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Selección de métodos de Trabajo y Columnas para sus Aplicaciones en HPLC y GC-MS
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HPLC y GC MS
¿Cuáles son la prácticas estándar en el desarrollode métodos?de métodos?
1. Elección del método más adecuado para la purificación de muestras y su clean up de la muestramuestras y su clean-up de la muestra.
2. Seguir un esquema preferido en el desarrollo de métodos y probardistintas situaciones modificando los parámetros que varían la selectividad– como el pH, la columna, o distintas fases móviles
3 U ft d d ll d ét d li li i3. Usar un software de desarrollo de métodos– realizar analisispredecibles y sacar conclusiones sobre el mejor método
4. Evaluar multiples columnas/multiples fases móviles de modomanual o automático, determinar los mejores resultados (i.e. usando valvulas de conmutación para cambiar entre columnas,usando valvulas de conmutación para cambiar entre columnas, software para evaluar picos, etc.)
Línea SampliQ SPE de Agilent.
Solución completa de Agilent para SPE• Nueva! Tecnología de Polímeros – Caracterizados
por su alta retención excepcional recuperación ypor su alta retención, excepcional recuperación y excelente reproducibilidad en un amplio rango de solventes y soluciones.
• Basados en Sílica – Disponibles en fase reversa (no-polar), normal (polar) e intercambio iónico con enlaces trifuncionales que proporcionan una mayor estabilidad.
• Otras fases– Fases de Florisil PR, aluminas y , ycarbono indicadas para aplicaciones especiales.
• Sorbentes especiales de modo mixto queproporcionan mecanismos de retencion duales.S b t l Q EChERS C l t• Sorbentes a granel y QuEChERS – Completaseleccion de sorbentes a granel para empaquetar suspropios cartuchos, así como una linea completa de sorbentes y sales para QuEChERS .
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¿Qué son los Polimeros SampliQ?Caracteristicas:• Alta retención, , excepcional recuperación y
excelente reproducibilidad• Gran robusted de los sorbentes: si el
cartucho se seca accidentalmente durante el d SPE h b á i d dproceso de SPE, no habrá riesgo de perder
analitos y/o reproducibilidad• Compatibilidad con la mayoría de los
solventes orgánicos y soluciones acuosas en un rango de pH range de 0 a 14u a go de p a ge de 0 a
• Partículas esféricas y estrecha distribución de tamaños, que aseguran un flujo reproducible
Especificaciones:p• spherical particles 30 y 60 μm• Tamaño de poro 74-80Å (medida BET)• pore size 1000Å (medida de exclusión portamaño inverso)
Control de Calidad de la Resina:Test de empaquetamiento de cartucho•Test de pureza de cartucho (GC)tamaño inverso)
• Area superficial 475-505 m2/g• Control de calidad de las partículas
•Deteccion Electrozona (tamaño)•Microscopia de luz (forma)
p ( )•Test de pureza de la frita(GC)•Comprobación del peso•Resistencia al flujo del cartucho•Extracción de Residuo (%)Microscopia de luz (forma)
•Espectrometria de masas (contaminantes)( )
•Turbidez (NTU)
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Rendimiento robusto de los Polímeros
100
120
140
60
80
100
DRY DRY DRY DRY DRY DRY DRYWET WET WET WET WET WET WETDRY DRY DRY DRY DRY DRY DRYWET WET WET WET WET WET WET
20
40
01acetaminophen
propranolol
brompheniramine
mianserin
doxepin
fluoxetine
Dihydroxynaphthalene
acetaminophen
propranolol
brompheniramine
mianserin
doxepin
fluoxetine
Dihydroxynaphthalene
• Recuperaciones altamente reproducibles en húmedo o seco– Cartuchos secados al vacío durante 10 minutos antes del paso de equilibración
• RSD’s de recuperaciones para cada compuesto (n=5) muy bajoR d t d d bá i l h t hid fóbi t• Rango de compuestos desde básicos muy polares hasta hidrofóbicos y neutros.
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Polimeros SampliQ OPT e Intercambio Ionico FuerteResin Resin
O
RN
R
SO -
Resin
N
R
x-Stream
SO3
OPT
R1 R2 N
SCX Resin
R3
R2R1
SAX resinOPT • Polimero de poliamida• Tiene afinidad por compuestoshidrofóbicos e hidrofílicos
SCX• Polimero de divinilbenzeno
difi d á id
SAX• Polimero de divinilbenzeno modificadomodificado con ácido
sulfónico• Tiene afinidad de modomixto para compuestosbá i t
divinilbenzeno modificadocon una amina terciaria• Tiene afinidad de modomixto para compuestosacidos y neutrosbásicos y neutros acidos y neutros
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Recuperaciones y Reproducibilidad de Antibióticos en un extracto de miel con el sorbente poliméricoS liQ OPTSampliQ-OPT
Agilent Pub# 5990-3615ENg
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Recuperaciones y Reproducibilidad paraβ-Agonistas en Cerdo con Intercambiadorβ gcationico fuerte SampliQ-SCX
Agilent Pub# 5990-4180EN
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SampliQ WAX• La Resina WAX (weak anion exchanger) es un polimeroLa Resina WAX (weak anion exchanger) es un polimero
divinilbenceno modificado con una amina neutra. Su pKa ~6
• Muestra retención acídica/aniónica, neutros y ácidos fuertes (e.g. sulfonatos) que se retienen irreversiblemente en las resinas desulfonatos) que se retienen irreversiblemente en las resinas de intercambio aniónico fuerte
• El grupo amina funcional (pKa ~ 6) puede estarionizado o neutro (dependiendo del pH del tampón); al contrario de las resinas de intercambio aniónico fuerte (SAX, siemprei i d K 18) WAX f d Hionizado, pKa ~18) WAX ofrece un rango de pH más amplio
• Las resinas de intercambio aniónico débil exhiben un mecanismomixto de comportamiento: intercambio aniónico y fase reversa.
• La resina WAX es estable en el rango de pH de 0 a 14, y se puedehumedecer con agua(water-wettable)humedecer con agua(water wettable)
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Rendimientos de la Resina SampliQ WAX(intercambiadoranionico débil) en la Extracción de CompuestosÁ id / i i N t d Pl HÁcidos/anionicos y Neutros de Plasma Humano
Excepcional Recuperación con
8090
100
Excepcional Recuperación con SampliQ WAX
010203040506070
Acidic Compound Recovery from SampliQ 0 eco e y o Sa p QWAX
SampliQ WCX
• La resina WCX (weak cation exchanger) es un polimero divinilbencenomodificado con un ácido carboxílico modificado neutro.
• Muestra retención básica/aniónica neutros y bases fuertes (e g aminasMuestra retención básica/aniónica, neutros y bases fuertes (e.g. aminascuaternarias) que se retienen irreversiblemente en las resinas de intercambio cationico fuerte
El grupo carboxilo funcional (pKa 5) puede estar• El grupo carboxilo funcional (pKa ~ 5) puede estarionizado o neutro (dependiendo del pH del tampón); al contrario de las resinas de intercambio catiónico fuerte SCX siempreintercambio catiónico fuerte SCX, siempreionizado a todos los pHs, WCX ofrece un rango de pH más amplio
L i WCX hib i i t d t i t• Las resinas WCX exhiben un mecanismo mixto de comportamiento: intercambio catiónico y fase reversa.
• La resina WCX es estable en el rango de pH de 0 a 14, y se puedehumedecer con agua(water-wettable)
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Rendimientos de la Resina SampliQ WCX (intercambiador catiónico débil) en la Extracción de C t F t t Bá i /C tió i N tCompuestos Fuertemente Básicos/Catiónicos y Neutros
Basic Compounds Eluted by WCX
80
90
100
Basic Compounds Eluted by WCX
50
60
70
80
Basic Compounds
10
20
30
40
0
10
Atenolol Protryptyline Chlorpromazine
Strong AcidspKa <1
Weak BasespKa 2-10
Weak AcidspKa 2-8
Strong BasespKa >10
Agilent SampliQ Polymeric A/N/B MethodNeutral
CompoundspKa 3-10Analyte: Log P < 1.5 Log P < 1.5Log P > 1.3
Use: SampliQ OPT
Use: SampliQ SCX
Use: SampliQ WAX
Use: SampliQ SAX
Use: SampliQ WCX
Prepare Sample for SPE
Equilibrate:
Condition: 0.1% Formic Acid in Methanol
2% Formic Acid in Water
Methanol
Water
Methanol
Water
Load:
W h
q
Prepared sample
2% F i A id
Prepared sample
5% NH OH
Prepared sample
5% - 10% Methanol inWash:
Elute 1:
2% Formic Acid 5% NH4OH5% 10% Methanol in Water
Methanol or 0.1% Formic Acid in
MethanolWeak100% Methanol
Weak100% Methanol
Elute 2: 2% Formic Acid in Methanol
Methanol
5% NH4OH in Methanol
Weak Acids
Weak Bases
Weak Bases
Strong Acids
Strong BasesWeak Acids
NeutralsPage 13
Metodos preparación de muestra tradicionales- SPE- SPE
Prelavado*
Eli t i t
Preacondicionamiento
Cargar Lavar Eluir
P l t h C t L l t El i l litiElimar contaminantes quepuedan eluir con el analito
Preparar el cartuchopara aceptar la muestra
Cargar muestra y enjuagar cartucho)
Lavar con solvente queno eluya el analito
Eluir el analitio en volumen más pequeño
posible
1 21 2
Si el solvente de eluciónes más fuerte que el
solvente de preacondicionamiento
1. MeOH o ACN
2. Solvente débil(
Eluyen los componentes de la matriz deblimente
Se retienenanalitos y otros
compuestos de la
Eluye el anallitodejando los compuestospreacondicionamiento (agua,
tampón)
matriz deblimenteretenidos
compuestos de la matriz
compuestosaltamente retenidos
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¿Qué es QuEChERS?• Quick Easy Cheap Effective Robust and Safe QuEChERSQuick, Easy, Cheap, Effective, Robust and Safe , QuEChERS
• Método de Preparación de Muestra orientado a los mercados de Seguridad AlimentariaSeguridad Alimentaria.
Desarrollado conjuntamente por la USDA (2003) y por las AgenciasReguladoras de Alimentos Europeas (método prEn 15662: 2007)
• Metodología para una extracción simplificada de un gran número de residuos de pesticidas multiclase y multiresiduo en frutas y vegetales.
Mercado al que se dirigeMercado al que se dirige- Científicos en Seguridad Alimentaria que analizen residuos
de pesticidas/herbicidas en frutas y vegetales
A i l d /i t d l G bi- Agencias reguladoras/inspectoras del Gobierno
- Compañías de proceso de alimentos y analisis medioambientales
I ti d l U i id d/C t- Investigadores en la Universidad/Centrosde Investigación
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Primer Paso- Extracción
Representación Gráfica de los pasos QuEchERS El uso de SulfatoMagnésico en el paso depaso de extracción ayudaa mejorar lasrecuperaciones al facilitar la partición de los pesticidas en la capa orgánica, gracias a queretiene el agua.
Segundo Paso – SPE Dispersiva
Representación Gráfica de los pasos QuEchERS
La SPE Dispersiva implica la mezclade la sal y los sorbentes con el extracto en un tubo de centrífugapara retener las interferencias de matriz, pero no los analitos.
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Guía de Selección de SampliQ QuEChERS
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Aplicaciones
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Analisis de Residuos de Pesticidas en Espinacas usandolos kits AOAC QuEChERS Agilent SampliQ por GC/MS(Publication 5990 4305EN)(Publication 5990-4305EN)
En esta aplicación se describe el uso los kits AOAC de QuEChERS, en la preparación de muestra mediante, p pextracción y cleanup de 18 residuos de pesticidas multiclase, cromatografiables por GC en espinacas.
Para evitar la pérdida significante de pesticidas planarescausados por el carbon grafitizado(GCB) en la SPE dispersiva, se utilizó un método modificado con la adición dedispersiva, se utilizó un método modificado con la adición de tolueno
Los pesticidas del extracto de espinacas se analizaronp pentonces por cromatografía de gases/espectrometria de masas (GC/MS) operando en modo selective ion monitoring (SIM)(SIM).
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GC/MS de una extracción de espinacas por QuEChERS
Resultados del método original sin tolueno
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Resultados del método modificado contoluenotolueno
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Tendencias actuales en la investigacion en QuEChERSQuEChERS• En general la metodologia de QuEChERS se está
expandiendo hacia otras areas además de frutas y vegetales.• Analisis de pesticidas en aceites y alimentación infantil• PAHs en pescados.• Análisis de residuos de fármacos: Fármacos en Sangre Total• Análisis de residuos de fármacos: Fármacos en Sangre Total• Antihelmínticos en tejidos animales• Farmacos veterinarios en tejidos animales
(antibióticos (sulfonamida y quinolona) en higado de vaca.Pubnumber 5982-4921, 5982-4956)
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¿Cuáles son la prácticas estándar en el desarrollode métodos?de métodos?
1. Elección del método más adecuado para la purificación de muestras y su clean upmuestras y su clean-up.
2. Seguir un esquema preferido en el desarrollo de métodos y probardistintas situaciones modificando los parámetros que varían la selectividad– como el pH, la columna, o distintas fases móviles
3. Evaluar multiples columnas/multiples fases móviles de modomanual o automático, determinar los mejores resultados (i.e. , j (usando valvulas de conmutación para cambiar entre columnas, software para evaluar picos, etc.)
¿Cual sería un buen comienzo para el Desarrollo de Médotos según este modelo?de Médotos según este modelo?1. Elegimos una columna C18 – muchas posibilidades, tecnología bien conocida
a) Una columna corta reduce el tiempo de desarrollo de un métodob) Tamaños pequeños de partícula proporcionan la resolucion deseada en menosb) Tamaños pequeños de partícula proporcionan la resolucion deseada en menos
tiempoc) Las nuevas columnas C18 puede mejorar los resultados– basada en altas
eficacias y mejores formas de pico2. Elegimos una fase móvil simple– fiable, que trabaje con muchas muestras
a) Tampón fostato a pH 3, TFA, o ácido fórmico en la parte acuosab) Acetonitrilo o metanol en la parte orgánica
3. Ajustar la fase móvil para conseguir la retención y resolución deseadasa) Adecuar la resolución de todos los picos, Rs 2.0 – require la más alta eficaciab) La retención del primer pico preferiblemente debe ser al menos k=1c) Tiempo de análisis por debajo de 20 min– o más corto d) Nuevas columnas, columnas cortas con pequeños tamaños de partícula
que proporcionen más eficacia y resolución en tiempos de analisis cortos, acelerando el desarrollo de métodos.
Parametros Típicos en el Desarrollo de Métodos- Efectos de la Selectividad, Eficacia y Retención en la Resolución
7.00Lo que más influye en la Resolución es la Selectividad
• Cambio Fase Estacionaria• Cambio Fase Móvil Parámetros Típicos Desarrollo Métodos
Lo que más influye en la Resolución es la Selectividad
5.00
6.00 • Los Platos es lo más fácil de aumentar
3.00
4.00
Res
olut
ion
Increase NIncrease AlphaIncrease k'
1.00
2.00
0.001 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Rs = N½/4 (-1)/ k’/(k’+1)
Plates: 5000 10000 15000 20000 25000Alpha: 1.10 1.35 1.60 1.85 2.1Alpha: 1.10 1.35 1.60 1.85 2.1k’: 2.0 4.5 7.0 9.5 12.0
Nuevas opciones de columnas para el Desarrollo de Métodos Estándarde Métodos Estándar 1. Columnas más cortas con tamaños de partícula más pequeños
– Columnas Rapid Resolution High Throughput (RRHT) con tamaño de partícula de 1 8um y– Columnas Rapid Resolution High Throughput (RRHT) con tamaño de partícula de 1.8um y 600 bares – 50mm o más cortas para un desarrollo de métodos más rápido
– Columnas más largas para maximizar la eficacia, con particulas de1.8um hasta 1200 bares-100 o 150mm
– Columnas de nucleo solido, Poroshell 120, de 2.7um hasta 600 bares.– Muchas opciones de fases estacionarias para un esquema completo en el desarrollo de
métodos
2. Fases Estacionarias mejoradas con un rendimiento escepcional
– Mejor forma de pico y eficacia dan lugar a una mayor resoluciónC íti l j ét d– Críticas para los mejores métodos
– Las nuevas columnas Eclipse Plus proporcionan un rendimiento mejorado
USP and FDA Method Adjustment CriteriaMethod Adjustment Criteria for Column Dimensionsj
Parameter Maximum Specifications Comments/Examples
Column Length ± 70% 250mm 75mmColumn Length ± 70% 150mm 50mm
Column Internal Diameter
±50% (FDA ORA-LAB 5.4.5*)
USP – Column ID can be dj t d id d li l it
4.6 mm 3.0 mm (-35%)
4.6 mm 2.1 mm (-54%)adjusted provided linear velocity
is constant** 3.0 mm 2.1 mm (-30%)
Flow Rate ±50%Reduce as much as needed – If you change to a smaller/ shorter
Injection VolumeReduce as much as needed must still meet detection limits
and precision
If you change to a smaller/ shorter column make the appropriate
change in injection volume
Particle Size Reduce by up to 50% You can change column length Particle Size Reduce by up to 50% and particle size to keep Rs same
*For the current and official copy, check the Intranet at http://web.ora.fda.gov/dfs/policies/manuals/default.htm ** USP 30 Second Supplement Revisions, PF34(1)
Elija la mejor fase estacionaria para cada rango de pH
StableBond, pH 1-61. Grupos silanos voluminosos
Eclipse XDB, pH 2-91. dimethylalquilsilanos
Extend-C18, pH 2-11.51. Estructura bidentada única
Eclipse Plus, pH 2-91. Mayor pureza de la sílicep
2. No desactivaday q
eXtra Densely Bonded 2. doble-desactivaciónproprietaria
�
2. Doble desactivación
* R
SiO R1C18C18
CH3
SiOCH3
SiO
y p2. Mejorada doble desactivación
O
R
Si
ROH
R1
SiO
SiO
Silica Support
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
O
O
Si
SiCH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
O
O
Si
SiCH3
OH
Si
R
R
O R1O
O Si
CH3
CH3
CH3
CH3CH3
CH3
Si O
O Si
CH3
CH3
CH3
CH3CH3
CH3
Si
RCH3 CH3
Capacidad de carga de las columnas
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Primeros pasos en un esquema de desarrollo de métodos
P i l i fPrimero selecciona una fase estacionaria C18 o C8 de alta calidad para una buena retención y resolución con muestras típicas ácidas básicas y neutras• Bajo pH
• Elige Eclipse Plus C18PASO 1
muestras típicas ácidas, básicas y neutras.
Optimiza el componente organico de la fase movil para mejorar la selectividad
Bajo pH • Ajusta %ACN a 0.5 <k < 20
PASO 2Resolución insuficiente
Elige fases estacionarias alternativas para optimizar el método si es necesario
Cambia % organicoPASO 2
PASO 3Resolucón insuficiente
necesario
Elige SB-C18 para pH 1-2
C l l RRHT
• Cambia el modificador orgánico• Ajusta % orgánico a 0.5 < k <20
PASOResolución insuficiente
Con las nuevas columnas RRHT, estos pasos pueden hacerse rapidamente, haciendo posible encontrar el mejor método
• Cambia fase estacionaria• Eclipse Plus C8, SB-C18, CN, Fenil, otra RP
PASO 4
encontrar el mejor método.Fenil, otra RP
1. Comienza el Desarrollo de Métodos con columnas RRHT Diferentes ZORBAX RRHT C18 para maximizar la Selectividad
Eclipse Plus C18
F Mó il (69 31) ACN
1 23
41º OpciónMejor Resolución y Forma de Pico
StableBondSB C18
Fase Móvil: (69:31) ACN: aguaFlujo 1.5 mL/min.Temp: 30 °CDetector: Single Quad ESI positive mode scan Columnas: RRHT
1 2 3 4 5
1 234
2º OpciónSelectividad Altenativa debido
l d i
Eclipse
SB-C18 Columnas: RRHT 4.6 x 50 mm 1.8 um
Muestra:1. anandamide (AEA)2 P l it l th l id (PEA)1 4
min1 2 3 4 5
al non-endcapping
3a Opción EclipseXDB-C18
2. Palmitoylethanolamide (PEA)3. 2-arachinoylglycerol (2-AG)4. Oleoylethanolamide (OEA)
1 23
4
1 2 3 4 5
3 OpciónBuena eficacia y forma de picoSe puede mejorar la Resolución
4ª Opción V i d d FExtend-C181 2,3 4
4 OpciónResolución pobre,Para esta separación, mejor Otras opciones.
Variedad en Fases Estacionarias para un desarrollo de
métodos efectivo1 2 3 4 5
métodos efectivo.
Desarrollo de métodos en fármacos
dipyridamolepropranolol pindolol
disopyramidediltiazem
disopyramide
Comenzar a pH bajo, Ajustando el OrganicoEclipse Plus C18. Fármacos Cardíacos con Acetonitrilo
mAU
400
Column: ZORBAX RRHT Eclipse Plus C18, 4.6 x 50 mm, 1.8 mFase Móvil: A: 25 mM NaH2PO4 , pH 3.0 B: ACN
Flujo: 2.0 mL/min Temperatura: 30°C Detección: UV 240 nm M estra Fármacos Cardíacos 1 Pindolol 2 Diisop ridamida 3 Propranolol 4 Dip ridamol 5 Diltia em
20
100
200
300 Muestra: Fármacos Cardíacos 1.Pindolol 2. Diisopyridamida 3.Propranolol 4.Dipyridamol 5. Diltiazem
40% ACN RRHT Eclipse Plus C18 permite una muy rápida optimización del % orgánico en la fase móvil.
mAU
255075
100125
30% ACNBuena ResoluciónAnálisis RápidoSi t d ti
Para obtener este k en l d 2
2
025
mAU
20% ACN
Sin gasto de tiempo una columna de 25cm a 2 mL/min habría requerido 1.5 horas de analisis!!
-20
0
20
40
60 20% ACNk= 44!!
analisis!!
min2 4 6 8 10 12
Desarrollo de Métodos- Cambio de Modificador Orgánico. Comparación de Acetonitrilo y MeOH
mAU140
Columna: ZORBAX RRHT Eclipse Plus C18, 4.6 x 50 mm, 1.8 mFase Móvil: A: 25 mM NaH2PO4 , pH 3.0 B: organico
Flujo: 2.0 mL/min Temperatura: 30°C Detección: UV 240 nm Muestra: Fármacos Cardíacos1.Pindolol 2. Disopyridamide 3.Propranolol 4.Diltiazem 5. Dipyridamole1
40
60
80
100
120
23 4
50% MeOH
5 Resolución de los pares(2,3), (3,4), (4,5)es mejor en MeOH.
1 2 3-20
0
20
40
5
jPico 5 cambio selectividad
mAU
80
100
120
140
30% ACN
1
2
345
Resolución del par crítico
-20
0
20
40
60 30% ACN2 (1,2), es mejor en ACN
1 2
¿Por qué el pH es crítico en el desarrollo de métodos?métodos?
¿qué compuestos son sensibles al pH?¿qué compuestos son sensibles al pH?
¿ Cómo afecta el pH a la retención y a la resolución?
¿Cómo afecta el pH al desarrollo del método?
¿Cómo afecta el pH en al elección de la columna?
El Cambio de Retención debido al pH para Compuestos Ionizables es Clave en el Desarrollo de Métodos
Los analitos no cargados tienen mejor retención (i.e. á id b j H b H lt )ácidos a bajo pH y bases a pH alto)
Los Silanoles en la sílica ionizan a pH medio, incrementando la retención de los analítos básicos (i.e posibles interacciones de intercambio iónico)
Elija el pH de la fase móvil para optimizar la retención y la selectividad durante el desarrollo de métodos
La Eclipse Plus puede usarse en un amplio rango de pH
Existen otras alternativas para pH altos.
Primeros pasos en un esquema de desarrollo de métodos
P i l i fPrimero selecciona una fase estacionaria C18 o C8 de alta calidad para una buena retención y resolución con muestras típicas ácidas básicas y neutras• Bajo pH
• Elige Eclipse Plus C18PASO 1
muestras típicas ácidas, básicas y neutras.
Optimiza el component organico de la fase movil para mejorar la selectividad
Bajo pH • Ajusta %ACN a 0.5 <k < 20
PASO 2Resolución insuficiente
Elige fases estacionarias alternativas para optimizar el método si es necesario
Cambia % organicoPASO 2
PASO 3Resolucón insuficiente
necesario
Elige SB-C18 para pH 1-2
C l l RRHT
• Cambia el modificador orgánico• Ajusta % orgánico a 0.5 < k <20
PASOResolución insuficiente
Con las nuevas columnas RRHT, estos pasos pueden hacerse rapidamente, haciendo posible encontrar el mejor método
• Cambia fase estacionaria• Eclipse Plus C8, SB-C18, CN, Fenil, otra RP
PASO 4
encontrar el mejor método.Fenil, otra RP
El cambio de retención por el pH para Compuestos Ionizables depende del compuesto
12
Compuestos Ionizables depende del compuestoLos analitos no cargados tienen mejor retención(i.e. ácidos a bajo pH y bases a alto pH)
8
10
)
Acetylsalicylic acid
Pyridine
pKa 3.5pka 5.2
6
8
on ti
me
(min
) y
Codeine
Procainamide
Amphetamine
ppKa 8.0pKa 9.2pKa 9.9K 14
4rete
ntio Caffeine pKa 14
Fase Móvil: 45% MeOH:
0
245% MeOH: 55% 20 mM Tampón Fosfato
pH 2.5 pH 6.5 pH 8 pH 11.5
pH
Ionización de la SilicaEl pKa de la Sílica es 4 -5
A pH 3, alrededor del 90% de los silanoles superficiales están protonados (neutral Si OH)(neutral Si-OH)
A pH 6, alrededor del 90% de los silanoles superficiales están ionizadossilanoles superficiales están ionizados (negativamente cargados Si-O-)
•Entre pH 3 y 6 hay una mezcla de silanoles ionicos y neutrales, por lo tanto son posibles las interacciones de intercambio iónicotanto son posibles las interacciones de intercambio iónico.
• Pequeños cambios de pH pueden causar grandes cambios en el grado de ionización de los compuestos ionizables.g ado de o ac ó de os co puestos o ab es
• Esto puede provocar grandes cambios de retención.
Retención vs. pH para Antihistaminas Básicas -Menos Variación en Retención a pH bajosMenos Variación en Retención a pH bajos
50
Columna: Eclipse XDB-C8 K 4 4 9 2 DoxylamineChlorpheniramineTriprolidineDiphenhydramine
40
30mL
Columna: Eclipse XDB-C84.6 x 150 mm, 5 m
Fase Móvil: 75% 25 mM Tampón Fostato25% Acetonitrilo
pKa 4.4, 9.2 pKa 9.1 pKa 6.5 pKa 9.0
30
20
etenti
on V
olume
m
La retención no cambia en este rango
10
Re
pH3 4 5 6 7
0
• Ligeros cambios de pH pueden cambiar dramáticamente la retención/selectividad• Evalúe siempre los cambios de retención por pH durante el desarrollo de métodos
Esquema de Desarrollo de Métodos– Añadiendo pH medio
Desde pH bajo
• ZORBAX Eclipse Plus C18PASO 5
Desde pH bajoEl pH medio puede dar mejor selectividad.
• pH 7 (6-9) 20 - 50 mM tampón,•Ajustar %ACN for 0.5 <k < 20
Resolución insuficiente
Puede ser más compatible con tu muestra.
El proceso de investigación a pH di l i H b j
Cambiar % orgánicoPASO 6
PASO 7
Resolución insuficiente
Resolución insuficiente
medio es el mismo que a pH bajo
Eclipse Plus proporciona un rendimiento excepcional a pH medio
• Cambiar Modificador Orgánico(MeOH)• Ajustar % orgánico para 0.5 < k <20• Volver al PASO 6
Resolución insuficiente
Si se busca una mejor selectividad deberían considerarse fases estacionarias alternativas
PASO 8• Try Eclipse Plus Phenyl-Hexyl, Eclipse XDB-CN, Phenyl or Bonus-RP • Volver al PASO 5Volver al PASO 5
Las Diferencias de Selectividad a pH 2 y pH 7 Pueden ser DramáticasPueden ser Dramáticas
Eclipse Plus C8 4.6 x 50mm, 5 umpH 2.71. Acetaminofen
2. Cafeina1 3
3. Ácido Acetilsalicílico4. desconocido
42
Columna: 4.6 x 50, 5 um PN 959946-906
pH 7.01
min0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Gradiente: 10-60% B/3 min.pH 2.7: A: 0.1% ácido fórmico B: 0.1% fa en ACNpH 7.0: A 20 mM Na fosfato B: ACN
Muestra: “ Comprimido genérico Excedrin”
3
42 2 min.
min0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
La Selectividad puede cambiar dramáticamente de pH 2 – 7 with con muchas muestras, como este comprimido analgésico.p gEclipse Plus puede ser usada en ambas condiciones
Desarrollo de Métodos a pH Alto– una Tercera OpciónOpción
PASO 9
Desde pH MedioRazones para usar pH Alto
• ZORBAX Extend-C18• pH 10.5 (9-12) 5 mM amonio, o TEA, o •10 – 50 mM orgánico o tampones borato
PASO 9Incrementar la retención de los compuestos básicos analizándolos en su forma no cargada
M j l l ti id d10 – 50 mM orgánico o tampones borato • T = 25°C (ambiente – 40°C)• Ajustar MeOH para 0.5 <k < 20
R l ió i fi i
Mejorar la selectividad
• Cambiar modificador orgánico (ACN or THF)• Ajustar parar 0.5 < k<20
PASO 10Resolución insuficiente
Probar otro modo de HPLC
El pH Alto Aumenta la Retención de AntihistaminasExtend-C18
Columna: ZORBAX Extend-C18, 4.6 x 150 mm, 5 m Fase Móvil: ver abajo Flujo: 1.0 mL/min Temperatura: RT Detección: UV 254 nm Muestra:l: 1. Maleato 2. Scopolamina 3. Pseudoefedrina 4. Doxylamina 5. Clorfeniramina
6. Triprolidina 7. Difenhidramina
pH 7 pH 11
4 77
pH 730% 20 mM Na2HPO470% MeOH
pH 1130% 20 mM TEA70% MeOH
1
2,3
4 7
1
3
4
5tR = 8.5 tR = 11.45
6 26
0 5Time (min)
0 5 10Time (min)
La retención de esta muestra de compuestos básicos aumenta a pH alto.
Cómo incrementar las capacidades de su HPLC convencional: nuevas columnas Poroshell 120 , una nueva era en el desarrollo tecnológico de las columnas de HPLC
Columns HPLC
desarrollo tecnológico de las columnas de HPLC
Agilent Poroshell 120-
Dispare su productividad en LC
Page 48
Poroshell 120 – Una nueva aproximación a la Alta Resolución y la Alta Velocidad en LCResolución y la Alta Velocidad en LC• Poroshell 120 es una columna de alta eficacia y alta
resolución para mejorar la productividad en un HPLC o UHPLC.
• Para separaciones de alta resolución en equipos 1200, 1100 y otros HPLCs (Presión < 400 bar)y otros HPLCs (Presión < 400 bar).• Columnas de 4.6 y 3.0 mm ID de gran volumen para cualquier HPLC
• Columnas de 2 1 mm ID adecuadas para LC/MS y sistemas• Columnas de 2.1 mm ID adecuadas para LC/MS y sistemasoptimizados para bajos volumenes de columna.
• Para separaciones de alta presión en equipos 1200 RRLC, 1290 Infinity u otros UHPLC con Presión > 400 bar• La columnas Poroshell 120 largas proporcionan una elevada eficacia
(un columna o dos columnas en serie).(un columna o dos columnas en serie).
October 18, 2010Page 49
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC:
• 80-90% de eficicacia de las sub 2um
Las Columnas Poroshell 120 tienen:
• A presiones un ~40-50% más bajas• Con un tamaño de partícula de 2.7um• Con una frita de entrada de 2um• Con un límite de presión de 600 bar
• La partícula tiene un núcleo sólido(1.7um) y una cubierta exterior porosade 0 5 m como ona de dif siónde 0.5um como zona de difusión
OctoberConfidentialitPage 50
¿Qué hace diferente a la Poroshell 120 de otras Columnas de Partícula Superficialmente Porosas?Columnas de Partícula Superficialmente Porosas?El proceso de coacervación usado para hacer la
cubierta exterior porosa en un solo paso, en d lti d lvez de un proceso multicapa, reduce la
variabilidad y genera más reproducibilidad
La distribución de tamaño de partícula más pestrecha con una relacion 90%/10% de 1.16, proporciona la mejor eficacia
La mejor simetría de pico del mercado TF muyLa mejor simetría de pico del mercado. TF muy próximos a 1, mejor que la competencia
OctoberConfidentialit51
Van Deemter – La TeoríaTermino C la resistencia a la transferencia de masa se mejora porTermino C– la resistencia a la transferencia de masa se mejora por
•Reducción en el tamaño de partícula– esta es la aproximación más común•Mejorando la difusión
eóric
oH
P ti l ñ
A menor Altura de Plato Teorico H, mejorResolución
ade
Plat
o Te
Curva Van-Deemter resultanteH = A + B/u + C x u
Partícula grande Particula pequeña
Altu
ra
Resistencia a la Transferencia de Masas (C)
H min
(A)Multipath Term
Difusión Longitudinal (B)
Flujo lineal uu opt
Page 52
¿Qué partes de la equación Knox/VanDeemter se ven afectadas por la partícula de la columna?ven afectadas por la partícula de la columna?Término A – difusión eddy y distribución de flujo• La partícula impacta el Término A
T t l t ñ d tí l l lid d d l t i t i fl l• Tanto el tamaño de partícula como la calidad del empaquetamiento influyen en el término A
• Una ajustada distribución del tamaño de partícula mejora el término A Término B – difusión longitudinal g• La partícula tambien impacta en el Término B• Este término se ve impactado por el tamaño de poro de la partículaTérmino C– componente de la Transferencia de Masap• La partícula y sus propiedades impactan en el Término C• La Transferencia de Masa se mejora usando partículas más pequeñas con rutas
de difusión más cortasE t j h tí l fi i l t• Esto se mejora mucho con partículas superficialmente porosas
• Esto permite obtener alta eficacia a flujos altos
Page 53
Columnas Poroshell 120 de 150mm – HPLC o UHPLCCondiciones: Columna: Poroshell 120 EC C18 4 6 x 150mm 2 7um Fase Móvil: Solvente A: Agua con 0 1% Ácido Fórmico
2 mL/minmAU120
P = 538 bar
Condiciones: Columna: Poroshell 120 EC-C18, 4.6 x 150mm, 2.7um Fase Móvil: Solvente A: Agua con 0.1% Ácido FórmicoSolvente B: Acetonitrilo 1200 SL temperatura controlada a 25 °C Celda de Flujo 2 ul
1. Hidroquinona2. Resourcinol3. Catecol4. Fenol
60
80
100
4. Fenol5. 4-Nitrofenol6. p-cresol7. o-cresol8. 2-Nitrofenol9. 3,4 di metil fenol
min0 2 4 6 8 10 12 14 16 180
20
40 10. 2,3 di metil fenol11. 2,5 di metil fenol12. 1-naftol
mAU
80
100
120 1 mL/min P = 285 barGradiente: 1mL/minTime%B6.0 5%
0
20
40
60 51 60%Gradiente: 2mL/minTime%B3.0 5%25.5 60%
min0 5 10 15 20 25 30 35
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Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloqueaMuestras Complejas- Plasmap j
Columna: Poroshell 120 EC-C18, 3.0 x 50mm, 2.7um LC: Agilent 1200 RRLC (SL) Muestra: Plasma Precipitado: 2 partes Plasma: 7 Partes 20/80 Agua-MeCN w/0.1 % Ácido Fórmico con 1 Parte de Diflusinal en 50/50 Agua-MeCN 10 ug/ml (Concentracion Final Diflusinal 1 ug/ml) Agitado y dejado reposar 10 minutosNo Centrifugado/ No Filtrado
Diflusinal in Plasma
380
400 200000
No Centrifugado/ No FiltradoVolumen de Inyección: 1ul
Solvente A: Agua w/0.1 % TFASolvente B: MeCN w/0.08 % TFAFlujo 1 ml/min 1 ul inyecciónTiempo % B
260
280
300
320
340
360
140000
160000
180000Tiempo % B0 200.5 900.6 901.1 202.5 20
140
160
180
200
220
240
Pres
sure
80000
100000
120000
Effic
ienc
y (N
)
End PressPlates
0
20
40
60
80
100
120
0
20000
40000
60000
'Diflunisal' es un anti-inflamatorio no esteroidal análogoa la aspirina desarrollado por Merck Sharp & Dohme0
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
0
Page 55
a la aspirina. desarrollado por Merck Sharp & Dohme .
Comparación de 4.6 x 250 mm 5 um con Poroshell120 EC-C18 4.6 x 100 mm, 2.7um120 EC C18 4.6 x 100 mm, 2.7um
mAU100
11.5
96
Sulfadiazina,SulfatiazolSulfapiridinaSulfamerazina,Sulfametazina, Sulfametazol,
Tiempo %B0 833 3334 33Columna: Eclipse Plus C18
Fase Móvil:A: 0.1% Ácido Fórmico en AguaB: 0.1% Ácido Fórmico en ACN
Tiempo %B0 812 3313.2 33Columna: 4.6 x 100mmPoroshell 120 EC C18
40
60
80
100
9.71
2
11.1
16
12.6
74
15.2
48
16.1
5116
.435
20.6
87
23.0
76
29.2
90
110 bar
Sulfametoxipiridazina,SulfacloropiridazinaSulfametoxazol, Sulfadimetoxina
4.6 x 250mm, 5umFlujo: 1 mL/min
Poroshell 120 EC-C18, 2.7umFlujo: 1.85 mL/min
min5 10 15 20 25 300
20
mAU 1 7.03
7
A áli i á á id ( l á t fl j á lt )32 b
100
150
200
250
1.71
92.
189
2.31
2.60
6
3.86
7
4.43
7 4.5
58
5.45
05.
920
Análisis más rápido(columna más corta, flujo más alto) Mayor sensibilidad(partícula más pequeña,pico más estrecho) Más optimizado (un análisis más rápido permite ajustar mejor) Ambos análisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar) No se requiere cambio en la preparación de muestra, frita de entrada
325 bar
min5 10 15 20 25 300
50
100 3 q p p ,de 2 micras en ambas columnas.
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Guías de Selección de Columnas Agilent UHPLC
AnálisisRápido
Alta Rs (N)
400 bar LC “Compatible”
1000+ bar UHPLC
“Compatible”
Escalabilidadde Partícula1.8, 3.5um
ID’s 4.6, 3.0 & 2 1
Muestrassucias?
Compatibleetc. & 2.1
mmPoroshell 120, 600 X fritabar X
only 2.7um frita2um
RRHT,
600 bar <50mm
RRHD, 1200 bar X X
(3.0 & 2 1)
2.1)
Page 57
Poroshell 300 – Fue la primeracolumna Poroshell de Agilent (2003)columna Poroshell de Agilent (2003)
Separaciones Rápidas y de Alta R l ió d P li é tid P t iResolución de Polipéptidos y ProteinasPoroshell es más quePoroshell 120. Es una de las
Las Columnas Poroshell 300 son paraseparaciones de grandes péptidos y proteinas
Las Partículas Poroshell 300 tienen un
Poroshell 120. Es una de lasalternativas para la industriaFarmacéutica y Biofarmacéutica
Las Partículas Poroshell 300 tienen un núcleo sólido de silice con una cubiertasuperficial porosa de 300Å de tamaño de poro.
CubiertaPorosa
Esto resulta en una transferencia de masa más eficaz, picos más estrechos y separaciones rápidas y eficaces de grandes proteinas and péptidos
NÚCLEO SÓLIDO
5 um
Group/Presentation TitleAgilent Restricted
grandes proteinas and péptidos
Page 58
Poroshell 120 vs. Poroshell 300
Use Poroshell 120 para mapeo peptídico.• Peptidos de la digestión de proteinas o anticuerpos monoclonales• Las separaciones típicas de gradiente funcionan bien.• Use flujos de 0.5 mL/min o mayores para separaciones rápidas en columnas 2.1 j y p p p
mm ID• Use Poroshell 120 EC-C18 para aplicaciones LC/MS con ácido fórmico.
Use Poroshell 300 para biomolecules más grandesUse Poroshell 300 para biomolecules más grandes• Si toda la muestra son polipéptides o moléculas mayores• Se puede usar con proteinas muy grandes.• Use un flujo alto para una eficacia óptima (i.e. 1.0mL/min en columnas de 2.1 mm
ID)
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Flujos Altos con 2.1 mm ID Poroshell 300 paraSeparaciones Rápidas y de Alta ResoluciónSeparaciones Rápidas y de Alta Resolución
34
5Columna: Poroshell 300SB-C182 1 x 75 mm 5 um
Muestra:1. Angiotensina II
12
3
67
8
2.1 x 75 mm, 5 umFase Móvil:A: 0.1% TFA
B: 0.07% TFA en ACNGradiente: 5 – 100% B en 1.0 min.Flujo: 3.0 mL/min.T t 70°C
2. Neurotensina3. Rnasa4. Insulina5. Lisozima6. Mioglobina7 Anhidrasa CarbónicaTemperatura: 70°C
Presión: 250 barDetección: UV 215 nm
7.Anhidrasa Carbónica8.Ovalbumina
0 0 5 1 00 0.5 1.0Time (min)
Poroshell 300 puede proporcionar alta eficacia a flujos más altos para separacionesextremadamente rápidas de proteinas and péptidos. Esto es debido a una transferencia de masa más rápida de las partículas
Group/Presentation TitleAgilent Restricted
Esto es debido a una transferencia de masa más rápida de las partículassuperficialmente porosas.
Page 60
ConclusionesLa elección de la técnica de tratamiento de muestra es crucial enLa elección de la técnica de tratamiento de muestra es crucial en el análisis cromatográfico (SPE, Quechers, extracciones…).
Ya que muchos compuestos son ionizables, y el pH tiene un granimpacto en la retención y selectividad de estos compuestos losimpacto en la retención y selectividad de estos compuestos, los esquemas de desarrollo de métodos deberían contemplar lasvariaciones de pH.
Cualquier esquema de desarrollo de métodos debería incluirCualquier esquema de desarrollo de métodos debería incluirtambién el uso de diferentes fases estacionarias. Las Diferentesfases estacionarias y columnas pueden ser también seleccionadaspor pH.p p
El tercer aspecto clave en el desarrollo de métodos es la fasemóvil y el modificador orgánico, ya que es determinante en muchasseparaciones. sepa ac o es
Nuevas columnas, como las 1.8um RRHT,Poroshell 120 y fasesestacionarias como Eclipse Plus pueden mejorar los enfoquestípicos del desarrollo de métodostípicos del desarrollo de métodos..