BLOQUE TEMTICO I: FLUJO DE LA INFORMACIN BIOLGICA

BM1 Replicacin del ADN BM 1.0. Introduccin: el flujo de informacin en los sistemas biolgicos BM 1.1. El genoma en el ciclo celular. Relaciones estructura y funcin en el ADN condensado BM 1.2. Replicacin del ADN: relaciones estructura y funcin de las ADN polimerasas BM 1.3. Recombinacin del ADN

EL FLUJO DE INFORMACIN EN LOS SISTEMAS BIOLGICOS

ADN ARN

protena

Replicacin

Transcripcin Traduccin

Expresin

Transcripcin inversa

Replicacin del ARN

Genoma: conjunto total de material gentico hereditario presente en una clula (ncleo, mitocondrias y cloroplastos)

EL GENOMA EN EL CICLO CELULAR. RELACIONES ENTRE ESTRUCTURA Y FUNCIN EN EL ADN CONDENSADO

Especie Virus polioma Fago

Escherichia coli

Levadura

Ratn

Humanos

bp (haploide)

5100

48600

4.2 x 106

13.5 x 106

2,5 x 109

3.2 x 109

longitud (m)

1.7

16

1360

4600

860000

1100000

Tamao del DNA genmico de varias especies

Comparacin de tamaos

Una nica clula humana, longitud DNA: ~ 2 m (2x106 m). Ncleo celular: 4-6 m. Cuerpo humano: ~ 2x1012 clulas = 4x109 Km DNA. Circunferencia de la tierra: 4x104 km Distancia entre tierra y luna: 3x105 km Distancia entre tierra y sol: 1.5 x 108 km DNA cuerpo humano: 100000 vueltas a la tierra Para escribir la secuencia completa del genma humano haran falta 1320 volmenes (1000 pgs. cada uno y 5000 letras por pg.) Es necesario un extraordinario nivel de organizacin y compactacin para conseguir empaquetar esta longitud de DNA en las clulas.

Es necesaria una compactacin del DNA que cumpla con dos requisitos:

- mantenimiento de un alto grado de organizacin estructural

- Accesibilidad a la informacin contenida en el DNA

2 m

4-6 mm

Ncleo de una clula humana somtica

Molcula de DNA total (46 cromosomas) de una clula

Cromatina: DNA asociado a protenas histonas (empaquetan y ordenan el DNA nucleosoma) y no histonas (regulan expresin de genes) y una pequea cantidad de RNA.

Empezando por los nucleosomas, el DNA cromosmico eucaritico se empaqueta en una sucesin de estructuras de orden superior que dan lugar finalmente al cromosoma compacto.

El genoma en el ciclo celular

Durante la interfase, la cromatina se encuentra dispersa por el ncleo

Cuando las clulas se preparan para dividirse, la cromatina se condensa y se estructura en cromosomas.

Niveles de condensacin del ADN nuclear

Ocu

rre

du

ran

te la

fas

e G

2 d

el c

iclo

cel

ula

r

Co

mien

za desp

us d

e la divisi

n (fase M

) y con

tin

a du

rante la

fase G1

hasta alcan

zar la fase S do

nd

e se replica el A

DN

o Unidades fundamentales sobre las que se construye el empaquetamiento de orden superior.

o Cada nucleosoma est formado por:

Ncleo con 8 molculas de histona (dos copias de H2A, H2B, H3 y H4).

Una molcula de H1 que se coloca en la parte externa del ncleo y es abrazada por las hebras de DNA entrante y saliente

Un segmento de DNA de ~200 pb (~146 pb se enrollan alrededor del nucleosoma. El resto es el DNA espaciador)

o El espaciamiento entre nucleosomas es regular.

Nucleosomas

H2A H2B

H2A H2B

H4

H3

H4

H3 DNA

H1

DNA

200 pb

1,8 vueltas

Histonas

H1

Las histonas son las principales protenas de la cromatina.

Funcin fundamental: estabilizar la estructura del DNA.

Protenas pequeas y bsicas.

Ricas en aa bsicos Arg y Lys ( 1/3 aa totales).

Cargadas positivamente a pH fisiolgico. Se asocian a los grupos fosfato del esqueleto del

DNA.

La condensacin del DNA se regula por modificacin de las histonas (metilacin,

acetilacin y fosforilacin), afectando la accesibilidad del DNA para la transcripcin.

Cinco clases de histonas: H1, H2A, H2B, H3, H4.

H3 y H4 altamente conservadas evolutivamente (H4 tiene 2 aa diferentes entre guisante y

buey y 8 entre humanos y levaduras).

De los tipos H2A y H2B hay varias formas (variantes) con un papel en el metabolismo del

DNA.

Histonas

Tipos de histona

Difieren en su masa molecular y composicin de aa (alto contenido en a bsicos Arg y Lys) y en su papel estructural en la organizacin del nucleosoma.

DNA superenrollado alrededor del ncleo de histonas: superenrollamiento solenoidal (hacia la izquierda).

Fibra bsica de cromatina o fibra de 10 nm (= grosor = dimetro del nucleosoma). Tambin se llama estructura en cuentas de rosario. Se consigue un empaquetamiento de 10 veces.

Fibra de 10 nm

o Los nucleosomas se empaquetan en estructuras de orden sucesivamente mayor.

o Adoptan una conformacin en zig-zag para dar lugar a una estructura solenoidal en la que hay

6 nucleosomas por vuelta = fibra de 30 nm.

o Se desconoce su estructura exacta in vivo. Se cree que la H1 queda en el interior del solenoide,

acercando los nucleosomas entre s.

o Es probablemente la forma fisiolgica ms descondensada de la cromatina.

Fibra de 30 nm

Fibra de 30 nm Se consigue un empaquetamiento de 40-100 veces aprox.

Bucles radiales

Las cadenas de DNA entran y salen del ncleo central formando bucles (~ 50-100 Kb).

Estructuras que se forman cuando el DNA se asocia con un esqueleto de protenas fibrosas no histnicas esqueleto nuclear. Estos bucles sufren superenrollamiento regulado por topoisimerasas asociadas al esqueleto.

Constituyen unidades transcripcionales

A partir de esta estructura se forman enrollamientos superiores, que hacen que la cromatina en la interfase presente un grado de condensacin variable. Se consigue un empaquetmiento de 1000-2000 veces aprox.

Existen niveles adicionales de organizacin en los cromosomas eucariticos, cada uno de los cuales multiplica el grado de compactacin e implica enrollamientos de enrollamientos de enrollamientos

Cada cromosoma contiene una nica molcula de DNA, plegada.

Estructura final

Heterocromatina

Mxima condensacin de la cromatina

Minoritaria durante la interfase

No es accesible debido a su elevada condensacin

Los genes que contienen no se expresan

Eucromatina

Forma menos condensada

Forma mayoritaria durante la interfase

Es accesible se replica durante la fase S

Sus genes se expresan

Tipos de cromatina

Cromosomas

Cromosomas en mitosis, ordenados por parejas de homlogos y por su longitud (cariotipo).

Las clulas humanas contienen dos tipos de genomas: Nuclear (~3,2x109 nt), distribuidos en 22 autosomas (cualquier cromosoma que no sea sexual) y dos cromosomas sexuales, X e Y. Mitocondrial (16569 nt), en forma de una molcula de DNA circular. Mltiples copias en el interior de cada mitocondria.

Cada clula del cuerpo humano contiene el genoma, a excepcin de algunos tipos celulares que carecen de ncleo en su estado diferenciado, como los glbulos rojos. La mayora de clulas somticas son diploides (2n, dos copias de cada autosoma) 46 cromosomas. Cada cromosoma tiene una estructura doble, con dos cromtidas hermanas paralelas entre s y unidas por un nico centrmero. Durante la mitosis las cromtidas hermanas, que son idnticas, se separan una de otra hacia dos nuevas clulas. Los gametos son haploides y contienen una copia de cada autosoma, ms un cromosoma sexual (23 cromosomas).

Estructura de un cromosoma

Centrmero: punto de unin de las protenas que fijan el cromosoma a los microtbulos del huso mittico necesario para la separacin de las cromtidas durante la divisin. Telmeros: secuencias situadas en los extremos de los cromosomas que mantienen la integridad y aseguran la replicacin de los extremos.

REPLICACIN DEL ADN: RELACION ENTRE ESTRUCTURA Y FUNCIN DE LAS ADN POLIMERASAS

Replicacin del DNA

1 molcula de DNA parental o progenitora 2 molculas idnticas, segregadas a clulas hijas durante la divisin celular.

Sincronizacin con la divisin celular: el DNA se replica una vez por ciclo en la fase S del ciclo.

Ocurre en el ncleo celular.

Funcin de preservacin de la informacin gentica de la especie (fidelidad replicacin + reparacin).

Propiedades de la replicacin

1. Carcter semiconservador

o Cada cadena del DNA progenitor sirve de molde para la sntesis de una cadena complementaria.

o Una molcula de DNA hija posee una cadena progenitora y una cadena hija (de nueva sntesis). Siempre se conserva la mitad de la molcula de DNA original.

Propiedades de la replicacin

2. Simultanea

o La sntesis de la nueva molcula de DNA comienza en puntos concretos: orgenes de replicacin.

o Apertura local de la doble hlice

o Sntesis simultnea de las dos nuevas hebras

o Replicn: regin de DNA que puede ser replicada a partir de un mismo origen de replicacin

Propiedades de la replicacin

3. Bidireccional

o A partir de cada origen de replicacin, la separacin de las cadenas progenitoras progresa en ambas direcciones: replicacin bidireccional.

o Horquillas de replicacin: puntos de transicin entre cadena doble y cadena sencilla.

Propiedades de la replicacin

4. Inicio multifocal o monofocal

o Eucariotas: multifocal

Mltiples orgenes de replicacin/cromosoma

~ 30,000 orgenes de replicacin

o Procariotas: monofocal

Cromosoma circular nico

Un nico origen de replicacin: OriC

Propiedades de la replicacin

5. Secuencial

Ambas cadenas de nueva sntesis se van alargando progresivamente por adicin secuencial de nucletidos en direccin 53 y de forma semidiscontinua.

DNA polimerasas

Cataliza el ataque nucleoflico del oxgeno hidroxlico 3 sobre el tomo de fosforo ms interno de un dNTP elongacin en sentido 53.

Reaccin: (cebador o DNA)-3OH + dNTP (cebador o DNA)-dNMP + PPi

La probabilidad de que se forme un enlace y de que se establezca un puente fosfodiester es muy pequea, a menos que el nucletido que llegue sea complementario del de la hebra molde.

DNA polimerasas

Clases de DNA polimerasas en procariotas

Enzima principal de replicacin: DNA polimerasa III Enzima de reparacin: DNA polimerasa II Enzima de limpieza, recombinacin y reparacin: DNA polimerasa I

DNA polimerasa I

FUNCIONES

o Correccin: actividad exonucloltica 35

o Replicacin: actividad polimerasa

o Reparacin: actividad exonucleoltica 53

Fragmento Klenow

DNA polimerasa III

FUNCIONES

o Correccin: actividad exonucloltica 35 subunidad e

o Replicacin: actividad polimerasa de la subunidad a

Compuesta por 10 subunidades: a, e y q polimerasa ncleo (el holoenzima contiene 2 unidades nucleo o core) t, g, d, d, g complejo de carga de la abrazadera c y y (no mostradas) se unen al complejo de carga de la abrazadera b se asocia por pares, rodea al ADN actuando como abrazadera (clamp). Potenciadora de la procesibidad de la polimerasa ncleo.

helicasa

Clases de DNA polimerasas en eucariotas

Requerimientos ADN polimerasa

Cebador (primer): fragmento iniciador que aporta el grupo 3-OH libre

Oligonucletido de RNA

Apareado a la cadena progenitora de forma complementaria y antiparalela

Sustratos: dNTPs: dATP, dCTP, dTTP y dGTP

Cofactor: Ion metlico divalente: Mg2+.

Molde o plantilla: la cadena de DNA molde determina el orden correcto de incorporacin de los dNMPs, por complementariedad de bases.

Etapas

o Apertura de la doble hlice en el origen de replicacin

o Formacin de la horquilla de replicacin

o Sntesis de cebadores 1) INICIO

2) ELONGACIN

3) TERMINACIN

Apertura de la doble hlice

Orgen de replicacin:

Procariotas: 1un solo replicn

Eucariotas: n numerosos replicones, replicacin simultnea coordinacin entre todos los replicones

Secuencias caractersticas: en Ecoli oriC, 245pb con secuencias de DNA muy conservadas)

procariotas

eucariotas

1 replicn: 1 origen + 2 horquillas

Reconocen la secuencia de inicio, abren la hlice de DNA y establecen un complejo precebador

Helicasas y ATPasas:

Unin al origen y separacin cadenas (hidrlisis ATP)

Creacin de dos horquillas, avance en sentido opuesto y liderado por la helicasa, seguida por el complejo de elongacin.

Topoisomerasas: se encargan de relajar la tensin creada por las helicasas.

Protenas de unin al DNA (SSB): se encargan de estabilizar las cadenas separadas simples para que no se vuelvan a enrollar.

Primasas: se encargan de sintetizar el primer o cebador de RNA.

Protenas de iniciacin

Reconocimiento del origen de replicacin, apertura y desenrollamiento de la doble hlice:

Procariotas: protenas DnaA, DnaB (helicasa) y DnaC

Eucariotas: complejo de reconocimiento del origen

DnaA componente clave en procariotas, con actividad ATPasa, forma oligmeros en forma helicoidal en oriC.

DnaC otra ATPasa facilita la unin de DnaB a las hebras separadas de DNA.

HU es una protena tipo histona que facilita la curvatura del ADN

Inicio de la replicacin

Iniciacin

DnaB migra en direccin 53 a lo largo del DNA de cadena sencilla desenrollando el DNA. El holoenzima de la DNA polimerasa III se le une a travs de la subunidad t.

Otras protenas como SSB (protena de unin al DNA de cadena sencilla) se unen para estabilizar las hebras separadas e impedir su reapareamiento. En eucariotas RPA (protena de replicacin A)

La girasa de DNA (topoisomerasa II) alivia la tensin creada ms all de la horquilla como consecuencia del desenrollamiento.

Topoisomerasas

Evitan el superenrollamiento por delante de la horquilla ocasionado por la separacin de las hebras por parte de las helicasas.

Alteran el superenrollamiento del DNA sin modificar su estructura.

Clase I: realizan un corte transitorio en una de las dos hebras del DNA.

Clase II: cortan ambas hebras

Primasa

o DNApol: nicamente elongan una cadena preexistente.

o Primasa (DnaG): polimerasa de RNA dirigida por DNA. Sintetiza cadenas cortas de RNA complementarias a las cadenas sencillas en el origen de replicacin

o Procariotas: primasa = protena independiente

o Eucariotas: DNApola/prim (actividad primasa en subunidad diferente a la actividad polimerasa)

procariotas

Elongacin

Avance de la horquilla:

Sntesis simultnea de ambas cadenas

DNApol: sntesis 5 3

Hebra conductora, lder o gua (leading strand):

Expuesta en sentido 35

Sentido de sntesis y de avance coinciden

Hebra retardada (lagging strand):

Expuesta en sentido 53

Sentido de sntesis y de avance opuestos

Desfase respecto a la sntesis de la hebra lder

Fragmentos de Okazaki

Fragmentos de Okazaki: Sntesis discontinua de la hebra retardada Copia DNA correspondiente a un fragmento de Okazaki Liberacin por parte de la horquilla de cierta longitud de cadena sencilla Bucle de sta sobre la DNApol (hiptesis) Sntesis de un nuevo fragmento

Sntesis semidiscontinua: sntesis conjunta de cadena lder (continua) y retardada (discontinua).

1 RNA cebador / 1 fragmento de Okazaki

DNApol III

REPLICACIN DEL DNA: Elongacin

Maduracin de los fragmentos de Okazaki

Nucleasas: eliminacin de cebador fragmento1

DNApol y e: elongacin extremo 3 del fragmento2 hasta extremo 5 del fragmento1

DNA ligasa I: unin del extremo 5-P del fragmento1 con el 3-OH del fragmento2

REPLICACIN DEL DNA: Elongacin

Terminacin

Falta de confirmacin experimental de muchas etapas

Final de la elongacin:

Finalizacin de la replicacin en cada horquilla de un replicn, posiblemente cuando alcanzan las horquillas del replicn adyacente

Mecanismo similar a la maduracin de

los fragmentos de Okazaki.

Los cebadores de los extremos 5 de

las cadenas nuevas tambin pueden

ser eliminados, pero no sustituidos

las hebras nuevas quedan ms

cortas en 5 que sus cadenas molde.

REPLICACIN DEL DNA: Terminacin

Telmeros

Estructura de los telmeros: DNA repetitivo: unidades de 6-8 pb repetidas en tndem centenares-miles de veces. Extremos cohesivos: en cada replicacin, las cadenas de nueva sntesis son ms cortas en el extremo 5 que la cadena molde (eliminacin del cebador). Disminucin progresiva de la longitud del cromosoma.

Replicacin de los telmeros:

Telomerasa: molcula de RNA + polimerasa de DNA dirigida por RNA (transcriptasa inversa) RNA de la telomerasa = = molde para elongacin del saliente 3. La telomerasa se va deslizando sobre las repeticiones y copindolas de nuevo.

REPLICACIN DEL DNA: Terminacin

o Actividad telomerasa ausente en la mayora de clulas somticas acortamiento fisiolgico de los telmeros.

o Podra estar relacionado con el control de la proliferacin correcta en los tejidos.

o Actividad telomerasa presente en lnea germinal, tejidos fetales y ciertas clulas madre. Tambin en clulas tumorales.

Actividad Telomerasa

REPLICACIN DEL DNA: Terminacin

INFORMACIN ADICIONAL

ACIDOS NUCLEICOS ADN

ARN