Replicación del ADNReplicación del ADN

La división celular requiere de la duplicación del material genético

mitosis

mitosis

meiosis

Mecanismo generalMecanismo general

La misma estructura del ADN sugirió un mecanismo de replicación de la información◦Cada hebra sirve como

molde para replicar la complementaria

PropiedadesPropiedades

Semiconservativa: cada nueva molécula esta formada por una hebra parental y una recién sintetizada◦ Experimentos de Meselson y Stahl

Bidireccional: Se da hacia ambos lados del sitio de inicio denominado origen de replicación

A cada lado de la burbuja de replicación se forma una horquilla de replicación

Dirección de la síntesis: 5’ 3’

Semidiscontinua: Una de las hebras no puede ser sintetizada de continuo◦ Consecuencia de la direccionalidad

Replicación en procariotasReplicación en procariotas

MecanismoMecanismo Inicio

◦ Reconocimiento de orígenes de replicación.◦ Separación de hebras. ◦ Posicionamiento de maquinaria transcripcional.

Elongación ◦ Crecimiento bidireccional de las horquillas de replicación.◦ Replicación semiconservativa, semidiscontinua,

coordinada.

Terminación ◦ Reconocimiento de señales de terminación.◦ Desensamble de replisomas.

ADN polimerasas:◦ Pol I◦ Pol II◦ Pol III (replicasa)◦ Pol IV y V

Necesitan 3’ OH libre

Maquinaria enzimáticaMaquinaria enzimáticaADN polimerasas: Síntesis de ADNPrimasas: Generación 3’OH libresLigasas: Unión los fragmentos de

OkazakiHelicasas: Separación de hebrasTopoisomerasas: Mantenimiento

del grado de superenrollamientoSSBs: Mantenimiento de simples

hebras

InicioInicio

Reconocimiento del origen y apertura de las hebras

ElongaciónElongación

Primasa: ◦ Sintetiza fragmentos

de ARN (cebadores) que provean los 3’ OH libres

◦ Puede comenzar sin necesidad de cebador

ReplisomaReplisoma

TerminaciónTerminación

Replicación en eucariotasReplicación en eucariotas

Los mecanismos son similaresMás de un origen de replicación por

cromosomaEs más complejoProteins Functions

RPA

PCNARFC

Pol α/primasePol δ / ε FENI DNA2 DNA ligase IMcm2-7

Single-stranded DNA binding; stimulates DNA polymerases; facilitates helicase loading

Stimulates DNA polymerases and RFC ATPaseDNA-dependent ATPase; primer-template DNA binding;

stimulates DNA polymerases; PCNA loading RNA-DNA primer synthesis DNA polymerase; 3'-5' exonucleaseNuclease for removal of DNA/RNA primersNuclease for removal of DNA/RNA primers Ligation of DNADNA helicase; primosome assembly, licensing factor

ADN polimerasasADN polimerasas

Ocurre durante la fase SUna única vez por ciclo

celular

Horquilla eucariotaHorquilla eucariota

TelómerosTelómeros

Son secuencias repetidas que se encuentran en los extremos de los cromosomas lineales

Entre otras funciones resuelven los problemas de replicar este tipo de cromosomas

TelomerasaTelomerasa

Enzima capaz de resolver el problema de acortamiento de los extremos

Ribonucleoproteína

Mantenimiento de la Mantenimiento de la información hereditariainformación hereditariaErrores durante la replicación:

◦Las ADN polimerasas no son 100% fieles◦Los errores son reparados en un alto

porcentaje de las veces◦Cuando los errores escapan los

mecanismos de reparación ocurren cambios en la secuencia del ADN: Mutaciones

Las mutaciones también pueden ocurrir por fenómenos post replicación (mutágenos físicos, químicos, etc.)

Mecanismos de Mecanismos de reparaciónreparación

Las propias replicasas son capaces de reparar sus errores durante la elongación:◦actividad correctora de prueba (proofreading)◦Implica una actividad exonucleasa 3’ 5’

Mecanismos de Mecanismos de reparaciónreparación

Replicación de ADN Replicación de ADN in-vitroin-vitro: : PCRPCR Permite la amplificación de un fragmento de ADN de

interés Algunas aplicaciones:

◦ Clonado acelular de moléculas de ADN◦ Detección de secuencias sin purificación previa◦ Análisis de expresión génica◦ Secuenciación de ácidos nucleicos◦ Amplificación de ADN para su posterior clonación celular◦ Aplicaciones en medicina:

Diagnostico de enfermedades hereditarias/infecciosas Diagnóstico parental (amniocentesis, vellosidades coriónicas) Tipado de tejidos para transplantes Detección de células tumorales Estudios de asociación genotipo-fenotipo

◦ Técnicas forenses: huellas genéticas (Identificación de polimorfismos) Identificación individual Tests de paternidad

◦ Filogenia◦ Análisis de genética poblacional

Reacción de replicación Reacción de replicación in-vitro:in-vitro:

MoldeADN polimerasa: Taq polimerasa

(termoestable)Cebadores:

◦ 3’ OH libre◦ Definen la región a amplificar

dNTPs (A, C, G, T)Condiciones para el funcionamiento de la

enzima:◦ Buffer◦ Mg++ (cofactor de la enzima)

ProcedimientoProcedimiento

Desnaturalización del ADN (94ºC)

Agregado e hibridación de los cebadores (50ºC-65ºC dependiendo de los cebadores)

Elongación (72ºC)Repetición de

estas etapas (25-35 ciclos)

Luego de terminados los ciclos se obtienen millones de moléculas de la región blanco

La hace una técnica extremadamente sensible◦Ventaja: se puede amplificar ADN

partiendo de muy poco material◦Desventaja: Contaminaciones

Variantes del métodoVariantes del métodort- PCR:

◦Se usa una transcriptasa reversa para pasar una muestra de ARN a ADN obteniendose ADN copia (ADNc)

◦Se realiza un PCR para amplificar el ADNc de interés

◦Estudios de expresión génica◦Clonado de genes eucariotas

(eliminación de intrones)

PCR cuantitativo (real time PCR, qPCR):◦Se diferencia en que en cada ciclo de

amplificación se cuantifica la cantidad de ADN obtenida

◦Permite inferir la cantidad de moléculas de molde que existía originalmente en la muestra: Cuantificación de la expresión génica Cuantificación de microorganismos

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Método de Sanger (nobel en 1980)Utiliza dideoxinucleotidos (ddNTPs)

para terminar una reacción de síntesis de ADN in-vitro

Realizando 4 reacciones independientes (una para cada base) se puede inferir la secuencia original

Secuenciación automáticaSecuenciación automática

Sigue el mismo principioA diferencia del método anterior cada

ddNTP se marca con una molecula fluorescente diferente

Esto permite realizar una unica reaccion en la cual estan presentes los 4 ddNTPs marcados

Los fragmentos obtenidos se separan por electroforesis capilar

La detección se realiza en un punto fijo al final de la corrida

Secuenciación de Secuenciación de genomasgenomas

Cada reacción de secuencia es capaz de leer unas 500 pb

Como se obtuvo la secuencia continua del conjunto de los cromosomas humanos?

Cada cromosoma tiene en promedio 150Mb (genoma completo 109)

Construcción de biblioteca de ADN genómico fragmentado al azar

Lectura de secuencias individualesLas secuencias individuales son solapadas y

ensambladas (contigs)Para asegurarse de que todas las

secuencias estén representadas se leen unas 10 veces la cantidad de bases del genoma

La velocidad de producción de las secuencias ha ido en aumento.

Recientemente se dio un salto en este sentido con el desarrollo de los secuenciadores de “próxima generación”

No usan terminación de cadenaSe coloca una base cada vez y se detecta

cual fue incorporada a cada molécula que se esta secuenciando

Producen en una única reacción de secuencia millones de lecturas de fragmentos diferentes (paralelización)

108 1010 bases por corrida (menos de 1 día)De esta forma se secuencio el genoma

entero de Watson en menos de 1 mes a un “bajo” costo