hipotaacutelamo secreta diversas hormonas o factores que regulan la secrecioacuten de hormonas hipofisarias

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Hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH LHRH o LHRF) Es un decapeacuteptido (una cadena de 10 aminoaacutecidos) que actuacutea sobre la hipoacutefisis estimulando la produccioacuten y la liberacioacuten de la hormona luteinizante (LH) y la hormona foliculoestimulante (FSH) El balance de estas hormonas coordina el ciclo menstrual femenino y la espermatogeacutenesis en los hombres

Hormona liberadora de tirotropina (TRH) Es un tripeacuteptido (moleacutecula compuesta por tres aminoaacutecidos) Estimula la secrecioacuten de prolactina (PRL) y de tirotropina (TSH) por parte de la adenohipoacutefisis

Corte sagital medio del cerebro El punto blanco en frente del hipotaacutelamo es el quiasma oacuteptico debajo del cual estaacute la pituitaria La liacutenea blanca entre la pituitaria y el espacio negro es la silla turca (hueso)

Hormona liberadora de corticotropina (CRH o CRF) Se sintetiza en los nuacutecleos paraventriculares a partir de un precursor polipeptiacutedico de unos 41aminoaacutecidos y posee una vida larga (minutos) Las neuronas secretoras se encuentran en la porcioacuten anterior de los nuacutecleos paraventriculares y sus axones terminan en la capa externa de la eminencia media Estimula la liberacioacuten de adrenocorticotropina (ACTH) y β-endorfina por parte de la adenohipoacutefisis La hormona antidiureacutetica y la angiotensina II potencian el efecto liberador de CRH

Somatocrinina hormona liberadora de somatotropina (STH) o factor liberador de hormona del crecimiento (GRF) Las neuronas productoras de este factor se encuentran en el nuacutecleo arcuato del hipotaacutelamo Se sintetiza a partir de un precursor de 107 o 108 aminoaacutecidos Estimula la liberacioacuten de la hormona del crecimiento hipofisaria (GH)

Somatostatina u hormona inhibidora de la liberacioacuten de somatotropina (GIH) Como su nombre indica inhibe la secrecioacuten de somatotropinay de otras hormonas como la insulina el glucagoacuten el polipeacuteptido pancreaacutetico y la TSH La zona secretora se encuentra en la regioacuten periventricular del hipotaacutelamo Es un tetradecapeacuteptido que se encuentra en el hipotaacutelamo y en las ceacutelulas D de los islotes de Langerhans Su precursor posee 116 aminoaacutecidos Hormona liberadora de corticotropina

PIF (Factor inhibidor de la liberacioacuten de prolactina) Actuacutea en forma constante inhibiendo la secrecioacuten de prolactina hipofisaria Dado que la dopamina inhibe tambieacuten la produccioacuten de prolactina al unirse a las

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ENDOCRINOLOGIA

ceacutelulas lactotropas de la hipoacutefisis durante alguacuten tiempo se pensoacute que se trataba de PIF la dopamina puede ser un PIF secundario Las neuronas secretoras de PIF se encuentran en el nuacutecleo arcuato hipotalaacutemico

Angiotensina II (AII) Es un octapeacuteptido que estimula la accioacuten de la hormona liberadora de corticotropina libera algo de adrenocorticotropina hipofisaria

Hormona tiroidea

Las hormonas tiroideas son producidas por la glaacutendula tiroides Su efecto es el aumento del metabolismo basal lo cual es indispensable para un correcto desarrollo fetal y el funcionamiento adecuado de los sistemas cardiovascular musculoesqueleacutetico hematopoyeacutetico asiacute como para respuestas corporales adecuadas en cuanto a produccioacuten de calor consumo de oxiacutegeno y regulacioacuten de otros sistemas hormonales

Tipos de hormona tiroidea

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ENDOCRINOLOGIA

T4 T3

Existen tres hormonas circulantescirculantesco grande

T4 tetrayodotironina o tiroxina T3 o triyodotironina

T3 reversa Esta es bioloacutegicamente inactiva

Los niveles plasmaacuteticos de estas hormonas se mantienen estables durante toda la vida con excepcioacuten del periacuteodo neonatal y en algunas enfermedades o con el uso de algunos faacutermacos

Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas

Los yoduros que se ingieren en los alimentos y en el agua son concentrados de forma activa por la glaacutendula tiroides convertidos a yodo orgaacutenico por la peroxidasa tiroidea e incorporados a la tirosina en la tiroglobulina intrafolicular contenida en el coloide de la superficie apical de la ceacutelula folicular del tiroides

Las tirosinas son yodadas en un lugar (monoyodotirosina) o en dos (diyodotirosina) y se acoplan para formar las hormonas activas

diyodotirosina + diyodotirosina (r) --gt tetrayodotironina [tiroxina T4] diyodotirosina + monoyodotirosina( r) --gt triyodotironina [T3]

Otra fuente de T3 en el interior de la glaacutendula tiroides es el producto de la monodesyodacioacuten del anillo externo de la T4 por una selenoenzima la desyodasa tipo I (5-D-I) Esta enzima se encuentra tambieacuten en el hiacutegado y los rintildeones La T3 resultante pasa a la circulacioacuten Tambieacuten existe una isoenzima que efectuacutea la misma reaccioacuten llamada desyodasa tipo II que se encuentra en el cerebro y la hipoacutefisis La T3 resultante actuacutea localmente2

La tiroglobulina una glucoproteiacutena que contiene T3 y T4 en su matriz es captada por el foliacuteculo en forma de gotitas de coloide por las ceacutelulas tiroideas

Todas las reacciones necesarias para la formacioacuten de T3 y T4 son influidas y controladas por la hormona estimulante del tiroides (TSH) llamada tambieacuten tirotropina que estimula las ceacutelulas foliculares en la glaacutendula tiroides

Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas se metabolizan principalmente en el hiacutegado Producto de una conjugacioacuten con los aacutecidos glucoroacutenico y sulfuacuterico por medio de un grupo hidroxilo fenoacutelico se genera una forma excretable a traveacutes de la bilis

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ENDOCRINOLOGIA

Una parte de los productos conjugados eliminados por la bilis se hidroliza y se absorbe como hormona activa en el intestino Es un fenoacutemeno conocido como circulacioacuten enterohepaacutetica El resto se elimina por las heces

En la circulacioacuten sanguiacutenea la T4 se metaboliza a T3 y T3 reversa las que a su vez se desyodan produceacutendose diyodotironinas inactivas

Efectos de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas tienen dos efectos fisioloacutegicos principales

1 Aumentan la siacutentesis de proteiacutenas praacutecticamente en todos los tejidos del organismo (La T3 y la T4 penetran en las ceacutelulas donde la T3 que se obtiene de la circulacioacuten y por la conversioacuten de T4 en T3 dentro de la ceacutelula se une a receptores nucleares individuales e influye sobre la formacioacuten de ARNm)

2 La T3 incrementa el consumo de oxiacutegeno mediante el aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa (bomba sodio-potasio) sobre todo en los tejidos responsables del consumo basal de oxiacutegeno (es decir hiacutegado rintildeoacuten corazoacuten y muacutesculo esqueleacutetico) El aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa es secundario al incremento de la siacutentesis de esta enzima por consiguiente el aumento del consumo de oxiacutegeno probablemente tambieacuten estaacute relacionado con la fijacioacuten nuclear de hormonas tiroideas No obstante no se ha descartado un efecto directo de la T3 sobre la mitocondria Se cree que la T3 es la hormona tiroidea activa aunque la misma T4 pueda ser bioloacutegicamente activa

Efectos fisioloacutegicos

Desarrollo normal del sistema nervioso central en el feto Funcionamiento normal del sistema nervioso central Su falta enlentece

su funcionamiento

Generacioacuten de calor

Efectos cronotroacutepico e inotroacutepico en el sistema cardiovascular

Aumenta el nuacutemero de receptores para catecolaminas y amplifica la respuesta postreceptor en el sistema simpaacutetico3

Aumenta la eritropoyetina

Regula el metabolismo oacuteseo

Permite la relajacioacuten muscular

Interviene en los niveles de produccioacuten de hormonas gonadotrofinas y somatotropa o GH

Permite la correcta respuesta del centro respiratorio a la hipoxia e hipercapnia

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Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma

Las hormonas tiroideas circulan unidas a proteiacutenas plasmaacuteticas Un porcentaje bajo de T4 y T3 circula libremente por la sangre y es de este porcentaje bajo de hormona que depende la accioacuten hormonal sobre los receptores celulares

Las proteiacutenas a las que se unen las hormonas tiroideas son

Globulina transportadora de tiroxina o TBG (del ingleacutes Thyroxin Binding Globulin)

Prealbuacutemina transportadora de tiroxina o TBPA (del ingleacutes Thyroxin Binding Pre Albumin)

Albuacutemina

Ya que existen factores que afectan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas mencionadas modificando la cantidad de hormona libre es muy importante medir la hormona libre en el plasma para evaluar la condicioacuten fisiopatoloacutegica en estudio

Por ejemplo los siguientes faacutermacos compiten con las hormonas tiroideas por su unioacuten con las proteiacutenas transportadoras

Salicilatos Hidantoiacutenas

Algunos antiinflamatorios no esteroideos como el Diclofenaco y el aacutecido mefenaacutemico

Furosemida

Por el contrario los siguientes faacutermacos incrementan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas transportadoras

Estroacutegenos Metadona

Clofibrato

Heroiacutena

Tamoxifeno

En el embarazo tambieacuten se modifica la afinidad de las hormonas tiroideas por las proteiacutenas transportadoras aumentando esta unioacuten y disminuyendo la hormona libre

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ENDOCRINOLOGIA

Paratiroides

Las glaacutendulas paratiroides son glaacutendulas endocrinas Situadas en el cuello generalmente localizadas en los polos De la glaacutendula tiroides que producen La hormona paratiroidea o paratohormona Por lo general hay cuatro glaacutendulas paratiroides Dos superiores y dos inferiores pero de forma ocasional puede haber cinco o maacutes Cuando existe alguna glaacutendula adicional eacutesta suele encontrarse en el mediastino en relacioacuten con el timo o dentro de la glaacutendula tiroides

La hormona paratiroidea participa en el control de la homeostasis del calcio y foacutesforo asiacute como en la fisiologiacutea del hueso

El exceso de funcioacuten de las glaacutendulas paratiroides se conoce como hiperparatiroidismo y suele cursar con elevacioacuten de los niveles plasmaacuteticos de calcio y fragilidad oacutesea que condiciona una mayor susceptibilidad a padecer fracturas La funcioacuten insuficiente de las glaacutendulas paratiroides (hipoparatiroidismo) es mucho menos frecuente y generalmente se presenta tras una cirugiacutea sobre la glaacutendula tiroides que conlleva la existencia de hipocalcemia Existen algunas enfermedades mucho maacutes raras que parecen deberse a alteraciones en el receptor de la hormona paratiroidea como la condroplasia metafiseal de Jansen y la condroplasia de Blomstrand

Hormona paratiroidea o parathormona Es secretada por las ceacutelulas principales de la glaacutendula paratiroides es un polipeacuteptido de 84 aminoaacutecidos cuyo peso molecular es de aproximadamente 9500 Daltons Facilita la absorcioacuten del calcio Vitamina D (en su forma natural) y fosfato conjuntamente en el intestino Aumenta la resorcioacuten de los huesos Mediante la produccioacuten de maacutes osteoclastos a partir de las ceacutelulas madre mesenquimatosas de la meacutedula oacutesea y retrasando la conversioacuten de estas en osteoblastos Los osteoclastos absorben el hueso mediante la liberacioacuten de hormonas proteoliacuteticas liberadas por lisosomas y la secrecioacuten de varios aacutecidos entre ellos el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido laacutectico Aumenta la reabsorcioacuten del calcio y reduce la resorcioacuten del fosfato en los tuacutebulos renales provocando que este salga en la orina en mayor concentracioacuten Aumenta la resorcioacuten del calcio en el intestino Induce un incremento en la formacioacuten del 125-dihidroxicolecalciferol (forma activa de la Vitamina D calitriol o Vitamina D3) a partir del 25-hidroxicolecalciferol (calcifediol) en los rintildeones la vitamina D3 luego actuacutea a nivel del epitelio intestinal aumentando la absorcioacuten del calcio aumentando asiacute los

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niveles de calcio plasmaacuteticos (valor normal del calcio plasmaacutetico 92-104 mgdl) Luego por un mecanismo de retroaccioacuten o retroalimentacioacuten negativa elevadas concentraciones de calcio plasmaacuteticos inhiben la secrecioacuten de la PTH (Hormona paratiroidea)ademaacutes ayuda a la reabsorcion del calcio por medio de los rintildeones

Calcitonina Secretada por las ceacutelulas parafoliculares en la Tiroides es un polipeacuteptido de 32 aminoaacutecidos con un peso molecular aproximado de 3000 Daltons aproximadamente Tiene una funcioacuten opuesta a la Hormona Paratiroidea disminuye la actividad osteoclaacutestica desacelera la formacioacuten de los osteoclastos y acelera la formacioacuten de osteoblastos (ceacutelulas encargadas de la formacioacuten del hueso)

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Glaacutendula suprarrenal

Las glaacutendulas con forma de triaacutengulo que estaacuten situadas encima de los rintildeones cuya funcioacuten es la de regular las respuestas al estreacutes a traveacutes de la siacutentesis de corticosteroides (principalmente cortisol) y catecolaminas (adrenalina sobre todo)

Capas de la glaacutendula suprarrenal

Introduccioacuten

Anatoacutemicamente las glaacutendulas suprarrenales estaacuten separadas situadas en la cara anterosuperior de los rintildeones y estaacuten irrigadas por la sangre que reciben de las suprarrenales (las suprarrenales superiores las suprarrenales medias y las suprarrenales inferiores) Estaacuten formadas por estructuras diferentes que son la meacutedula suprarrenal y la corteza suprarrenal ambas inervadas por el sistema nervioso autoacutenomo Como su nombre sugiere la meacutedula suprarrenal estaacute situada dentro de la glaacutendula rodeada por la corteza suprarrenal que forma la superficie

Meacutedula suprarrenal La suprarrenal o meacutedula adrenal estaacute compuesta principalmente por ceacutelulas cromafines productoras de hormonas siendo el principal oacutergano de conversioacuten del aminoaacutecido tirosina en catecolaminas epinefrina y norepinefrina tambieacuten llamadas adrenalina y noradrenalina respectivamente Las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal derivan embrioloacutegicamente de la cresta neural como neuronas modificadas Realmente estas ceacutelulas son ceacutelulas postganglionares del sistema nervioso simpaacutetico que reciben la inervacioacuten de ceacutelulas preganglionares Como las sinapsis entre fibras pre y postganglionares seon ganglios nerviosos autonoacutemicos la meacutedula suprarrenal puede considerarse como un ganglio nervioso del sistema nervioso simpaacutetico

En respuesta a una situacioacuten estresante como es el ejercicio fiacutesico o un peligro inminente las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal producen catecolaminas a la sangre en una relacioacuten 70 a 30 de epinefrina y norepinefrina respectivamente

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ENDOCRINOLOGIA

La epinefrina produce efectos importantes como el aumento de la frecuencia cardiacuteaca vasoconstriccioacuten broncodilatacioacuten y aumento del metabolismo que son respuestas muy fugaces

Corteza suprarrenal

La corteza suprarrenal o corteza adrenal estaacute situada rodeando la circunferencia de la glaacutendula suprarrenal Su funcioacuten es la de regular varios componentes del metabolismo con la produccioacuten de mineralcorticoides y glucocorticoides que incluyen a la aldosterona y cortisol La corteza suprarrenal tambieacuten es un lugar secundario de siacutentesis de androacutegenos

La corteza suprarrenal secreta hormonas esteroideas (de naturaleza lipidica) por lo que sus ceacutelulas presentan abundante REL (reticulo endoplasmaacutetico liso) y mitocondrias con crestas longitudinales al MET Se dispone en tres capas diferentes de tejido basado en los tipos celulares y la funcioacuten que realizan

Zona glomerular Produccioacuten de mineralocorticoides sobre todo aldosterona

Zona fascicular Produccioacuten de glucocorticoides principalmente cortisol cerca del 95

Zona reticular Produccioacuten de androacutegenos incluyendo testosterona

Zona glomerular

Las ceacutelulas de la zona glomerular de la corteza suprarrenal segregan mineralocorticoides como la aldosterona y la desoxicorticosterona en respuesta a un aumento de los niveles de potasio o descenso del flujo de sangre en los rintildeones La aldosterona es liberada a la sangre formando parte del sistema renina-angiotensina que regula la concentracioacuten de electrolitos en la sangre sobre todo de sodio y potasio actuando en el tuacutebulo contorneado distal de la nefrona de los rintildeones

Aumentando la excrecioacuten de potasio Aumentando la reabsorcioacuten de sodio

La Aldosterona es una hormona que ayuda a regular la presioacuten osmoacutetica de mi organismo Por ejemplo si en el plasma sanguiacuteneo hay una escasez de sales ([osmolaridad] baja) se secretaraacute mayor cantidad de Aldosterona para reabsorber maacutes sodio y por consiguiente normalizar los niveles Lo mismo si hay una concentracioacuten muy elevada de sales en la sangre (osmolaridad alta) se secretaraacute menos o se inhibiraacute la secrecioacuten de Aldosterona para no tener que reabsorber el Sodio y por consiguiente eliminarlo normalizando las concentraciones

Zona fascicular

Capa predominante en la corteza suprarrenal cuyas celulas se disponen en hileras separadas por tabiques y capilares Sus ceacutelulas se llaman espongiocitos

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porque son voluminosas y contienen numerosos granulos claros dando a su superficie un aspecto de esponja Estas ceacutelulas segregan glucocorticoides como el cortisol o hidrocortisona y la cortisona al ser estimuladas por la hormona adrenocorticotropica (ACTH) La ACTH es producida por la hipoacutefisis en respuesta al factor hipotalaacutemico estimulante de corticotropina (CRH) Estos tres oacuterganos del sistema endocrino forman el eje hipotaacutelamo-hipofisario-suprarrenal

El principal glucocorticoide producido por las glaacutendulas suprarrenales es el cortisol que cumple diferentes funciones en el metabolismo en muacuteltiples ceacutelulas del organismo como

Estimulacioacuten de la produccioacuten de aminoaacutecidos por el cuerpo rompiendo proteiacutenas proteoacutelisis

Estimulacioacuten de la lipoacutelisis es decir rompiendo la grasa

Estimulacioacuten gluconeogeacutenesis la produccioacuten de glucosa a partir de nuevas fuentes como los aminaacutecidos y la glicerina de los aacutecidos grasos

Mantenimiento de la glucosa inhibiendo su liberacioacuten desde el muacutesculo y del tejido adiposo

Los glucocorticoides aumentan las concentraciones de glucosa en sangre pues actuacutean como antagonistas de la insulina e inhiben su liberacioacuten lo que produce una disminucioacuten de la captacioacuten de glucosa por los tejidos esto favorece que aumente la siacutentesis de glucosa en el hiacutegado y aumente la cantidad de glucoacutegeno en este mismo

Los glucocorticoides tambieacuten tienen propiedades antiinflamatorias que estaacuten relacionadas con sus efectos sobre la microcirculacioacuten y la inhibicioacuten de las citocinas pro-inflamatorias (IL-1 e IL-6) prostaglandinas y linfocinas Por lo tanto regulan las respuestas inmunitarias a traveacutes del llamado eje inmunosuprarrenal

Tambieacuten el cortisol tiene efectos importantes sobre la regulacioacuten del agua corporal retrasando la entrada de este liacutequido del espacio extracelular al intracelular Por lo que favorece la eliminacioacuten renal de agua

El cortisol inhibe la secrecioacuten de la propiomelanocortina (precursor de ACTH) de la CRH (Hormona liberadora de Corticotropina producida por las ceacutelulas de la eminencia media del hipotaacutelamo) y de Vasopresina

Zona reticular

Es la maacutes interna y presenta ceacutelulas dispuestas en cordones entrecruzados o anastomosados que segregan esteroides sexuales como estroacutegenos y androacutegenos

Las ceacutelulas de la zona reticular producen una fuente secundaria de androacutegenos como testosterona dihidrotestosterona (DHT) androstendiona y

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ENDOCRINOLOGIA

dehidroepiandrosterona (DHEA) Estas hormonas aumentan la masa muscular estimulan el crecimiento celular y ayudan al desarrollo de los caracteres sexuales secundarios

Paacutencreas

El paacutencreas oacutergano que segrega enzimas digestivas que pasan al intestino delgado Estas enzimas ayudan en la ruptura de carbohidratos liacutepidos proteinas y aacutecidos nucleacuteicos en el quimo Tiene forma coacutenica con un proceso uniforme medial e inferior En la especie humana su longitud oscila entre 20 y 30 cm tiene una anchura de unos 4 cm y un grosor de 5 centiacutemetros con un peso 30g La cabeza se localiza en la concavidad del duodeno o asa duodenal formada por la segunda porcioacuten del duodeno

Histologiacutea del paacutencreas

El paacutencreas tiene una parte exocrina y una parte endocrina

La parte exocrina contiene unas glaacutendulas llamadas aacutecinos serosos que son redondos u ovalados con ceacutelulas epiteliales Formados por las celuacutelas acinosas y en parte por las centroacinosas

La parte endocrina se agrupa en islotes de Langerhans que consisten en cuacutemulos de ceacutelulas secretoras de hormonas que producen insulina glucagoacuten y somatostatina Estos tipos de ceacutelulas son los siguientes

Ceacutelula alfa (Alfa cell)

Estas ceacutelulas alfa sintetizan y liberan glucagoacuten El glucagoacuten aumenta el nivel de glucosa sanguiacutenea al estimular la formacioacuten de este carbohidrato a partir del glucoacutegeno almacenado en hepatocitos Tambieacuten ejerce efecto en el metabolismo de proteiacutenas y grasas La liberacioacuten del glucagoacuten es inhibida por la hiperglucemia Representan entre el 10 - 20 del volumen del islote y se distribuyen de forma perifeacuterica

Ceacutelula beta (Beta Cell)

Las ceacutelulas beta producen y liberan insulina hormona que regula el nivel de glucosa en la sangre (facilitando el uso de glucosa por parte de las ceacutelulas y retirando el exceso de glucosa que se almacena en el hiacutegado en forma de glucoacutegeno)

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ENDOCRINOLOGIA

En los diabeacuteticos tipo I las ceacutelulas beta han sido dantildeadas y no son capaces de producir la hormona

Ceacutelula delta (Delta Cell)

Las ceacutelulas delta producen somatostatina hormona que se cree que regulariacutea la produccioacuten y liberacioacuten de la insulina por las ceacutelulas beta y la produccioacuten y liberacioacuten de glucagoacuten por las ceacutelulas alfa

Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)

Estas ceacutelulas hacen que el estoacutemago produzca y libere la hormona Grelina

Ceacutelula F (PP CELL)

Estas ceacutelulas producen y liberan Polipeacuteptido Pancreaacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

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ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

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ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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ENDOCRINOLOGIA

Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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ENDOCRINOLOGIA

Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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ENDOCRINOLOGIA

AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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ENDOCRINOLOGIA

5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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ENDOCRINOLOGIA

como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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ENDOCRINOLOGIA

cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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ENDOCRINOLOGIA

se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
                                            • a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net
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ENDOCRINOLOGIA

Hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH LHRH o LHRF) Es un decapeacuteptido (una cadena de 10 aminoaacutecidos) que actuacutea sobre la hipoacutefisis estimulando la produccioacuten y la liberacioacuten de la hormona luteinizante (LH) y la hormona foliculoestimulante (FSH) El balance de estas hormonas coordina el ciclo menstrual femenino y la espermatogeacutenesis en los hombres

Hormona liberadora de tirotropina (TRH) Es un tripeacuteptido (moleacutecula compuesta por tres aminoaacutecidos) Estimula la secrecioacuten de prolactina (PRL) y de tirotropina (TSH) por parte de la adenohipoacutefisis

Corte sagital medio del cerebro El punto blanco en frente del hipotaacutelamo es el quiasma oacuteptico debajo del cual estaacute la pituitaria La liacutenea blanca entre la pituitaria y el espacio negro es la silla turca (hueso)

Hormona liberadora de corticotropina (CRH o CRF) Se sintetiza en los nuacutecleos paraventriculares a partir de un precursor polipeptiacutedico de unos 41aminoaacutecidos y posee una vida larga (minutos) Las neuronas secretoras se encuentran en la porcioacuten anterior de los nuacutecleos paraventriculares y sus axones terminan en la capa externa de la eminencia media Estimula la liberacioacuten de adrenocorticotropina (ACTH) y β-endorfina por parte de la adenohipoacutefisis La hormona antidiureacutetica y la angiotensina II potencian el efecto liberador de CRH

Somatocrinina hormona liberadora de somatotropina (STH) o factor liberador de hormona del crecimiento (GRF) Las neuronas productoras de este factor se encuentran en el nuacutecleo arcuato del hipotaacutelamo Se sintetiza a partir de un precursor de 107 o 108 aminoaacutecidos Estimula la liberacioacuten de la hormona del crecimiento hipofisaria (GH)

Somatostatina u hormona inhibidora de la liberacioacuten de somatotropina (GIH) Como su nombre indica inhibe la secrecioacuten de somatotropinay de otras hormonas como la insulina el glucagoacuten el polipeacuteptido pancreaacutetico y la TSH La zona secretora se encuentra en la regioacuten periventricular del hipotaacutelamo Es un tetradecapeacuteptido que se encuentra en el hipotaacutelamo y en las ceacutelulas D de los islotes de Langerhans Su precursor posee 116 aminoaacutecidos Hormona liberadora de corticotropina

PIF (Factor inhibidor de la liberacioacuten de prolactina) Actuacutea en forma constante inhibiendo la secrecioacuten de prolactina hipofisaria Dado que la dopamina inhibe tambieacuten la produccioacuten de prolactina al unirse a las

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ENDOCRINOLOGIA

ceacutelulas lactotropas de la hipoacutefisis durante alguacuten tiempo se pensoacute que se trataba de PIF la dopamina puede ser un PIF secundario Las neuronas secretoras de PIF se encuentran en el nuacutecleo arcuato hipotalaacutemico

Angiotensina II (AII) Es un octapeacuteptido que estimula la accioacuten de la hormona liberadora de corticotropina libera algo de adrenocorticotropina hipofisaria

Hormona tiroidea

Las hormonas tiroideas son producidas por la glaacutendula tiroides Su efecto es el aumento del metabolismo basal lo cual es indispensable para un correcto desarrollo fetal y el funcionamiento adecuado de los sistemas cardiovascular musculoesqueleacutetico hematopoyeacutetico asiacute como para respuestas corporales adecuadas en cuanto a produccioacuten de calor consumo de oxiacutegeno y regulacioacuten de otros sistemas hormonales

Tipos de hormona tiroidea

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ENDOCRINOLOGIA

T4 T3

Existen tres hormonas circulantescirculantesco grande

T4 tetrayodotironina o tiroxina T3 o triyodotironina

T3 reversa Esta es bioloacutegicamente inactiva

Los niveles plasmaacuteticos de estas hormonas se mantienen estables durante toda la vida con excepcioacuten del periacuteodo neonatal y en algunas enfermedades o con el uso de algunos faacutermacos

Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas

Los yoduros que se ingieren en los alimentos y en el agua son concentrados de forma activa por la glaacutendula tiroides convertidos a yodo orgaacutenico por la peroxidasa tiroidea e incorporados a la tirosina en la tiroglobulina intrafolicular contenida en el coloide de la superficie apical de la ceacutelula folicular del tiroides

Las tirosinas son yodadas en un lugar (monoyodotirosina) o en dos (diyodotirosina) y se acoplan para formar las hormonas activas

diyodotirosina + diyodotirosina (r) --gt tetrayodotironina [tiroxina T4] diyodotirosina + monoyodotirosina( r) --gt triyodotironina [T3]

Otra fuente de T3 en el interior de la glaacutendula tiroides es el producto de la monodesyodacioacuten del anillo externo de la T4 por una selenoenzima la desyodasa tipo I (5-D-I) Esta enzima se encuentra tambieacuten en el hiacutegado y los rintildeones La T3 resultante pasa a la circulacioacuten Tambieacuten existe una isoenzima que efectuacutea la misma reaccioacuten llamada desyodasa tipo II que se encuentra en el cerebro y la hipoacutefisis La T3 resultante actuacutea localmente2

La tiroglobulina una glucoproteiacutena que contiene T3 y T4 en su matriz es captada por el foliacuteculo en forma de gotitas de coloide por las ceacutelulas tiroideas

Todas las reacciones necesarias para la formacioacuten de T3 y T4 son influidas y controladas por la hormona estimulante del tiroides (TSH) llamada tambieacuten tirotropina que estimula las ceacutelulas foliculares en la glaacutendula tiroides

Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas se metabolizan principalmente en el hiacutegado Producto de una conjugacioacuten con los aacutecidos glucoroacutenico y sulfuacuterico por medio de un grupo hidroxilo fenoacutelico se genera una forma excretable a traveacutes de la bilis

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ENDOCRINOLOGIA

Una parte de los productos conjugados eliminados por la bilis se hidroliza y se absorbe como hormona activa en el intestino Es un fenoacutemeno conocido como circulacioacuten enterohepaacutetica El resto se elimina por las heces

En la circulacioacuten sanguiacutenea la T4 se metaboliza a T3 y T3 reversa las que a su vez se desyodan produceacutendose diyodotironinas inactivas

Efectos de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas tienen dos efectos fisioloacutegicos principales

1 Aumentan la siacutentesis de proteiacutenas praacutecticamente en todos los tejidos del organismo (La T3 y la T4 penetran en las ceacutelulas donde la T3 que se obtiene de la circulacioacuten y por la conversioacuten de T4 en T3 dentro de la ceacutelula se une a receptores nucleares individuales e influye sobre la formacioacuten de ARNm)

2 La T3 incrementa el consumo de oxiacutegeno mediante el aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa (bomba sodio-potasio) sobre todo en los tejidos responsables del consumo basal de oxiacutegeno (es decir hiacutegado rintildeoacuten corazoacuten y muacutesculo esqueleacutetico) El aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa es secundario al incremento de la siacutentesis de esta enzima por consiguiente el aumento del consumo de oxiacutegeno probablemente tambieacuten estaacute relacionado con la fijacioacuten nuclear de hormonas tiroideas No obstante no se ha descartado un efecto directo de la T3 sobre la mitocondria Se cree que la T3 es la hormona tiroidea activa aunque la misma T4 pueda ser bioloacutegicamente activa

Efectos fisioloacutegicos

Desarrollo normal del sistema nervioso central en el feto Funcionamiento normal del sistema nervioso central Su falta enlentece

su funcionamiento

Generacioacuten de calor

Efectos cronotroacutepico e inotroacutepico en el sistema cardiovascular

Aumenta el nuacutemero de receptores para catecolaminas y amplifica la respuesta postreceptor en el sistema simpaacutetico3

Aumenta la eritropoyetina

Regula el metabolismo oacuteseo

Permite la relajacioacuten muscular

Interviene en los niveles de produccioacuten de hormonas gonadotrofinas y somatotropa o GH

Permite la correcta respuesta del centro respiratorio a la hipoxia e hipercapnia

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ENDOCRINOLOGIA

Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma

Las hormonas tiroideas circulan unidas a proteiacutenas plasmaacuteticas Un porcentaje bajo de T4 y T3 circula libremente por la sangre y es de este porcentaje bajo de hormona que depende la accioacuten hormonal sobre los receptores celulares

Las proteiacutenas a las que se unen las hormonas tiroideas son

Globulina transportadora de tiroxina o TBG (del ingleacutes Thyroxin Binding Globulin)

Prealbuacutemina transportadora de tiroxina o TBPA (del ingleacutes Thyroxin Binding Pre Albumin)

Albuacutemina

Ya que existen factores que afectan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas mencionadas modificando la cantidad de hormona libre es muy importante medir la hormona libre en el plasma para evaluar la condicioacuten fisiopatoloacutegica en estudio

Por ejemplo los siguientes faacutermacos compiten con las hormonas tiroideas por su unioacuten con las proteiacutenas transportadoras

Salicilatos Hidantoiacutenas

Algunos antiinflamatorios no esteroideos como el Diclofenaco y el aacutecido mefenaacutemico

Furosemida

Por el contrario los siguientes faacutermacos incrementan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas transportadoras

Estroacutegenos Metadona

Clofibrato

Heroiacutena

Tamoxifeno

En el embarazo tambieacuten se modifica la afinidad de las hormonas tiroideas por las proteiacutenas transportadoras aumentando esta unioacuten y disminuyendo la hormona libre

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ENDOCRINOLOGIA

Paratiroides

Las glaacutendulas paratiroides son glaacutendulas endocrinas Situadas en el cuello generalmente localizadas en los polos De la glaacutendula tiroides que producen La hormona paratiroidea o paratohormona Por lo general hay cuatro glaacutendulas paratiroides Dos superiores y dos inferiores pero de forma ocasional puede haber cinco o maacutes Cuando existe alguna glaacutendula adicional eacutesta suele encontrarse en el mediastino en relacioacuten con el timo o dentro de la glaacutendula tiroides

La hormona paratiroidea participa en el control de la homeostasis del calcio y foacutesforo asiacute como en la fisiologiacutea del hueso

El exceso de funcioacuten de las glaacutendulas paratiroides se conoce como hiperparatiroidismo y suele cursar con elevacioacuten de los niveles plasmaacuteticos de calcio y fragilidad oacutesea que condiciona una mayor susceptibilidad a padecer fracturas La funcioacuten insuficiente de las glaacutendulas paratiroides (hipoparatiroidismo) es mucho menos frecuente y generalmente se presenta tras una cirugiacutea sobre la glaacutendula tiroides que conlleva la existencia de hipocalcemia Existen algunas enfermedades mucho maacutes raras que parecen deberse a alteraciones en el receptor de la hormona paratiroidea como la condroplasia metafiseal de Jansen y la condroplasia de Blomstrand

Hormona paratiroidea o parathormona Es secretada por las ceacutelulas principales de la glaacutendula paratiroides es un polipeacuteptido de 84 aminoaacutecidos cuyo peso molecular es de aproximadamente 9500 Daltons Facilita la absorcioacuten del calcio Vitamina D (en su forma natural) y fosfato conjuntamente en el intestino Aumenta la resorcioacuten de los huesos Mediante la produccioacuten de maacutes osteoclastos a partir de las ceacutelulas madre mesenquimatosas de la meacutedula oacutesea y retrasando la conversioacuten de estas en osteoblastos Los osteoclastos absorben el hueso mediante la liberacioacuten de hormonas proteoliacuteticas liberadas por lisosomas y la secrecioacuten de varios aacutecidos entre ellos el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido laacutectico Aumenta la reabsorcioacuten del calcio y reduce la resorcioacuten del fosfato en los tuacutebulos renales provocando que este salga en la orina en mayor concentracioacuten Aumenta la resorcioacuten del calcio en el intestino Induce un incremento en la formacioacuten del 125-dihidroxicolecalciferol (forma activa de la Vitamina D calitriol o Vitamina D3) a partir del 25-hidroxicolecalciferol (calcifediol) en los rintildeones la vitamina D3 luego actuacutea a nivel del epitelio intestinal aumentando la absorcioacuten del calcio aumentando asiacute los

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ENDOCRINOLOGIA

niveles de calcio plasmaacuteticos (valor normal del calcio plasmaacutetico 92-104 mgdl) Luego por un mecanismo de retroaccioacuten o retroalimentacioacuten negativa elevadas concentraciones de calcio plasmaacuteticos inhiben la secrecioacuten de la PTH (Hormona paratiroidea)ademaacutes ayuda a la reabsorcion del calcio por medio de los rintildeones

Calcitonina Secretada por las ceacutelulas parafoliculares en la Tiroides es un polipeacuteptido de 32 aminoaacutecidos con un peso molecular aproximado de 3000 Daltons aproximadamente Tiene una funcioacuten opuesta a la Hormona Paratiroidea disminuye la actividad osteoclaacutestica desacelera la formacioacuten de los osteoclastos y acelera la formacioacuten de osteoblastos (ceacutelulas encargadas de la formacioacuten del hueso)

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ENDOCRINOLOGIA

Glaacutendula suprarrenal

Las glaacutendulas con forma de triaacutengulo que estaacuten situadas encima de los rintildeones cuya funcioacuten es la de regular las respuestas al estreacutes a traveacutes de la siacutentesis de corticosteroides (principalmente cortisol) y catecolaminas (adrenalina sobre todo)

Capas de la glaacutendula suprarrenal

Introduccioacuten

Anatoacutemicamente las glaacutendulas suprarrenales estaacuten separadas situadas en la cara anterosuperior de los rintildeones y estaacuten irrigadas por la sangre que reciben de las suprarrenales (las suprarrenales superiores las suprarrenales medias y las suprarrenales inferiores) Estaacuten formadas por estructuras diferentes que son la meacutedula suprarrenal y la corteza suprarrenal ambas inervadas por el sistema nervioso autoacutenomo Como su nombre sugiere la meacutedula suprarrenal estaacute situada dentro de la glaacutendula rodeada por la corteza suprarrenal que forma la superficie

Meacutedula suprarrenal La suprarrenal o meacutedula adrenal estaacute compuesta principalmente por ceacutelulas cromafines productoras de hormonas siendo el principal oacutergano de conversioacuten del aminoaacutecido tirosina en catecolaminas epinefrina y norepinefrina tambieacuten llamadas adrenalina y noradrenalina respectivamente Las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal derivan embrioloacutegicamente de la cresta neural como neuronas modificadas Realmente estas ceacutelulas son ceacutelulas postganglionares del sistema nervioso simpaacutetico que reciben la inervacioacuten de ceacutelulas preganglionares Como las sinapsis entre fibras pre y postganglionares seon ganglios nerviosos autonoacutemicos la meacutedula suprarrenal puede considerarse como un ganglio nervioso del sistema nervioso simpaacutetico

En respuesta a una situacioacuten estresante como es el ejercicio fiacutesico o un peligro inminente las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal producen catecolaminas a la sangre en una relacioacuten 70 a 30 de epinefrina y norepinefrina respectivamente

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ENDOCRINOLOGIA

La epinefrina produce efectos importantes como el aumento de la frecuencia cardiacuteaca vasoconstriccioacuten broncodilatacioacuten y aumento del metabolismo que son respuestas muy fugaces

Corteza suprarrenal

La corteza suprarrenal o corteza adrenal estaacute situada rodeando la circunferencia de la glaacutendula suprarrenal Su funcioacuten es la de regular varios componentes del metabolismo con la produccioacuten de mineralcorticoides y glucocorticoides que incluyen a la aldosterona y cortisol La corteza suprarrenal tambieacuten es un lugar secundario de siacutentesis de androacutegenos

La corteza suprarrenal secreta hormonas esteroideas (de naturaleza lipidica) por lo que sus ceacutelulas presentan abundante REL (reticulo endoplasmaacutetico liso) y mitocondrias con crestas longitudinales al MET Se dispone en tres capas diferentes de tejido basado en los tipos celulares y la funcioacuten que realizan

Zona glomerular Produccioacuten de mineralocorticoides sobre todo aldosterona

Zona fascicular Produccioacuten de glucocorticoides principalmente cortisol cerca del 95

Zona reticular Produccioacuten de androacutegenos incluyendo testosterona

Zona glomerular

Las ceacutelulas de la zona glomerular de la corteza suprarrenal segregan mineralocorticoides como la aldosterona y la desoxicorticosterona en respuesta a un aumento de los niveles de potasio o descenso del flujo de sangre en los rintildeones La aldosterona es liberada a la sangre formando parte del sistema renina-angiotensina que regula la concentracioacuten de electrolitos en la sangre sobre todo de sodio y potasio actuando en el tuacutebulo contorneado distal de la nefrona de los rintildeones

Aumentando la excrecioacuten de potasio Aumentando la reabsorcioacuten de sodio

La Aldosterona es una hormona que ayuda a regular la presioacuten osmoacutetica de mi organismo Por ejemplo si en el plasma sanguiacuteneo hay una escasez de sales ([osmolaridad] baja) se secretaraacute mayor cantidad de Aldosterona para reabsorber maacutes sodio y por consiguiente normalizar los niveles Lo mismo si hay una concentracioacuten muy elevada de sales en la sangre (osmolaridad alta) se secretaraacute menos o se inhibiraacute la secrecioacuten de Aldosterona para no tener que reabsorber el Sodio y por consiguiente eliminarlo normalizando las concentraciones

Zona fascicular

Capa predominante en la corteza suprarrenal cuyas celulas se disponen en hileras separadas por tabiques y capilares Sus ceacutelulas se llaman espongiocitos

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ENDOCRINOLOGIA

porque son voluminosas y contienen numerosos granulos claros dando a su superficie un aspecto de esponja Estas ceacutelulas segregan glucocorticoides como el cortisol o hidrocortisona y la cortisona al ser estimuladas por la hormona adrenocorticotropica (ACTH) La ACTH es producida por la hipoacutefisis en respuesta al factor hipotalaacutemico estimulante de corticotropina (CRH) Estos tres oacuterganos del sistema endocrino forman el eje hipotaacutelamo-hipofisario-suprarrenal

El principal glucocorticoide producido por las glaacutendulas suprarrenales es el cortisol que cumple diferentes funciones en el metabolismo en muacuteltiples ceacutelulas del organismo como

Estimulacioacuten de la produccioacuten de aminoaacutecidos por el cuerpo rompiendo proteiacutenas proteoacutelisis

Estimulacioacuten de la lipoacutelisis es decir rompiendo la grasa

Estimulacioacuten gluconeogeacutenesis la produccioacuten de glucosa a partir de nuevas fuentes como los aminaacutecidos y la glicerina de los aacutecidos grasos

Mantenimiento de la glucosa inhibiendo su liberacioacuten desde el muacutesculo y del tejido adiposo

Los glucocorticoides aumentan las concentraciones de glucosa en sangre pues actuacutean como antagonistas de la insulina e inhiben su liberacioacuten lo que produce una disminucioacuten de la captacioacuten de glucosa por los tejidos esto favorece que aumente la siacutentesis de glucosa en el hiacutegado y aumente la cantidad de glucoacutegeno en este mismo

Los glucocorticoides tambieacuten tienen propiedades antiinflamatorias que estaacuten relacionadas con sus efectos sobre la microcirculacioacuten y la inhibicioacuten de las citocinas pro-inflamatorias (IL-1 e IL-6) prostaglandinas y linfocinas Por lo tanto regulan las respuestas inmunitarias a traveacutes del llamado eje inmunosuprarrenal

Tambieacuten el cortisol tiene efectos importantes sobre la regulacioacuten del agua corporal retrasando la entrada de este liacutequido del espacio extracelular al intracelular Por lo que favorece la eliminacioacuten renal de agua

El cortisol inhibe la secrecioacuten de la propiomelanocortina (precursor de ACTH) de la CRH (Hormona liberadora de Corticotropina producida por las ceacutelulas de la eminencia media del hipotaacutelamo) y de Vasopresina

Zona reticular

Es la maacutes interna y presenta ceacutelulas dispuestas en cordones entrecruzados o anastomosados que segregan esteroides sexuales como estroacutegenos y androacutegenos

Las ceacutelulas de la zona reticular producen una fuente secundaria de androacutegenos como testosterona dihidrotestosterona (DHT) androstendiona y

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ENDOCRINOLOGIA

dehidroepiandrosterona (DHEA) Estas hormonas aumentan la masa muscular estimulan el crecimiento celular y ayudan al desarrollo de los caracteres sexuales secundarios

Paacutencreas

El paacutencreas oacutergano que segrega enzimas digestivas que pasan al intestino delgado Estas enzimas ayudan en la ruptura de carbohidratos liacutepidos proteinas y aacutecidos nucleacuteicos en el quimo Tiene forma coacutenica con un proceso uniforme medial e inferior En la especie humana su longitud oscila entre 20 y 30 cm tiene una anchura de unos 4 cm y un grosor de 5 centiacutemetros con un peso 30g La cabeza se localiza en la concavidad del duodeno o asa duodenal formada por la segunda porcioacuten del duodeno

Histologiacutea del paacutencreas

El paacutencreas tiene una parte exocrina y una parte endocrina

La parte exocrina contiene unas glaacutendulas llamadas aacutecinos serosos que son redondos u ovalados con ceacutelulas epiteliales Formados por las celuacutelas acinosas y en parte por las centroacinosas

La parte endocrina se agrupa en islotes de Langerhans que consisten en cuacutemulos de ceacutelulas secretoras de hormonas que producen insulina glucagoacuten y somatostatina Estos tipos de ceacutelulas son los siguientes

Ceacutelula alfa (Alfa cell)

Estas ceacutelulas alfa sintetizan y liberan glucagoacuten El glucagoacuten aumenta el nivel de glucosa sanguiacutenea al estimular la formacioacuten de este carbohidrato a partir del glucoacutegeno almacenado en hepatocitos Tambieacuten ejerce efecto en el metabolismo de proteiacutenas y grasas La liberacioacuten del glucagoacuten es inhibida por la hiperglucemia Representan entre el 10 - 20 del volumen del islote y se distribuyen de forma perifeacuterica

Ceacutelula beta (Beta Cell)

Las ceacutelulas beta producen y liberan insulina hormona que regula el nivel de glucosa en la sangre (facilitando el uso de glucosa por parte de las ceacutelulas y retirando el exceso de glucosa que se almacena en el hiacutegado en forma de glucoacutegeno)

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ENDOCRINOLOGIA

En los diabeacuteticos tipo I las ceacutelulas beta han sido dantildeadas y no son capaces de producir la hormona

Ceacutelula delta (Delta Cell)

Las ceacutelulas delta producen somatostatina hormona que se cree que regulariacutea la produccioacuten y liberacioacuten de la insulina por las ceacutelulas beta y la produccioacuten y liberacioacuten de glucagoacuten por las ceacutelulas alfa

Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)

Estas ceacutelulas hacen que el estoacutemago produzca y libere la hormona Grelina

Ceacutelula F (PP CELL)

Estas ceacutelulas producen y liberan Polipeacuteptido Pancreaacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

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ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

Trabajo final Paacutegina 27

ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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ENDOCRINOLOGIA

Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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ceacutelulas lactotropas de la hipoacutefisis durante alguacuten tiempo se pensoacute que se trataba de PIF la dopamina puede ser un PIF secundario Las neuronas secretoras de PIF se encuentran en el nuacutecleo arcuato hipotalaacutemico

Angiotensina II (AII) Es un octapeacuteptido que estimula la accioacuten de la hormona liberadora de corticotropina libera algo de adrenocorticotropina hipofisaria

Hormona tiroidea

Las hormonas tiroideas son producidas por la glaacutendula tiroides Su efecto es el aumento del metabolismo basal lo cual es indispensable para un correcto desarrollo fetal y el funcionamiento adecuado de los sistemas cardiovascular musculoesqueleacutetico hematopoyeacutetico asiacute como para respuestas corporales adecuadas en cuanto a produccioacuten de calor consumo de oxiacutegeno y regulacioacuten de otros sistemas hormonales

Tipos de hormona tiroidea

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ENDOCRINOLOGIA

T4 T3

Existen tres hormonas circulantescirculantesco grande

T4 tetrayodotironina o tiroxina T3 o triyodotironina

T3 reversa Esta es bioloacutegicamente inactiva

Los niveles plasmaacuteticos de estas hormonas se mantienen estables durante toda la vida con excepcioacuten del periacuteodo neonatal y en algunas enfermedades o con el uso de algunos faacutermacos

Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas

Los yoduros que se ingieren en los alimentos y en el agua son concentrados de forma activa por la glaacutendula tiroides convertidos a yodo orgaacutenico por la peroxidasa tiroidea e incorporados a la tirosina en la tiroglobulina intrafolicular contenida en el coloide de la superficie apical de la ceacutelula folicular del tiroides

Las tirosinas son yodadas en un lugar (monoyodotirosina) o en dos (diyodotirosina) y se acoplan para formar las hormonas activas

diyodotirosina + diyodotirosina (r) --gt tetrayodotironina [tiroxina T4] diyodotirosina + monoyodotirosina( r) --gt triyodotironina [T3]

Otra fuente de T3 en el interior de la glaacutendula tiroides es el producto de la monodesyodacioacuten del anillo externo de la T4 por una selenoenzima la desyodasa tipo I (5-D-I) Esta enzima se encuentra tambieacuten en el hiacutegado y los rintildeones La T3 resultante pasa a la circulacioacuten Tambieacuten existe una isoenzima que efectuacutea la misma reaccioacuten llamada desyodasa tipo II que se encuentra en el cerebro y la hipoacutefisis La T3 resultante actuacutea localmente2

La tiroglobulina una glucoproteiacutena que contiene T3 y T4 en su matriz es captada por el foliacuteculo en forma de gotitas de coloide por las ceacutelulas tiroideas

Todas las reacciones necesarias para la formacioacuten de T3 y T4 son influidas y controladas por la hormona estimulante del tiroides (TSH) llamada tambieacuten tirotropina que estimula las ceacutelulas foliculares en la glaacutendula tiroides

Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas se metabolizan principalmente en el hiacutegado Producto de una conjugacioacuten con los aacutecidos glucoroacutenico y sulfuacuterico por medio de un grupo hidroxilo fenoacutelico se genera una forma excretable a traveacutes de la bilis

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Una parte de los productos conjugados eliminados por la bilis se hidroliza y se absorbe como hormona activa en el intestino Es un fenoacutemeno conocido como circulacioacuten enterohepaacutetica El resto se elimina por las heces

En la circulacioacuten sanguiacutenea la T4 se metaboliza a T3 y T3 reversa las que a su vez se desyodan produceacutendose diyodotironinas inactivas

Efectos de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas tienen dos efectos fisioloacutegicos principales

1 Aumentan la siacutentesis de proteiacutenas praacutecticamente en todos los tejidos del organismo (La T3 y la T4 penetran en las ceacutelulas donde la T3 que se obtiene de la circulacioacuten y por la conversioacuten de T4 en T3 dentro de la ceacutelula se une a receptores nucleares individuales e influye sobre la formacioacuten de ARNm)

2 La T3 incrementa el consumo de oxiacutegeno mediante el aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa (bomba sodio-potasio) sobre todo en los tejidos responsables del consumo basal de oxiacutegeno (es decir hiacutegado rintildeoacuten corazoacuten y muacutesculo esqueleacutetico) El aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa es secundario al incremento de la siacutentesis de esta enzima por consiguiente el aumento del consumo de oxiacutegeno probablemente tambieacuten estaacute relacionado con la fijacioacuten nuclear de hormonas tiroideas No obstante no se ha descartado un efecto directo de la T3 sobre la mitocondria Se cree que la T3 es la hormona tiroidea activa aunque la misma T4 pueda ser bioloacutegicamente activa

Efectos fisioloacutegicos

Desarrollo normal del sistema nervioso central en el feto Funcionamiento normal del sistema nervioso central Su falta enlentece

su funcionamiento

Generacioacuten de calor

Efectos cronotroacutepico e inotroacutepico en el sistema cardiovascular

Aumenta el nuacutemero de receptores para catecolaminas y amplifica la respuesta postreceptor en el sistema simpaacutetico3

Aumenta la eritropoyetina

Regula el metabolismo oacuteseo

Permite la relajacioacuten muscular

Interviene en los niveles de produccioacuten de hormonas gonadotrofinas y somatotropa o GH

Permite la correcta respuesta del centro respiratorio a la hipoxia e hipercapnia

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ENDOCRINOLOGIA

Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma

Las hormonas tiroideas circulan unidas a proteiacutenas plasmaacuteticas Un porcentaje bajo de T4 y T3 circula libremente por la sangre y es de este porcentaje bajo de hormona que depende la accioacuten hormonal sobre los receptores celulares

Las proteiacutenas a las que se unen las hormonas tiroideas son

Globulina transportadora de tiroxina o TBG (del ingleacutes Thyroxin Binding Globulin)

Prealbuacutemina transportadora de tiroxina o TBPA (del ingleacutes Thyroxin Binding Pre Albumin)

Albuacutemina

Ya que existen factores que afectan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas mencionadas modificando la cantidad de hormona libre es muy importante medir la hormona libre en el plasma para evaluar la condicioacuten fisiopatoloacutegica en estudio

Por ejemplo los siguientes faacutermacos compiten con las hormonas tiroideas por su unioacuten con las proteiacutenas transportadoras

Salicilatos Hidantoiacutenas

Algunos antiinflamatorios no esteroideos como el Diclofenaco y el aacutecido mefenaacutemico

Furosemida

Por el contrario los siguientes faacutermacos incrementan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas transportadoras

Estroacutegenos Metadona

Clofibrato

Heroiacutena

Tamoxifeno

En el embarazo tambieacuten se modifica la afinidad de las hormonas tiroideas por las proteiacutenas transportadoras aumentando esta unioacuten y disminuyendo la hormona libre

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ENDOCRINOLOGIA

Paratiroides

Las glaacutendulas paratiroides son glaacutendulas endocrinas Situadas en el cuello generalmente localizadas en los polos De la glaacutendula tiroides que producen La hormona paratiroidea o paratohormona Por lo general hay cuatro glaacutendulas paratiroides Dos superiores y dos inferiores pero de forma ocasional puede haber cinco o maacutes Cuando existe alguna glaacutendula adicional eacutesta suele encontrarse en el mediastino en relacioacuten con el timo o dentro de la glaacutendula tiroides

La hormona paratiroidea participa en el control de la homeostasis del calcio y foacutesforo asiacute como en la fisiologiacutea del hueso

El exceso de funcioacuten de las glaacutendulas paratiroides se conoce como hiperparatiroidismo y suele cursar con elevacioacuten de los niveles plasmaacuteticos de calcio y fragilidad oacutesea que condiciona una mayor susceptibilidad a padecer fracturas La funcioacuten insuficiente de las glaacutendulas paratiroides (hipoparatiroidismo) es mucho menos frecuente y generalmente se presenta tras una cirugiacutea sobre la glaacutendula tiroides que conlleva la existencia de hipocalcemia Existen algunas enfermedades mucho maacutes raras que parecen deberse a alteraciones en el receptor de la hormona paratiroidea como la condroplasia metafiseal de Jansen y la condroplasia de Blomstrand

Hormona paratiroidea o parathormona Es secretada por las ceacutelulas principales de la glaacutendula paratiroides es un polipeacuteptido de 84 aminoaacutecidos cuyo peso molecular es de aproximadamente 9500 Daltons Facilita la absorcioacuten del calcio Vitamina D (en su forma natural) y fosfato conjuntamente en el intestino Aumenta la resorcioacuten de los huesos Mediante la produccioacuten de maacutes osteoclastos a partir de las ceacutelulas madre mesenquimatosas de la meacutedula oacutesea y retrasando la conversioacuten de estas en osteoblastos Los osteoclastos absorben el hueso mediante la liberacioacuten de hormonas proteoliacuteticas liberadas por lisosomas y la secrecioacuten de varios aacutecidos entre ellos el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido laacutectico Aumenta la reabsorcioacuten del calcio y reduce la resorcioacuten del fosfato en los tuacutebulos renales provocando que este salga en la orina en mayor concentracioacuten Aumenta la resorcioacuten del calcio en el intestino Induce un incremento en la formacioacuten del 125-dihidroxicolecalciferol (forma activa de la Vitamina D calitriol o Vitamina D3) a partir del 25-hidroxicolecalciferol (calcifediol) en los rintildeones la vitamina D3 luego actuacutea a nivel del epitelio intestinal aumentando la absorcioacuten del calcio aumentando asiacute los

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ENDOCRINOLOGIA

niveles de calcio plasmaacuteticos (valor normal del calcio plasmaacutetico 92-104 mgdl) Luego por un mecanismo de retroaccioacuten o retroalimentacioacuten negativa elevadas concentraciones de calcio plasmaacuteticos inhiben la secrecioacuten de la PTH (Hormona paratiroidea)ademaacutes ayuda a la reabsorcion del calcio por medio de los rintildeones

Calcitonina Secretada por las ceacutelulas parafoliculares en la Tiroides es un polipeacuteptido de 32 aminoaacutecidos con un peso molecular aproximado de 3000 Daltons aproximadamente Tiene una funcioacuten opuesta a la Hormona Paratiroidea disminuye la actividad osteoclaacutestica desacelera la formacioacuten de los osteoclastos y acelera la formacioacuten de osteoblastos (ceacutelulas encargadas de la formacioacuten del hueso)

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ENDOCRINOLOGIA

Glaacutendula suprarrenal

Las glaacutendulas con forma de triaacutengulo que estaacuten situadas encima de los rintildeones cuya funcioacuten es la de regular las respuestas al estreacutes a traveacutes de la siacutentesis de corticosteroides (principalmente cortisol) y catecolaminas (adrenalina sobre todo)

Capas de la glaacutendula suprarrenal

Introduccioacuten

Anatoacutemicamente las glaacutendulas suprarrenales estaacuten separadas situadas en la cara anterosuperior de los rintildeones y estaacuten irrigadas por la sangre que reciben de las suprarrenales (las suprarrenales superiores las suprarrenales medias y las suprarrenales inferiores) Estaacuten formadas por estructuras diferentes que son la meacutedula suprarrenal y la corteza suprarrenal ambas inervadas por el sistema nervioso autoacutenomo Como su nombre sugiere la meacutedula suprarrenal estaacute situada dentro de la glaacutendula rodeada por la corteza suprarrenal que forma la superficie

Meacutedula suprarrenal La suprarrenal o meacutedula adrenal estaacute compuesta principalmente por ceacutelulas cromafines productoras de hormonas siendo el principal oacutergano de conversioacuten del aminoaacutecido tirosina en catecolaminas epinefrina y norepinefrina tambieacuten llamadas adrenalina y noradrenalina respectivamente Las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal derivan embrioloacutegicamente de la cresta neural como neuronas modificadas Realmente estas ceacutelulas son ceacutelulas postganglionares del sistema nervioso simpaacutetico que reciben la inervacioacuten de ceacutelulas preganglionares Como las sinapsis entre fibras pre y postganglionares seon ganglios nerviosos autonoacutemicos la meacutedula suprarrenal puede considerarse como un ganglio nervioso del sistema nervioso simpaacutetico

En respuesta a una situacioacuten estresante como es el ejercicio fiacutesico o un peligro inminente las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal producen catecolaminas a la sangre en una relacioacuten 70 a 30 de epinefrina y norepinefrina respectivamente

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ENDOCRINOLOGIA

La epinefrina produce efectos importantes como el aumento de la frecuencia cardiacuteaca vasoconstriccioacuten broncodilatacioacuten y aumento del metabolismo que son respuestas muy fugaces

Corteza suprarrenal

La corteza suprarrenal o corteza adrenal estaacute situada rodeando la circunferencia de la glaacutendula suprarrenal Su funcioacuten es la de regular varios componentes del metabolismo con la produccioacuten de mineralcorticoides y glucocorticoides que incluyen a la aldosterona y cortisol La corteza suprarrenal tambieacuten es un lugar secundario de siacutentesis de androacutegenos

La corteza suprarrenal secreta hormonas esteroideas (de naturaleza lipidica) por lo que sus ceacutelulas presentan abundante REL (reticulo endoplasmaacutetico liso) y mitocondrias con crestas longitudinales al MET Se dispone en tres capas diferentes de tejido basado en los tipos celulares y la funcioacuten que realizan

Zona glomerular Produccioacuten de mineralocorticoides sobre todo aldosterona

Zona fascicular Produccioacuten de glucocorticoides principalmente cortisol cerca del 95

Zona reticular Produccioacuten de androacutegenos incluyendo testosterona

Zona glomerular

Las ceacutelulas de la zona glomerular de la corteza suprarrenal segregan mineralocorticoides como la aldosterona y la desoxicorticosterona en respuesta a un aumento de los niveles de potasio o descenso del flujo de sangre en los rintildeones La aldosterona es liberada a la sangre formando parte del sistema renina-angiotensina que regula la concentracioacuten de electrolitos en la sangre sobre todo de sodio y potasio actuando en el tuacutebulo contorneado distal de la nefrona de los rintildeones

Aumentando la excrecioacuten de potasio Aumentando la reabsorcioacuten de sodio

La Aldosterona es una hormona que ayuda a regular la presioacuten osmoacutetica de mi organismo Por ejemplo si en el plasma sanguiacuteneo hay una escasez de sales ([osmolaridad] baja) se secretaraacute mayor cantidad de Aldosterona para reabsorber maacutes sodio y por consiguiente normalizar los niveles Lo mismo si hay una concentracioacuten muy elevada de sales en la sangre (osmolaridad alta) se secretaraacute menos o se inhibiraacute la secrecioacuten de Aldosterona para no tener que reabsorber el Sodio y por consiguiente eliminarlo normalizando las concentraciones

Zona fascicular

Capa predominante en la corteza suprarrenal cuyas celulas se disponen en hileras separadas por tabiques y capilares Sus ceacutelulas se llaman espongiocitos

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ENDOCRINOLOGIA

porque son voluminosas y contienen numerosos granulos claros dando a su superficie un aspecto de esponja Estas ceacutelulas segregan glucocorticoides como el cortisol o hidrocortisona y la cortisona al ser estimuladas por la hormona adrenocorticotropica (ACTH) La ACTH es producida por la hipoacutefisis en respuesta al factor hipotalaacutemico estimulante de corticotropina (CRH) Estos tres oacuterganos del sistema endocrino forman el eje hipotaacutelamo-hipofisario-suprarrenal

El principal glucocorticoide producido por las glaacutendulas suprarrenales es el cortisol que cumple diferentes funciones en el metabolismo en muacuteltiples ceacutelulas del organismo como

Estimulacioacuten de la produccioacuten de aminoaacutecidos por el cuerpo rompiendo proteiacutenas proteoacutelisis

Estimulacioacuten de la lipoacutelisis es decir rompiendo la grasa

Estimulacioacuten gluconeogeacutenesis la produccioacuten de glucosa a partir de nuevas fuentes como los aminaacutecidos y la glicerina de los aacutecidos grasos

Mantenimiento de la glucosa inhibiendo su liberacioacuten desde el muacutesculo y del tejido adiposo

Los glucocorticoides aumentan las concentraciones de glucosa en sangre pues actuacutean como antagonistas de la insulina e inhiben su liberacioacuten lo que produce una disminucioacuten de la captacioacuten de glucosa por los tejidos esto favorece que aumente la siacutentesis de glucosa en el hiacutegado y aumente la cantidad de glucoacutegeno en este mismo

Los glucocorticoides tambieacuten tienen propiedades antiinflamatorias que estaacuten relacionadas con sus efectos sobre la microcirculacioacuten y la inhibicioacuten de las citocinas pro-inflamatorias (IL-1 e IL-6) prostaglandinas y linfocinas Por lo tanto regulan las respuestas inmunitarias a traveacutes del llamado eje inmunosuprarrenal

Tambieacuten el cortisol tiene efectos importantes sobre la regulacioacuten del agua corporal retrasando la entrada de este liacutequido del espacio extracelular al intracelular Por lo que favorece la eliminacioacuten renal de agua

El cortisol inhibe la secrecioacuten de la propiomelanocortina (precursor de ACTH) de la CRH (Hormona liberadora de Corticotropina producida por las ceacutelulas de la eminencia media del hipotaacutelamo) y de Vasopresina

Zona reticular

Es la maacutes interna y presenta ceacutelulas dispuestas en cordones entrecruzados o anastomosados que segregan esteroides sexuales como estroacutegenos y androacutegenos

Las ceacutelulas de la zona reticular producen una fuente secundaria de androacutegenos como testosterona dihidrotestosterona (DHT) androstendiona y

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ENDOCRINOLOGIA

dehidroepiandrosterona (DHEA) Estas hormonas aumentan la masa muscular estimulan el crecimiento celular y ayudan al desarrollo de los caracteres sexuales secundarios

Paacutencreas

El paacutencreas oacutergano que segrega enzimas digestivas que pasan al intestino delgado Estas enzimas ayudan en la ruptura de carbohidratos liacutepidos proteinas y aacutecidos nucleacuteicos en el quimo Tiene forma coacutenica con un proceso uniforme medial e inferior En la especie humana su longitud oscila entre 20 y 30 cm tiene una anchura de unos 4 cm y un grosor de 5 centiacutemetros con un peso 30g La cabeza se localiza en la concavidad del duodeno o asa duodenal formada por la segunda porcioacuten del duodeno

Histologiacutea del paacutencreas

El paacutencreas tiene una parte exocrina y una parte endocrina

La parte exocrina contiene unas glaacutendulas llamadas aacutecinos serosos que son redondos u ovalados con ceacutelulas epiteliales Formados por las celuacutelas acinosas y en parte por las centroacinosas

La parte endocrina se agrupa en islotes de Langerhans que consisten en cuacutemulos de ceacutelulas secretoras de hormonas que producen insulina glucagoacuten y somatostatina Estos tipos de ceacutelulas son los siguientes

Ceacutelula alfa (Alfa cell)

Estas ceacutelulas alfa sintetizan y liberan glucagoacuten El glucagoacuten aumenta el nivel de glucosa sanguiacutenea al estimular la formacioacuten de este carbohidrato a partir del glucoacutegeno almacenado en hepatocitos Tambieacuten ejerce efecto en el metabolismo de proteiacutenas y grasas La liberacioacuten del glucagoacuten es inhibida por la hiperglucemia Representan entre el 10 - 20 del volumen del islote y se distribuyen de forma perifeacuterica

Ceacutelula beta (Beta Cell)

Las ceacutelulas beta producen y liberan insulina hormona que regula el nivel de glucosa en la sangre (facilitando el uso de glucosa por parte de las ceacutelulas y retirando el exceso de glucosa que se almacena en el hiacutegado en forma de glucoacutegeno)

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ENDOCRINOLOGIA

En los diabeacuteticos tipo I las ceacutelulas beta han sido dantildeadas y no son capaces de producir la hormona

Ceacutelula delta (Delta Cell)

Las ceacutelulas delta producen somatostatina hormona que se cree que regulariacutea la produccioacuten y liberacioacuten de la insulina por las ceacutelulas beta y la produccioacuten y liberacioacuten de glucagoacuten por las ceacutelulas alfa

Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)

Estas ceacutelulas hacen que el estoacutemago produzca y libere la hormona Grelina

Ceacutelula F (PP CELL)

Estas ceacutelulas producen y liberan Polipeacuteptido Pancreaacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

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ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

Trabajo final Paacutegina 27

ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

Trabajo final Paacutegina 31

ENDOCRINOLOGIA

Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

Trabajo final Paacutegina 32

ENDOCRINOLOGIA

Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

Trabajo final Paacutegina 33

ENDOCRINOLOGIA

AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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ENDOCRINOLOGIA

5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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ENDOCRINOLOGIA

como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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ENDOCRINOLOGIA

cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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ENDOCRINOLOGIA

se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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ENDOCRINOLOGIA

bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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ENDOCRINOLOGIA

Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ENDOCRINOLOGIA

ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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ENDOCRINOLOGIA

Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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ENDOCRINOLOGIA

2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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ENDOCRINOLOGIA

52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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ENDOCRINOLOGIA

BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

Trabajo final Paacutegina 52

ENDOCRINOLOGIA

Trabajo final Paacutegina 53

  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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Page 16: Trabajo Final Endocrinologia

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T4 T3

Existen tres hormonas circulantescirculantesco grande

T4 tetrayodotironina o tiroxina T3 o triyodotironina

T3 reversa Esta es bioloacutegicamente inactiva

Los niveles plasmaacuteticos de estas hormonas se mantienen estables durante toda la vida con excepcioacuten del periacuteodo neonatal y en algunas enfermedades o con el uso de algunos faacutermacos

Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas

Los yoduros que se ingieren en los alimentos y en el agua son concentrados de forma activa por la glaacutendula tiroides convertidos a yodo orgaacutenico por la peroxidasa tiroidea e incorporados a la tirosina en la tiroglobulina intrafolicular contenida en el coloide de la superficie apical de la ceacutelula folicular del tiroides

Las tirosinas son yodadas en un lugar (monoyodotirosina) o en dos (diyodotirosina) y se acoplan para formar las hormonas activas

diyodotirosina + diyodotirosina (r) --gt tetrayodotironina [tiroxina T4] diyodotirosina + monoyodotirosina( r) --gt triyodotironina [T3]

Otra fuente de T3 en el interior de la glaacutendula tiroides es el producto de la monodesyodacioacuten del anillo externo de la T4 por una selenoenzima la desyodasa tipo I (5-D-I) Esta enzima se encuentra tambieacuten en el hiacutegado y los rintildeones La T3 resultante pasa a la circulacioacuten Tambieacuten existe una isoenzima que efectuacutea la misma reaccioacuten llamada desyodasa tipo II que se encuentra en el cerebro y la hipoacutefisis La T3 resultante actuacutea localmente2

La tiroglobulina una glucoproteiacutena que contiene T3 y T4 en su matriz es captada por el foliacuteculo en forma de gotitas de coloide por las ceacutelulas tiroideas

Todas las reacciones necesarias para la formacioacuten de T3 y T4 son influidas y controladas por la hormona estimulante del tiroides (TSH) llamada tambieacuten tirotropina que estimula las ceacutelulas foliculares en la glaacutendula tiroides

Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas se metabolizan principalmente en el hiacutegado Producto de una conjugacioacuten con los aacutecidos glucoroacutenico y sulfuacuterico por medio de un grupo hidroxilo fenoacutelico se genera una forma excretable a traveacutes de la bilis

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ENDOCRINOLOGIA

Una parte de los productos conjugados eliminados por la bilis se hidroliza y se absorbe como hormona activa en el intestino Es un fenoacutemeno conocido como circulacioacuten enterohepaacutetica El resto se elimina por las heces

En la circulacioacuten sanguiacutenea la T4 se metaboliza a T3 y T3 reversa las que a su vez se desyodan produceacutendose diyodotironinas inactivas

Efectos de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas tienen dos efectos fisioloacutegicos principales

1 Aumentan la siacutentesis de proteiacutenas praacutecticamente en todos los tejidos del organismo (La T3 y la T4 penetran en las ceacutelulas donde la T3 que se obtiene de la circulacioacuten y por la conversioacuten de T4 en T3 dentro de la ceacutelula se une a receptores nucleares individuales e influye sobre la formacioacuten de ARNm)

2 La T3 incrementa el consumo de oxiacutegeno mediante el aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa (bomba sodio-potasio) sobre todo en los tejidos responsables del consumo basal de oxiacutegeno (es decir hiacutegado rintildeoacuten corazoacuten y muacutesculo esqueleacutetico) El aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa es secundario al incremento de la siacutentesis de esta enzima por consiguiente el aumento del consumo de oxiacutegeno probablemente tambieacuten estaacute relacionado con la fijacioacuten nuclear de hormonas tiroideas No obstante no se ha descartado un efecto directo de la T3 sobre la mitocondria Se cree que la T3 es la hormona tiroidea activa aunque la misma T4 pueda ser bioloacutegicamente activa

Efectos fisioloacutegicos

Desarrollo normal del sistema nervioso central en el feto Funcionamiento normal del sistema nervioso central Su falta enlentece

su funcionamiento

Generacioacuten de calor

Efectos cronotroacutepico e inotroacutepico en el sistema cardiovascular

Aumenta el nuacutemero de receptores para catecolaminas y amplifica la respuesta postreceptor en el sistema simpaacutetico3

Aumenta la eritropoyetina

Regula el metabolismo oacuteseo

Permite la relajacioacuten muscular

Interviene en los niveles de produccioacuten de hormonas gonadotrofinas y somatotropa o GH

Permite la correcta respuesta del centro respiratorio a la hipoxia e hipercapnia

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ENDOCRINOLOGIA

Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma

Las hormonas tiroideas circulan unidas a proteiacutenas plasmaacuteticas Un porcentaje bajo de T4 y T3 circula libremente por la sangre y es de este porcentaje bajo de hormona que depende la accioacuten hormonal sobre los receptores celulares

Las proteiacutenas a las que se unen las hormonas tiroideas son

Globulina transportadora de tiroxina o TBG (del ingleacutes Thyroxin Binding Globulin)

Prealbuacutemina transportadora de tiroxina o TBPA (del ingleacutes Thyroxin Binding Pre Albumin)

Albuacutemina

Ya que existen factores que afectan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas mencionadas modificando la cantidad de hormona libre es muy importante medir la hormona libre en el plasma para evaluar la condicioacuten fisiopatoloacutegica en estudio

Por ejemplo los siguientes faacutermacos compiten con las hormonas tiroideas por su unioacuten con las proteiacutenas transportadoras

Salicilatos Hidantoiacutenas

Algunos antiinflamatorios no esteroideos como el Diclofenaco y el aacutecido mefenaacutemico

Furosemida

Por el contrario los siguientes faacutermacos incrementan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas transportadoras

Estroacutegenos Metadona

Clofibrato

Heroiacutena

Tamoxifeno

En el embarazo tambieacuten se modifica la afinidad de las hormonas tiroideas por las proteiacutenas transportadoras aumentando esta unioacuten y disminuyendo la hormona libre

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ENDOCRINOLOGIA

Paratiroides

Las glaacutendulas paratiroides son glaacutendulas endocrinas Situadas en el cuello generalmente localizadas en los polos De la glaacutendula tiroides que producen La hormona paratiroidea o paratohormona Por lo general hay cuatro glaacutendulas paratiroides Dos superiores y dos inferiores pero de forma ocasional puede haber cinco o maacutes Cuando existe alguna glaacutendula adicional eacutesta suele encontrarse en el mediastino en relacioacuten con el timo o dentro de la glaacutendula tiroides

La hormona paratiroidea participa en el control de la homeostasis del calcio y foacutesforo asiacute como en la fisiologiacutea del hueso

El exceso de funcioacuten de las glaacutendulas paratiroides se conoce como hiperparatiroidismo y suele cursar con elevacioacuten de los niveles plasmaacuteticos de calcio y fragilidad oacutesea que condiciona una mayor susceptibilidad a padecer fracturas La funcioacuten insuficiente de las glaacutendulas paratiroides (hipoparatiroidismo) es mucho menos frecuente y generalmente se presenta tras una cirugiacutea sobre la glaacutendula tiroides que conlleva la existencia de hipocalcemia Existen algunas enfermedades mucho maacutes raras que parecen deberse a alteraciones en el receptor de la hormona paratiroidea como la condroplasia metafiseal de Jansen y la condroplasia de Blomstrand

Hormona paratiroidea o parathormona Es secretada por las ceacutelulas principales de la glaacutendula paratiroides es un polipeacuteptido de 84 aminoaacutecidos cuyo peso molecular es de aproximadamente 9500 Daltons Facilita la absorcioacuten del calcio Vitamina D (en su forma natural) y fosfato conjuntamente en el intestino Aumenta la resorcioacuten de los huesos Mediante la produccioacuten de maacutes osteoclastos a partir de las ceacutelulas madre mesenquimatosas de la meacutedula oacutesea y retrasando la conversioacuten de estas en osteoblastos Los osteoclastos absorben el hueso mediante la liberacioacuten de hormonas proteoliacuteticas liberadas por lisosomas y la secrecioacuten de varios aacutecidos entre ellos el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido laacutectico Aumenta la reabsorcioacuten del calcio y reduce la resorcioacuten del fosfato en los tuacutebulos renales provocando que este salga en la orina en mayor concentracioacuten Aumenta la resorcioacuten del calcio en el intestino Induce un incremento en la formacioacuten del 125-dihidroxicolecalciferol (forma activa de la Vitamina D calitriol o Vitamina D3) a partir del 25-hidroxicolecalciferol (calcifediol) en los rintildeones la vitamina D3 luego actuacutea a nivel del epitelio intestinal aumentando la absorcioacuten del calcio aumentando asiacute los

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ENDOCRINOLOGIA

niveles de calcio plasmaacuteticos (valor normal del calcio plasmaacutetico 92-104 mgdl) Luego por un mecanismo de retroaccioacuten o retroalimentacioacuten negativa elevadas concentraciones de calcio plasmaacuteticos inhiben la secrecioacuten de la PTH (Hormona paratiroidea)ademaacutes ayuda a la reabsorcion del calcio por medio de los rintildeones

Calcitonina Secretada por las ceacutelulas parafoliculares en la Tiroides es un polipeacuteptido de 32 aminoaacutecidos con un peso molecular aproximado de 3000 Daltons aproximadamente Tiene una funcioacuten opuesta a la Hormona Paratiroidea disminuye la actividad osteoclaacutestica desacelera la formacioacuten de los osteoclastos y acelera la formacioacuten de osteoblastos (ceacutelulas encargadas de la formacioacuten del hueso)

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ENDOCRINOLOGIA

Glaacutendula suprarrenal

Las glaacutendulas con forma de triaacutengulo que estaacuten situadas encima de los rintildeones cuya funcioacuten es la de regular las respuestas al estreacutes a traveacutes de la siacutentesis de corticosteroides (principalmente cortisol) y catecolaminas (adrenalina sobre todo)

Capas de la glaacutendula suprarrenal

Introduccioacuten

Anatoacutemicamente las glaacutendulas suprarrenales estaacuten separadas situadas en la cara anterosuperior de los rintildeones y estaacuten irrigadas por la sangre que reciben de las suprarrenales (las suprarrenales superiores las suprarrenales medias y las suprarrenales inferiores) Estaacuten formadas por estructuras diferentes que son la meacutedula suprarrenal y la corteza suprarrenal ambas inervadas por el sistema nervioso autoacutenomo Como su nombre sugiere la meacutedula suprarrenal estaacute situada dentro de la glaacutendula rodeada por la corteza suprarrenal que forma la superficie

Meacutedula suprarrenal La suprarrenal o meacutedula adrenal estaacute compuesta principalmente por ceacutelulas cromafines productoras de hormonas siendo el principal oacutergano de conversioacuten del aminoaacutecido tirosina en catecolaminas epinefrina y norepinefrina tambieacuten llamadas adrenalina y noradrenalina respectivamente Las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal derivan embrioloacutegicamente de la cresta neural como neuronas modificadas Realmente estas ceacutelulas son ceacutelulas postganglionares del sistema nervioso simpaacutetico que reciben la inervacioacuten de ceacutelulas preganglionares Como las sinapsis entre fibras pre y postganglionares seon ganglios nerviosos autonoacutemicos la meacutedula suprarrenal puede considerarse como un ganglio nervioso del sistema nervioso simpaacutetico

En respuesta a una situacioacuten estresante como es el ejercicio fiacutesico o un peligro inminente las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal producen catecolaminas a la sangre en una relacioacuten 70 a 30 de epinefrina y norepinefrina respectivamente

Trabajo final Paacutegina 21

ENDOCRINOLOGIA

La epinefrina produce efectos importantes como el aumento de la frecuencia cardiacuteaca vasoconstriccioacuten broncodilatacioacuten y aumento del metabolismo que son respuestas muy fugaces

Corteza suprarrenal

La corteza suprarrenal o corteza adrenal estaacute situada rodeando la circunferencia de la glaacutendula suprarrenal Su funcioacuten es la de regular varios componentes del metabolismo con la produccioacuten de mineralcorticoides y glucocorticoides que incluyen a la aldosterona y cortisol La corteza suprarrenal tambieacuten es un lugar secundario de siacutentesis de androacutegenos

La corteza suprarrenal secreta hormonas esteroideas (de naturaleza lipidica) por lo que sus ceacutelulas presentan abundante REL (reticulo endoplasmaacutetico liso) y mitocondrias con crestas longitudinales al MET Se dispone en tres capas diferentes de tejido basado en los tipos celulares y la funcioacuten que realizan

Zona glomerular Produccioacuten de mineralocorticoides sobre todo aldosterona

Zona fascicular Produccioacuten de glucocorticoides principalmente cortisol cerca del 95

Zona reticular Produccioacuten de androacutegenos incluyendo testosterona

Zona glomerular

Las ceacutelulas de la zona glomerular de la corteza suprarrenal segregan mineralocorticoides como la aldosterona y la desoxicorticosterona en respuesta a un aumento de los niveles de potasio o descenso del flujo de sangre en los rintildeones La aldosterona es liberada a la sangre formando parte del sistema renina-angiotensina que regula la concentracioacuten de electrolitos en la sangre sobre todo de sodio y potasio actuando en el tuacutebulo contorneado distal de la nefrona de los rintildeones

Aumentando la excrecioacuten de potasio Aumentando la reabsorcioacuten de sodio

La Aldosterona es una hormona que ayuda a regular la presioacuten osmoacutetica de mi organismo Por ejemplo si en el plasma sanguiacuteneo hay una escasez de sales ([osmolaridad] baja) se secretaraacute mayor cantidad de Aldosterona para reabsorber maacutes sodio y por consiguiente normalizar los niveles Lo mismo si hay una concentracioacuten muy elevada de sales en la sangre (osmolaridad alta) se secretaraacute menos o se inhibiraacute la secrecioacuten de Aldosterona para no tener que reabsorber el Sodio y por consiguiente eliminarlo normalizando las concentraciones

Zona fascicular

Capa predominante en la corteza suprarrenal cuyas celulas se disponen en hileras separadas por tabiques y capilares Sus ceacutelulas se llaman espongiocitos

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ENDOCRINOLOGIA

porque son voluminosas y contienen numerosos granulos claros dando a su superficie un aspecto de esponja Estas ceacutelulas segregan glucocorticoides como el cortisol o hidrocortisona y la cortisona al ser estimuladas por la hormona adrenocorticotropica (ACTH) La ACTH es producida por la hipoacutefisis en respuesta al factor hipotalaacutemico estimulante de corticotropina (CRH) Estos tres oacuterganos del sistema endocrino forman el eje hipotaacutelamo-hipofisario-suprarrenal

El principal glucocorticoide producido por las glaacutendulas suprarrenales es el cortisol que cumple diferentes funciones en el metabolismo en muacuteltiples ceacutelulas del organismo como

Estimulacioacuten de la produccioacuten de aminoaacutecidos por el cuerpo rompiendo proteiacutenas proteoacutelisis

Estimulacioacuten de la lipoacutelisis es decir rompiendo la grasa

Estimulacioacuten gluconeogeacutenesis la produccioacuten de glucosa a partir de nuevas fuentes como los aminaacutecidos y la glicerina de los aacutecidos grasos

Mantenimiento de la glucosa inhibiendo su liberacioacuten desde el muacutesculo y del tejido adiposo

Los glucocorticoides aumentan las concentraciones de glucosa en sangre pues actuacutean como antagonistas de la insulina e inhiben su liberacioacuten lo que produce una disminucioacuten de la captacioacuten de glucosa por los tejidos esto favorece que aumente la siacutentesis de glucosa en el hiacutegado y aumente la cantidad de glucoacutegeno en este mismo

Los glucocorticoides tambieacuten tienen propiedades antiinflamatorias que estaacuten relacionadas con sus efectos sobre la microcirculacioacuten y la inhibicioacuten de las citocinas pro-inflamatorias (IL-1 e IL-6) prostaglandinas y linfocinas Por lo tanto regulan las respuestas inmunitarias a traveacutes del llamado eje inmunosuprarrenal

Tambieacuten el cortisol tiene efectos importantes sobre la regulacioacuten del agua corporal retrasando la entrada de este liacutequido del espacio extracelular al intracelular Por lo que favorece la eliminacioacuten renal de agua

El cortisol inhibe la secrecioacuten de la propiomelanocortina (precursor de ACTH) de la CRH (Hormona liberadora de Corticotropina producida por las ceacutelulas de la eminencia media del hipotaacutelamo) y de Vasopresina

Zona reticular

Es la maacutes interna y presenta ceacutelulas dispuestas en cordones entrecruzados o anastomosados que segregan esteroides sexuales como estroacutegenos y androacutegenos

Las ceacutelulas de la zona reticular producen una fuente secundaria de androacutegenos como testosterona dihidrotestosterona (DHT) androstendiona y

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dehidroepiandrosterona (DHEA) Estas hormonas aumentan la masa muscular estimulan el crecimiento celular y ayudan al desarrollo de los caracteres sexuales secundarios

Paacutencreas

El paacutencreas oacutergano que segrega enzimas digestivas que pasan al intestino delgado Estas enzimas ayudan en la ruptura de carbohidratos liacutepidos proteinas y aacutecidos nucleacuteicos en el quimo Tiene forma coacutenica con un proceso uniforme medial e inferior En la especie humana su longitud oscila entre 20 y 30 cm tiene una anchura de unos 4 cm y un grosor de 5 centiacutemetros con un peso 30g La cabeza se localiza en la concavidad del duodeno o asa duodenal formada por la segunda porcioacuten del duodeno

Histologiacutea del paacutencreas

El paacutencreas tiene una parte exocrina y una parte endocrina

La parte exocrina contiene unas glaacutendulas llamadas aacutecinos serosos que son redondos u ovalados con ceacutelulas epiteliales Formados por las celuacutelas acinosas y en parte por las centroacinosas

La parte endocrina se agrupa en islotes de Langerhans que consisten en cuacutemulos de ceacutelulas secretoras de hormonas que producen insulina glucagoacuten y somatostatina Estos tipos de ceacutelulas son los siguientes

Ceacutelula alfa (Alfa cell)

Estas ceacutelulas alfa sintetizan y liberan glucagoacuten El glucagoacuten aumenta el nivel de glucosa sanguiacutenea al estimular la formacioacuten de este carbohidrato a partir del glucoacutegeno almacenado en hepatocitos Tambieacuten ejerce efecto en el metabolismo de proteiacutenas y grasas La liberacioacuten del glucagoacuten es inhibida por la hiperglucemia Representan entre el 10 - 20 del volumen del islote y se distribuyen de forma perifeacuterica

Ceacutelula beta (Beta Cell)

Las ceacutelulas beta producen y liberan insulina hormona que regula el nivel de glucosa en la sangre (facilitando el uso de glucosa por parte de las ceacutelulas y retirando el exceso de glucosa que se almacena en el hiacutegado en forma de glucoacutegeno)

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ENDOCRINOLOGIA

En los diabeacuteticos tipo I las ceacutelulas beta han sido dantildeadas y no son capaces de producir la hormona

Ceacutelula delta (Delta Cell)

Las ceacutelulas delta producen somatostatina hormona que se cree que regulariacutea la produccioacuten y liberacioacuten de la insulina por las ceacutelulas beta y la produccioacuten y liberacioacuten de glucagoacuten por las ceacutelulas alfa

Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)

Estas ceacutelulas hacen que el estoacutemago produzca y libere la hormona Grelina

Ceacutelula F (PP CELL)

Estas ceacutelulas producen y liberan Polipeacuteptido Pancreaacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

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ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

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ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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ENDOCRINOLOGIA

Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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ENDOCRINOLOGIA

Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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ENDOCRINOLOGIA

5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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ENDOCRINOLOGIA

como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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ENDOCRINOLOGIA

cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
                                            • a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net
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ENDOCRINOLOGIA

Una parte de los productos conjugados eliminados por la bilis se hidroliza y se absorbe como hormona activa en el intestino Es un fenoacutemeno conocido como circulacioacuten enterohepaacutetica El resto se elimina por las heces

En la circulacioacuten sanguiacutenea la T4 se metaboliza a T3 y T3 reversa las que a su vez se desyodan produceacutendose diyodotironinas inactivas

Efectos de las hormonas tiroideas

Las hormonas tiroideas tienen dos efectos fisioloacutegicos principales

1 Aumentan la siacutentesis de proteiacutenas praacutecticamente en todos los tejidos del organismo (La T3 y la T4 penetran en las ceacutelulas donde la T3 que se obtiene de la circulacioacuten y por la conversioacuten de T4 en T3 dentro de la ceacutelula se une a receptores nucleares individuales e influye sobre la formacioacuten de ARNm)

2 La T3 incrementa el consumo de oxiacutegeno mediante el aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa (bomba sodio-potasio) sobre todo en los tejidos responsables del consumo basal de oxiacutegeno (es decir hiacutegado rintildeoacuten corazoacuten y muacutesculo esqueleacutetico) El aumento de actividad de la Sodio-potasio ATPasa es secundario al incremento de la siacutentesis de esta enzima por consiguiente el aumento del consumo de oxiacutegeno probablemente tambieacuten estaacute relacionado con la fijacioacuten nuclear de hormonas tiroideas No obstante no se ha descartado un efecto directo de la T3 sobre la mitocondria Se cree que la T3 es la hormona tiroidea activa aunque la misma T4 pueda ser bioloacutegicamente activa

Efectos fisioloacutegicos

Desarrollo normal del sistema nervioso central en el feto Funcionamiento normal del sistema nervioso central Su falta enlentece

su funcionamiento

Generacioacuten de calor

Efectos cronotroacutepico e inotroacutepico en el sistema cardiovascular

Aumenta el nuacutemero de receptores para catecolaminas y amplifica la respuesta postreceptor en el sistema simpaacutetico3

Aumenta la eritropoyetina

Regula el metabolismo oacuteseo

Permite la relajacioacuten muscular

Interviene en los niveles de produccioacuten de hormonas gonadotrofinas y somatotropa o GH

Permite la correcta respuesta del centro respiratorio a la hipoxia e hipercapnia

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ENDOCRINOLOGIA

Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma

Las hormonas tiroideas circulan unidas a proteiacutenas plasmaacuteticas Un porcentaje bajo de T4 y T3 circula libremente por la sangre y es de este porcentaje bajo de hormona que depende la accioacuten hormonal sobre los receptores celulares

Las proteiacutenas a las que se unen las hormonas tiroideas son

Globulina transportadora de tiroxina o TBG (del ingleacutes Thyroxin Binding Globulin)

Prealbuacutemina transportadora de tiroxina o TBPA (del ingleacutes Thyroxin Binding Pre Albumin)

Albuacutemina

Ya que existen factores que afectan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas mencionadas modificando la cantidad de hormona libre es muy importante medir la hormona libre en el plasma para evaluar la condicioacuten fisiopatoloacutegica en estudio

Por ejemplo los siguientes faacutermacos compiten con las hormonas tiroideas por su unioacuten con las proteiacutenas transportadoras

Salicilatos Hidantoiacutenas

Algunos antiinflamatorios no esteroideos como el Diclofenaco y el aacutecido mefenaacutemico

Furosemida

Por el contrario los siguientes faacutermacos incrementan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas transportadoras

Estroacutegenos Metadona

Clofibrato

Heroiacutena

Tamoxifeno

En el embarazo tambieacuten se modifica la afinidad de las hormonas tiroideas por las proteiacutenas transportadoras aumentando esta unioacuten y disminuyendo la hormona libre

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ENDOCRINOLOGIA

Paratiroides

Las glaacutendulas paratiroides son glaacutendulas endocrinas Situadas en el cuello generalmente localizadas en los polos De la glaacutendula tiroides que producen La hormona paratiroidea o paratohormona Por lo general hay cuatro glaacutendulas paratiroides Dos superiores y dos inferiores pero de forma ocasional puede haber cinco o maacutes Cuando existe alguna glaacutendula adicional eacutesta suele encontrarse en el mediastino en relacioacuten con el timo o dentro de la glaacutendula tiroides

La hormona paratiroidea participa en el control de la homeostasis del calcio y foacutesforo asiacute como en la fisiologiacutea del hueso

El exceso de funcioacuten de las glaacutendulas paratiroides se conoce como hiperparatiroidismo y suele cursar con elevacioacuten de los niveles plasmaacuteticos de calcio y fragilidad oacutesea que condiciona una mayor susceptibilidad a padecer fracturas La funcioacuten insuficiente de las glaacutendulas paratiroides (hipoparatiroidismo) es mucho menos frecuente y generalmente se presenta tras una cirugiacutea sobre la glaacutendula tiroides que conlleva la existencia de hipocalcemia Existen algunas enfermedades mucho maacutes raras que parecen deberse a alteraciones en el receptor de la hormona paratiroidea como la condroplasia metafiseal de Jansen y la condroplasia de Blomstrand

Hormona paratiroidea o parathormona Es secretada por las ceacutelulas principales de la glaacutendula paratiroides es un polipeacuteptido de 84 aminoaacutecidos cuyo peso molecular es de aproximadamente 9500 Daltons Facilita la absorcioacuten del calcio Vitamina D (en su forma natural) y fosfato conjuntamente en el intestino Aumenta la resorcioacuten de los huesos Mediante la produccioacuten de maacutes osteoclastos a partir de las ceacutelulas madre mesenquimatosas de la meacutedula oacutesea y retrasando la conversioacuten de estas en osteoblastos Los osteoclastos absorben el hueso mediante la liberacioacuten de hormonas proteoliacuteticas liberadas por lisosomas y la secrecioacuten de varios aacutecidos entre ellos el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido laacutectico Aumenta la reabsorcioacuten del calcio y reduce la resorcioacuten del fosfato en los tuacutebulos renales provocando que este salga en la orina en mayor concentracioacuten Aumenta la resorcioacuten del calcio en el intestino Induce un incremento en la formacioacuten del 125-dihidroxicolecalciferol (forma activa de la Vitamina D calitriol o Vitamina D3) a partir del 25-hidroxicolecalciferol (calcifediol) en los rintildeones la vitamina D3 luego actuacutea a nivel del epitelio intestinal aumentando la absorcioacuten del calcio aumentando asiacute los

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ENDOCRINOLOGIA

niveles de calcio plasmaacuteticos (valor normal del calcio plasmaacutetico 92-104 mgdl) Luego por un mecanismo de retroaccioacuten o retroalimentacioacuten negativa elevadas concentraciones de calcio plasmaacuteticos inhiben la secrecioacuten de la PTH (Hormona paratiroidea)ademaacutes ayuda a la reabsorcion del calcio por medio de los rintildeones

Calcitonina Secretada por las ceacutelulas parafoliculares en la Tiroides es un polipeacuteptido de 32 aminoaacutecidos con un peso molecular aproximado de 3000 Daltons aproximadamente Tiene una funcioacuten opuesta a la Hormona Paratiroidea disminuye la actividad osteoclaacutestica desacelera la formacioacuten de los osteoclastos y acelera la formacioacuten de osteoblastos (ceacutelulas encargadas de la formacioacuten del hueso)

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ENDOCRINOLOGIA

Glaacutendula suprarrenal

Las glaacutendulas con forma de triaacutengulo que estaacuten situadas encima de los rintildeones cuya funcioacuten es la de regular las respuestas al estreacutes a traveacutes de la siacutentesis de corticosteroides (principalmente cortisol) y catecolaminas (adrenalina sobre todo)

Capas de la glaacutendula suprarrenal

Introduccioacuten

Anatoacutemicamente las glaacutendulas suprarrenales estaacuten separadas situadas en la cara anterosuperior de los rintildeones y estaacuten irrigadas por la sangre que reciben de las suprarrenales (las suprarrenales superiores las suprarrenales medias y las suprarrenales inferiores) Estaacuten formadas por estructuras diferentes que son la meacutedula suprarrenal y la corteza suprarrenal ambas inervadas por el sistema nervioso autoacutenomo Como su nombre sugiere la meacutedula suprarrenal estaacute situada dentro de la glaacutendula rodeada por la corteza suprarrenal que forma la superficie

Meacutedula suprarrenal La suprarrenal o meacutedula adrenal estaacute compuesta principalmente por ceacutelulas cromafines productoras de hormonas siendo el principal oacutergano de conversioacuten del aminoaacutecido tirosina en catecolaminas epinefrina y norepinefrina tambieacuten llamadas adrenalina y noradrenalina respectivamente Las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal derivan embrioloacutegicamente de la cresta neural como neuronas modificadas Realmente estas ceacutelulas son ceacutelulas postganglionares del sistema nervioso simpaacutetico que reciben la inervacioacuten de ceacutelulas preganglionares Como las sinapsis entre fibras pre y postganglionares seon ganglios nerviosos autonoacutemicos la meacutedula suprarrenal puede considerarse como un ganglio nervioso del sistema nervioso simpaacutetico

En respuesta a una situacioacuten estresante como es el ejercicio fiacutesico o un peligro inminente las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal producen catecolaminas a la sangre en una relacioacuten 70 a 30 de epinefrina y norepinefrina respectivamente

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ENDOCRINOLOGIA

La epinefrina produce efectos importantes como el aumento de la frecuencia cardiacuteaca vasoconstriccioacuten broncodilatacioacuten y aumento del metabolismo que son respuestas muy fugaces

Corteza suprarrenal

La corteza suprarrenal o corteza adrenal estaacute situada rodeando la circunferencia de la glaacutendula suprarrenal Su funcioacuten es la de regular varios componentes del metabolismo con la produccioacuten de mineralcorticoides y glucocorticoides que incluyen a la aldosterona y cortisol La corteza suprarrenal tambieacuten es un lugar secundario de siacutentesis de androacutegenos

La corteza suprarrenal secreta hormonas esteroideas (de naturaleza lipidica) por lo que sus ceacutelulas presentan abundante REL (reticulo endoplasmaacutetico liso) y mitocondrias con crestas longitudinales al MET Se dispone en tres capas diferentes de tejido basado en los tipos celulares y la funcioacuten que realizan

Zona glomerular Produccioacuten de mineralocorticoides sobre todo aldosterona

Zona fascicular Produccioacuten de glucocorticoides principalmente cortisol cerca del 95

Zona reticular Produccioacuten de androacutegenos incluyendo testosterona

Zona glomerular

Las ceacutelulas de la zona glomerular de la corteza suprarrenal segregan mineralocorticoides como la aldosterona y la desoxicorticosterona en respuesta a un aumento de los niveles de potasio o descenso del flujo de sangre en los rintildeones La aldosterona es liberada a la sangre formando parte del sistema renina-angiotensina que regula la concentracioacuten de electrolitos en la sangre sobre todo de sodio y potasio actuando en el tuacutebulo contorneado distal de la nefrona de los rintildeones

Aumentando la excrecioacuten de potasio Aumentando la reabsorcioacuten de sodio

La Aldosterona es una hormona que ayuda a regular la presioacuten osmoacutetica de mi organismo Por ejemplo si en el plasma sanguiacuteneo hay una escasez de sales ([osmolaridad] baja) se secretaraacute mayor cantidad de Aldosterona para reabsorber maacutes sodio y por consiguiente normalizar los niveles Lo mismo si hay una concentracioacuten muy elevada de sales en la sangre (osmolaridad alta) se secretaraacute menos o se inhibiraacute la secrecioacuten de Aldosterona para no tener que reabsorber el Sodio y por consiguiente eliminarlo normalizando las concentraciones

Zona fascicular

Capa predominante en la corteza suprarrenal cuyas celulas se disponen en hileras separadas por tabiques y capilares Sus ceacutelulas se llaman espongiocitos

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ENDOCRINOLOGIA

porque son voluminosas y contienen numerosos granulos claros dando a su superficie un aspecto de esponja Estas ceacutelulas segregan glucocorticoides como el cortisol o hidrocortisona y la cortisona al ser estimuladas por la hormona adrenocorticotropica (ACTH) La ACTH es producida por la hipoacutefisis en respuesta al factor hipotalaacutemico estimulante de corticotropina (CRH) Estos tres oacuterganos del sistema endocrino forman el eje hipotaacutelamo-hipofisario-suprarrenal

El principal glucocorticoide producido por las glaacutendulas suprarrenales es el cortisol que cumple diferentes funciones en el metabolismo en muacuteltiples ceacutelulas del organismo como

Estimulacioacuten de la produccioacuten de aminoaacutecidos por el cuerpo rompiendo proteiacutenas proteoacutelisis

Estimulacioacuten de la lipoacutelisis es decir rompiendo la grasa

Estimulacioacuten gluconeogeacutenesis la produccioacuten de glucosa a partir de nuevas fuentes como los aminaacutecidos y la glicerina de los aacutecidos grasos

Mantenimiento de la glucosa inhibiendo su liberacioacuten desde el muacutesculo y del tejido adiposo

Los glucocorticoides aumentan las concentraciones de glucosa en sangre pues actuacutean como antagonistas de la insulina e inhiben su liberacioacuten lo que produce una disminucioacuten de la captacioacuten de glucosa por los tejidos esto favorece que aumente la siacutentesis de glucosa en el hiacutegado y aumente la cantidad de glucoacutegeno en este mismo

Los glucocorticoides tambieacuten tienen propiedades antiinflamatorias que estaacuten relacionadas con sus efectos sobre la microcirculacioacuten y la inhibicioacuten de las citocinas pro-inflamatorias (IL-1 e IL-6) prostaglandinas y linfocinas Por lo tanto regulan las respuestas inmunitarias a traveacutes del llamado eje inmunosuprarrenal

Tambieacuten el cortisol tiene efectos importantes sobre la regulacioacuten del agua corporal retrasando la entrada de este liacutequido del espacio extracelular al intracelular Por lo que favorece la eliminacioacuten renal de agua

El cortisol inhibe la secrecioacuten de la propiomelanocortina (precursor de ACTH) de la CRH (Hormona liberadora de Corticotropina producida por las ceacutelulas de la eminencia media del hipotaacutelamo) y de Vasopresina

Zona reticular

Es la maacutes interna y presenta ceacutelulas dispuestas en cordones entrecruzados o anastomosados que segregan esteroides sexuales como estroacutegenos y androacutegenos

Las ceacutelulas de la zona reticular producen una fuente secundaria de androacutegenos como testosterona dihidrotestosterona (DHT) androstendiona y

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ENDOCRINOLOGIA

dehidroepiandrosterona (DHEA) Estas hormonas aumentan la masa muscular estimulan el crecimiento celular y ayudan al desarrollo de los caracteres sexuales secundarios

Paacutencreas

El paacutencreas oacutergano que segrega enzimas digestivas que pasan al intestino delgado Estas enzimas ayudan en la ruptura de carbohidratos liacutepidos proteinas y aacutecidos nucleacuteicos en el quimo Tiene forma coacutenica con un proceso uniforme medial e inferior En la especie humana su longitud oscila entre 20 y 30 cm tiene una anchura de unos 4 cm y un grosor de 5 centiacutemetros con un peso 30g La cabeza se localiza en la concavidad del duodeno o asa duodenal formada por la segunda porcioacuten del duodeno

Histologiacutea del paacutencreas

El paacutencreas tiene una parte exocrina y una parte endocrina

La parte exocrina contiene unas glaacutendulas llamadas aacutecinos serosos que son redondos u ovalados con ceacutelulas epiteliales Formados por las celuacutelas acinosas y en parte por las centroacinosas

La parte endocrina se agrupa en islotes de Langerhans que consisten en cuacutemulos de ceacutelulas secretoras de hormonas que producen insulina glucagoacuten y somatostatina Estos tipos de ceacutelulas son los siguientes

Ceacutelula alfa (Alfa cell)

Estas ceacutelulas alfa sintetizan y liberan glucagoacuten El glucagoacuten aumenta el nivel de glucosa sanguiacutenea al estimular la formacioacuten de este carbohidrato a partir del glucoacutegeno almacenado en hepatocitos Tambieacuten ejerce efecto en el metabolismo de proteiacutenas y grasas La liberacioacuten del glucagoacuten es inhibida por la hiperglucemia Representan entre el 10 - 20 del volumen del islote y se distribuyen de forma perifeacuterica

Ceacutelula beta (Beta Cell)

Las ceacutelulas beta producen y liberan insulina hormona que regula el nivel de glucosa en la sangre (facilitando el uso de glucosa por parte de las ceacutelulas y retirando el exceso de glucosa que se almacena en el hiacutegado en forma de glucoacutegeno)

Trabajo final Paacutegina 24

ENDOCRINOLOGIA

En los diabeacuteticos tipo I las ceacutelulas beta han sido dantildeadas y no son capaces de producir la hormona

Ceacutelula delta (Delta Cell)

Las ceacutelulas delta producen somatostatina hormona que se cree que regulariacutea la produccioacuten y liberacioacuten de la insulina por las ceacutelulas beta y la produccioacuten y liberacioacuten de glucagoacuten por las ceacutelulas alfa

Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)

Estas ceacutelulas hacen que el estoacutemago produzca y libere la hormona Grelina

Ceacutelula F (PP CELL)

Estas ceacutelulas producen y liberan Polipeacuteptido Pancreaacutetico

Trabajo final Paacutegina 25

ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

Trabajo final Paacutegina 26

ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

Trabajo final Paacutegina 27

ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

Trabajo final Paacutegina 28

ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

Trabajo final Paacutegina 30

ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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ENDOCRINOLOGIA

Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

httpwwwcirujanosdechileclRevistaPDF20Cirujanos202005_02RevCir205(14)AVpdf

httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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ENDOCRINOLOGIA

Trabajo final Paacutegina 53

  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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ENDOCRINOLOGIA

Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma

Las hormonas tiroideas circulan unidas a proteiacutenas plasmaacuteticas Un porcentaje bajo de T4 y T3 circula libremente por la sangre y es de este porcentaje bajo de hormona que depende la accioacuten hormonal sobre los receptores celulares

Las proteiacutenas a las que se unen las hormonas tiroideas son

Globulina transportadora de tiroxina o TBG (del ingleacutes Thyroxin Binding Globulin)

Prealbuacutemina transportadora de tiroxina o TBPA (del ingleacutes Thyroxin Binding Pre Albumin)

Albuacutemina

Ya que existen factores que afectan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas mencionadas modificando la cantidad de hormona libre es muy importante medir la hormona libre en el plasma para evaluar la condicioacuten fisiopatoloacutegica en estudio

Por ejemplo los siguientes faacutermacos compiten con las hormonas tiroideas por su unioacuten con las proteiacutenas transportadoras

Salicilatos Hidantoiacutenas

Algunos antiinflamatorios no esteroideos como el Diclofenaco y el aacutecido mefenaacutemico

Furosemida

Por el contrario los siguientes faacutermacos incrementan la unioacuten de las hormonas tiroideas a las proteiacutenas transportadoras

Estroacutegenos Metadona

Clofibrato

Heroiacutena

Tamoxifeno

En el embarazo tambieacuten se modifica la afinidad de las hormonas tiroideas por las proteiacutenas transportadoras aumentando esta unioacuten y disminuyendo la hormona libre

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ENDOCRINOLOGIA

Paratiroides

Las glaacutendulas paratiroides son glaacutendulas endocrinas Situadas en el cuello generalmente localizadas en los polos De la glaacutendula tiroides que producen La hormona paratiroidea o paratohormona Por lo general hay cuatro glaacutendulas paratiroides Dos superiores y dos inferiores pero de forma ocasional puede haber cinco o maacutes Cuando existe alguna glaacutendula adicional eacutesta suele encontrarse en el mediastino en relacioacuten con el timo o dentro de la glaacutendula tiroides

La hormona paratiroidea participa en el control de la homeostasis del calcio y foacutesforo asiacute como en la fisiologiacutea del hueso

El exceso de funcioacuten de las glaacutendulas paratiroides se conoce como hiperparatiroidismo y suele cursar con elevacioacuten de los niveles plasmaacuteticos de calcio y fragilidad oacutesea que condiciona una mayor susceptibilidad a padecer fracturas La funcioacuten insuficiente de las glaacutendulas paratiroides (hipoparatiroidismo) es mucho menos frecuente y generalmente se presenta tras una cirugiacutea sobre la glaacutendula tiroides que conlleva la existencia de hipocalcemia Existen algunas enfermedades mucho maacutes raras que parecen deberse a alteraciones en el receptor de la hormona paratiroidea como la condroplasia metafiseal de Jansen y la condroplasia de Blomstrand

Hormona paratiroidea o parathormona Es secretada por las ceacutelulas principales de la glaacutendula paratiroides es un polipeacuteptido de 84 aminoaacutecidos cuyo peso molecular es de aproximadamente 9500 Daltons Facilita la absorcioacuten del calcio Vitamina D (en su forma natural) y fosfato conjuntamente en el intestino Aumenta la resorcioacuten de los huesos Mediante la produccioacuten de maacutes osteoclastos a partir de las ceacutelulas madre mesenquimatosas de la meacutedula oacutesea y retrasando la conversioacuten de estas en osteoblastos Los osteoclastos absorben el hueso mediante la liberacioacuten de hormonas proteoliacuteticas liberadas por lisosomas y la secrecioacuten de varios aacutecidos entre ellos el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido laacutectico Aumenta la reabsorcioacuten del calcio y reduce la resorcioacuten del fosfato en los tuacutebulos renales provocando que este salga en la orina en mayor concentracioacuten Aumenta la resorcioacuten del calcio en el intestino Induce un incremento en la formacioacuten del 125-dihidroxicolecalciferol (forma activa de la Vitamina D calitriol o Vitamina D3) a partir del 25-hidroxicolecalciferol (calcifediol) en los rintildeones la vitamina D3 luego actuacutea a nivel del epitelio intestinal aumentando la absorcioacuten del calcio aumentando asiacute los

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ENDOCRINOLOGIA

niveles de calcio plasmaacuteticos (valor normal del calcio plasmaacutetico 92-104 mgdl) Luego por un mecanismo de retroaccioacuten o retroalimentacioacuten negativa elevadas concentraciones de calcio plasmaacuteticos inhiben la secrecioacuten de la PTH (Hormona paratiroidea)ademaacutes ayuda a la reabsorcion del calcio por medio de los rintildeones

Calcitonina Secretada por las ceacutelulas parafoliculares en la Tiroides es un polipeacuteptido de 32 aminoaacutecidos con un peso molecular aproximado de 3000 Daltons aproximadamente Tiene una funcioacuten opuesta a la Hormona Paratiroidea disminuye la actividad osteoclaacutestica desacelera la formacioacuten de los osteoclastos y acelera la formacioacuten de osteoblastos (ceacutelulas encargadas de la formacioacuten del hueso)

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ENDOCRINOLOGIA

Glaacutendula suprarrenal

Las glaacutendulas con forma de triaacutengulo que estaacuten situadas encima de los rintildeones cuya funcioacuten es la de regular las respuestas al estreacutes a traveacutes de la siacutentesis de corticosteroides (principalmente cortisol) y catecolaminas (adrenalina sobre todo)

Capas de la glaacutendula suprarrenal

Introduccioacuten

Anatoacutemicamente las glaacutendulas suprarrenales estaacuten separadas situadas en la cara anterosuperior de los rintildeones y estaacuten irrigadas por la sangre que reciben de las suprarrenales (las suprarrenales superiores las suprarrenales medias y las suprarrenales inferiores) Estaacuten formadas por estructuras diferentes que son la meacutedula suprarrenal y la corteza suprarrenal ambas inervadas por el sistema nervioso autoacutenomo Como su nombre sugiere la meacutedula suprarrenal estaacute situada dentro de la glaacutendula rodeada por la corteza suprarrenal que forma la superficie

Meacutedula suprarrenal La suprarrenal o meacutedula adrenal estaacute compuesta principalmente por ceacutelulas cromafines productoras de hormonas siendo el principal oacutergano de conversioacuten del aminoaacutecido tirosina en catecolaminas epinefrina y norepinefrina tambieacuten llamadas adrenalina y noradrenalina respectivamente Las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal derivan embrioloacutegicamente de la cresta neural como neuronas modificadas Realmente estas ceacutelulas son ceacutelulas postganglionares del sistema nervioso simpaacutetico que reciben la inervacioacuten de ceacutelulas preganglionares Como las sinapsis entre fibras pre y postganglionares seon ganglios nerviosos autonoacutemicos la meacutedula suprarrenal puede considerarse como un ganglio nervioso del sistema nervioso simpaacutetico

En respuesta a una situacioacuten estresante como es el ejercicio fiacutesico o un peligro inminente las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal producen catecolaminas a la sangre en una relacioacuten 70 a 30 de epinefrina y norepinefrina respectivamente

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ENDOCRINOLOGIA

La epinefrina produce efectos importantes como el aumento de la frecuencia cardiacuteaca vasoconstriccioacuten broncodilatacioacuten y aumento del metabolismo que son respuestas muy fugaces

Corteza suprarrenal

La corteza suprarrenal o corteza adrenal estaacute situada rodeando la circunferencia de la glaacutendula suprarrenal Su funcioacuten es la de regular varios componentes del metabolismo con la produccioacuten de mineralcorticoides y glucocorticoides que incluyen a la aldosterona y cortisol La corteza suprarrenal tambieacuten es un lugar secundario de siacutentesis de androacutegenos

La corteza suprarrenal secreta hormonas esteroideas (de naturaleza lipidica) por lo que sus ceacutelulas presentan abundante REL (reticulo endoplasmaacutetico liso) y mitocondrias con crestas longitudinales al MET Se dispone en tres capas diferentes de tejido basado en los tipos celulares y la funcioacuten que realizan

Zona glomerular Produccioacuten de mineralocorticoides sobre todo aldosterona

Zona fascicular Produccioacuten de glucocorticoides principalmente cortisol cerca del 95

Zona reticular Produccioacuten de androacutegenos incluyendo testosterona

Zona glomerular

Las ceacutelulas de la zona glomerular de la corteza suprarrenal segregan mineralocorticoides como la aldosterona y la desoxicorticosterona en respuesta a un aumento de los niveles de potasio o descenso del flujo de sangre en los rintildeones La aldosterona es liberada a la sangre formando parte del sistema renina-angiotensina que regula la concentracioacuten de electrolitos en la sangre sobre todo de sodio y potasio actuando en el tuacutebulo contorneado distal de la nefrona de los rintildeones

Aumentando la excrecioacuten de potasio Aumentando la reabsorcioacuten de sodio

La Aldosterona es una hormona que ayuda a regular la presioacuten osmoacutetica de mi organismo Por ejemplo si en el plasma sanguiacuteneo hay una escasez de sales ([osmolaridad] baja) se secretaraacute mayor cantidad de Aldosterona para reabsorber maacutes sodio y por consiguiente normalizar los niveles Lo mismo si hay una concentracioacuten muy elevada de sales en la sangre (osmolaridad alta) se secretaraacute menos o se inhibiraacute la secrecioacuten de Aldosterona para no tener que reabsorber el Sodio y por consiguiente eliminarlo normalizando las concentraciones

Zona fascicular

Capa predominante en la corteza suprarrenal cuyas celulas se disponen en hileras separadas por tabiques y capilares Sus ceacutelulas se llaman espongiocitos

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ENDOCRINOLOGIA

porque son voluminosas y contienen numerosos granulos claros dando a su superficie un aspecto de esponja Estas ceacutelulas segregan glucocorticoides como el cortisol o hidrocortisona y la cortisona al ser estimuladas por la hormona adrenocorticotropica (ACTH) La ACTH es producida por la hipoacutefisis en respuesta al factor hipotalaacutemico estimulante de corticotropina (CRH) Estos tres oacuterganos del sistema endocrino forman el eje hipotaacutelamo-hipofisario-suprarrenal

El principal glucocorticoide producido por las glaacutendulas suprarrenales es el cortisol que cumple diferentes funciones en el metabolismo en muacuteltiples ceacutelulas del organismo como

Estimulacioacuten de la produccioacuten de aminoaacutecidos por el cuerpo rompiendo proteiacutenas proteoacutelisis

Estimulacioacuten de la lipoacutelisis es decir rompiendo la grasa

Estimulacioacuten gluconeogeacutenesis la produccioacuten de glucosa a partir de nuevas fuentes como los aminaacutecidos y la glicerina de los aacutecidos grasos

Mantenimiento de la glucosa inhibiendo su liberacioacuten desde el muacutesculo y del tejido adiposo

Los glucocorticoides aumentan las concentraciones de glucosa en sangre pues actuacutean como antagonistas de la insulina e inhiben su liberacioacuten lo que produce una disminucioacuten de la captacioacuten de glucosa por los tejidos esto favorece que aumente la siacutentesis de glucosa en el hiacutegado y aumente la cantidad de glucoacutegeno en este mismo

Los glucocorticoides tambieacuten tienen propiedades antiinflamatorias que estaacuten relacionadas con sus efectos sobre la microcirculacioacuten y la inhibicioacuten de las citocinas pro-inflamatorias (IL-1 e IL-6) prostaglandinas y linfocinas Por lo tanto regulan las respuestas inmunitarias a traveacutes del llamado eje inmunosuprarrenal

Tambieacuten el cortisol tiene efectos importantes sobre la regulacioacuten del agua corporal retrasando la entrada de este liacutequido del espacio extracelular al intracelular Por lo que favorece la eliminacioacuten renal de agua

El cortisol inhibe la secrecioacuten de la propiomelanocortina (precursor de ACTH) de la CRH (Hormona liberadora de Corticotropina producida por las ceacutelulas de la eminencia media del hipotaacutelamo) y de Vasopresina

Zona reticular

Es la maacutes interna y presenta ceacutelulas dispuestas en cordones entrecruzados o anastomosados que segregan esteroides sexuales como estroacutegenos y androacutegenos

Las ceacutelulas de la zona reticular producen una fuente secundaria de androacutegenos como testosterona dihidrotestosterona (DHT) androstendiona y

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ENDOCRINOLOGIA

dehidroepiandrosterona (DHEA) Estas hormonas aumentan la masa muscular estimulan el crecimiento celular y ayudan al desarrollo de los caracteres sexuales secundarios

Paacutencreas

El paacutencreas oacutergano que segrega enzimas digestivas que pasan al intestino delgado Estas enzimas ayudan en la ruptura de carbohidratos liacutepidos proteinas y aacutecidos nucleacuteicos en el quimo Tiene forma coacutenica con un proceso uniforme medial e inferior En la especie humana su longitud oscila entre 20 y 30 cm tiene una anchura de unos 4 cm y un grosor de 5 centiacutemetros con un peso 30g La cabeza se localiza en la concavidad del duodeno o asa duodenal formada por la segunda porcioacuten del duodeno

Histologiacutea del paacutencreas

El paacutencreas tiene una parte exocrina y una parte endocrina

La parte exocrina contiene unas glaacutendulas llamadas aacutecinos serosos que son redondos u ovalados con ceacutelulas epiteliales Formados por las celuacutelas acinosas y en parte por las centroacinosas

La parte endocrina se agrupa en islotes de Langerhans que consisten en cuacutemulos de ceacutelulas secretoras de hormonas que producen insulina glucagoacuten y somatostatina Estos tipos de ceacutelulas son los siguientes

Ceacutelula alfa (Alfa cell)

Estas ceacutelulas alfa sintetizan y liberan glucagoacuten El glucagoacuten aumenta el nivel de glucosa sanguiacutenea al estimular la formacioacuten de este carbohidrato a partir del glucoacutegeno almacenado en hepatocitos Tambieacuten ejerce efecto en el metabolismo de proteiacutenas y grasas La liberacioacuten del glucagoacuten es inhibida por la hiperglucemia Representan entre el 10 - 20 del volumen del islote y se distribuyen de forma perifeacuterica

Ceacutelula beta (Beta Cell)

Las ceacutelulas beta producen y liberan insulina hormona que regula el nivel de glucosa en la sangre (facilitando el uso de glucosa por parte de las ceacutelulas y retirando el exceso de glucosa que se almacena en el hiacutegado en forma de glucoacutegeno)

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ENDOCRINOLOGIA

En los diabeacuteticos tipo I las ceacutelulas beta han sido dantildeadas y no son capaces de producir la hormona

Ceacutelula delta (Delta Cell)

Las ceacutelulas delta producen somatostatina hormona que se cree que regulariacutea la produccioacuten y liberacioacuten de la insulina por las ceacutelulas beta y la produccioacuten y liberacioacuten de glucagoacuten por las ceacutelulas alfa

Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)

Estas ceacutelulas hacen que el estoacutemago produzca y libere la hormona Grelina

Ceacutelula F (PP CELL)

Estas ceacutelulas producen y liberan Polipeacuteptido Pancreaacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

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ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

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ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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ENDOCRINOLOGIA

Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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ENDOCRINOLOGIA

5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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ENDOCRINOLOGIA

como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
                                            • a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net
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ENDOCRINOLOGIA

Paratiroides

Las glaacutendulas paratiroides son glaacutendulas endocrinas Situadas en el cuello generalmente localizadas en los polos De la glaacutendula tiroides que producen La hormona paratiroidea o paratohormona Por lo general hay cuatro glaacutendulas paratiroides Dos superiores y dos inferiores pero de forma ocasional puede haber cinco o maacutes Cuando existe alguna glaacutendula adicional eacutesta suele encontrarse en el mediastino en relacioacuten con el timo o dentro de la glaacutendula tiroides

La hormona paratiroidea participa en el control de la homeostasis del calcio y foacutesforo asiacute como en la fisiologiacutea del hueso

El exceso de funcioacuten de las glaacutendulas paratiroides se conoce como hiperparatiroidismo y suele cursar con elevacioacuten de los niveles plasmaacuteticos de calcio y fragilidad oacutesea que condiciona una mayor susceptibilidad a padecer fracturas La funcioacuten insuficiente de las glaacutendulas paratiroides (hipoparatiroidismo) es mucho menos frecuente y generalmente se presenta tras una cirugiacutea sobre la glaacutendula tiroides que conlleva la existencia de hipocalcemia Existen algunas enfermedades mucho maacutes raras que parecen deberse a alteraciones en el receptor de la hormona paratiroidea como la condroplasia metafiseal de Jansen y la condroplasia de Blomstrand

Hormona paratiroidea o parathormona Es secretada por las ceacutelulas principales de la glaacutendula paratiroides es un polipeacuteptido de 84 aminoaacutecidos cuyo peso molecular es de aproximadamente 9500 Daltons Facilita la absorcioacuten del calcio Vitamina D (en su forma natural) y fosfato conjuntamente en el intestino Aumenta la resorcioacuten de los huesos Mediante la produccioacuten de maacutes osteoclastos a partir de las ceacutelulas madre mesenquimatosas de la meacutedula oacutesea y retrasando la conversioacuten de estas en osteoblastos Los osteoclastos absorben el hueso mediante la liberacioacuten de hormonas proteoliacuteticas liberadas por lisosomas y la secrecioacuten de varios aacutecidos entre ellos el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido laacutectico Aumenta la reabsorcioacuten del calcio y reduce la resorcioacuten del fosfato en los tuacutebulos renales provocando que este salga en la orina en mayor concentracioacuten Aumenta la resorcioacuten del calcio en el intestino Induce un incremento en la formacioacuten del 125-dihidroxicolecalciferol (forma activa de la Vitamina D calitriol o Vitamina D3) a partir del 25-hidroxicolecalciferol (calcifediol) en los rintildeones la vitamina D3 luego actuacutea a nivel del epitelio intestinal aumentando la absorcioacuten del calcio aumentando asiacute los

Trabajo final Paacutegina 19

ENDOCRINOLOGIA

niveles de calcio plasmaacuteticos (valor normal del calcio plasmaacutetico 92-104 mgdl) Luego por un mecanismo de retroaccioacuten o retroalimentacioacuten negativa elevadas concentraciones de calcio plasmaacuteticos inhiben la secrecioacuten de la PTH (Hormona paratiroidea)ademaacutes ayuda a la reabsorcion del calcio por medio de los rintildeones

Calcitonina Secretada por las ceacutelulas parafoliculares en la Tiroides es un polipeacuteptido de 32 aminoaacutecidos con un peso molecular aproximado de 3000 Daltons aproximadamente Tiene una funcioacuten opuesta a la Hormona Paratiroidea disminuye la actividad osteoclaacutestica desacelera la formacioacuten de los osteoclastos y acelera la formacioacuten de osteoblastos (ceacutelulas encargadas de la formacioacuten del hueso)

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ENDOCRINOLOGIA

Glaacutendula suprarrenal

Las glaacutendulas con forma de triaacutengulo que estaacuten situadas encima de los rintildeones cuya funcioacuten es la de regular las respuestas al estreacutes a traveacutes de la siacutentesis de corticosteroides (principalmente cortisol) y catecolaminas (adrenalina sobre todo)

Capas de la glaacutendula suprarrenal

Introduccioacuten

Anatoacutemicamente las glaacutendulas suprarrenales estaacuten separadas situadas en la cara anterosuperior de los rintildeones y estaacuten irrigadas por la sangre que reciben de las suprarrenales (las suprarrenales superiores las suprarrenales medias y las suprarrenales inferiores) Estaacuten formadas por estructuras diferentes que son la meacutedula suprarrenal y la corteza suprarrenal ambas inervadas por el sistema nervioso autoacutenomo Como su nombre sugiere la meacutedula suprarrenal estaacute situada dentro de la glaacutendula rodeada por la corteza suprarrenal que forma la superficie

Meacutedula suprarrenal La suprarrenal o meacutedula adrenal estaacute compuesta principalmente por ceacutelulas cromafines productoras de hormonas siendo el principal oacutergano de conversioacuten del aminoaacutecido tirosina en catecolaminas epinefrina y norepinefrina tambieacuten llamadas adrenalina y noradrenalina respectivamente Las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal derivan embrioloacutegicamente de la cresta neural como neuronas modificadas Realmente estas ceacutelulas son ceacutelulas postganglionares del sistema nervioso simpaacutetico que reciben la inervacioacuten de ceacutelulas preganglionares Como las sinapsis entre fibras pre y postganglionares seon ganglios nerviosos autonoacutemicos la meacutedula suprarrenal puede considerarse como un ganglio nervioso del sistema nervioso simpaacutetico

En respuesta a una situacioacuten estresante como es el ejercicio fiacutesico o un peligro inminente las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal producen catecolaminas a la sangre en una relacioacuten 70 a 30 de epinefrina y norepinefrina respectivamente

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ENDOCRINOLOGIA

La epinefrina produce efectos importantes como el aumento de la frecuencia cardiacuteaca vasoconstriccioacuten broncodilatacioacuten y aumento del metabolismo que son respuestas muy fugaces

Corteza suprarrenal

La corteza suprarrenal o corteza adrenal estaacute situada rodeando la circunferencia de la glaacutendula suprarrenal Su funcioacuten es la de regular varios componentes del metabolismo con la produccioacuten de mineralcorticoides y glucocorticoides que incluyen a la aldosterona y cortisol La corteza suprarrenal tambieacuten es un lugar secundario de siacutentesis de androacutegenos

La corteza suprarrenal secreta hormonas esteroideas (de naturaleza lipidica) por lo que sus ceacutelulas presentan abundante REL (reticulo endoplasmaacutetico liso) y mitocondrias con crestas longitudinales al MET Se dispone en tres capas diferentes de tejido basado en los tipos celulares y la funcioacuten que realizan

Zona glomerular Produccioacuten de mineralocorticoides sobre todo aldosterona

Zona fascicular Produccioacuten de glucocorticoides principalmente cortisol cerca del 95

Zona reticular Produccioacuten de androacutegenos incluyendo testosterona

Zona glomerular

Las ceacutelulas de la zona glomerular de la corteza suprarrenal segregan mineralocorticoides como la aldosterona y la desoxicorticosterona en respuesta a un aumento de los niveles de potasio o descenso del flujo de sangre en los rintildeones La aldosterona es liberada a la sangre formando parte del sistema renina-angiotensina que regula la concentracioacuten de electrolitos en la sangre sobre todo de sodio y potasio actuando en el tuacutebulo contorneado distal de la nefrona de los rintildeones

Aumentando la excrecioacuten de potasio Aumentando la reabsorcioacuten de sodio

La Aldosterona es una hormona que ayuda a regular la presioacuten osmoacutetica de mi organismo Por ejemplo si en el plasma sanguiacuteneo hay una escasez de sales ([osmolaridad] baja) se secretaraacute mayor cantidad de Aldosterona para reabsorber maacutes sodio y por consiguiente normalizar los niveles Lo mismo si hay una concentracioacuten muy elevada de sales en la sangre (osmolaridad alta) se secretaraacute menos o se inhibiraacute la secrecioacuten de Aldosterona para no tener que reabsorber el Sodio y por consiguiente eliminarlo normalizando las concentraciones

Zona fascicular

Capa predominante en la corteza suprarrenal cuyas celulas se disponen en hileras separadas por tabiques y capilares Sus ceacutelulas se llaman espongiocitos

Trabajo final Paacutegina 22

ENDOCRINOLOGIA

porque son voluminosas y contienen numerosos granulos claros dando a su superficie un aspecto de esponja Estas ceacutelulas segregan glucocorticoides como el cortisol o hidrocortisona y la cortisona al ser estimuladas por la hormona adrenocorticotropica (ACTH) La ACTH es producida por la hipoacutefisis en respuesta al factor hipotalaacutemico estimulante de corticotropina (CRH) Estos tres oacuterganos del sistema endocrino forman el eje hipotaacutelamo-hipofisario-suprarrenal

El principal glucocorticoide producido por las glaacutendulas suprarrenales es el cortisol que cumple diferentes funciones en el metabolismo en muacuteltiples ceacutelulas del organismo como

Estimulacioacuten de la produccioacuten de aminoaacutecidos por el cuerpo rompiendo proteiacutenas proteoacutelisis

Estimulacioacuten de la lipoacutelisis es decir rompiendo la grasa

Estimulacioacuten gluconeogeacutenesis la produccioacuten de glucosa a partir de nuevas fuentes como los aminaacutecidos y la glicerina de los aacutecidos grasos

Mantenimiento de la glucosa inhibiendo su liberacioacuten desde el muacutesculo y del tejido adiposo

Los glucocorticoides aumentan las concentraciones de glucosa en sangre pues actuacutean como antagonistas de la insulina e inhiben su liberacioacuten lo que produce una disminucioacuten de la captacioacuten de glucosa por los tejidos esto favorece que aumente la siacutentesis de glucosa en el hiacutegado y aumente la cantidad de glucoacutegeno en este mismo

Los glucocorticoides tambieacuten tienen propiedades antiinflamatorias que estaacuten relacionadas con sus efectos sobre la microcirculacioacuten y la inhibicioacuten de las citocinas pro-inflamatorias (IL-1 e IL-6) prostaglandinas y linfocinas Por lo tanto regulan las respuestas inmunitarias a traveacutes del llamado eje inmunosuprarrenal

Tambieacuten el cortisol tiene efectos importantes sobre la regulacioacuten del agua corporal retrasando la entrada de este liacutequido del espacio extracelular al intracelular Por lo que favorece la eliminacioacuten renal de agua

El cortisol inhibe la secrecioacuten de la propiomelanocortina (precursor de ACTH) de la CRH (Hormona liberadora de Corticotropina producida por las ceacutelulas de la eminencia media del hipotaacutelamo) y de Vasopresina

Zona reticular

Es la maacutes interna y presenta ceacutelulas dispuestas en cordones entrecruzados o anastomosados que segregan esteroides sexuales como estroacutegenos y androacutegenos

Las ceacutelulas de la zona reticular producen una fuente secundaria de androacutegenos como testosterona dihidrotestosterona (DHT) androstendiona y

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ENDOCRINOLOGIA

dehidroepiandrosterona (DHEA) Estas hormonas aumentan la masa muscular estimulan el crecimiento celular y ayudan al desarrollo de los caracteres sexuales secundarios

Paacutencreas

El paacutencreas oacutergano que segrega enzimas digestivas que pasan al intestino delgado Estas enzimas ayudan en la ruptura de carbohidratos liacutepidos proteinas y aacutecidos nucleacuteicos en el quimo Tiene forma coacutenica con un proceso uniforme medial e inferior En la especie humana su longitud oscila entre 20 y 30 cm tiene una anchura de unos 4 cm y un grosor de 5 centiacutemetros con un peso 30g La cabeza se localiza en la concavidad del duodeno o asa duodenal formada por la segunda porcioacuten del duodeno

Histologiacutea del paacutencreas

El paacutencreas tiene una parte exocrina y una parte endocrina

La parte exocrina contiene unas glaacutendulas llamadas aacutecinos serosos que son redondos u ovalados con ceacutelulas epiteliales Formados por las celuacutelas acinosas y en parte por las centroacinosas

La parte endocrina se agrupa en islotes de Langerhans que consisten en cuacutemulos de ceacutelulas secretoras de hormonas que producen insulina glucagoacuten y somatostatina Estos tipos de ceacutelulas son los siguientes

Ceacutelula alfa (Alfa cell)

Estas ceacutelulas alfa sintetizan y liberan glucagoacuten El glucagoacuten aumenta el nivel de glucosa sanguiacutenea al estimular la formacioacuten de este carbohidrato a partir del glucoacutegeno almacenado en hepatocitos Tambieacuten ejerce efecto en el metabolismo de proteiacutenas y grasas La liberacioacuten del glucagoacuten es inhibida por la hiperglucemia Representan entre el 10 - 20 del volumen del islote y se distribuyen de forma perifeacuterica

Ceacutelula beta (Beta Cell)

Las ceacutelulas beta producen y liberan insulina hormona que regula el nivel de glucosa en la sangre (facilitando el uso de glucosa por parte de las ceacutelulas y retirando el exceso de glucosa que se almacena en el hiacutegado en forma de glucoacutegeno)

Trabajo final Paacutegina 24

ENDOCRINOLOGIA

En los diabeacuteticos tipo I las ceacutelulas beta han sido dantildeadas y no son capaces de producir la hormona

Ceacutelula delta (Delta Cell)

Las ceacutelulas delta producen somatostatina hormona que se cree que regulariacutea la produccioacuten y liberacioacuten de la insulina por las ceacutelulas beta y la produccioacuten y liberacioacuten de glucagoacuten por las ceacutelulas alfa

Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)

Estas ceacutelulas hacen que el estoacutemago produzca y libere la hormona Grelina

Ceacutelula F (PP CELL)

Estas ceacutelulas producen y liberan Polipeacuteptido Pancreaacutetico

Trabajo final Paacutegina 25

ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

Trabajo final Paacutegina 26

ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

Trabajo final Paacutegina 27

ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

Trabajo final Paacutegina 28

ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

Trabajo final Paacutegina 29

ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

Trabajo final Paacutegina 30

ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ENDOCRINOLOGIA

ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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ENDOCRINOLOGIA

Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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ENDOCRINOLOGIA

2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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ENDOCRINOLOGIA

52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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ENDOCRINOLOGIA

BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

httpwwwcirujanosdechileclRevistaPDF20Cirujanos202005_02RevCir205(14)AVpdf

httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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ENDOCRINOLOGIA

Trabajo final Paacutegina 53

  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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Page 20: Trabajo Final Endocrinologia

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niveles de calcio plasmaacuteticos (valor normal del calcio plasmaacutetico 92-104 mgdl) Luego por un mecanismo de retroaccioacuten o retroalimentacioacuten negativa elevadas concentraciones de calcio plasmaacuteticos inhiben la secrecioacuten de la PTH (Hormona paratiroidea)ademaacutes ayuda a la reabsorcion del calcio por medio de los rintildeones

Calcitonina Secretada por las ceacutelulas parafoliculares en la Tiroides es un polipeacuteptido de 32 aminoaacutecidos con un peso molecular aproximado de 3000 Daltons aproximadamente Tiene una funcioacuten opuesta a la Hormona Paratiroidea disminuye la actividad osteoclaacutestica desacelera la formacioacuten de los osteoclastos y acelera la formacioacuten de osteoblastos (ceacutelulas encargadas de la formacioacuten del hueso)

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ENDOCRINOLOGIA

Glaacutendula suprarrenal

Las glaacutendulas con forma de triaacutengulo que estaacuten situadas encima de los rintildeones cuya funcioacuten es la de regular las respuestas al estreacutes a traveacutes de la siacutentesis de corticosteroides (principalmente cortisol) y catecolaminas (adrenalina sobre todo)

Capas de la glaacutendula suprarrenal

Introduccioacuten

Anatoacutemicamente las glaacutendulas suprarrenales estaacuten separadas situadas en la cara anterosuperior de los rintildeones y estaacuten irrigadas por la sangre que reciben de las suprarrenales (las suprarrenales superiores las suprarrenales medias y las suprarrenales inferiores) Estaacuten formadas por estructuras diferentes que son la meacutedula suprarrenal y la corteza suprarrenal ambas inervadas por el sistema nervioso autoacutenomo Como su nombre sugiere la meacutedula suprarrenal estaacute situada dentro de la glaacutendula rodeada por la corteza suprarrenal que forma la superficie

Meacutedula suprarrenal La suprarrenal o meacutedula adrenal estaacute compuesta principalmente por ceacutelulas cromafines productoras de hormonas siendo el principal oacutergano de conversioacuten del aminoaacutecido tirosina en catecolaminas epinefrina y norepinefrina tambieacuten llamadas adrenalina y noradrenalina respectivamente Las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal derivan embrioloacutegicamente de la cresta neural como neuronas modificadas Realmente estas ceacutelulas son ceacutelulas postganglionares del sistema nervioso simpaacutetico que reciben la inervacioacuten de ceacutelulas preganglionares Como las sinapsis entre fibras pre y postganglionares seon ganglios nerviosos autonoacutemicos la meacutedula suprarrenal puede considerarse como un ganglio nervioso del sistema nervioso simpaacutetico

En respuesta a una situacioacuten estresante como es el ejercicio fiacutesico o un peligro inminente las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal producen catecolaminas a la sangre en una relacioacuten 70 a 30 de epinefrina y norepinefrina respectivamente

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ENDOCRINOLOGIA

La epinefrina produce efectos importantes como el aumento de la frecuencia cardiacuteaca vasoconstriccioacuten broncodilatacioacuten y aumento del metabolismo que son respuestas muy fugaces

Corteza suprarrenal

La corteza suprarrenal o corteza adrenal estaacute situada rodeando la circunferencia de la glaacutendula suprarrenal Su funcioacuten es la de regular varios componentes del metabolismo con la produccioacuten de mineralcorticoides y glucocorticoides que incluyen a la aldosterona y cortisol La corteza suprarrenal tambieacuten es un lugar secundario de siacutentesis de androacutegenos

La corteza suprarrenal secreta hormonas esteroideas (de naturaleza lipidica) por lo que sus ceacutelulas presentan abundante REL (reticulo endoplasmaacutetico liso) y mitocondrias con crestas longitudinales al MET Se dispone en tres capas diferentes de tejido basado en los tipos celulares y la funcioacuten que realizan

Zona glomerular Produccioacuten de mineralocorticoides sobre todo aldosterona

Zona fascicular Produccioacuten de glucocorticoides principalmente cortisol cerca del 95

Zona reticular Produccioacuten de androacutegenos incluyendo testosterona

Zona glomerular

Las ceacutelulas de la zona glomerular de la corteza suprarrenal segregan mineralocorticoides como la aldosterona y la desoxicorticosterona en respuesta a un aumento de los niveles de potasio o descenso del flujo de sangre en los rintildeones La aldosterona es liberada a la sangre formando parte del sistema renina-angiotensina que regula la concentracioacuten de electrolitos en la sangre sobre todo de sodio y potasio actuando en el tuacutebulo contorneado distal de la nefrona de los rintildeones

Aumentando la excrecioacuten de potasio Aumentando la reabsorcioacuten de sodio

La Aldosterona es una hormona que ayuda a regular la presioacuten osmoacutetica de mi organismo Por ejemplo si en el plasma sanguiacuteneo hay una escasez de sales ([osmolaridad] baja) se secretaraacute mayor cantidad de Aldosterona para reabsorber maacutes sodio y por consiguiente normalizar los niveles Lo mismo si hay una concentracioacuten muy elevada de sales en la sangre (osmolaridad alta) se secretaraacute menos o se inhibiraacute la secrecioacuten de Aldosterona para no tener que reabsorber el Sodio y por consiguiente eliminarlo normalizando las concentraciones

Zona fascicular

Capa predominante en la corteza suprarrenal cuyas celulas se disponen en hileras separadas por tabiques y capilares Sus ceacutelulas se llaman espongiocitos

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ENDOCRINOLOGIA

porque son voluminosas y contienen numerosos granulos claros dando a su superficie un aspecto de esponja Estas ceacutelulas segregan glucocorticoides como el cortisol o hidrocortisona y la cortisona al ser estimuladas por la hormona adrenocorticotropica (ACTH) La ACTH es producida por la hipoacutefisis en respuesta al factor hipotalaacutemico estimulante de corticotropina (CRH) Estos tres oacuterganos del sistema endocrino forman el eje hipotaacutelamo-hipofisario-suprarrenal

El principal glucocorticoide producido por las glaacutendulas suprarrenales es el cortisol que cumple diferentes funciones en el metabolismo en muacuteltiples ceacutelulas del organismo como

Estimulacioacuten de la produccioacuten de aminoaacutecidos por el cuerpo rompiendo proteiacutenas proteoacutelisis

Estimulacioacuten de la lipoacutelisis es decir rompiendo la grasa

Estimulacioacuten gluconeogeacutenesis la produccioacuten de glucosa a partir de nuevas fuentes como los aminaacutecidos y la glicerina de los aacutecidos grasos

Mantenimiento de la glucosa inhibiendo su liberacioacuten desde el muacutesculo y del tejido adiposo

Los glucocorticoides aumentan las concentraciones de glucosa en sangre pues actuacutean como antagonistas de la insulina e inhiben su liberacioacuten lo que produce una disminucioacuten de la captacioacuten de glucosa por los tejidos esto favorece que aumente la siacutentesis de glucosa en el hiacutegado y aumente la cantidad de glucoacutegeno en este mismo

Los glucocorticoides tambieacuten tienen propiedades antiinflamatorias que estaacuten relacionadas con sus efectos sobre la microcirculacioacuten y la inhibicioacuten de las citocinas pro-inflamatorias (IL-1 e IL-6) prostaglandinas y linfocinas Por lo tanto regulan las respuestas inmunitarias a traveacutes del llamado eje inmunosuprarrenal

Tambieacuten el cortisol tiene efectos importantes sobre la regulacioacuten del agua corporal retrasando la entrada de este liacutequido del espacio extracelular al intracelular Por lo que favorece la eliminacioacuten renal de agua

El cortisol inhibe la secrecioacuten de la propiomelanocortina (precursor de ACTH) de la CRH (Hormona liberadora de Corticotropina producida por las ceacutelulas de la eminencia media del hipotaacutelamo) y de Vasopresina

Zona reticular

Es la maacutes interna y presenta ceacutelulas dispuestas en cordones entrecruzados o anastomosados que segregan esteroides sexuales como estroacutegenos y androacutegenos

Las ceacutelulas de la zona reticular producen una fuente secundaria de androacutegenos como testosterona dihidrotestosterona (DHT) androstendiona y

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ENDOCRINOLOGIA

dehidroepiandrosterona (DHEA) Estas hormonas aumentan la masa muscular estimulan el crecimiento celular y ayudan al desarrollo de los caracteres sexuales secundarios

Paacutencreas

El paacutencreas oacutergano que segrega enzimas digestivas que pasan al intestino delgado Estas enzimas ayudan en la ruptura de carbohidratos liacutepidos proteinas y aacutecidos nucleacuteicos en el quimo Tiene forma coacutenica con un proceso uniforme medial e inferior En la especie humana su longitud oscila entre 20 y 30 cm tiene una anchura de unos 4 cm y un grosor de 5 centiacutemetros con un peso 30g La cabeza se localiza en la concavidad del duodeno o asa duodenal formada por la segunda porcioacuten del duodeno

Histologiacutea del paacutencreas

El paacutencreas tiene una parte exocrina y una parte endocrina

La parte exocrina contiene unas glaacutendulas llamadas aacutecinos serosos que son redondos u ovalados con ceacutelulas epiteliales Formados por las celuacutelas acinosas y en parte por las centroacinosas

La parte endocrina se agrupa en islotes de Langerhans que consisten en cuacutemulos de ceacutelulas secretoras de hormonas que producen insulina glucagoacuten y somatostatina Estos tipos de ceacutelulas son los siguientes

Ceacutelula alfa (Alfa cell)

Estas ceacutelulas alfa sintetizan y liberan glucagoacuten El glucagoacuten aumenta el nivel de glucosa sanguiacutenea al estimular la formacioacuten de este carbohidrato a partir del glucoacutegeno almacenado en hepatocitos Tambieacuten ejerce efecto en el metabolismo de proteiacutenas y grasas La liberacioacuten del glucagoacuten es inhibida por la hiperglucemia Representan entre el 10 - 20 del volumen del islote y se distribuyen de forma perifeacuterica

Ceacutelula beta (Beta Cell)

Las ceacutelulas beta producen y liberan insulina hormona que regula el nivel de glucosa en la sangre (facilitando el uso de glucosa por parte de las ceacutelulas y retirando el exceso de glucosa que se almacena en el hiacutegado en forma de glucoacutegeno)

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ENDOCRINOLOGIA

En los diabeacuteticos tipo I las ceacutelulas beta han sido dantildeadas y no son capaces de producir la hormona

Ceacutelula delta (Delta Cell)

Las ceacutelulas delta producen somatostatina hormona que se cree que regulariacutea la produccioacuten y liberacioacuten de la insulina por las ceacutelulas beta y la produccioacuten y liberacioacuten de glucagoacuten por las ceacutelulas alfa

Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)

Estas ceacutelulas hacen que el estoacutemago produzca y libere la hormona Grelina

Ceacutelula F (PP CELL)

Estas ceacutelulas producen y liberan Polipeacuteptido Pancreaacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

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ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

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ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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ENDOCRINOLOGIA

Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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ENDOCRINOLOGIA

Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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ENDOCRINOLOGIA

AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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ENDOCRINOLOGIA

5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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ENDOCRINOLOGIA

como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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ENDOCRINOLOGIA

cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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ENDOCRINOLOGIA

se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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ENDOCRINOLOGIA

bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

httpwwwcirujanosdechileclRevistaPDF20Cirujanos202005_02RevCir205(14)AVpdf

httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
                                            • a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net
Page 21: Trabajo Final Endocrinologia

ENDOCRINOLOGIA

Glaacutendula suprarrenal

Las glaacutendulas con forma de triaacutengulo que estaacuten situadas encima de los rintildeones cuya funcioacuten es la de regular las respuestas al estreacutes a traveacutes de la siacutentesis de corticosteroides (principalmente cortisol) y catecolaminas (adrenalina sobre todo)

Capas de la glaacutendula suprarrenal

Introduccioacuten

Anatoacutemicamente las glaacutendulas suprarrenales estaacuten separadas situadas en la cara anterosuperior de los rintildeones y estaacuten irrigadas por la sangre que reciben de las suprarrenales (las suprarrenales superiores las suprarrenales medias y las suprarrenales inferiores) Estaacuten formadas por estructuras diferentes que son la meacutedula suprarrenal y la corteza suprarrenal ambas inervadas por el sistema nervioso autoacutenomo Como su nombre sugiere la meacutedula suprarrenal estaacute situada dentro de la glaacutendula rodeada por la corteza suprarrenal que forma la superficie

Meacutedula suprarrenal La suprarrenal o meacutedula adrenal estaacute compuesta principalmente por ceacutelulas cromafines productoras de hormonas siendo el principal oacutergano de conversioacuten del aminoaacutecido tirosina en catecolaminas epinefrina y norepinefrina tambieacuten llamadas adrenalina y noradrenalina respectivamente Las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal derivan embrioloacutegicamente de la cresta neural como neuronas modificadas Realmente estas ceacutelulas son ceacutelulas postganglionares del sistema nervioso simpaacutetico que reciben la inervacioacuten de ceacutelulas preganglionares Como las sinapsis entre fibras pre y postganglionares seon ganglios nerviosos autonoacutemicos la meacutedula suprarrenal puede considerarse como un ganglio nervioso del sistema nervioso simpaacutetico

En respuesta a una situacioacuten estresante como es el ejercicio fiacutesico o un peligro inminente las ceacutelulas de la meacutedula suprarrenal producen catecolaminas a la sangre en una relacioacuten 70 a 30 de epinefrina y norepinefrina respectivamente

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ENDOCRINOLOGIA

La epinefrina produce efectos importantes como el aumento de la frecuencia cardiacuteaca vasoconstriccioacuten broncodilatacioacuten y aumento del metabolismo que son respuestas muy fugaces

Corteza suprarrenal

La corteza suprarrenal o corteza adrenal estaacute situada rodeando la circunferencia de la glaacutendula suprarrenal Su funcioacuten es la de regular varios componentes del metabolismo con la produccioacuten de mineralcorticoides y glucocorticoides que incluyen a la aldosterona y cortisol La corteza suprarrenal tambieacuten es un lugar secundario de siacutentesis de androacutegenos

La corteza suprarrenal secreta hormonas esteroideas (de naturaleza lipidica) por lo que sus ceacutelulas presentan abundante REL (reticulo endoplasmaacutetico liso) y mitocondrias con crestas longitudinales al MET Se dispone en tres capas diferentes de tejido basado en los tipos celulares y la funcioacuten que realizan

Zona glomerular Produccioacuten de mineralocorticoides sobre todo aldosterona

Zona fascicular Produccioacuten de glucocorticoides principalmente cortisol cerca del 95

Zona reticular Produccioacuten de androacutegenos incluyendo testosterona

Zona glomerular

Las ceacutelulas de la zona glomerular de la corteza suprarrenal segregan mineralocorticoides como la aldosterona y la desoxicorticosterona en respuesta a un aumento de los niveles de potasio o descenso del flujo de sangre en los rintildeones La aldosterona es liberada a la sangre formando parte del sistema renina-angiotensina que regula la concentracioacuten de electrolitos en la sangre sobre todo de sodio y potasio actuando en el tuacutebulo contorneado distal de la nefrona de los rintildeones

Aumentando la excrecioacuten de potasio Aumentando la reabsorcioacuten de sodio

La Aldosterona es una hormona que ayuda a regular la presioacuten osmoacutetica de mi organismo Por ejemplo si en el plasma sanguiacuteneo hay una escasez de sales ([osmolaridad] baja) se secretaraacute mayor cantidad de Aldosterona para reabsorber maacutes sodio y por consiguiente normalizar los niveles Lo mismo si hay una concentracioacuten muy elevada de sales en la sangre (osmolaridad alta) se secretaraacute menos o se inhibiraacute la secrecioacuten de Aldosterona para no tener que reabsorber el Sodio y por consiguiente eliminarlo normalizando las concentraciones

Zona fascicular

Capa predominante en la corteza suprarrenal cuyas celulas se disponen en hileras separadas por tabiques y capilares Sus ceacutelulas se llaman espongiocitos

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porque son voluminosas y contienen numerosos granulos claros dando a su superficie un aspecto de esponja Estas ceacutelulas segregan glucocorticoides como el cortisol o hidrocortisona y la cortisona al ser estimuladas por la hormona adrenocorticotropica (ACTH) La ACTH es producida por la hipoacutefisis en respuesta al factor hipotalaacutemico estimulante de corticotropina (CRH) Estos tres oacuterganos del sistema endocrino forman el eje hipotaacutelamo-hipofisario-suprarrenal

El principal glucocorticoide producido por las glaacutendulas suprarrenales es el cortisol que cumple diferentes funciones en el metabolismo en muacuteltiples ceacutelulas del organismo como

Estimulacioacuten de la produccioacuten de aminoaacutecidos por el cuerpo rompiendo proteiacutenas proteoacutelisis

Estimulacioacuten de la lipoacutelisis es decir rompiendo la grasa

Estimulacioacuten gluconeogeacutenesis la produccioacuten de glucosa a partir de nuevas fuentes como los aminaacutecidos y la glicerina de los aacutecidos grasos

Mantenimiento de la glucosa inhibiendo su liberacioacuten desde el muacutesculo y del tejido adiposo

Los glucocorticoides aumentan las concentraciones de glucosa en sangre pues actuacutean como antagonistas de la insulina e inhiben su liberacioacuten lo que produce una disminucioacuten de la captacioacuten de glucosa por los tejidos esto favorece que aumente la siacutentesis de glucosa en el hiacutegado y aumente la cantidad de glucoacutegeno en este mismo

Los glucocorticoides tambieacuten tienen propiedades antiinflamatorias que estaacuten relacionadas con sus efectos sobre la microcirculacioacuten y la inhibicioacuten de las citocinas pro-inflamatorias (IL-1 e IL-6) prostaglandinas y linfocinas Por lo tanto regulan las respuestas inmunitarias a traveacutes del llamado eje inmunosuprarrenal

Tambieacuten el cortisol tiene efectos importantes sobre la regulacioacuten del agua corporal retrasando la entrada de este liacutequido del espacio extracelular al intracelular Por lo que favorece la eliminacioacuten renal de agua

El cortisol inhibe la secrecioacuten de la propiomelanocortina (precursor de ACTH) de la CRH (Hormona liberadora de Corticotropina producida por las ceacutelulas de la eminencia media del hipotaacutelamo) y de Vasopresina

Zona reticular

Es la maacutes interna y presenta ceacutelulas dispuestas en cordones entrecruzados o anastomosados que segregan esteroides sexuales como estroacutegenos y androacutegenos

Las ceacutelulas de la zona reticular producen una fuente secundaria de androacutegenos como testosterona dihidrotestosterona (DHT) androstendiona y

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dehidroepiandrosterona (DHEA) Estas hormonas aumentan la masa muscular estimulan el crecimiento celular y ayudan al desarrollo de los caracteres sexuales secundarios

Paacutencreas

El paacutencreas oacutergano que segrega enzimas digestivas que pasan al intestino delgado Estas enzimas ayudan en la ruptura de carbohidratos liacutepidos proteinas y aacutecidos nucleacuteicos en el quimo Tiene forma coacutenica con un proceso uniforme medial e inferior En la especie humana su longitud oscila entre 20 y 30 cm tiene una anchura de unos 4 cm y un grosor de 5 centiacutemetros con un peso 30g La cabeza se localiza en la concavidad del duodeno o asa duodenal formada por la segunda porcioacuten del duodeno

Histologiacutea del paacutencreas

El paacutencreas tiene una parte exocrina y una parte endocrina

La parte exocrina contiene unas glaacutendulas llamadas aacutecinos serosos que son redondos u ovalados con ceacutelulas epiteliales Formados por las celuacutelas acinosas y en parte por las centroacinosas

La parte endocrina se agrupa en islotes de Langerhans que consisten en cuacutemulos de ceacutelulas secretoras de hormonas que producen insulina glucagoacuten y somatostatina Estos tipos de ceacutelulas son los siguientes

Ceacutelula alfa (Alfa cell)

Estas ceacutelulas alfa sintetizan y liberan glucagoacuten El glucagoacuten aumenta el nivel de glucosa sanguiacutenea al estimular la formacioacuten de este carbohidrato a partir del glucoacutegeno almacenado en hepatocitos Tambieacuten ejerce efecto en el metabolismo de proteiacutenas y grasas La liberacioacuten del glucagoacuten es inhibida por la hiperglucemia Representan entre el 10 - 20 del volumen del islote y se distribuyen de forma perifeacuterica

Ceacutelula beta (Beta Cell)

Las ceacutelulas beta producen y liberan insulina hormona que regula el nivel de glucosa en la sangre (facilitando el uso de glucosa por parte de las ceacutelulas y retirando el exceso de glucosa que se almacena en el hiacutegado en forma de glucoacutegeno)

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ENDOCRINOLOGIA

En los diabeacuteticos tipo I las ceacutelulas beta han sido dantildeadas y no son capaces de producir la hormona

Ceacutelula delta (Delta Cell)

Las ceacutelulas delta producen somatostatina hormona que se cree que regulariacutea la produccioacuten y liberacioacuten de la insulina por las ceacutelulas beta y la produccioacuten y liberacioacuten de glucagoacuten por las ceacutelulas alfa

Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)

Estas ceacutelulas hacen que el estoacutemago produzca y libere la hormona Grelina

Ceacutelula F (PP CELL)

Estas ceacutelulas producen y liberan Polipeacuteptido Pancreaacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

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ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

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ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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ENDOCRINOLOGIA

Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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ENDOCRINOLOGIA

Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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ENDOCRINOLOGIA

5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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ENDOCRINOLOGIA

2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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ENDOCRINOLOGIA

52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

Trabajo final Paacutegina 51

ENDOCRINOLOGIA

BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

Trabajo final Paacutegina 52

ENDOCRINOLOGIA

Trabajo final Paacutegina 53

  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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Page 22: Trabajo Final Endocrinologia

ENDOCRINOLOGIA

La epinefrina produce efectos importantes como el aumento de la frecuencia cardiacuteaca vasoconstriccioacuten broncodilatacioacuten y aumento del metabolismo que son respuestas muy fugaces

Corteza suprarrenal

La corteza suprarrenal o corteza adrenal estaacute situada rodeando la circunferencia de la glaacutendula suprarrenal Su funcioacuten es la de regular varios componentes del metabolismo con la produccioacuten de mineralcorticoides y glucocorticoides que incluyen a la aldosterona y cortisol La corteza suprarrenal tambieacuten es un lugar secundario de siacutentesis de androacutegenos

La corteza suprarrenal secreta hormonas esteroideas (de naturaleza lipidica) por lo que sus ceacutelulas presentan abundante REL (reticulo endoplasmaacutetico liso) y mitocondrias con crestas longitudinales al MET Se dispone en tres capas diferentes de tejido basado en los tipos celulares y la funcioacuten que realizan

Zona glomerular Produccioacuten de mineralocorticoides sobre todo aldosterona

Zona fascicular Produccioacuten de glucocorticoides principalmente cortisol cerca del 95

Zona reticular Produccioacuten de androacutegenos incluyendo testosterona

Zona glomerular

Las ceacutelulas de la zona glomerular de la corteza suprarrenal segregan mineralocorticoides como la aldosterona y la desoxicorticosterona en respuesta a un aumento de los niveles de potasio o descenso del flujo de sangre en los rintildeones La aldosterona es liberada a la sangre formando parte del sistema renina-angiotensina que regula la concentracioacuten de electrolitos en la sangre sobre todo de sodio y potasio actuando en el tuacutebulo contorneado distal de la nefrona de los rintildeones

Aumentando la excrecioacuten de potasio Aumentando la reabsorcioacuten de sodio

La Aldosterona es una hormona que ayuda a regular la presioacuten osmoacutetica de mi organismo Por ejemplo si en el plasma sanguiacuteneo hay una escasez de sales ([osmolaridad] baja) se secretaraacute mayor cantidad de Aldosterona para reabsorber maacutes sodio y por consiguiente normalizar los niveles Lo mismo si hay una concentracioacuten muy elevada de sales en la sangre (osmolaridad alta) se secretaraacute menos o se inhibiraacute la secrecioacuten de Aldosterona para no tener que reabsorber el Sodio y por consiguiente eliminarlo normalizando las concentraciones

Zona fascicular

Capa predominante en la corteza suprarrenal cuyas celulas se disponen en hileras separadas por tabiques y capilares Sus ceacutelulas se llaman espongiocitos

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ENDOCRINOLOGIA

porque son voluminosas y contienen numerosos granulos claros dando a su superficie un aspecto de esponja Estas ceacutelulas segregan glucocorticoides como el cortisol o hidrocortisona y la cortisona al ser estimuladas por la hormona adrenocorticotropica (ACTH) La ACTH es producida por la hipoacutefisis en respuesta al factor hipotalaacutemico estimulante de corticotropina (CRH) Estos tres oacuterganos del sistema endocrino forman el eje hipotaacutelamo-hipofisario-suprarrenal

El principal glucocorticoide producido por las glaacutendulas suprarrenales es el cortisol que cumple diferentes funciones en el metabolismo en muacuteltiples ceacutelulas del organismo como

Estimulacioacuten de la produccioacuten de aminoaacutecidos por el cuerpo rompiendo proteiacutenas proteoacutelisis

Estimulacioacuten de la lipoacutelisis es decir rompiendo la grasa

Estimulacioacuten gluconeogeacutenesis la produccioacuten de glucosa a partir de nuevas fuentes como los aminaacutecidos y la glicerina de los aacutecidos grasos

Mantenimiento de la glucosa inhibiendo su liberacioacuten desde el muacutesculo y del tejido adiposo

Los glucocorticoides aumentan las concentraciones de glucosa en sangre pues actuacutean como antagonistas de la insulina e inhiben su liberacioacuten lo que produce una disminucioacuten de la captacioacuten de glucosa por los tejidos esto favorece que aumente la siacutentesis de glucosa en el hiacutegado y aumente la cantidad de glucoacutegeno en este mismo

Los glucocorticoides tambieacuten tienen propiedades antiinflamatorias que estaacuten relacionadas con sus efectos sobre la microcirculacioacuten y la inhibicioacuten de las citocinas pro-inflamatorias (IL-1 e IL-6) prostaglandinas y linfocinas Por lo tanto regulan las respuestas inmunitarias a traveacutes del llamado eje inmunosuprarrenal

Tambieacuten el cortisol tiene efectos importantes sobre la regulacioacuten del agua corporal retrasando la entrada de este liacutequido del espacio extracelular al intracelular Por lo que favorece la eliminacioacuten renal de agua

El cortisol inhibe la secrecioacuten de la propiomelanocortina (precursor de ACTH) de la CRH (Hormona liberadora de Corticotropina producida por las ceacutelulas de la eminencia media del hipotaacutelamo) y de Vasopresina

Zona reticular

Es la maacutes interna y presenta ceacutelulas dispuestas en cordones entrecruzados o anastomosados que segregan esteroides sexuales como estroacutegenos y androacutegenos

Las ceacutelulas de la zona reticular producen una fuente secundaria de androacutegenos como testosterona dihidrotestosterona (DHT) androstendiona y

Trabajo final Paacutegina 23

ENDOCRINOLOGIA

dehidroepiandrosterona (DHEA) Estas hormonas aumentan la masa muscular estimulan el crecimiento celular y ayudan al desarrollo de los caracteres sexuales secundarios

Paacutencreas

El paacutencreas oacutergano que segrega enzimas digestivas que pasan al intestino delgado Estas enzimas ayudan en la ruptura de carbohidratos liacutepidos proteinas y aacutecidos nucleacuteicos en el quimo Tiene forma coacutenica con un proceso uniforme medial e inferior En la especie humana su longitud oscila entre 20 y 30 cm tiene una anchura de unos 4 cm y un grosor de 5 centiacutemetros con un peso 30g La cabeza se localiza en la concavidad del duodeno o asa duodenal formada por la segunda porcioacuten del duodeno

Histologiacutea del paacutencreas

El paacutencreas tiene una parte exocrina y una parte endocrina

La parte exocrina contiene unas glaacutendulas llamadas aacutecinos serosos que son redondos u ovalados con ceacutelulas epiteliales Formados por las celuacutelas acinosas y en parte por las centroacinosas

La parte endocrina se agrupa en islotes de Langerhans que consisten en cuacutemulos de ceacutelulas secretoras de hormonas que producen insulina glucagoacuten y somatostatina Estos tipos de ceacutelulas son los siguientes

Ceacutelula alfa (Alfa cell)

Estas ceacutelulas alfa sintetizan y liberan glucagoacuten El glucagoacuten aumenta el nivel de glucosa sanguiacutenea al estimular la formacioacuten de este carbohidrato a partir del glucoacutegeno almacenado en hepatocitos Tambieacuten ejerce efecto en el metabolismo de proteiacutenas y grasas La liberacioacuten del glucagoacuten es inhibida por la hiperglucemia Representan entre el 10 - 20 del volumen del islote y se distribuyen de forma perifeacuterica

Ceacutelula beta (Beta Cell)

Las ceacutelulas beta producen y liberan insulina hormona que regula el nivel de glucosa en la sangre (facilitando el uso de glucosa por parte de las ceacutelulas y retirando el exceso de glucosa que se almacena en el hiacutegado en forma de glucoacutegeno)

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ENDOCRINOLOGIA

En los diabeacuteticos tipo I las ceacutelulas beta han sido dantildeadas y no son capaces de producir la hormona

Ceacutelula delta (Delta Cell)

Las ceacutelulas delta producen somatostatina hormona que se cree que regulariacutea la produccioacuten y liberacioacuten de la insulina por las ceacutelulas beta y la produccioacuten y liberacioacuten de glucagoacuten por las ceacutelulas alfa

Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)

Estas ceacutelulas hacen que el estoacutemago produzca y libere la hormona Grelina

Ceacutelula F (PP CELL)

Estas ceacutelulas producen y liberan Polipeacuteptido Pancreaacutetico

Trabajo final Paacutegina 25

ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

Trabajo final Paacutegina 26

ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

Trabajo final Paacutegina 27

ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

Trabajo final Paacutegina 28

ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

Trabajo final Paacutegina 29

ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

Trabajo final Paacutegina 30

ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ENDOCRINOLOGIA

ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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ENDOCRINOLOGIA

Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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ENDOCRINOLOGIA

52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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ENDOCRINOLOGIA

BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

httpwwwcirujanosdechileclRevistaPDF20Cirujanos202005_02RevCir205(14)AVpdf

httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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ENDOCRINOLOGIA

Trabajo final Paacutegina 53

  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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Page 23: Trabajo Final Endocrinologia

ENDOCRINOLOGIA

porque son voluminosas y contienen numerosos granulos claros dando a su superficie un aspecto de esponja Estas ceacutelulas segregan glucocorticoides como el cortisol o hidrocortisona y la cortisona al ser estimuladas por la hormona adrenocorticotropica (ACTH) La ACTH es producida por la hipoacutefisis en respuesta al factor hipotalaacutemico estimulante de corticotropina (CRH) Estos tres oacuterganos del sistema endocrino forman el eje hipotaacutelamo-hipofisario-suprarrenal

El principal glucocorticoide producido por las glaacutendulas suprarrenales es el cortisol que cumple diferentes funciones en el metabolismo en muacuteltiples ceacutelulas del organismo como

Estimulacioacuten de la produccioacuten de aminoaacutecidos por el cuerpo rompiendo proteiacutenas proteoacutelisis

Estimulacioacuten de la lipoacutelisis es decir rompiendo la grasa

Estimulacioacuten gluconeogeacutenesis la produccioacuten de glucosa a partir de nuevas fuentes como los aminaacutecidos y la glicerina de los aacutecidos grasos

Mantenimiento de la glucosa inhibiendo su liberacioacuten desde el muacutesculo y del tejido adiposo

Los glucocorticoides aumentan las concentraciones de glucosa en sangre pues actuacutean como antagonistas de la insulina e inhiben su liberacioacuten lo que produce una disminucioacuten de la captacioacuten de glucosa por los tejidos esto favorece que aumente la siacutentesis de glucosa en el hiacutegado y aumente la cantidad de glucoacutegeno en este mismo

Los glucocorticoides tambieacuten tienen propiedades antiinflamatorias que estaacuten relacionadas con sus efectos sobre la microcirculacioacuten y la inhibicioacuten de las citocinas pro-inflamatorias (IL-1 e IL-6) prostaglandinas y linfocinas Por lo tanto regulan las respuestas inmunitarias a traveacutes del llamado eje inmunosuprarrenal

Tambieacuten el cortisol tiene efectos importantes sobre la regulacioacuten del agua corporal retrasando la entrada de este liacutequido del espacio extracelular al intracelular Por lo que favorece la eliminacioacuten renal de agua

El cortisol inhibe la secrecioacuten de la propiomelanocortina (precursor de ACTH) de la CRH (Hormona liberadora de Corticotropina producida por las ceacutelulas de la eminencia media del hipotaacutelamo) y de Vasopresina

Zona reticular

Es la maacutes interna y presenta ceacutelulas dispuestas en cordones entrecruzados o anastomosados que segregan esteroides sexuales como estroacutegenos y androacutegenos

Las ceacutelulas de la zona reticular producen una fuente secundaria de androacutegenos como testosterona dihidrotestosterona (DHT) androstendiona y

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ENDOCRINOLOGIA

dehidroepiandrosterona (DHEA) Estas hormonas aumentan la masa muscular estimulan el crecimiento celular y ayudan al desarrollo de los caracteres sexuales secundarios

Paacutencreas

El paacutencreas oacutergano que segrega enzimas digestivas que pasan al intestino delgado Estas enzimas ayudan en la ruptura de carbohidratos liacutepidos proteinas y aacutecidos nucleacuteicos en el quimo Tiene forma coacutenica con un proceso uniforme medial e inferior En la especie humana su longitud oscila entre 20 y 30 cm tiene una anchura de unos 4 cm y un grosor de 5 centiacutemetros con un peso 30g La cabeza se localiza en la concavidad del duodeno o asa duodenal formada por la segunda porcioacuten del duodeno

Histologiacutea del paacutencreas

El paacutencreas tiene una parte exocrina y una parte endocrina

La parte exocrina contiene unas glaacutendulas llamadas aacutecinos serosos que son redondos u ovalados con ceacutelulas epiteliales Formados por las celuacutelas acinosas y en parte por las centroacinosas

La parte endocrina se agrupa en islotes de Langerhans que consisten en cuacutemulos de ceacutelulas secretoras de hormonas que producen insulina glucagoacuten y somatostatina Estos tipos de ceacutelulas son los siguientes

Ceacutelula alfa (Alfa cell)

Estas ceacutelulas alfa sintetizan y liberan glucagoacuten El glucagoacuten aumenta el nivel de glucosa sanguiacutenea al estimular la formacioacuten de este carbohidrato a partir del glucoacutegeno almacenado en hepatocitos Tambieacuten ejerce efecto en el metabolismo de proteiacutenas y grasas La liberacioacuten del glucagoacuten es inhibida por la hiperglucemia Representan entre el 10 - 20 del volumen del islote y se distribuyen de forma perifeacuterica

Ceacutelula beta (Beta Cell)

Las ceacutelulas beta producen y liberan insulina hormona que regula el nivel de glucosa en la sangre (facilitando el uso de glucosa por parte de las ceacutelulas y retirando el exceso de glucosa que se almacena en el hiacutegado en forma de glucoacutegeno)

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ENDOCRINOLOGIA

En los diabeacuteticos tipo I las ceacutelulas beta han sido dantildeadas y no son capaces de producir la hormona

Ceacutelula delta (Delta Cell)

Las ceacutelulas delta producen somatostatina hormona que se cree que regulariacutea la produccioacuten y liberacioacuten de la insulina por las ceacutelulas beta y la produccioacuten y liberacioacuten de glucagoacuten por las ceacutelulas alfa

Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)

Estas ceacutelulas hacen que el estoacutemago produzca y libere la hormona Grelina

Ceacutelula F (PP CELL)

Estas ceacutelulas producen y liberan Polipeacuteptido Pancreaacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

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ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

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ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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ENDOCRINOLOGIA

Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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ENDOCRINOLOGIA

Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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ENDOCRINOLOGIA

5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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ENDOCRINOLOGIA

como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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ENDOCRINOLOGIA

cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

httpwwwcirujanosdechileclRevistaPDF20Cirujanos202005_02RevCir205(14)AVpdf

httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
                                            • a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net
Page 24: Trabajo Final Endocrinologia

ENDOCRINOLOGIA

dehidroepiandrosterona (DHEA) Estas hormonas aumentan la masa muscular estimulan el crecimiento celular y ayudan al desarrollo de los caracteres sexuales secundarios

Paacutencreas

El paacutencreas oacutergano que segrega enzimas digestivas que pasan al intestino delgado Estas enzimas ayudan en la ruptura de carbohidratos liacutepidos proteinas y aacutecidos nucleacuteicos en el quimo Tiene forma coacutenica con un proceso uniforme medial e inferior En la especie humana su longitud oscila entre 20 y 30 cm tiene una anchura de unos 4 cm y un grosor de 5 centiacutemetros con un peso 30g La cabeza se localiza en la concavidad del duodeno o asa duodenal formada por la segunda porcioacuten del duodeno

Histologiacutea del paacutencreas

El paacutencreas tiene una parte exocrina y una parte endocrina

La parte exocrina contiene unas glaacutendulas llamadas aacutecinos serosos que son redondos u ovalados con ceacutelulas epiteliales Formados por las celuacutelas acinosas y en parte por las centroacinosas

La parte endocrina se agrupa en islotes de Langerhans que consisten en cuacutemulos de ceacutelulas secretoras de hormonas que producen insulina glucagoacuten y somatostatina Estos tipos de ceacutelulas son los siguientes

Ceacutelula alfa (Alfa cell)

Estas ceacutelulas alfa sintetizan y liberan glucagoacuten El glucagoacuten aumenta el nivel de glucosa sanguiacutenea al estimular la formacioacuten de este carbohidrato a partir del glucoacutegeno almacenado en hepatocitos Tambieacuten ejerce efecto en el metabolismo de proteiacutenas y grasas La liberacioacuten del glucagoacuten es inhibida por la hiperglucemia Representan entre el 10 - 20 del volumen del islote y se distribuyen de forma perifeacuterica

Ceacutelula beta (Beta Cell)

Las ceacutelulas beta producen y liberan insulina hormona que regula el nivel de glucosa en la sangre (facilitando el uso de glucosa por parte de las ceacutelulas y retirando el exceso de glucosa que se almacena en el hiacutegado en forma de glucoacutegeno)

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ENDOCRINOLOGIA

En los diabeacuteticos tipo I las ceacutelulas beta han sido dantildeadas y no son capaces de producir la hormona

Ceacutelula delta (Delta Cell)

Las ceacutelulas delta producen somatostatina hormona que se cree que regulariacutea la produccioacuten y liberacioacuten de la insulina por las ceacutelulas beta y la produccioacuten y liberacioacuten de glucagoacuten por las ceacutelulas alfa

Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)

Estas ceacutelulas hacen que el estoacutemago produzca y libere la hormona Grelina

Ceacutelula F (PP CELL)

Estas ceacutelulas producen y liberan Polipeacuteptido Pancreaacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

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ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

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ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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ENDOCRINOLOGIA

Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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ENDOCRINOLOGIA

Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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ENDOCRINOLOGIA

cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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ENDOCRINOLOGIA

se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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ENDOCRINOLOGIA

bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

httpwwwcirujanosdechileclRevistaPDF20Cirujanos202005_02RevCir205(14)AVpdf

httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
                                            • a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net
Page 25: Trabajo Final Endocrinologia

ENDOCRINOLOGIA

En los diabeacuteticos tipo I las ceacutelulas beta han sido dantildeadas y no son capaces de producir la hormona

Ceacutelula delta (Delta Cell)

Las ceacutelulas delta producen somatostatina hormona que se cree que regulariacutea la produccioacuten y liberacioacuten de la insulina por las ceacutelulas beta y la produccioacuten y liberacioacuten de glucagoacuten por las ceacutelulas alfa

Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)

Estas ceacutelulas hacen que el estoacutemago produzca y libere la hormona Grelina

Ceacutelula F (PP CELL)

Estas ceacutelulas producen y liberan Polipeacuteptido Pancreaacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

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ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

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ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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ENDOCRINOLOGIA

Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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ENDOCRINOLOGIA

se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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ENDOCRINOLOGIA

bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
                                            • a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net
Page 26: Trabajo Final Endocrinologia

ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor masculino

HORMONAS DEL ISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO

La mayoriacutea de las especies tienen dos sexos macho y hembra Cada sexo

tiene su sistema reproductor Difieren en forma y estructura pero ambos estaacuten

especiacuteficamente disentildeados para producir nutrir y transportar bien ovocitos o

bien espermatozoos

A diferencia de la mujer cuyo sistema reproductor estaacute localizado iacutentegramente

en la pelvis los oacuterganos reproductores del hombre o genitales se encuentran

tanto dentro como fuera de la pelvis Los genitales masculinos incluyen

los testiacuteculosel sistema de conductos integrado por el epidiacutedimo y el conducto deferente

las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula prostaacutetica

el pene

En un chico que ya ha alcanzado la madurez sexual los dos testiacuteculos

producen y almacenan millones de diminutos espermatozoides Los testiacuteculos

son ovalados y crecen hasta alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud por 3

Trabajo final Paacutegina 26

ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

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ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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ENDOCRINOLOGIA

Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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ENDOCRINOLOGIA

5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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ENDOCRINOLOGIA

se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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ENDOCRINOLOGIA

bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
                                            • a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net
Page 27: Trabajo Final Endocrinologia

ENDOCRINOLOGIA

cm de diaacutemetro Los testiacuteculos tambieacuten forman parte del sistema endocrino ya

que producen hormonas incluyendo la testosterona La testosterona

desempentildea un papel muy importante en la pubertad y a medida que un chico

va recorriendo esta etapa de su vida sus testiacuteculos van produciendo

cantidades cada vez mayores de esta hormona La testosterona es la hormona

que determina que los chicos cambien la voz desarrollen muacutesculos maacutes

voluminosos y fuertes y les crezca la barba y el vello corporal aparte de

estimular la produccioacuten de espermatozoides

Muy cerca de los testiacuteculos se encuentran el epidiacutedimo y el conducto

deferente que constituyen el sistema de conductos de los oacuterganos

reproductores masculinos El conducto deferente es un tubo muscular que

discurre junto a los testiacuteculos y transporta en sentido ascendente el fluido que

contiene los espermatozoides denominado semen El epidiacutedimo es un

conjunto de tubos en forma de espiral (uno para cada testiacuteculo) que estaacute

conectado al conducto deferente

El epidiacutedimo y los testiacuteculos estaacuten suspendidos en el interior de una estructura

similar a una bolsa ubicada fuera de la pelvis y denominada escroto Esta

bolsa de piel ayuda a regular la temperatura de los testiacuteculos que debe ser

inferior a la temperatura corporal para que puedan fabricar espermatozoides El

escroto cambia de tamantildeo para mantener la temperatura adecuada Cuando el

cuerpo estaacute friacuteo el escroto se encoge y se tensa para mantener el calor

corporal en su interior Cuando el cuerpo estaacute caliente el escroto se agranda y

se vuelve flaacutecido para eliminar el exceso de calor Esto ocurre sin que el

hombre tenga que pensar en ello El cerebro y el sistema nervioso dan al

escroto las instrucciones pertinentes para que cambie de tamantildeo cuando

convenga hacerlo

Las glaacutendulas accesorias que incluyen las vesiacuteculas seminales y la glaacutendula

prostaacutetica proporcionan los fluidos que lubrican el sistema de conductos y

nutren a los espermatozoides Las vesiacuteculas seminales son estructuras con

aspecto de bolsa unidas al conducto deferente a lado de la vejiga La glaacutendula

prostaacutetica que produce algunos de los componentes del semen rodea a los

conductos eyaculatorios en la base de la uretra justo debajo de la vejiga La

uretra es el conducto que conduce el semen hacia el exterior del cuerpo a

traveacutes del pene La uretra tambieacuten forma parte del sistema urinario ya que es

el conducto a traveacutes del cual pasa la orina cuando es expulsada del cuerpo

desde la vejiga

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ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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ENDOCRINOLOGIA

aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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ENDOCRINOLOGIA

Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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ENDOCRINOLOGIA

Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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ENDOCRINOLOGIA

5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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ENDOCRINOLOGIA

se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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ENDOCRINOLOGIA

bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

httpwwwcirujanosdechileclRevistaPDF20Cirujanos202005_02RevCir205(14)AVpdf

httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
                                            • a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net
Page 28: Trabajo Final Endocrinologia

ENDOCRINOLOGIA

El pene consta de dos partes el cuerpo y el glande El cuerpo es la parte

principal del pene mientras que el glande es la punta (a veces denominada

cabeza) En el extremo del glande hay una pequentildea ranura o abertura que

es por donde salen del cuerpo el semen y la orina a traveacutes de la uretra El

interior del cuerpo del pene estaacute formado por un tejido esponjoso y otro

cavernoso que se puede expandir y contraer

Todos los nintildeos nacen con prepucio un pliegue de piel en el extremo del

pene que cubre el glande Algunos nintildeos son circuncidados es decir un

meacutedico o un sacerdote les extirpa el prepucio La circuncisioacuten suele llevarse a

cabo durante los primeros diacuteas de vida Si bien la circuncisioacuten no es necesaria

desde el punto de vista meacutedico algunos padres deciden circuncidar a sus hijos

por creencias religiosas por cuestiones higieacutenicas o por motivos sociales o

culturales Los penes de los nintildeos circuncidados no son diferentes de los penes

de los nintildeos no circuncidados todos los penes funcionan de la misma manera y

tienen la misma sensibilidad independientemente de que se les haya extirpado

el prepucio o no

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ENDOCRINOLOGIA

Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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ENDOCRINOLOGIA

Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

httpwwwcirujanosdechileclRevistaPDF20Cirujanos202005_02RevCir205(14)AVpdf

httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino

El hipotaacutelamo excreta la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone) tambieacuten conocida como hormona liberadora de la hormona luteiniacuteca (LHRH) o gonadorelina Es un decapeacuteptido sintetizado a partir de una pre-hormona de mayor tamantildeo en las neuronas hipotalaacutemicas de las aacutereas arqueada y preoacuteptica Desde estas aacutereas la hormona es transportada axonalmente para su almacenamiento en la eminencia medial La GnRH es excretada en las venas portales de la pituitaria para su transporte a las ceacutelulas gonadotroacuteficas de la pituitaria anterior donde se une a los receptores de la membrana Una vez fijada a sus receptores la GnRH provoca una entrada de calcio que se actuacutea como segundo mensajero unieacutendose a la calmodulina y haciendo que las ceacutelulas liberen simultaacuteneamente hormona luteiacutenica (LH) y hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) de sus graacutenulos secretores La GnRH tambieacuten actuacutea estimulante la transcripcioacuten de los genes que dirigen la siacutentesis de las dos gonadotropinas

La produccioacuten de GnRH es estimulada por la norepinefrina e inhibida por las endorfinas la dopamina y el stress

PituitariaEl loacutebulo anterior de la pituitaria excreta la hormona luteiacutenica (LH) y la hormona estimulante del foliacuteculo (FSH) Ambas son glicoproteiacutenas y reciben en nombre de gonadotropinas por sus efectos sobre el testiacuteculo y el ovario Se asemejan a la hormona estimulante del tiroides (TSH) y como eacutesta estaacuten compuestas de dos subunidades a y b La primera es igual para las tres y consta de 91

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aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

httpwwwcirujanosdechileclRevistaPDF20Cirujanos202005_02RevCir205(14)AVpdf

httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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aminoaacutecidos La cadena b por su parte tiene 120 aminoaacutecidos En ambas gonadotropinas son necesarias ambas subunidades y la parte de carbohidrato para mantener la actividad

La LH tiene tres acciones distintas

Estimula las ceacutelulas de la teca ovaacuterica y las ceacutelulas de Leydig del testiacuteculo para producir androacutegenos y en menor proporcioacuten estroacutegenos Gracias a ella se forma la testosterona y androstendiona que luego seraacuten transformadas a estrona y estradiol En el testiacuteculo soacutelo se forman androacutegenos

Determina la rotura del foliacuteculo y por lo tanto la ovulacioacuten

Al seguir actuando sobre el ovario despueacutes de la ovulacioacuten determina la formacioacuten del cuerpo luacuteteo

La FSH estimula las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli para que estas excreten estroacutegenos Unieacutendose a sus receptores en la membrana de estas ceacutelulas y actuando el AMP-c como segundo mensajero la FSH aumenta la transcripcioacuten del gen de la aromatasa la enzima especiacutefica de la siacutentesis del estradiol La FSH tambieacuten incrementa el nuacutemero de receptores a la LH en las ceacutelulas diana aumentando por tanto su sensibilidad a esta hormona Finalmente estimula la produccioacuten de inhibina y otros peacuteptidos en las ceacutelulas de la granulosa y de Sertoli

Ovarios En los ovarios se sintetizan y excretan varios tipos de hormonas

las hormonas esteroiacutedicas entre las que se encuentran los estroacutegenos los androacutegenos y la progesterona

las hormonas peptiacutedicas inhibina relaxina y activina

otras hormonas y factores de crecimiento

Hormonas esteroiacutedicas

Los androacutegenos estroacutegenos y progesterona son todos ellos hormonas esteroiacutedicas que se sintetizan en el ovario o el testiacuteculo a partir del colesterol aunque tambieacuten pueden ser producidas en las glaacutendulas suprarrenales

Estroacutegenos los estroacutegenos cuyos miembros maacutes importantes son el estradiol la estrona y el estriol tienen tres importantes funciones

Promueven el desarrollo y el mantenimiento de las estructuras reproductoras de la mujer (en particular la mucosa del endometrio) de sus caracteriacutesticas sexuales (voz distribucioacuten de la grasa distribucioacuten del vello etc)

Ayudan al mantenimiento del control del balance electroliacutetico

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Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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ENDOCRINOLOGIA

AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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ENDOCRINOLOGIA

Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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ENDOCRINOLOGIA

2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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ENDOCRINOLOGIA

52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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ENDOCRINOLOGIA

BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

httpwwwcirujanosdechileclRevistaPDF20Cirujanos202005_02RevCir205(14)AVpdf

httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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ENDOCRINOLOGIA

Trabajo final Paacutegina 53

  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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Page 31: Trabajo Final Endocrinologia

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Aumentan el anabolismo de las proteiacutenas siendo sineacutergicos en este aspecto con la hormona del crecimiento

Unos niveles moderados de estroacutegenos en sangre inhiben la liberacioacuten de la GnRH hipotalaacutemica con la consiguiente reduccioacuten de la produccioacuten de LH y FSH por la pituitaria Esta inhibicioacuten es el fundamento del mecanismo de accioacuten de las piacuteldoras contraceptivas

Progesterona la progesterona actuacutea principalmente en el uacutetero preparando el endometrio para la implantacioacuten de un ovocito fertilizado mediante la secrecioacuten de glucoacutegeno y algunas proteiacutenas especiacuteficas y aumentando el desarrollo de los capilares del estroma endometrial Tambieacuten actuacutea sobre la mama produciendo el desarrollo de los acini mamarios

A nivel hipotalaacutemico la progesterona actuacutea frenando la liberacioacuten de la GnRH (aunque menos que los estroacutegenos) y excitando el centro teacutermico lo que provoca el aumento de temperatura que se observa como veremos en la segunda mitad del ciclo

Una importante accioacuten de la progesterona es la disminucioacuten del nuacutemero de receptores estrogeacutenicos del endometrio y el aumento de las enzimas que metabolizan el estradiol Por ambos mecanismos la progesterona tiene un efecto antiestrogeacutenico que previene el efecto canceriacutegeno que tienen los estroacutegenos Este es uno de los motivos que esplican porqueacute en la terapia hormonal sustitutiva siempre se asocia progesterona a androacutegenos

Androacutegenos los androacutegenos sirven fundamentalmente como precursores de los estroacutegenos aunque tienen algunos efectos sobre el vello pubiano y axilar y sobre el desarrollo del cliacutetoris La transformacioacuten de androacutegenos a estroacutegenos tiene lugar en las ceacutelulas intersticiales del foliacuteculo y en la grasa Esta uacuteltima reviste una gran importancia en la importancia en el mantenimiento de unos niveles de estroacutegenos despueacutes de la menopausia

Hormonas peptiacutedicas La inhibina es un peacuteptido formado por dos subunidades de 230 y 134 aminoaacutecidos producido por el cuerpo luacuteteo del ovario Inhibe la secrecioacuten de GnRH y de FSH y en menor extensioacuten de LH Como veremos la inhibina es juega un importante papel en la disminucioacuten de FSH y LH que se observa al final del ciclo ovaacuterico

La activina es asimismo un peacuteptido dimeacuterico constituido por dos unidades b de la inhibina (268 aminoacidos) Estimula la secrecioacuten hipofisiaria de FSH

La relaxina es producida por el cuerpo luacuteteo y la placenta Consta de dos subunidades de 13 y 26 aminoaacutecidos unidas por una puente de cisteiacutena Durante el parto la relaxina relaja los muacutesculos del cuello uterino para facilitar la dilatacioacuten y la siacutenfisis pubiana

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ENDOCRINOLOGIA

Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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ENDOCRINOLOGIA

Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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ENDOCRINOLOGIA

5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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ENDOCRINOLOGIA

como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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ENDOCRINOLOGIA

52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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ENDOCRINOLOGIA

BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

Trabajo final Paacutegina 52

ENDOCRINOLOGIA

Trabajo final Paacutegina 53

  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
                                            • a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net
Page 32: Trabajo Final Endocrinologia

ENDOCRINOLOGIA

Otras hormonasLa renina que se produce en el foliacuteculo ovaacuterico da lugar a la formacioacuten angiotensina II que juega un importante papel en la vascularizacioacuten del cuerpo luacuteteo

Los factores de crecimiento insulineacutergicos ILGF-I e ILGF-II son tambieacuten producidos en el foliacuteculo y promueven la siacutentesis de la aromatasa la enzima implicada en la transformacioacuten de los androacutegenos en estroacutegenos

CICLO HORMONAL FEMENINO

Desde la aparicioacuten de la primera menstruacioacuten (menarquiacutea) hasta la desaparicioacuten de la regla (menopausia) las mujeres no embarazadas experimentan unos cambios ciacuteclicos secuenciales en los ovarios y el uacutetero Cada ciclo tiene una duracioacuten de unos 28 diacuteas e implica la preparacioacuten de un ovocito por el ovario y la adecuacioacuten del endometrio para recibir a este en el supuesto de que quede fertilizado Si la fertilizacioacuten no se produce el endometrio se desprende del lecho compacto y esponjoso que habiacutea preparado dejando unas aacutereas hemorraacutegicas que producen el sangrado menstrual

Se producen dos ciclos simultaacuteneamente

El ciclo ovaacuterico que consiste en la maduracioacuten de un foliacuteculo y expulsioacuten de un ovocito

El ciclo menstrual (o ciclo endometrial) que consiste en la preparacioacuten de un lecho apto para recibir al ovocito y si este no estaacute fertilizado en la eliminacioacuten del mismo

Ambos ciclos estaacuten regulados por un conjunto de hormonas procedentes del hipotaacutelamo de la pituitaria y de los foliacuteculos ovaacutericos Todas ellas son interdependientes y forman un cascada hormonal retroalimentada

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ENDOCRINOLOGIA

Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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ENDOCRINOLOGIA

5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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ENDOCRINOLOGIA

como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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ENDOCRINOLOGIA

cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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ENDOCRINOLOGIA

se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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ENDOCRINOLOGIA

bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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ENDOCRINOLOGIA

Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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ENDOCRINOLOGIA

La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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ENDOCRINOLOGIA

Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ENDOCRINOLOGIA

ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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ENDOCRINOLOGIA

Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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ENDOCRINOLOGIA

BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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ENDOCRINOLOGIA

Trabajo final Paacutegina 53

  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
                                            • a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net
Page 33: Trabajo Final Endocrinologia

ENDOCRINOLOGIA

Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas

Hormona Hiposecrecioacuten Hipersecrecioacuten

Hormona del crecimientoSTH o somatotropina

HormonaProducida por laAdenohipoacutefisis

Enanismo hipofisiario

Causas individuos cuya glaacutendula hipoacutefisis no sintetiza suficiente hormona durante el crecimientoSiacutentomas seres humanos en miniatura poseen inteligencia normal y suelen tener proporciones corporales normales

Gigantismo

Causas excesiva produccioacuten de la hormona durante la infancia o la adolescencia Desorden causado por un tumor hipofisiario que si no se trata puede producir la muerteSiacutentomas los brazos y las piernas crecen desmesuradamente y las personas afectadas pueden sobrepasar los 24 m de altura

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ENDOCRINOLOGIA

AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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ENDOCRINOLOGIA

Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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ENDOCRINOLOGIA

2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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ENDOCRINOLOGIA

52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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ENDOCRINOLOGIA

BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

Trabajo final Paacutegina 52

ENDOCRINOLOGIA

Trabajo final Paacutegina 53

  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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Page 34: Trabajo Final Endocrinologia

ENDOCRINOLOGIA

AcromegaliaCausas tumor aparecido despueacutes del crecimiento completo de los huesosSiacutentomas cara larga mandiacutebulasprominentes y pies y mano grandes

Hormonas tiroideasProducidas en la glaacutendulatiroides

Bocio

Causas deacuteficit de yodoSiacutentomas crecimiento anormal de la glaacutendula tiroides

Cretinismo

Causas ausencia congeacutenita de tiroxina El yodo es un componente esencial para lasiacutentesis de la tiroxina su ausencia bloquea su produccioacuten y produce deacuteficit de tiroxinaSiacutentomas retraso fiacutesico y mental (un enfermo adulto alcanza una edad mental de 4 antildeos) estatura corta escoliosos abdomenen peacutendulo extremidades deformadas facciones toscas y pelo escaso y aspero

Hipertiroidismo

Causas aumento de produccioacuten

Siacutentomas aumento de la tasa metaboacutelica (nerviosismo irritabilidad)

Hormona paratiroidesParathormonaProducida en la glaacutendulaParatiroides

Tetania

Causas alteracioacuten de determinados iones sanguiacuteneos especialmente cuando existe hipocalcemia (huesos deacutebiles y quebradizos)Siacutentomas accesos de contraccioacuten toacutenica de los muacutesculos

Hipercalcemia (cantidad excesiva de calcio en la sangre)

Insulina

Diabetes mellitus

Causas En un diabeacutetico

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ENDOCRINOLOGIA

Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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ENDOCRINOLOGIA

5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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ENDOCRINOLOGIA

como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

Trabajo final Paacutegina 38

ENDOCRINOLOGIA

cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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ENDOCRINOLOGIA

se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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ENDOCRINOLOGIA

bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
                                            • a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net
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ENDOCRINOLOGIA

Producida por el paacutencreas glaacutendula de secrecioacuten mixta

hay un deacuteficit en la cantidad de insulina que produce el paacutencreas o una alteracioacuten de los receptores de insulina de las ceacutelulas dificultando el paso de glucosaSiacutentomas produce un aumento de los llamados cuerpos cetoacutenicos en la sangre cuyo PH se torna aacutecido interfiriendo con la respiracioacuten

Hiperglucemia (exceso de glucosa en la sangre)

HormonascorticosuprarrenalesProducidas por las caacutepsulassuprarrenales

Enfermedad de Addison

Causas Puede desarrollarse tras una infeccioacutengrave como la tuberculosis tras sangrado masivo en las suprarrenales o tras cirugiacutea ablativa de las glaacutendulas como larealizada para extirpar un tumorSiacutentomas la secrecioacuten insuficiente de la hormona corticosteroide origina debilidad y astenia peacuterdida de peso baja tensioacuten arterial desequilibrio ioacutenico alteracionesgastrointestinales hipoglucemia en sangre depresioacuten e irritabilidad

Enfermedad de CushingCausas el edema confiere al rostro el aspecto de una Luna llena se acumula grasa en el tronco aumenta la concentracioacuten de glucosa en sangre

Metodologiacutea para la determinacioacuten de hormonas

Los exaacutemenes de sangre o de orina para determinar los niveles de cualquiera de las diferentes hormonas en el cuerpo incluyendo las hormonas reproductivas las tiroideas las suprarrenales las pituitarias y muchas otras Los exaacutemenes de hormona(s) especiacutefica(s) dependen de la causa del trastorno que se sospeche o de los siacutentomas en cuestioacuten

Anaacutelisis que se pueden realizar

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ENDOCRINOLOGIA

5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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ENDOCRINOLOGIA

cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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ENDOCRINOLOGIA

bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ENDOCRINOLOGIA

ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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ENDOCRINOLOGIA

Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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ENDOCRINOLOGIA

2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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ENDOCRINOLOGIA

52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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ENDOCRINOLOGIA

BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

httpwwwcirujanosdechileclRevistaPDF20Cirujanos202005_02RevCir205(14)AVpdf

httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

Trabajo final Paacutegina 52

ENDOCRINOLOGIA

Trabajo final Paacutegina 53

  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
                                            • a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net
Page 36: Trabajo Final Endocrinologia

ENDOCRINOLOGIA

5-HIAA

17-OH progesterona

17-hidroxicorticosteroides

17-cetosteroides

Tasa de excrecioacuten de

aldosterona urinaria en 24

horas

25-OH Vitamina D

Anaacutelisis de ACTH

Prueba de estimulacioacuten de

Anaacutelisis de ACTH (cortrosin)

prueba de supresioacuten de

Anaacutelisis de ACTH

ADH

Anaacutelisis de Aldosterona

Calcitonina

Catecolaminas en sangre

Catecolaminas en orina

Nivel de cortisol

Cortisol en orina

Sulfato DHEA

FSH

Hormona del crecimiento

HCG (cualitativa en suero)

HCG (cualitativa en orina)

HCG (cuantitativa)

Prueba de insulina

LH

Respuesta de la LH a la

GnRH

Parathormona

Renina

Pregnandiol

Progesterona en suero

Prolactina

Peacuteptido semejante a la PTH

RT3U

Prueba de estimulacioacuten de

secretina

Serotonina

Anaacutelisis de T3

Anaacutelisis de T4

Testosterona

TSH

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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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ENDOCRINOLOGIA

como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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ENDOCRINOLOGIA

cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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ENDOCRINOLOGIA

se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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ENDOCRINOLOGIA

bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

httpwwwcirujanosdechileclRevistaPDF20Cirujanos202005_02RevCir205(14)AVpdf

httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
                                            • a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net
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ENDOCRINOLOGIA

INTRODUCCION

En la actualidad mediante las teacutecnicas de unioacuten se realizan cotidianamente la deteccioacuten de hormonas asiacute como tambieacuten de otro tipo de biomoleacuteculas que se encuentran en cantidades muy pequentildeas en fluiacutedos bioloacutegicos Son varias lasteacutecnicas de unioacuten algunas de eacutestas son los inmunoanaacutelisis el ensayo de enlace competitivo con proteiacutena transportadora y el ensayo de unioacuten con receptor La teacutecnica que frecuentemente se ha utilizado es el radioinmunoanaacutelisis A partir de 1960antildeo en que Yalow y Berson dieron a conocer esta teacutecnica otros grupos de investigacioacuten la han desarrollado auacuten maacutes Sin embargo los principios teoacutericos sobre los que se fundamenta hanpermitido el avance de teacutecnicas derivadas de la misma como el enzimoinmunoanaacutelisis fluoroinmunoanaacutelisis y viroinmunoanaacutelisis

RADIOINMUNOENSAYO

El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingleacutes Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o meacutetodo radioinmunomeacutetrico que se basa en la formacioacuten especiacutefica de los complejos Antiacutegeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los meacutetodos radioloacutegicos La teacutecnica ha sido praacutecticamente reemplazada por el meacutetodo ELISA el cual mide la unioacuten Ag-Ac mediante colorimetriacuteas en lugar de radiometriacuteas Casi todas las moleacuteculas pueden ser antigeacutenicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa moleacutecula y marcarla radiactivamente Una buena manera de provocar que una moleacutecula sea antigeacutenica estaacute basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune Un coadyugante muy usado es la Albuacutemina de suero bovino (BSA) por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie apareceraacuten Anticuerpos contra el hapteno El RIA como un ejemplo de los ensayos de unioacuten tambieacuten se le ha denominado ensayo de saturacioacuten anaacutelisis de desplazamiento anaacutelisis deenlace insaturado anaacutelisis de fraccioacuten no enlazada radioensayo de dilucioacuten anaacutelisis competitivo radioensayo de enlace competitivo y ensayo inmunoradiomeacutetrico La naturaleza de esta metodologiacutea ha permitido que se le asignen tales nombres Todos los ensayos de unioacuten se caracterizan por estar constituidos por tres componentes baacutesicos la moleacutecula enlazadora (ligador o unidor) la moleacutecula que se desea enlazar (analito o ligando) y otro ligando marcado (trazador) En la actualidad algunas teacutecnicas de unioacuten marcan al ligador en vez del ligando en cualquier caso siempre estaacute presente el trazador ya sea como ligando o ligadorLa moleacutecula ligadora debe ser capaz de unirse uacutenicamente con aquella que interesa medir Es decir debe ser especiacutefica Ademaacutes la unioacuten tiene que serSuficientemente estable propiedad que se le denomina afinidad (6) Esto permite al unidor enlazarse con un tipo de moleacutecula a pesar de existir varias moleacuteculas estereoquiacutemicamente semejantes Cuando se utilizan anticuerpos

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como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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ENDOCRINOLOGIA

BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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ENDOCRINOLOGIA

Trabajo final Paacutegina 53

  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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Page 38: Trabajo Final Endocrinologia

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como ligadores el anaacutelisis recibe el nombre de inmunoanaacutelisis si es un receptor se llama ensayo receptor o si es una proteiacutena transportadora se denomina ensayo de proteiacutena de enlace competitivo (CPBA) Se han disentildeado anaacutelisis de unioacuten que emplean en cada caso uno de estos unidores sin embargo el principal obstaacuteculo para hacer praacutectico estos ensayos es la carencia de altas cantidades del unidor que presenten elevada afinidad y especificidad Por esta razoacuten se utilizan principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales Los primeros se producen en altas cantidades a traveacutes de la inmunizacioacuten activa de conejos cuyos borregos caballos o gallinasLos anticuerpos monoclonales se obtienen por la fusioacuten de plasmacitoma con linfocitos B de alguacuten animal inmunizado previamente Los hibridomas resultantes forman clonas que producen un tipo de inmunoglobulinas dirigidas hacia un especiacutefico determinante antigeacutenico Una ventaja adicional que tiene la utilizacioacuten de estos anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por tecnicas de union

Teacutecnicas de unioacutenLa afinidad y especificidad hacia cada uno de los determinantes antigeacutenicos y no contra todos aquellos que constituyen el inmunoacutegeno Cuando la sustancia que interesa medir es una hormona droga o metabolito presente en el fluido bioloacutegico recibe el nombre de ligando y es la moleacutecula que no estaacute marcada A eacutesta se le llama ligando friacuteo El trazador es el mismo ligando pero marcado ya sea con radioisoacutetopo enzima virus o compuesto fluorescente La marca sirve para detectar el complejo de unioacuten formado entre el ligando de la muestra bioloacutegica con el ligador Originalmente se usoacute como marca al yodo radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3) Sin embargo la baja eficiencia del conteo de la radiacioacuten emitida y el efecto de la extincioacuten del centelleo ha originado que se sustituyan por yodo-125 que no presenta las desventajas anteriores Las teacutecnicas de unioacuten que utilizan como componentes a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA Por otro lado si la marca es una enzima que mediante la reaccioacuten con el sustrato especiacutefico produce color el cual se detecta por absorcioacuten de luz entonces se llama enzimoinmunoanaacutelisis (EIA) Los viroanaacutelisis utilizan a virus como marca y los fluoroinmunoanaacutelisis (FIA) compuestos

METODO DE ELISA

PRINCIPIO DEL FUNCIONAMIENTO DEL KIT

Se presenta una placa recubierta de un anticuerpo (de hormona corticoide beta-agonistahellip dependiendo del anaacutelisis que llevemos a cabo) Los estaacutendares (controles positivos y negativos de dichas sustancias) y las muestras son antildeadidos a sus pocillos correspondientes e incubados durante un periacuteodo de tiempo determinado a temperatura ambiente Posteriormente se antildeade un marcador enzimaacutetico e incubado durante un tiempo Transcurrido eacuteste los pocillos son lavados se antildeade un substrato enzimaacutetico y el

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ENDOCRINOLOGIA

cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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ENDOCRINOLOGIA

se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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ENDOCRINOLOGIA

bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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ENDOCRINOLOGIA

Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

httpwwwcirujanosdechileclRevistaPDF20Cirujanos202005_02RevCir205(14)AVpdf

httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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cromoacutegeno que permitiraacute una reaccioacuten de color Despueacutes del periacuteodo de incubacioacuten indicado en cada Kit se antildeade una solucioacuten de paro de la reaccioacuten y se lee la placa en el lector de microplacas a una determinada longitud de onda pudiendo asiacute interpretar los resultados por comparacioacuten con los estaacutendares

FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAEl ELISA se basa e el uso de antiacutegenos o anticuerpos marcados con una enzima de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunoloacutegica como enzimaacutetica Al estar uno de los componentes (antiacutegeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo quedaraacute inmovilizada y por tanto seraacute faacutecilmente revelada mediante la adicioacuten de un substrato especifico que al actuar la enzima produciraacute un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotoacutemetro o un coloriacutemetro

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacioacutenbull Anticuerpos marcados

1 ELISA Directo2 ELISA Indirecto3 ELISA saacutendwich4 Doble (DAS)5 Heteroacutelogo (HADAS)

bull Antiacutegeno marcado1 ELISA competitivo

ELISA DirectoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble (ldquotapizadordquo) de antiacutegenos especiacuteficos Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos marcados (ldquoconjugadosrdquo) con una enzima si los anticuerpos reaccionan con los antiacutegenos el complejo quedaraacute solubilizado Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Indirecto

Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de antiacutegenos especiacuteficos para los anticuerpos objeto de estudio Lavado para eliminar los antiacutegenos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten del suero problema de tal forma que sus anticuerpos reaccionaraacuten especiacuteficamente con los antiacutegenos fijados al soporte Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anti-anticuerpos conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los anticuerpos especiacuteficos antildeadidos en el paso anterior y que

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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ENDOCRINOLOGIA

Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
                                            • a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net
Page 40: Trabajo Final Endocrinologia

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se encuentran fijados a los antiacutegenos Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

Pasos generales de un ELISA1 Tapizado del pocillo con el antiacutegeno o anticuerpo2 Adicioacuten de la muestra problema con la mezcla de antiacutegenos o anticuerpos3 Unioacuten del antiacutegeno o anticuerpo especiacutefico al anticuerpo o antiacutegeno tapizado en el pocillo4 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antiacutegeno o anticuerpo no unido5 Adicioacuten del anticuerpo secundario marcado con la enzima6 Unioacuten del anticuerpo secundario al antiacutegeno o anticuerpo7 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8 Adicioacuten del substrato9 Unioacuten del substrato a la enzima10 Desarrollo del color

ELISA Saacutendwich ldquoDASrdquo (Double Antibody Sandwich)Consta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijadosbull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA Saacutendwich ldquoHADASrdquoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten de la muestra problema (extracto vegetal sangre suero plasma etc) de tal forma que si estaacute presente el agente patoacutegeno de diagnoacutestico (antiacutegeno) reaccionaraacute especiacuteficamente con los anticuerpos fijados al soporte Lavado para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
                                            • a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net
Page 41: Trabajo Final Endocrinologia

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bull Adicioacuten de anticuerpos especiacuteficos del antiacutegeno a detectar (deben tener un epiacutetopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) los cuales reaccionan con los antiacutegenos antildeadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado

ELISA CompetitivoConsta de las siguientes etapasbull Fijacioacuten al soporte insoluble de anticuerpos especiacuteficos del agente patoacutegeno a detectar Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijadosbull Adicioacuten en concentracioacuten conocida de una mezcla de antiacutegenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior marcados con una enzima y antiacutegenos desconocidos objeto de estudio Paralelamente antildeadir uacutenicamente antiacutegenos del anticuerpo usado en el paso anterior marcados con una enzima Lavar para eliminar los antiacutegenos que no hayan reaccionadobull Adicioacuten de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora Se puede parar la reaccioacuten si se deseabull Lectura visual o colorimeacutetrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados Si las lecturas de ambas pruebas son anaacutelogas el antiacutegeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos el antiacutegeno objeto de estudio estaacute relacionado seroloacutegicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad oacuteptica es proporcional a la concentracioacuten del antiacutegeno problema en la muestra

Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes gruposbull ELISAs para detectar antiacutegenos ELISAs saacutendwichbull ELISAs para detectar anticuerpos ELISAs indirectos

La fase soacutelida debe ser de un tipo que permita un faacutecil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unioacuten de antiacutegenos o anticuerpos sobre su superficie Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado nuacutemero de muestras y un vez tapizadas el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse esteacuteriles y con o sin tapa

Microplacas de poliestireno de 96 pocillosLas teacutecnicas de ELISA se realizan mediante la adicioacuten secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacioacuten de todas y cada una de las etapas

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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ENDOCRINOLOGIA

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
                                            • a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net
Page 42: Trabajo Final Endocrinologia

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Esta completa automatizacioacuten se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nuacutemero de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

1 Lavador de placas de 96 pocillos2 Lector de placas de 96 pocillos

1) 2)

Adsorcioacuten de antiacutegenos y anticuerpos (ldquotapizadordquo)

Los meacutetodos empleados son dos fundamentalmentebull Dilucioacuten del antiacutegeno o anticuerpo en tampoacuten carbonato (pH 96) e incubacioacuten posterior durante 3h a 37degC o 16h a 4degCbull Tratamiento a 40-50degC en tampoacuten fosfato (PBS) o en agua fisioloacutegica tamponada pH 72-74 hasta desecacioacuten

Solucioacuten de lavadoSolucioacuten salina con Tween 20 como agente tensioactivoClNa 85grTween 20 05mLAgua destilada 1000mL

Conjugados

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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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ENDOCRINOLOGIA

Trabajo final Paacutegina 53

  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
                                            • a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net
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La enzima escogida como marcador debe unirse faacutecilmente a antiacutegenos y anticuerpos encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogeacutenico o fluorogeacutenico conveniente y de faacutecil preparacioacuten Las enzimas maacutes utilizadas son fosfatas alcalina peroxidasa de raacutebano y szlig-galactosidasa a continuacioacuten se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una asiacute como los substratos que se emplean con cada una de ellasLas operaciones de marcado o conjugacioacuten llevan impliacutecitas dos etapasbull Purificacioacuten de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacioacuten generalmente salina de las proteiacutenas del antisuero seguida de una diaacutelisis y purificacioacuten de la fraccioacuten de anticuerpos mediante filtracioacuten molecular cromatografiacutea o separacioacuten en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacioacuten Finalmente se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mgmLbull Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehiacutedo o el del mperiodato soacutedico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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ENDOCRINOLOGIA

Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

httpwwwcirujanosdechileclRevistaPDF20Cirujanos202005_02RevCir205(14)AVpdf

httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccioacuten de IgGs y es la utilizacioacuten de proteiacutena A o G a Aquella dilucioacuten del conjugado que produzca menor reaccioacuten inespeciacutefica del conjugado auacuten a costa de aumentar el tapizado de la parada de la H o tanto el meacutetodo de deteccioacuten de los complejos antiacutegeno-anticuerpoy asiacute tenemos sistemas de deteccioacuten colorimeacutetricos fluorescentes y luminiscentes que a continuacioacuten pasamos a desarrollar marcadas con peroxidasaUna vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacioacuten esta conservacioacuten se suele realizar mediante liofilizacioacuten congelacioacuten a ndash70degC o filtrado esteacuteril y conservacioacuten a -20degC mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado esteacuterilLa buacutesqueda de la concentracioacuten oacuteptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1100 hasta 12000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antiacutegeno a concentracioacuten idoacutene (menor color de fondo o ldquobackgroundrdquo) con muestras negativas e implique una clara distincioacuten de las muestras positivas seraacute la oacuteptima La eleccioacuten de una concentracioacuten de conjugado oacuteptima va completamente ligada a planteamientos econoacutemicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro La eleccioacuten del substrato es de gran importancia para la estandarizacioacuten del meacutetodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta como son sensibilidad especificidad repetibilidad facilidad de lectura y complejidad de preparacioacuten asiacute como estabilidad despueacutes de la reaccioacuten hoy en diacutea existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y por la cual da lugar a productos de reaccioacuten solubles o necesario la utilizacioacuten de un substrato que tenga una tasa de reaccioacuten ldquolentardquo (15- alizar ensayos cineacuteticos de la reaccioacuten

COLORIMETRIA Los ensayos colorimeacutetricos dan un producto de reaccioacuten coloreado que absorbe luz en el espectro visible siendo la densidad oacuteptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medidoPara todos los ensayos enzimaacuteticos la etapa final es la adicioacuten del substrato enzimaacutetico el insolubles y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccioacuten Para ensayos colorimeacutetricos la tasa de desarrollo de color es proporcional dentro de un cierto rango a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenteTanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina tienen substratos que dan productos de reaccioacuten coloreados solubles La decisioacuten de queacute substrato es el mejor para cada tipo de ensayo depende de la sensibilidad deseada los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccioacuten que se vaya a utilizar Para ensayos que necesitan ser muy sensibles el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccioacuten muy raacutepida sin embargo para ensayos que requieren un rango dinaacutemico amplio son deseables substratos que den producto de reaccioacuten en un periacuteodo de tiempo largo(15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio dependiendo de la cantidad de muestra presentePara ensayos que se vayan a parar (se vaya a antildeadir a la reaccioacuten tras una cantidad de tiempo definido un inhibidor quiacutemico que pare el desarrollo de color y permita la deteccioacuten dentro de un periacuteodo razonable de tiempo) 30

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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

httpwwwcirujanosdechileclRevistaPDF20Cirujanos202005_02RevCir205(14)AVpdf

httpwwwcultekcominfotrossolucionesSoluciones-ELISA-protocolospdf

httpwwwrevbiomeduadymxpdfrb95616pdf

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ENDOCRINOLOGIA

Trabajo final Paacutegina 53

  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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minutos hasta su finalizacioacuten sin embargo cuando se vayan a reyenga una tasa de reaccioacuten ldquoraacutepidardquo (5 minutos o menos)Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimaacutetica (temperatura pH fuerza ioacutenica composicioacuten del tampoacuten reduccioacuten del substrato formacioacuten de productos inhibidores feed-back por formacioacuten del producto final desnaturalizacioacuten de la enzima y en ie del pocillo (donde la enzima estaacute localizada) y el lector no estaraacute midiendo la verdadera DO del pocillo Cuando siacute se mezcla ele los lectores de microplaca llevan incorporadosbull s colorimeacutetricos la enzima convierte el substrato presente El substrato deberiacutea ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz Asimismo el producto de la y utilizar algunos casos exposicioacuten a la luz) los que maacutes afectan al ensayo hoy en diacutea son el tiempo de reaccioacuten la temperatura y la exposicioacuten a la luzAntes de leer la DO yo tras la adicioacuten de la solucioacuten de parada es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccioacuten (ensayos de punto final solamente) y la total dispersioacuten del producto de color La precisioacuten del ensayo puede ser draacutesticamente mejorada antildeadiendo este simple paso al protocolo El efecto fiacutesico que la agitacioacuten de la placa antes de la lectura tiene en la DO resultante es muy importante Los coloriacutemetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo lo cual implica que una placa no agitada tendraacute pocillos que se asemejaraacuten maacutes al formato ldquoArdquo de la figura ya que debido a que la disolucioacuten del producto de la reaccioacuten es lenta si no es mecaacutenicamente agitada o mezclada el producto coloreado de la reaccioacuten estaraacute concentrado en la superficie producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato ldquoBrdquo de la figura) y el lector detectaraacute la verdadera DO del pocilloHay varias formas de realizar esta mezcla hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector hoy diacutea muchos si no la mayoriacutea dagitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser leiacutedas Ambos meacutetodos (agitadores internos o externos) cuando son usados correctamente pueden tener efectos positivos en la precisioacuten del ensayoFLUORESENCIA Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacioacuten de lo en un producto de reaccioacuten que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizadoEn comparacioacuten con los meacutetodos colorimeacutetricos los ensayos de fluorescencia son ligeramente maacutes sensibles y lo que es maacutes importante ampliacutean el rango de medida en oposicioacuten al liacutemite de 20-40 DO impuesto en los ensayos colorimeacutetricosUn substrato fluorogeacutenico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacioacuten la cual deberiacutea ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimaacutetico presenta reaccioacuten enzima-substrato deberiacutea tener distintas longitudes de onda de emisioacuten y de excitacioacuten ya que el substrato por si mismo no deberiacutea ser fluorescenteLos ensayos fluorimeacutetricos estaacuten sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la sentildeal inespeciacuteficamente La deteccioacuten por fluorescencia es

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

Trabajo final Paacutegina 48

ENDOCRINOLOGIA

Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

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ENDOCRINOLOGIA

2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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ENDOCRINOLOGIA

BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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Trabajo final Paacutegina 53

  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
                                            • a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net
Page 47: Trabajo Final Endocrinologia

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susceptible a cambios en el pH temperatura concentracioacuten ioacutenica concentracioacuten de detergente secado y a la matriz soacutelida lo cual puede conducir a distorsioacuten de luz un elevado background y fenoacutemenos de ldquoapagamientordquo yo ldquoblanqueamientordquo El fenoacutemeno de ldquolight scatteringrdquo (dispersioacuten de luz) estaacute ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moleacuteculas partiacuteculas en suspensioacuten o la superficie de la microplaca Por esta razoacuten es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillosreactivos quiacutemicos de elevado grado de pureza Las placas negras opacas y las tiras de la maacutes alta calidad estaacuten disentildeadas para reducir esta dispersioacuten de luz ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detectorEl ldquobackgroundrdquo (fluorescencia de fondo) yo la autofluorescencia son el principal problema para la realizacioacuten de ensayos en placas de 96 pocillos Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina bilirrubina partiacuteculas de celulosa drogas) los componentes de los diluyentes (iones metaacutelicos) el material de la placa (tipo de plaacutestico utilizado) y la contaminacioacuten variable (partiacuteculas de polvo huellas digitales) El background puede ser eliminado de tres formas mediante el disentildeo del ensayo (dilucioacuten de la muestra para ensayos homogeacuteneos y filtrado de los reactivos a traveacutes de una membrana de 045μm para ensayos heterogeacuteneos) mediantela instrumentacioacuten y mediante una estricta limpieza El fenoacutemeno de ldquoapagamientordquo (ldquoquenchingrdquo) se caracteriza por una reduccioacuten inespeciacutefica de la sentildeal y es causado por la absorcioacuten de la emisioacuten por el oxiacutegeno disuelto por lo que los reactivos pueden ser desgasificados pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura la estabilidad de la fuente permitido aumentar la versatilidad asociada con el disentildeo del experimento pe usando una variacioacuten del meacutetodo estaacutendar de ELISA 1048632 excitacioacuten se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciauesto que emite luz al ser degradado por ejemplo perdura ambiente durante todo el periacuteodo que dure el ensayo y debe ser elegido por su capacidad para producir luz intensa en estado activado por su capacidad exitacionsuspensacioacuten interna y mezcla dentro del propio lector la simplicidad del procedimiento la elevada sensibilidad la posibilidad de utilizan ndose lecturas seriadas hasta encontrar el oacuteptimo que seraacute aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia Las reacciones enzimaacuteticas colorimeacutetricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la graacutefica para muestras positivas y negativas por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimeacutetrica entre muestras positivas y negativas es maacuteximo antes de su utilizacioacuten para eliminar este efecto El fenoacutemeno de ldquoblanqueamientordquo (ldquobleachingrdquo) o ldquodecoloracioacutenrdquo (ldquofadingrdquo) estaacute tambieacuten caracterizado por una reduccioacuten en la sentildeal pero estaacute causado por un exceso en el tiempo de excitacioacuten Actualmente no suele ser unproblema debido a la baja energiacutea y corto tiempo de excitacioacuten de los fluoriacutemetros actualesOtras interferencias que de luz y el ancho de la banda de excitacioacuten La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos

Trabajo final Paacutegina 47

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ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

Trabajo final Paacutegina 48

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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
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ENDOCRINOLOGIA

ya que pequentildeas variaciones de un ensayo a otro pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismoMuchos de los plaacutesticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes por ello es importante elegir una placa que esteacute fabricada especiacuteficamente para fluorescencia Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda maacutes altas) ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan praacutecticamente las contaminaciones cruzadas Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos fluorescentes basados en ceacutelulas lo cual permite su visualizacioacuten durante el crecimiento de las mismas al mismo tiempo que reducen la transmisioacuten de luz lateral o la contaminacioacuten cruzad durante la deteccioacuten Con la llegada de los fluoriacutemetros para placas de 96 pocillos que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo una placa de fondo transparente se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimeacutetricamente con TMB) para la primera parte del ensayo y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimeacutetricamente con 4-MUP) para la segunda parte

LUMINISCENCIA Al igual que la fluorescencia la luminiscencia es u su rato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible La luminiscencia se describe como la emisioacuten de luz por parte d una sustancia que regresa desde un estado electroacutenicamente excitado a su estado original Las diferentes formas de luminiscencia difieren precisamente en la forma en que se alcanza dicho estado excitadoFotoluminiscencia la excitacioacuten mediante luz de una determinada longitud de onda es decir igual que en la fluorescenciaBioluminiscencia la excitacioacuten se alcanza mediante la utilizacioacuten de un compuesto luciferina o luciferasa

QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA la excitacioacuten se alcanza mediante una reaccioacuten quiacutemica

Actualmente es el meacutetodo disponible maacutes sensible debido a la posibilidad de multiplicacioacuten y amplificacioacuten de la sentildeal Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz) que son tiacutepicamente proporcionales a la cantidad de muestra presenteEl substrato luminiscente debe ser estable a temperaturabaja luminiscencia de fondo en estado basal (ldquobackground)de emitir luz estable durante un periacuteodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia)Existen dos meacutetodos de deteccioacuten de luminiscencia FLASH es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad maacutexima de luz en segundos o milisegundos por lo que es necesario comenzar la reaccioacuten mientras los reactantes estaacuten frente al sistema de deteccioacuten (fotomultiplicador)

Trabajo final Paacutegina 48

ENDOCRINOLOGIA

Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

1 Patologiacutea Animal

Trabajo final Paacutegina 49

ENDOCRINOLOGIA

2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

Trabajo final Paacutegina 50

ENDOCRINOLOGIA

52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

Trabajo final Paacutegina 51

ENDOCRINOLOGIA

BIBLIOGRAFIA

uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas

a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net

Catedra de Fisiopatologiacutea de la Universidad Nacional Experimental Romulo Gallegos - San Juan de los Morros ndash Venezuela

Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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Trabajo final Paacutegina 52

ENDOCRINOLOGIA

Trabajo final Paacutegina 53

  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
                                            • a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net
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Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicioacuten de los reactivos y el proceso de deteccioacuten sea siempre constanteGLOW consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una sentildeal constante La luz emitida a diferencia del color o la fluorescencia no se acumula por lo que la eacutesta debe ser intensa y la reaccioacuten enzimaacutetica prolongada para obtener suficiente sentildealLos aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son la reaccioacuten puede ser iniciada fuera del aparato de deteccioacuten por lo que se elimina la necesidad de incrementar la sentildeal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos Ademaacutes este tipo de reaccioacuten luminiscente puede ser medido usando un luminoacutemetro capturando la imagen en una peliacutecula fotograacutefica o mediante sistemas de anaacutelisis de imagenAunque en teoriacutea estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son maacutes homogeacuteneos cuando el tiempo de incubacioacuten enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un periacuteodo de estabilizacioacuten de 2 minutos tras la adicioacuten del substrato y entonces leer inmediatamente las placas)Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable y eacutesta ha de estar disentildeada especiacuteficamente para luminiscencia Habitualmente son blancas y opacas con el fondo transparente u opaco ambas versiones estaacuten disentildeadas para reducir contaminacioacuten cruzada y el background ocasionado por la composicioacuten de la resina blanca Las placas con fondo transparente s habitualmente para ensayos luminiscentes basados en ceacutelulas tales como ensayos de proliferacioacuten celular ya que permiten la visualizacioacuten de las ceacutelulas durante su crecimiento y tambieacuten previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccioacutenTambieacuten son uacutetiles para ensayos dobles con un producto colorimeacutetrico para un primer anaacutelisis y otro luminiscente para un segundoFinalmente se debe optimizar el tiempo de incubacioacuten realizaacute Variacioacuten de la absorbancia en funcioacuten del tiempo para muestras positivas y negativas y tiempo oacuteptimo de lectura o parada de la reaccioacutenLectura e interpretacioacuten de los resultadosLa lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimeacutetricamente A simple vista pueden ser leiacutedos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacioacuten y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacioacuten de 01 de densidad oacuteptica) ya que dicha lectura visual tendraacute el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos liacutemite No obstante evita la adquisicioacuten de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacasUna de las grandes ventajas de la teacutecnica ELISA es la posible automatizacioacuten de la lectura y por lo tanto su objetividad Dicha automatizacioacuten se puede conseguir con un simple coloriacutemetro o espectrofotoacutemetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automaacutetica de microplacasLos resultados finales de la lectura colorimeacutetrica se reflejan numeacutericamente mediante valores de absorbancia o densidad oacuteptica que se obtendraacuten a la longitud de onda maacutes adecuada para la coloracioacuten final alcanzadaAplicaciones del ELISA

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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

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52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
                                            • a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net
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2 Enfermedades producidas por paraacutesitos3 Babesias y tripanosomas4 Toxocara canis5 Toxoplasmosis6 Triquinosis7 Enfermedades producidas por Micoplasmas8 Enfermedades producidas por bacterias9 Mycobacterium tuberculosis10Brucelas11Enterotoxinas Vibrio cholerae12Estreptococos13Salmonelas14Enfermedades producidas por virus15Enfermedad de Aujeszky16Enfermedad de Newcstle17Fiebre aftosa18Leucemia felina19Peste porcina africana20Peste porcina claacutesica21Rinotraqueitis infecciosa22Rotavirus23Artritis viacuterica24Otras aplicaciones25Hormonas26Gonadotropina corioacutenica27Progesterona28Testosterona29Hormonas tiroideas30Cuantificacioacuten de inmunoglobulinas31 IgG32 IgE33 IgA34 Inmunopatologiacutea35Anticuerpos anti-DNA36Factor reumatoide37 Inmunocomplejos circulantes38Patologiacutea Vegetal39Enfermedades producidas por virus40En frutales41PPV42CLSV43TRSV44En ciacutetricos45CTV46En patata47PLRV48PVY49PVX50PVA51TRV

Trabajo final Paacutegina 50

ENDOCRINOLOGIA

52En cereales53En guisante54En luacutepulo55En soja56En ornamentales57En plantas hortiacutecolas58Enfermedades producidas por bacterias59Enfermedades producidas por Micoplasmas60Enfermedades producidas por hongos

Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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BIBLIOGRAFIA

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Patologiacutea General semiologiacutea cliacutenica y fisiopatologiacutea - J Garciacutea ndashConde

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
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Determinacioacuten de beta-agonistas corticosteroides y hormonas anabolizantes en piensos y correctores minerales suero sanguiacuteneo orinas y pelo Realizamos un meacutetodo analiacutetico por el cual podemos detectar la presencia de numerosas sustancias por la teacutecnica ELISA que consiste en primer lugar en una homogeneizacioacuten de la muestra una purificacioacuten de la misma concentracioacuten del analito y finalmente en una aplicacioacuten al Kit Paralelamente se doparaacute una muestra exenta del metabolitoanalito a detectar llamada muestra fortificada que llevaraacute el mismo proceso de extraccioacuten y que en caso de no dar resultado positivo se realizaraacute un meacutetodo de confirmacioacuten por CGMS Efecto de los antitiroideos Los antitiroideos son sustancias que inhiben la siacutentesis de hormona tiroidea (tiroxina) Se administran mezclados con el pienso durante 40 diacuteas antes del sacrificio de los animales por ello se conocen normalmente como ldquofinalizadores caacuternicosrdquo Producen un siacutendrome de hipotiroidismo caracterizado por apatiacutea engrosamiento de la piel edemas subcutaacuteneos duros retencioacuten de agua hipertrofia tiroidea y a veces cardiaca debilidad muscular y un raacutepido aumento de peso El empleo de estas sustancias constituye un auteacutentico fraude ya que la ganancia ponderal se debe a la retencioacuten hiacutedrica en los tejidos muscular y subcutaacuteneo y a un aumento de la grasa subcutaacutenea La utilizacioacuten de antitiroideos como promotores del crecimiento animal estaacute prohibida en la UE desde 1981 Determinacioacuten de tireostaacuteticos en tiroides Meacutetodo analiacutetico por el cual se puede detectar la presencia de determinados tireostaacuteticos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten en la glaacutendula tiroides El procedimiento consiste en homogeneizar la glaacutendula tiroidal someterla a un ataque con un disolvente orgaacutenico y purificar la muestra obtenieacutendose asiacute un residuo que seraacute llevado a un vial

cromatograacutefico para proceder a la identificacioacuten de sustancia mediante la identificacioacuten de picos en funcioacuten de su separacioacuten en un tiempo de retencioacuten y longitud de onda determinados

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  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
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  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
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            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
                                            • uarr Apuntes de Fisiopatologiacutea de Sistemas
                                            • a b 247 Tirotropina Hormona estimulante del tiroides - N3 Participacioacuten Funcional - psicobiologia net
Page 53: Trabajo Final Endocrinologia

ENDOCRINOLOGIA

Trabajo final Paacutegina 53

  • Farmacologiacutea
  • Etimologiacutea
  • Partes
  • Loacutebulo posterior o neurohipoacutefisis procedente de la evaginacioacuten del piso del tercer ventriacuteculo del dienceacutefalo al cual se le conoce con el nombre de infundiacutebulo queda unido a traveacutes del tallo hipofisario almacena a las hormonas ADH y oxitocina secretadas por las fibras amieliacutenicas de los nuacutecleos supraoacutepticos y paraventriculares de las neuronas del hipotaacutelamo
  • Adenohipoacutefisis
    • Hormonas de la adenohipoacutefisis
    • Hormona del crecimiento o somatotrofina (GH) Estimula la siacutentesis proteica e induce la captacioacuten de glucosa por parte del muacutesculo y los adipocitos ademaacutes induce la gluconeogeacutenesis por lo que aumenta la glucemia su efecto maacutes importante es quizaacutes que promueve el crecimiento de todos los tejidos y los huesos en conjunto con las somatomedinas Por lo que un deacuteficit de esta hormona causa enanismo y un aumento (ocasionado por un tumor acidoacutefilo) ocasiona gigantismo en nintildeos y acromegalia en adultos (consecuencia del previo cierre de los discos epifisiarios)
      • Neurohipoacutefisis
      • Regulacioacuten hipotalaacutemica
        • HORMONAS DEL HIPOTALAMO
        • El hipotaacutelamo es una glaacutendula endocrina que forma parte del dienceacutefalo y se situacutea por debajo del taacutelamo[] Libera al menos nueve hormonas que actuacutean como inhibidoras o estimulantes en la secrecioacuten de otras hormonas en la adenohipoacutefisis por lo que se puede decir que trabaja en conjunto con eacutesta
          • Anatomiacutea
          • Nuacutecleos neuronales
          • Funciones
          • Hormonas
            • Neurohormonas
            • Factores hipotalaacutemicos
              • Hormona tiroidea
                • Tipos de hormona tiroidea
                • Siacutentesis y liberacioacuten de hormonas tiroideas
                • Metabolismo y eliminacioacuten de las hormonas tiroideas
                • Efectos de las hormonas tiroideas
                  • Efectos fisioloacutegicos
                    • Medicioacuten del nivel de hormonas tiroideas en el plasma
                      • Paratiroides
                      • Glaacutendula suprarrenal
                        • Introduccioacuten
                        • Corteza suprarrenal
                          • Zona glomerular
                          • Zona fascicular
                          • Zona reticular
                              • Paacutencreas
                                • Histologiacutea del paacutencreas
                                  • Ceacutelula alfa (Alfa cell)
                                  • Ceacutelula beta (Beta Cell)
                                  • Ceacutelula delta (Delta Cell)
                                  • Ceacutelula epsilon (Epsilon Cell)
                                  • Ceacutelula F (PP CELL)
                                  • Estructura ubicacioacuten y hormonas que se producen en el sistema reproductor femenino
                                    • Pituitaria
                                    • Ovarios
                                    • Hormonas esteroiacutedicas
                                    • Hormonas peptiacutedicas
                                    • Otras hormonas
                                      • Principales alteraciones patoloacutegicas de las hormonas
                                          • RADIOINMUNOENSAYO
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