GENÈTICA MOLECULAR

DUPLICACIÓ DE L’ADN

MUTACIONS

“Dogma central de la biologia”

BIOSÍNTESI DE L’ADN

La duplicació de l’ADN és un procés multienzimàtic on les dues cadenes es separen i es sintetitzen dues de noves.

En un principi existien tres hipòtesis de treball:Replicació conservativaReplicació dispersativaReplicació semiconservativa

La replicació de l’ADN en eucariotes es fa en la fase S del cicle cel·lular i cada cromosoma es replica a partir de molts orígens de replicació (replicons)

Treballant amb marcadors radioactius es va demostrar que la duplicació de l’ADN seguia el model semiconservatiu

Experiment de Meselson i Stahl (1957)

Van cultivar el bacteri Escherichia coli en un medi amb nitrogen no radioactiu (isòtop pesant).

Seguidament van transferir els bacteris a un medi amb nitrogen lleuger i els van deixar reproduir una vegada. Llavors van extreure l’ADN i el van ultracentrifugar

Si es feia el mateix procediment amb la segona generació (deixant que es reproduïssin dues vegades en nitrogen lleuger), apareixien dues bandes (semipesant i lleuger)

Això demostrà que la replicació era semiconservativa. Si fos conservativa, la F1 haurien de sortir 2 bandes (lleugera i pesant) i si fos dispersativa hauria de sortir ADN en tota la franja des de la banda lleugera fins la pesada

REPLICACIÓ SEMICONSERVATIVA

Segons aquest model, cada nou fragment d’ADN conté una cadena “original” i una cadena “nova”

Els estudis es van realitzar primerament sobre procariotes. Posteriorment, es va veure que els resultats observats en procariotes eren molt semblants als observats en eucariotes.

Per tal que es pugui fer la replicació, les dues cadenes s’han de desenrotllar i obrir, de manera que es formaran bombolles de replicació

La duplicació de l’ADN segueix sempre la mateixa direcció:

ELS ENZIMS QUE DUPLIQUEN l’ADN LLEGEIXEN AQUEST DE L’EXTREM 3’ CAP A L’EXTREM 5’ PERÒ POSEN ELS NUCLEÒTIDS COMPLEMENTARIS NOUS A L’INREVÉS, DE L’EXTREM 5’ CAP AL 3’

De fet, tots els enzims que llegeixen l’ADN ho fan de la mateixa manera: llegeixen de l’extrem 3’ cap al 5’ i copien del 5’ cap al 3’

REPLICACIÓ EN PROCARIOTES

Els estudis fets sobre procariotes van demostrar que la duplicació de l’ADN era semiconservativa (cada doble cadena està formada per una cadena nova i una altra original), seqüencial (sense interrupcions) i bidireccional (sempre en la mateixa direcció: lectura 3’ a 5’ i copia de 5’ a 3’).

REPLICACIÓ SEMICONSERVATIVA (EN EUCARIOTES)Diferenciem 3 passos:

1. Desenrotllament i obertura de la cadena:1.1. La cadena perd la seva estructura secundària gràcies a enzims com helicases, girases, topoisomerases,etc...

1.2. Es formen bombolles de replicació. Les cadenes s’han d’obrir (en un únic punt en les procariotes però en molts en eucariotes) per poder fer la duplicació. Aquestes bombolles s’obren més i donen lloc a les forquetes de replicació. D’aquesta manera es permet que els enzims que han de llegir l’ADN ho puguin fer

2. Síntesis de les noves cadenes d’ADNL’enzim encarregat de seleccionar i posar els nucleòtids complementaris és l’ADN polimerasa. Aquest enzim, però, necessita una petita seqüència de nucleòtids ja feta (“primer”),sintetitzat per una primasa. El primer és una petita seqüència de nucleòtids d’ARN complementaria a la cadena d’ADN i que serveix com a base per a que l’ADN polimerasa pugui realitzar la seva funció. Més endavant, aquest primer s’hidrolitzarà per acció d’una nucleasa i els nucleòtids seran substituïts per nucleòtids d’ADN

Mentre l’ADN polimerasa posa nucleòtids, la forqueta de replicació es desplaça en la mateixa direcció que la duplicació (de l’extrem 3’ cap al 5’). Això fa que mentre una de les dues cadenes es sintetitza de manera continua, l’altra no es pot sintetitzar (la cadena orientada de 5’ a 3’)

Davant d’aquest problema el 1968 Reiji Okazaki proposà que la cadena 5’ a 3’ es duplicava “a salts”. Aquests salts feien aparèixer fragments nous d’ADN denominats fragments d’Okazaki

A mesura que la forqueta de replicació avança, la cadena 5’ a 3’ resta sense duplicar. Quant aquesta part es prou llarga, es sintetitza un primer en sentit contrari a l’obertura de la forqueta de manera que una ADN polimerasa pot duplicar el fragment. Com que el procés és continu (obertura de la forqueta i duplicació), a mesura que la forqueta de duplicació avança es creen noves parts que es duplicaran “a salts”

Distingim llavors entre la cadena continua i la cadena retardada

A mesura que el procés avança, els primers són hidrolitzats per les nucleases i substituïts per nucleòtids d’ADN. Més endavant, els fragments s’uneixen gràcies a ligases

La replicació de l’ADN lineal (com la dels cromosomes eucariòtics) planteja un problema amb els extrems de l’ADN.

En cada replicació queda un encebador de ARN en l’extrem del filament retardat que no pot ser substituït per nucleòtids d’ADN, ja que l’ADN polimerasa necessita un encebador, i no hi ha lloc per sintetitzar-lo (“la cadena s’ha acabat”)

Com a resultat d’això, cada replicació faria que l’ADN s’anés escurçant.

En els cromosomes eucariòtics aquest problema es presenta en els extrems, els anomenats telòmers.

En els telòmers la seqüència de bases és especial i està controlada per l’activitat d’un enzim anomenat telomerasa, que afegeix els nucleòtids d’ADN que falten

3. Correcció d’errorsEls errors que es corregeixen són errors d’aparellaments entre bases.

Existeixen dos mecanismes de correcció.

El primer mecanisme es troba en la pròpia ADN polimerasa. Aquest enzim pot actuar com a exonucleasa, reconeixent els errors que pot fer durant la duplicació. L’ADN polimerasa, abans de posar un nou nucleòtid, comprova si el nucleòtid anterior és correcte, rectificant-lo si és necessari.

Tot i així, hi ha errors. Aproximadament la freqüència d’errors és de.... 1/10·106 bases.............És molt ???

Complexes multienzimàtics:. Un cop sintetitzada un fragment d’ADN, aquests complexes recorren les noves cadenes detectant els errors d’aparellament i corregint-los

...I Tot i així, encara hi ha errors. Menys que abans, això si !!

El sistema no és infalible!! (Això és bo ????)

La freqüència d’errors baixa fins a.... 1/10 000·106 bases

I com es reconeixen les bases que són errònies???

COMPARACIÓ DE LA REPLICACIÓ ENTRE PROCARIOTES I EUCARIOTES

PROCARIOTES EUCARIOTESL’ADN no està enrotllat formant nucleosomes i per tant no necessita desenrotllar-se per ser llegit

L’ADN està enrotllat i forma nucleosomes per la qual cosa s’ha de desenrrotllar

Només hi ha una bombolla de replicació Hi ha moltes bombolles de replicació (replicons) (a Drosophila hi ha 3 500)

Els fragments d’Okazaki tenen de 1 000 a 2 000 nucleòtids

Els fragments tenen entre 100 i 200 nucleòtids

Hi ha 3 ADN polimerases Hi ha 5 ADN polimerases