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PROTOCOLO PROYECTO DE GRADO

PROTOCOLO PARA REALIZACIÓN DE VENTANA CRANEAL

CRÓNICA EN MURINOS

ASISTENTE DE INVESTIGACIÓN

ALEJANDRA GUTIÉRREZ BERNAL UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE MEDICINA X SEMESTRE

200721976

JUAN CARLOS BRICEÑO TRIANA INGENIERO MECANICO, PhD INGENIERÍA BIOMÉDICA

PROFESOR TITULAR DEL DEPARTAMENTO DE INGENIERIA MECÁNICA

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

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Tabla de contenido

Lista de Tablas ........................................................................................................................ 3

Lista de Figuras ....................................................................................................................... 3

Resumen ................................................................................................................................ 4

Palabras Clave ........................................................................................................................ 4

Abstract ................................................................................................................................. 4

Marco teórico ........................................................................................................................ 5

Planteamiento del problema .................................................................................................. 7

Objetivos ................................................................................................................................ 9

Método .................................................................................................................................. 9

Resultados ........................................................................................................................... 12

Análisis y conclusión ............................................................................................................. 16

Bibliografía ........................................................................................................................... 18

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Lista de Tablas

Tabla 1. Propiedades de vasos piales vs. parenquimatosos. ............................................................ 5

Tabla 2. Anestésicos utilizados para ventanas craneales en murinos. ............................................. 7

Tabla 3. Cronograma .................................................................................................................... 12

Tabla 4. Características de murinos intervenidos y dosis de medicamentos aplicadas. ................. 13

Lista de Figuras

Figura 1. Animal anestesiado previo a procedimiento. ................................................................ 14

Figura 2. Área de intervención rasurada. ...................................................................................... 14

Figura 3. Marco de estereotaxia. .................................................................................................. 15

Figura 4. Luego del lavado y previo a la incisión. .......................................................................... 15

Figura 5. Calota limpia y seca antes de la craneotomía. ................................................................ 15

Figura 6. Craneotomía delineada.................................................................................................. 15

Figura 7. Craneotomía de 4mm en hueso parietal. ....................................................................... 16

Figura 8. Post operatorio de ventana craneal. .............................................................................. 16

Figura 9. Visualización de ventana craneal en el microscopio. ...................................................... 16

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Resumen

Se realizó un diseño experimental para evaluar la microcirculación pial y de la circulación cerebral

por medio de microscopia in vivo. La intervención consiste en una craneotomía de 4mm de

diámetro en el hueso parietal de murinos wistar. Posterior a la hemostasia esta se sella con un

vidrio y se asegura con acrílico y un tornillo. La duración máxima de esta ventana fue de cinco días

y se postula que puede ser mayor al adquirir más experiencia. El comportamiento del animal no se

ve afectado por la cirugía y, excluyendo el efecto de la anestesia o la posible infección subsecuente

(que se observó en uno de los animales sujetos al procedimiento), no se relaciona con signos

clínicos de focalización ó deterioro. La perfección de la técnica permite la evaluación del efecto de

medicamentos e injuria en la microcirculación que podrá tener una amplia aplicación en muchos

escenarios de investigación.

Palabras Clave

MeSH: Craneotomy/methods, mice, animals, microcirculation, brain/blood supply, Brain/surgery,

Cerebrovascular Circulation, Cerebral Veins/physiology, Capillaries/physiology.

Abstract

An experimental procedure is proposed to evaluate pial and brain microcirculation of mice in vivo.

The protocol consists of a cranial window of 4mm in the parietal bone of Wistar mice. The

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Marco teórico

El cerebro, protegido por la bóveda craneana, se encuentra cubierto por un conjunto de tejido

conectivo conocido como meninges y líquido céfalo raquídeo. Las meninges están conformadas

por tres capas; la pia, la más profunda que se encuentra en aposición con el cerebro, la aracnoides

y la más externa, la dura que está en contacto con el cráneo. El flujo sanguíneo cerebral y

meníngeo proviene de sistemas arteriales distintos, el primero proviene de la carótida interna y el

segundo de la carótida externa. [1]

El flujo sanguíneo intracerebral esta dado por grandes arterias cerebrales como son la cerebral

anterior y media, ramas de la carótida interna. Al transcurrir por la corteza estas arterias se

ramifican generando arteriolas que pasan por la superficie cerebral y se conocen como vasos

piales. Histológicamente estos vasos están formados por una capa de células endoteliales, una de

musculo liso y finalmente una capa de leptomeninge que los recubre e incluye la pia. Los separa

del tejido cerebral un espacio llamado Virchow-Robin. Este espacio se oblitera a medida que los

vasos van penetrando aún más el parénquima cerebral donde la membrana basal del vaso entra

en contacto directo con las terminales de los astrocitos y los vasos se nominan intracerebrales. [2].

Los vasos piales y los parenquimatosos tienen varias diferencias (tabla 1) sin embargo estos

interactúan juntos para responder a los diferentes estímulos generando cambios en el flujo

sanguíneo cerebral. [2].

Vaso pial Parenquimatoso

Inervación perivascular- PNS ó extrínseca Inervación intrínseca

Una capa de músculo liso; tono basal mayor y no responden a ciertos neurotransmisores

Más músculo liso Mayor respuesta a neurotransmisores

Circulación colateral extensa Menos colaterales, la oclusión de una rama genera más daño.

Tabla 1. Propiedades de vasos piales vs. parenquimatosos.

La regulación del flujo cerebral está dada por la unidad microvascular [2]. El flujo sanguíneo

cerebral puede aumentar hasta 8 veces cuando el hematocrito cae más del 10% [3]. El aporte de

oxigeno cerebral depende del contenido arterial de oxigeno lo cual incluye el hematocrito. El

máximo aporte de oxigeno a los tejidos se mantiene hasta un hematocrito alrededor del 30%, si

disminuye más que esto, el aporte de oxigeno cae [3]. La unidad neurovascular está conformada

por las neuronas, los astrocitos el músculo liso y las células endoteliales. El endotelio capilar es

continuo con los astrocitos, células que regulan el flujo sanguíneo cerebral, aumentan las uniones

estrechas, contribuyen al balance electrolítico e interactúan directamente con las neuronas y el

endotelio liberando factores vasoactivos [2]. El cambio en el flujo sanguíneo cerebral responde a

los cambios metabólicos de la célula, incluyendo la razón de lactato/piruvato, y la transmisión

6

sináptica. Los neurotransmisores actúan como vasodilatadores ó inducen su liberación [2]. Se ha

documentado que la dopamina, la noradrenalina y la serotonina son vasodilatadoras y la

acetilcolina es vasoconstrictora. Por otro lado, el aumento de calcio causado por la glutamina

activa la producción de adenosina y metabolitos del ácido araquidónico. [2-4].

Las arterias piales, son las que tienen más resistencia, y por lo tanto controlan el flujo. Aunque las

arteriolas más profundas se dilaten, el flujo sanguíneo no aumentará a menos de que el flujo en

las arterias piales que suplen las arterias parenquimatosas se incremente. Se sugiere que la señal

de vasodilatación se transmite desde el lugar acción a los vasos externos por medio de la

señalización intramural vascular por las uniones comunicantes. Otra teoría es la vasodilatación

dependiente del flujo en la cual el aumento del flujo distalmente genera un aumento en el flujo en

arterias más proximales causando un estrés mecánico que genera la liberación de vasodilatadores

[2].

Ya que la circulación de la pia es un reflejo de la circulación cerebral, la ventana craneal es una

herramienta para valorar la circulación cerebral in vivo de una forma crónica. Esto permite evaluar

el comportamiento del flujo cerebral en respuesta a la injuria incluyendo la hipovolemia, los

medicamentos y la sepsis entre otros. La primera descripción del procedimiento fue realizada por

Forbes en 1928. Más tarde en 1975 Levasseur et. al. describe una ventana craneal crónica en gatos

usando tornillos, una ventana de acrílico y válvulas para circular líquido simulando el LCR ya que

removían la dura y la aracnoides [5]. Svodoba et. al hicieron unos experimentos similares en

murinos, removiendo la dura y aplicando Sigma Tipo III-A (líquido céfalo raquídeo artificial) para

medir potenciales de acción e inyectar corriente en especímenes in vivo con microscopia laser de

dos fotones. [6-9]

Si el objetivo es obtener una visión de la microcirculación corporal, se puede hacer una ventana

craneal sin incidir en la duramadre para observar los vasos de la dura madre. Con los nuevos

microscopios es posible visualizar los vasos piales mirando un plano más profundo sin embargo

para mirar directamente los vasos piales es necesario remover la dura. La dura madre es la capa

más externa de las meninges. Su irrigación proviene de la carótida externa por medio de la arteria

meníngea media que ingresa al cráneo por el foramen espinoso, por ramas de la arteria etmoidal,

carótida interna, faríngea ascendente y occipital y por lo tanto es un reflejo de la microcirculación

corporal general. [1] Estos vasos no se ven influenciados por la presión intracraneales ni demás

variables que afectan la circulación intraparenquimatosa.

Mostany et al de la Universidad de California han desarrollado un protocolo para la realización de

una ventana craneal crónica para ver los vasos de la dura sin incidir en esta. Para fijar el objetivo

usan cianocrilato y acrílico dental en vez de tornillos. El procedimiento es fácil, la visualización de

los vasos es buena y la recuperación es rápida. [10]

7

Otros grupos se han acercado a la visualización cerebral adelgazando el cráneo. Se ha diseñado un

protocolo para la visualización de neuronas, glia y vasos sanguíneos marcados con fluorescencia

por medio de un procedimiento para adelgazar la corteza dejándola transparente y usando el

microscopio de doble fotón. Este procedimiento es mucho menos invasivo que los que se han

mencionado previamente y por lo tanto menos lesivo para el animal, riesgoso y más duradero. [11,

9]. En el 2012 Iida H. et. al compararon el efecto de la anestesia en la microcirculación intracraneal

y medular haciendo ventanas craneales y medulares en ratas. [12]

Por su parte Masuda et al. hicieron tres trépanos en el área parietal de ratas para evaluar el

efecto de la radiofrecuencia en el flujo cerebral. Insertaron por los trepanos un termómetro, y dos

fibras ópticas una de las cuales conectaron a un doppler para medir el flujo cerebral. [13]

En los estudios más recientes la craneotomía se realiza a un lado de la línea media en el hueso

parietal para evadir el seno sagital superior que podría sangrar mucho. Las ventanas se hacen de

3-4mm. El anestésico utilizado varía mucho en los diferentes estudios (ver tabla 2)

Estudio Anestesia

Mostany et. al isofluorane (4% para inducción y 1.5-2% cx)

Klenke et. al inyección intraperitoneal ketamina (65mg/k) xilacina(13mg/k),

acepromazina(2mg/k)

Svoboda et. al, 1997 uretano 2mg/k intraperitoneal

Kelly et. al. 2011 Fentanyl 0.05mg/kg, midazolam 5mg/k, metatomadina 0.5mg/k, avertin

(tribromoetanol)0.0075mg/ml.

Masuda H et. al Ketamina 100mg/k y xilacina 10mg/k IM y pentobarbital 12.5mg/k SC

Tabla 2. Anestésicos utilizados para ventanas craneales en murinos.

En su protocolo Mostany y col. inyectan dexametasona (0.2mg/kg) y carprofeno (5mg/kg) intra

peritoneal para disminuir el edema cerebral que puede causar el procedimiento. Para el control

del dolor y sangrado en el área quirúrgica aplican un poco de lidocaína y epinefrina al periosteo.

[10] Kelly et. al administran analgésico buprenorfina 0.5mg/kg SC [11].

Planteamiento del problema

Generalmente los estudios se han dedicado a medir parámetros macroscópicos incluyendo el

gasto cardiaco, el aporte de oxígeno, la presión, entre otras. La microvasculación no ha sido muy

8

estudiada pero este es el sitio en el cual se da el intercambio de oxígeno y nutrientes. Las

intervenciones que mejoran la perfusión orgánica inherentemente deben mejorar la perfusión

microvascular. En los últimos años se han dado grandes avances tecnológicos que incluyen

microscopios de polarización espectral (OPS) y de campo obscuro (SDF) que permiten una

evaluación de la microvasculación. De acuerdo a un panel de expertos los parámetros que

determinan con mayor confiabilidad la función microvascular deben incluir la densidad capilar y su

heterogeneidad [14]. La ventana craneal permite hacer este tipo de medidas en especímenes in

vivo y por lo tanto constituye un elemento esencial para la investigación.

En este momento hay muchos protocolos existentes para la visualización craneal crónica. Con la

cantidad de tecnología, equipos y opciones disponibles es necesario generar un protocolo

estándar que se acople a las instalaciones y material de nuestra institución. Este trabajo pretende

generar un método que sea repetible para hacer una ventana craneal cónica que permita la

observación de los vasos de la dura (un acercamiento a la microvasculación corporal) y los vasos

piales (un reflejo de la circulación intracerebral).

Se ha determinado que la hemodilución isovolemica que se da al hacer reposición de líquidos con

cristaloides como dicta el protocolo del ATLS genera un efecto hiperemico en la circulación

cerebral. El contenido arterial de oxigeno se ve disminuido al caer el hematocrito. Para compensar

esto debe aumentar el gasto cardiaco ó la extracción de oxigeno [15]. Cuando hay un descenso

moderado del hematocrito la suplencia de oxígeno puede mejorar ya que el aumento del flujo

sanguíneo excede la disminución en el contenido arterial de oxigeno. [3]El aumento de flujo se

genera ya que la hemodilución normovolémica disminuye la viscosidad sanguínea lo cual mejora el

retorno venoso y disminuye la post carga, un aumento de la vasodilatación dado por ON y un

aumento del estímulo simpático al corazón lo cual aumenta el gasto cardiaco. Esto sugiere una

redistribución del flujo sanguíneo regional y un ajuste microvascular que incluye la aceleración del

flujo sanguíneo [15].

Se ha demostrado que la resucitación luego de la hipovolemia y la anemia requieren en primer

lugar la reposición de líquidos para recuperar la función y hemodinámica microvascular y, en

segunda instancia, el aporte de oxígeno [16]. Contrario a lo esperado, la supervivencia en choque

hemorrágico se ha relacionado con el mantenimiento de la densidad capilar funcional más que con

el aporte de oxigeno. La densidad capilar se mantiene con líquidos con alta viscosidad, contratrio

a lo planteado previamente donde para la restitución hídrica se usaban fluidos de baja viscosidad

para acelerar el flujo sanguíneo. Los sustitutos con alta viscosidad mantienen la presión de

perfusión y el movimiento de la curva de disociación de la hemoglobina hacia la izquierda

asegurando que la extracción de oxígeno se mantenga elevada y los capilares permeables [16]. Es

posible que la reposición de líquidos con hemosustitutos tenga un perfil benéfico en la

microcirculación cerebral. Para evaluar el efecto en la dinámica microvascular del hemosustituto

9

es importante estandarizar un método que permita la evaluación de la microcirculación in vivo en

respuesta a este compuesto.

No hay reportes del efecto que tienen este tipo de procedimientos en los animales. Por lo tanto en

este protocolo se pretende determinar el estado pre y post quirúrgico de los murinos. Para esto se

propone una evaluación neuropsicológica del murino que permita hacer una aproximación global

al comportamiento del animal. Generalmente se exploran siete esferas: la apariencia y respuesta

al estimulo general, el comportamiento sensitivo, la postura y movilidad, la capacidad de

locomoción, la habilidad para realizar movimientos más complejos que incluye el manejo de la

comida, el comportamiento especifico de su especie y la capacidad de aprendizaje.

Objetivos

• Primario

• Crear un protocolo para la realizar una ventana craneal crónica en murinos.

• Secundarios

• Generar un procedimiento viable y reproducible.

• Evaluar la seguridad, efectividad y el efecto del procedimiento en murinos y la

duración de la ventana.

Método

Materiales:

6 ratas de 400-550 g

Rasuradora

Gasas

Isodine solución

Isodine espuma

Alcohol al 70%

Cloruro férrico al 10%

Solución salina al 0.9%

Bolsa de agua caliente

Plataforma quirúrgica

Jeringa de insulina

isopos

Equipo de disección

Marco de estereotaxia

Equipo de microcirugía-

microtijeras, microcureta.

10

Bisturí

meloxicam

Gelfoam

Vancomicina

Xilacina

ketamina (Rotex Med 50

mg/ml)

Dexametasona

Carprofeno

Lidocaína+epinefrina al 2%

Procedimiento

1) Luego de hacer asepsia en la mesa quirúrgica con alcohol al 70% y tener listo y estéril el

instrumental se procede a preparar el animal que se va a intervenir. Este se pesa, se toma

su frecuencia cardiaca, respiratoria y temperatura.

a. La temperatura debe mantenerse alrededor de 37.5° C, durante todo el

procedimiento. La anestesia puede bajar la temperatura por lo cual es importante

la manta caliente y si es necesario una lámpara de calor.

2) Con la jeringa de insulina se anestesia la rata con ketamina (Rotex Med 50 mg/ml) 67.5

mg/k y xilacina 10 mg/kg como relajante muscular. Luego de esperar unos minutos se

examinan la respuesta al dolor del animal haciéndole presión en el talón y en la cola para

asegurar que esté completamente dormido.

3) Como analgésico se administra meloxicam 2 mg/kg SC.

4) Como antibiótico profiláctico se administra Vancomicina a una dosis equivalente al 10%

del peso del animal.

5) Se rasura la porción superior de la cabeza de la rata desde encima de los ojos hasta la

parte posterior de las orejas.

6) Posicionar la rata en el marco de estereotaxia, ubicándolo en el centro y asegurándolo con

los pines en ambos canales auditivos. Poner la manta caliente debajo del animal. Insertar

un termómetro rectal.

7) Administrar dexametasona 0.2 mg/kg y carprofeno 5 mg/kg SC. Para proteger los ojos,

aplicar terramicina en ungüento en ambos ojos y cubrirlos.

8) Lavar el sitio operatorio con alcohol al 70%, isodine espuma y finalmente isodine solución

iniciando por el lugar de la incisión y haciendo círculos hacia la periferia. Cubrir con

campos estériles el resto del campo quirúrgico.

11

9) Hacer una incisión en forma de U para remover la piel desde detrás de las orejas hasta los

ojos. Disecar y retirar la piel dejando un área de 2X2cm libre de piel y tejido celular

subcutáneo.

10) Aplicar una gota de lidocaína+epinefrina al 2% en el área y retraer los músculos y el

periostio con un bisturí ó una cureta. Es importante que el cráneo quede sin periostio y

esté seco para poder pegar el cubre objetos. De ser necesario aplicar con un isopo un poco

de cloruro férrico para asegurarse de que toda la superficie este limpia.

11) Con un taladro dremel a baja velocidad delinear un círculo de 4mm de diámetro en el

hueso parietal a un lado de la sutura sagital.

12) Aplicar nuevamente una gota de lidocaína+epinefrina a la superficie y luego de unos

segundos, taladrar lentamente irrigando con solución salina alrededor del circulo marcado

previamente hasta sentir que la superficie ósea esta suave y se puede mover.

13) Con una cureta retraer la craneotomía. Humedecer el área con solución salina y con unos

fórceps levantar el hueso y exponer la dura.

14) Humedecer un gelfoam con solución salina y hacer hemostasia.

15) Si se quiere retirar la dura, hacer una pequeña incisión en la misma con una microtijera e

insertar en ella suavemente una cureta para cortar la dura sobre la misma y no dañar la

aracnoides removiendo la dura para exponer los vasos piales. Si sale líquido céfalo

raquídeo se ha dañado la aracnoides y se ha generado una fistula.

16) Suavemente sin hacer mucha presión parar cualquier sangrado con el gelfoam.

17) Luego de que la superficie esté seca y asegurándose que no haya ningún sangrado, poner

un cubreobjetos estéril previamente cortado de 5mm sobre la craneotomía.

18) Aplicar cianoacrilato en el hemisferio opuesto a la craneotomía con cuidado para que este

no dañe la ventana y esparcir por toda la superficie craneana para pegar al cubre objetos.

Esperar a que el pegante esté seco.

19) Aplicar acrílico dental sobre el cráneo y sobre el borde del cubreobjetos para asegurarlo al

hueso.

20) Dejar secar el acrílico por 10 minutos y trasladar el animal a una jaula caliente para que se

recupere.

21) Una vez despierto poner el animal en su jaula tomarle los signos vitales y observar el

comportamiento del animal para evaluar el efecto del procedimiento.

12

Cronograma

Mes Febrero Marzo Abril Mayo

Revisión de

literatura

X X

Comité de ética X

Fase de

experimentación

Animal 1

Animal 2

Animal 3

Animal 4

X

X

X

X

Elaboración de

documento

X

Tabla 3. Cronograma

Resultados

A lo largo de los distintos experimentos se tuvieron que cambiar pasos del método y materiales

utilizados. En la primera ventana realizada se logro retraer la ventana craneal sin complicaciones

sin embargo ya que no tenia surgicel y la hemostasia no fue perfecta. El animal tuvo una excelente

recuperación sin embargo a la semana fue sacrificado ya que un coagulo de sangre tapo la

ventana e impidió la visualización de la circulación.

El segundo animal se hizo la intervención sin complicaciones, la incisión en la piel fue extensa y se

noto que no era necesario que esta fuese tan grande. Estéticamente la ventana no tuvo ningún

problema sin embargo ya que el cianocrialato no se utilizo la ventana quedó suelta. La rata se

enfermo a pesar del medicamento profiláctico. El veterinario dignosticó una infección de la vía

respiratoria ya que presento fiebre, dolor leve, baja actividad, exudado bajo área quirúrgica,

heces blandas estornudos sanguinolentos con estertores y distrés respiratorio. Fue tratada con

trimetopim sulfametaxol 1 mg/kg IM por 5 días y meloxicam para el manejo analgésico. De

13

acuerdo al veterinario, no se podía volver a intervenir para fijar bien la ventana hasta que

estuviese sana. La ventana se soltó antes de que fuera posible repetir la intervención y por lo

tanto fue necesario sacrificar el animal.

La tercera cirugía sucedió sin complicaciones, la ventana estéticamente quedo muy bien e incluso

pasamos la rata al microscopio y visualizamos los vasos con claridad. Para prevenir que la ventana

se soltara se puso un tornillo en el hemisferio opuesto a la ventana ya que según la experiencia del

laboratorio esto permite su estabilización. Sin embargo ya que la acción de la anestesia dura

únicamente de 20 a 30min fue necesario poner un refuerzo de anestesia con un cuarto de la dosis.

El animal no se recupero de la anestesia y el diagnostico fue sobredosis de la misma.

La última cirugía se realizó siguiendo el protocolo final. La incisión fue pequeña y la ventana se

realizó en el hueso parietal derecho. El área de la ventana fue adecuada y la visión fue buena. En el

post operatorio la rata evolucionó sin ninguna alteración. Su comportamiento fue normal y la

visión de la ventana fue adecuada con una duración de 6 días. Sin embargo al sexto día se observó

una costra debajo del área de la ventana que impedía la visualización de la corteza y la pia. El

animal se sacrifico y se realizó una autopsia. La ventana estaba bien adherida al cráneo lo cual

apoya la necesidad del tornillo. Debajo de la ventana se encontró que el sangrado provenía de un

vaso muy pequeño de la aracnoides a un lado de la ventana con un sangrado mínimo sin

hematoma epidural u otro hallazgo de importancia.

animal peso Sexo ketamina

(75 mg/kg)

Xilacina

(10 mg/kg)

cefazolina

(50 mg/kg)

Meloxicam

(2 mg/kg)

1

2 480 g Macho 0.648 ml 0.24 ml 0.6 ml 0,96 ml

3 260 g Hembra 0.375 ml 0.125 ml 0.325 ml 0,52 ml

4 240 g Hembra 0.360 ml 0.12 ml 0.30 ml 0.9 6ml

Tabla 4. Características de murinos intervenidos y dosis de medicamentos aplicadas.

El protocolo final es el siguiente:

Materiales

4 ratas wistar de 200-550 g Rasuradora Gasas

14

Isodine solución

Isodine espuma

Alcohol al 70%

Solución salina al 0.9%

Bolsa de agua caliente

Plataforma quirúrgica

Jeringa de insulina

isopos

Equipo de disección

Marco de estereotaxia

Equipo de disección

Bisturí

Taladro y brocas pequeñas

Tornillos de 5mm

meloxicam

surgicel

Cefazolina

Xilacina

ketamina (Rotex Med 50

mg/ml)

Dexametasona

Lidocaína+epinefrina al 2%

1. Luego de hacer asepsia en la mesa quirúrgica con alcohol al 70% y tener listo y estéril

el instrumental se procede a preparar el animal que se va a intervenir. Este se pesa y

se calculan y alistan las dosis de los medicamentos, se toma su frecuencia cardiaca,

respiratoria y temperatura.

a. La temperatura debe mantenerse alrededor de

34.5° C, durante todo el procedimiento. La

anestesia puede bajar la temperatura por lo cual

es importante la manta caliente y si es necesario

una lámpara de calor.

2. Con la jeringa de insulina se anestesia la rata con

ketamina (Rotex Med 50 mg/ml) 75 mg/k y xilacina

10 mg/kg como relajante muscular. Luego de esperar

unos minutos se examinan la respuesta al dolor del

animal haciéndole presión en el talón y en la cola

para asegurar que esté completamente dormido.

3. Como analgésico se administra meloxicam 2 mg/kg

SC.

4. Como antibiótico profiláctico se administra

cefazolina 50 mg/kg previo a la incisión.

5. Se retira el pelo de la porción superior de la cabeza

de la rata desde encima de los ojos hasta la parte

Figura 1. animal anestesiado

previo a procedimiento.

Figura 2. Área de intervención

rasurada.

15

posterior de las orejas descubriendo un área

aproximada de 1X1cm.

6. Posicionar la rata en el marco de estereotaxia,

ubicándolo en el centro y asegurándolo con los pines

en ambos canales auditivos. Poner la manta caliente

debajo del animal. Insertar un termómetro rectal.

7. Administrar dexametasona 0.2 mg/kg. Para proteger

los ojos, aplicar terramicina en ungüento en ambos

ojos y cubrirlos.

8. Lavar el sitio operatorio con alcohol al 70%, isodine

espuma y finalmente isodine solución iniciando por

el lugar de la incisión y haciendo círculos hacia la

periferia. Cubrir con campos estériles el resto del

campo quirúrgico.

9. Hacer una incisión en forma de U para remover la

piel desde detrás de las orejas hasta los ojos. Disecar

y retirar la piel dejando un área de 1X1cm libre de

piel y tejido celular subcutáneo.

10. Aplicar una gota de lidocaína+epinefrina al 2% en el

área y retraer los músculos y el periostio con un

bisturí ó una cureta. Es importante que el cráneo

quede sin periostio y esté seco para poder pegar el

cubre objetos.

11. Con un taladro dremel a baja velocidad delinear un

círculo de 4mm de diámetro en el hueso parietal a

un lado de la sutura sagital.

12. Aplicar nuevamente una gota de

lidocaína+epinefrina a la superficie y luego de unos

segundos, taladrar lentamente irrigando con

solución salina alrededor del circulo marcado

previamente hasta sentir que la superficie ósea esta

suave y se puede mover.

Figura 3. Marco de estereotaxia.

Figura 4. Luego del lavado y

previo a la incisión.

Figura 5. Calota limpia y seca

antes de la craneotomía.

Figura 6. Craneotomía delineada.

16

13. Con una cureta retraer la craneotomía. Humedecer

el área con solución salina y con unos fórceps

levantar el hueso y exponer la dura.

14. Hacer hemostasia cuidadosamente con surgicel y

algodón, cuando se este seguro de que no sangra

retirar este material para dejar el campo visual libre.

15. Poner un cubreobjetos estéril previamente cortado

de 5mm sobre la craneotomía.

16. En el hemisferio o0puesto de la craneotomía taladrar

con una broca pequeña un orificio para atornillar un tornillo de 5mm.

17. Aplicar acrílico dental sobre el cráneo, alrededor del tornillo y sobre el borde del

cubreobjetos para asegurarlo al hueso.

18. Dejar secar el acrílico por 10 minutos y trasladar el

animal a una jaula caliente para que se recupere.

19. Una vez despierto poner el animal en su jaula tomarle

los signos vitales y observar el comportamiento del

animal para evaluar el efecto del procedimiento.

Análisis y conclusión

La evaluación de la micro circulación es muy importante para

entender el efecto de muchos medicamentos y estados

críticos como lo es el shock. Este protocolo pretende generar

un lineamiento para la evaluación de la microcirculación in

vivo. Luego del procedimiento el animal es llevado al

microscopio y se puede hacer un mapa de los vasos piales y

cerebrales.

Como todo procedimiento experimental la clave del mismo es

la experiencia. En este caso el número de especímenes usados

fue limitado y por lo tanto no se logró que éste fuese perfecto.

La duración máxima de la ventana fue de 5 días. La hipótesis

Figura 7. Craneotomía de 4mm en

hueso parietal.

Figura 8. post operatorio de

ventana craneal.

Figura 9. Visualización de ventana

craneal en el microscopio.

17

es que el cianocrilato logró meterse un poco al campo de la ventana y las meninges se adhirieron a

la parte interna de la calota, con un movimiento del animal un vaso se rompió. La recomendación

es que se asegure la ventana únicamente con el acrílico y el tornillo y se evite el uso del

cianocrilato ya que es difícil de limitar su extensión al cráneo sin lesionar la ventana. Además

según lo evaluado post mortem la estabilidad que se logra con el tornillo es suficiente.

Ya que en este laboratorio no contamos con gelfoam el uso de otros métodos hemostáticos es

igual de efectivo si no se lesionan muchos vasos en el evento quirúrgico y se usa la lidocaína con

epinefrina como vasoconstrictor. Es importante asegurarse que el campo esté seco antes de

poner la ventana y no traccionar la piel y el tejido circundante al aplicar el acrílico ya que este

puede lesionar estos tejidos y generar un sangrado que aunque no es importante, puede

obscurecer el campo visual.

El postoperatorio de los animales en este caso no fue el mejor. Un animal se infectó por una

neumonía secundaria al estrés de la anestesia y el procedimiento quirúrgico. En otro caso hubo

una sobredosis de la anestesia. Sin embargo en dos de los casos (la mitad de la muestra) los

animales se sacrificaron ya que la visión de la ventana se ocluyó pero clínicamente estaban en

buen estado.

Para lograr una buena técnica es necesario repetir el procedimiento para superar la pendiente de

la curva de aprendizaje. Así mismo es necesario monitorizar y limpiar la ventana frecuentemente

para asegurar que ésta no se ensucie y detectar cualquier cambio para intervenir rápidamente. El

perfeccionar este procedimiento permitirá evaluar la microcirculación y será de gran utilidad no

solo para la evaluación del hemosustituto sino que es un modelo aplicable a muchos

medicamentos y estados críticos importantes para la investigación.

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