PCR TECNICAS

5/14/2018 PCR TECNICAS - slidepdf.com

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Tema 10. Biodegradación de Compuestos Xenobióticos

• Biodegradación de compuestos cloroaromáticos- Biodegradación de dioxinas y dibenzofuranos clorados- Biodegradación de policlorobifenilos (PCBs)

- Biodegradación de pentaclorofenol

• Biodegradación de compuestos nitroaromáticos- Rutas aeróbicas oxidativas: monooxigenasas y dioxigenasas- Rutas aeróbicas reductivas: nitrorreductasas y transferasas de hidruro

- Rutas anaeróbicas: cometabolismo del 2,4-dinitrofenol en Rhodobacter - Biodegradación del 2,4,6-trinitrotolueno (TNT)- Biodegradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos

• Biotecnologías asociadas a los compuestos nitroaromáticos- Biorremediación de nitroaromáticos- Biotecnologías terapéuticas antibacterianas y antitumorales



Entre los compuestos xenobióticos, los más importantes cuantitativamente son los

derivados aromáticos clorados y nitrados producidos en las industrias de fabricación deexplosivos, colorantes, herbicidas y plaguicidas, disolventes, aislantes y otros productosde interés industrial. Existen algunos compuestos clorados y nitrados de origen natural(antibióticos como el cloramfenicol), por lo que algunos microorganismos poseen rutasbiodegradativas para este tipo de compuestos xenobióticos, que son altamente tóxicos(desacoplantes, cancerígenos, interferidores hormonales, etc.)

Biodegradación de Compuestos Xenobióticos

Cl Cl

OH

OH

OH

OH

O

O

Cl

Cl Cl

Cl

4,4'-diclorobifenilo

Estradiol

2,3,7,8-tetraclorodioxina

Testosterona

O

I

I

OH

I

I

Ala

Tiroxina (T4)

ClCl

Cl Cl

Cl

DDT

Fig. 15.1. Semejanza estructural de algunas hormonas con compuestos xenobióticos clorados



Biodegradación de Compuestos Cloroaromáticos

Cl

O

O

Cl

Cl

O

Cl

Cl

Cl

COOH

OH

Cl

PCBs

Cl

Cl

OH

OH

COOH

Clorodibenzo-dioxinas Clorodibenzofuranos

Clorosalicilatos Clorobenzoatos

Clorocatecoles

Figura 15.2. Convergencia en clorocatecoles de las rutas de degradación dedioxinas cloradas, clorodibenzofuranos y policlorobifenilos (PCB). La posición delos cloros es arbitraria.

Las rutas biodegradativas aeróbicas de los cloroaromáticos (dioxinas, dibenzofuranos y

bifenilos policlorados) forman un “embudo metabólico” que converge en los clorocatecoles(el catecol es el o -dihidroxibenzeno)

Las dioxinas (sin cloros)apenas se encuentran en lanaturaleza, aunque eldibenzofurano y el bifeniloson compuestos naturales.Sus derivados clorados

son xenobióticos muyrecalcitrantes, y entreellos, los PCBs son losmás abundantes



Biodegradación de Dioxinas y Dibenzofuranos Clorados

Dioxinas cloradas: compuestos con dos grupos clorofenilo unidos por dos enlaces -O-

Clorodibenzofuranos: compuestos con dos grupos clorofenilo unidos por un grupo furano

Cl

O

O

Cl

Cl

O

Cl

Clorodibenzo-dioxinas Clorodibenzofuranos



Origen Dioxinas:

NATURAL ANTROPOGÉNICO

Volcanes Incineración comp. organicos clorados

incendios forestales Blanqueado pulpa papel con cloro

Síntesis química de herbicidas (2,4,5-T,

2,4,5-triclorofenoxiacético, exfolianteVietnan (gas naranja)

La primera bacteria descrita capaz de usar dioxinas y dibenzofuranos como fuentede carbono (Sphingomonas sp. RW1) se aisló en 1992, lo que es indicativo de la

recalcitrancia de estas moléculas.

La toxicidad de las dioxinas depende de la posición de los cloros:

2,3,7,8-tetraclorodioxina es la molécula más tóxica de la biosfera

En Seveso (Italia), en 1976, se produjo el mayor vertido de dioxinas cloradas por

un accidente en una fábrica del herbicida 2,4,5-T.



Biodegradación de Dioxinasy Dibenzofuranos

1. Dioxigenasa

2. Dioxigenasa (meta)

3. Hidrolasa

Ruta metabólica poco evolucionada(moléculas relativamente recientesen la biosfera)

Figura 15.3. Conversión de dioxina y dibenzofurano enderivados dihidroxilados por Sphingomonas sp. RW1

O2

2

1O2 + NADH

HOOC

COOH

+

OH

OH

OH

OH

COOHHO

OH

OH

H2O

3

COOH

OH

OH

O

O

O

O

O

O

O

OO

O

O

HO

OH

OH

OH

COOH

COOHCOOH

1

2

3

+

4

O2

2

1O2 + NADH

HOOC

COOH

+

OH

OH

OH

OH

COOHHO

OH

OH

H2O

3

COOH

OH

OH

O

O

O

O

O

O

O

OO

O

O

HO

OH

OH

OH

COOH

COOHCOOH

1

2

3

+

4

O2

2

O2

2

1O2 + NADH

1O2 + NADH

HOOC

COOH

+

OH

OH

OH

OH

COOHHO

OH

OH

H2O

3

COOH

OH

OH

O

O

O

O

O

O

O

OO

O

O

HO

OH

OH

OH

COOH

COOHCOOH

1

2

3

+

4

5C

6C

DioxinaDibenzofurano

salicilato

gentisato catecol



La presencia de cloros en las dioxinas y dibenzofuranos hace más recalcitrante a

estas moléculas, que no se degradan en aerobiosis. Existen algunas bacterias

que pueden eliminar los átomos de cloro en anaerobiosis en un proceso

respiratorio denominado deshalorrespiración

Las moléculas poco cloradas pueden ser atacadas por la dioxigenasa,

generándose clorocatecoles y clorosalicilatos, pero para la biodegradación de

dioxinas muy cloradas se precisaría un primer paso anaeróbico previo a la

degradación aeróbica.

Biodegradación de Dioxinas y Dibenzofuranos Clorados



Biodegradación de Policlorobifenilos (PCBs)1 2

3

45

1'2'

3'

4' 5'

Cl

Cl

Figura 15.4. Estructura general de los PCB

Hay 5 posiciones para el Cl en cada anillo aromático (209 posibles PCBs). Se utilizan

desde 1929 en la fabricación de cosméticos, barnices, material ignífugo, y sobre todo

como lubricantes en transformadores eléctricos debido a su estabilidad a altatemperatura y a su capacidad dieléctrica. Se comercializaron como mezclas (Aroclor,

Clophen, Fenclor o Kanechlor). Principales problemas debidos a su recalcitrancia, su

toxicidad y su bioacumulación. Son poco solubles en agua pero muy liposolubles,

por lo que se van acumulando en la cadena trófica. En la CE está prohibida su

fabricación y los PCBs existentes deben eliminarse antes del 2010.



Los PCBs de los transformadores eléctricos en desuso pueden eliminarse por

incineración, en instalaciones especiales a 1200 ºC, pero es un proceso costoso. En

España no existen instalaciones autorizadas.

Para la contaminación del suelo, la incineración es inviable y hay que recurrir a la

biodegradación. Se han descrito microorganismos (bacterias y hongos) capaces de

transformar o degradar PCBs, pero ninguno es capaz de mineralizar todos los PCBs,

ya que existen pasos limitantes. Las bacterias que degradan PCBs se han aisladomediante enriquecimiento a partir de suelos contaminados usando bifenilo, un

análogo natural no tóxico, como única fuente de carbono y energía.

Biodegradación de Policlorobifenilos (PCBs)



El bifenilo es un compuesto natural degradable por diversas bacterias en

aerobiosis:1) Oxidación de bifenilo y rotura en meta para formar benzoato y un derivado de

5 C que se transforma en acetaldehído y piruvato (ruta superior)

2) Oxidación del benzoato hasta piruvato y acetaldehído (ruta inferior delplásmido TOL)

Ambas rutas se suelen encontrar en unidades transcripcionales diferentes

Los PCBs se degradan por las mismas enzimas de la ruta del bifenilo, pero

existen pasos limitantes. Ejemplo: grado de cloración; nº Cl ataque del O2

La solución, como en el caso de las dioxinas policloradas, es la descloración de

los PCBs mediante tratamiento microbiológico anaeróbico, eficaz pero muy

lento, o realizar un pretratamiento químico reductivo. Una vez reducido elcontenido en cloro, el residuo puede tratarse con las bacterias aeróbicas

adecuadas para su completa destrucción



Biodegradación de PCBsO

2

NAD(P)H

O O

HH

NAD(P)+BphA1A2A3A4

HH

NAD(P)H

NAD(P)+

BphB

HHO O

O2

O

HOOC OH

BphC

BphDOH2

COOH

HOOC

OH

OH2

HOOC

O

OH

OH2

BphH

CH3

HOOC

O

+CH3

H

O

BphI

CoA +NAD+

CH3

SCoA

O

BphJ

Figura15.5. Ruta degradativa de bifenilo por bacterias.

Benzoato 5 C

Acetil-CoA

Piruvato

Bifenilo

Acetaldehído

TOL



Biodegradación de PCBs

La degradación bacteriana de los PCBspoco clorados produce clorobenzoatosy derivados de 5C.

La mayoría de las bacterias quedegradan PCB no degradanclorobenzoatos.

En la ruta superior puede producirsedescloración. Sin embargo, lo habituales el ataque del O2 al anillo no clorado omenos clorado, con la consiguienteformación y acumulación declorobenzoatos

Cl

Cl

OH OH

Cl

H Cl

HOOC Cl

OH

COOH

CAT

BphA

Reacciónespontánea

ClHOH OH

Cl

O2 + 2H

+

BphD

BphC

Figura 15.7. Degradación de PCB por bacterias, conacumulación de clorobenzoatos. CAT (Ciclo de Krebs).

5 C



OH

OH

Catecol

HOOCO

O

Muconolactona

HOOCO

O

HOOC

HOOC

O

Enol lactona del 3-oxoadipato

3-Oxoadipato(ß-cetoadipato)

OH

OH

ClOH

OH

Cl

Cis,cis -muconato

HOOC

HOOC

Cl

HOOC

HOOCCl

HOOC

HOOC

HOOC

O

O

COOH

O

O

2-cloro-cis,cis -muconato

HOOC

HOOC

O

3-clorocatecol 4-clorocatecol

3-cloro-cis,cis -muconato

Cis -dienlactonatrans -dienlactona

Maleil-acetato

Catecol-1,2-dioxigenasa(Tipo I)

Cloroatecol-1,2-dioxigenasa(Tipo II)

Muconato

cicloisomerasa

Cloromuconato

cicloisomerasa

Muconolactonaisomerasa

HCl

Dienlactonahidrolasa

Maleilacetatoreductasa

TCA

Figura 15.8. Comparación de las rutas para la degradación de

catecol y clorocatecoles y convergencia en 3-oxoadipato.

Existen bacterias que degradanclorobenzoatos por una benzoatodioxigenasa que transforma elclorobenzoato en clorocatecol

Estas enzimas difieren en laespecificidad de sustrato aunque hayalgunas bacterias con benzoato

dioxigenasas de amplia especifidad,pero incapaces de degradar loscorrespondientes clorocatecoles

Sería posible complementar

bacterias con benzoato dioxigenasade amplia especificidad con otrasbacterias que degradenclorocatecoles




Cl

HOOC

Cl

OH

OHCl

Bacteria degradadora de PCBs

Bacteria transformadora

de clorobazoatos

Bacteria degradadora de clorocatecoles

CO2

+ H2O + HCl

Figura 15.9. Biodegradación de PCB mediante la co-inoculación de tres tipos de bacterias.

Biodegradación de Policlorobifenilos (PCBs)

INCONVENIENTES CO-INOCULACIÓN

- 4-Cl SUBSTITUIDOS:un metabolito tóxico a partir del 4-clorobenzoato que “envenena” todo elsistema. Este metabolito es laprotoanemonina, un antibiótico que se

produce en reacciones catalizadas porenzimas de la ruta del 3-oxoadipato.Este es un ejemplo claro de que lasrutas metabólicas son algo más que lasuma de las reacciones.



OHOH

Cl

O

O

4-clorocatecol

Protoanemonina

H +

CO2

HOOC

HOOC

Cl

HOOC

Cl

OO

Cl

OO

O

O

H+

H+

Catecol-1,2- dioxigenasa (Tipo I)

Muconato cicloisomerasa Cl

Figura 15.10. Formación de protoanemonina a partir de 4-clorocatecol, mediante enzimas de la ruta del 3-oxoadipato. Entrecorchetes se ilustra el posible mecanismo de la reacción.

La formación de metabolitostóxicos a partir de xenobióticoses habitual, por lo que la

formación de protoanemonina noes el único ejemplo.




Principal incompatibilidad degradación PCB y clorocatecoles EN GENERAL:

Bifenilo, y el benzoato derivado de su metabolismo, se degradan por una ruta meta ,clorocatecoles sólo lo hacen por una ruta orto .La rotura en meta de los clorocatecoles genera sustratos suicidas haluro de acilo.

La rotura en orto de metilcatecoles produce metil-muconolactonas que no pueden serdegradadas por las enzimas de ruta del 3-oxoadipato.

OH

OHCl

3-Clorocatecol

Catecol 2,3-dioxigenasa

HOOCCOCl

OH

Haluro de ácido

OH

OH

Catecol

HOOC OHCHO

Semialdehido

-COOH

COOH

Cis,cis- muconato

OH

OH

CH3

4-metilcatecol

CH3

COOHCOOH

3-metil-cis,cis- muconato

Catecol 1,2-dioxigenasa

Incompatibilidad para la degradación de cloro- y metil-catecoles simultáneamente

meta (TOL)

Orto (3-0A)

meta orto



Pseudomonas sp. B13 Pseudomonas sp. BN10

Pseudomonas sp. BN210

Figura 15.12. Selección de bacterias que degradan

nuevos congéneres de PCB.

Degrada 3-clorobenzoato Degrada policlorobifenilos(PCB)

Degrada 3-clorobenzoato y PCB

Para degradar PCBs se requieren 3 pasos:1.- Enzimas para degradar PCB hastabenzoatos (genes de microorganismosaislados de suelos contaminados con PCB).2.- Enzimas para transformar clorobenzoatosen clorocatecoles (genes de bacterias quedegradan clorobenzoatos o del plásmido TOL,que codifica una dioxigenasa de amplia

especificidad).3.- Enzimas que catalicen la degradación

completa de clorocatecoles (genes debacterias que degradan clorocatecoles).

Esto ha permitido la construcción de bacteriasmodificadas genéticamente capaces demineralizar una amplia gama de PCBs, lo quepodría ser una solución definitiva delproblema de la contaminación con este tipode residuos industriales.




CO2 + H2O

2 Cl -DOX OH

CHOCOO -

ClCl

O2

OH

ClCl

ClCl

Cl

PCP

MOX

Cl

OH

Cl

Cl Cl

OHO2

TCHQ

DHL

OH

Cl Cl

OH2 GSH

DCHQ

Cl - Cl- Cl-

CO2 + H2O

2 Cl -DOX OH

CHOCOO -

ClCl

O2

OH

ClCl

ClCl

Cl

PCP

MOX

Cl

OH

Cl

Cl Cl

OHO2

TCHQ

DHL

OH

Cl Cl

OH2 GSH

DCHQ

CO2 + H2O

2 Cl -

CO2 + H2OCO2 + H2O

2 Cl -DOX OH

CHOCOO -

ClCl

O2

DOX OH

CHOCOO -

ClCl

O2

OH

CHOCOO -

ClCl

OH

CHOCOO -

ClCl

O2

OH

ClCl

ClCl

Cl

PCP

OH

ClCl

ClCl

Cl

OH

ClCl

ClCl

Cl

OH

ClCl

ClCl

Cl

PCP

MOX

Cl

OH

Cl

Cl Cl

OHO2

TCHQ

MOX

Cl

OH

Cl

Cl Cl

OHO2

TCHQ

Cl

OH

Cl

Cl Cl

OH

Cl

OH

Cl

Cl Cl

OH

Cl

OH

Cl

Cl Cl

OH

OH

Cl

Cl Cl

OHO2

TCHQ

DHL

OH

Cl Cl

OH2 GSH

DCHQ

DHL

OH

Cl Cl

OH2 GSH

DCHQ

OH

Cl Cl

OH2 GSH

DCHQ

Cl - Cl- Cl-Cl -Cl - Cl-Cl- Cl-Cl-

Figura 15.14. Ruta degradativa del pentaclorofenol (PCP). MOX (monooxigenasa); DHL(deshalogenasa); DOX (dioxigenasa); TCHQ (triclorohidroquinona); DCHQ (diclorohidroquinona).

Ruta inespecífica de Shingomonas chlorophenolica que está construida reclutando una

enzima preexistente de una ruta ajena y alterando la especificidad de enzimasdegradantes de clorofenoles naturales. La ruta elimina los cloros combinando un proceso

oxidativo con la deshalogenación reductiva. La flavoenzima MOX es una monooxigenasa

común en bacterias del suelo que degradan clorofenoles naturales. Es muy inespecífica y

reemplaza -H, -NO2, -NH2, -CN y -Cl por grupos -OH. La deshalogenasa que cataliza la

descloración reductiva ha evolucionado a partir de una isomerasa del catabolismo de la

fenilalanina, un aminoácido aromático. La dioxigenasa que cataliza la rotura del anillo

pertenece a rutas degradativas de diclorofenoles producidos por hongos e insectos.

Biodegradación de Pentaclorofenol



Los compuestos nitroaromáticos suelen tener origen humano, en industrias de

explosivos (TNT, ácido pícrico), colorantes, plaguicidas (paration) y herbicidas

(dinoseb), disolventes y fármacos. Son compuestos muy estables y persistentes en el

medio ambiente, donde pueden permanecer inalterados durante siglos. Se pueden

adsorber a la superficie de las fases inorgánica y orgánica (humus) del suelo tanto por

enlaces débiles como covalentes.

El consumo humano de estos compuestos puede resultar muy peligroso por su altatoxicidad (el 2,4-dinitrofenol es un desacoplante y los nitrotoluenos causan anemia y

hepatitis) y la mutagenicidad de sus derivados aminoaromáticos (el 2-nitro-4-

aminofenol y la 5-nitro-o -toluidina son carcinogénicos). Algunos compuestos

nitroaromáticos no son tóxicos per se , sino sus productos de biotransformación

Biodegradación de Compuestos Nitroaromáticos



Figura 16.1. Formas resonantes del nitrato (izquierda). Estructura del anillo aromático del nitrobenceno,C6H5-NO2 (centro) y de las formas resonantes del grupo nitroaromático (derecha). La carga (+) en el anillo(Ar+) estaría localizada en los C 2-6 ó 4.

N

-O O

O

N

O

O

-O

N

O O

-O

NO2

26

4

-O O

Ar

N+

Ar

N+

-OO

Ar+

N+

O--O

N

-O O

O

NN

-O O

O

-O O

O

N

O

O

-O

NN

O

O

-O

N

O O

-O

NN

O O

-O

NO2

26

4

NO2NO2

26

4

-O O

Ar

N+

Ar

N+

-OO

Ar+

N+

O--O-O O

Ar

N+

-O O

Ar

N+N+

Ar

N+

-OO

Ar

N+N+

-OO

Ar+

N+

O--O

Ar+

N+N+

O--O

La carga positiva sobre el N del grupo –NO2 extrae carga electrónica del anilloaromático, que resulta cargado positivamente, tanto más cuanto mayor sea el

número de grupos nitro.

La carga positiva del anillo nitroaromático está influenciada por sustituyentes

que puede aumentar aún más (-Cl, -NO2, -C≡≡≡≡N, -SO3H, -COOH), o disminuirla (-

CH3, -NH2 , -O-).



OH

OH

N = 0 N = 2

OH

OH

O2N

H

O2N

NH 2

O2N

N = 3

OH

O2N

O2NCH3

X

O2N

Ataqueoxidativo

Ataquereductivo

N = 1

OH

OH

O2N

OH

O2N

O2N

Y

OH

OH

N = 0

OH

OH

OH

OH

OH

OH

N = 0 N = 2

OH

OH

O2N

H

O2N

NH 2

O2N

N = 2

OH

OH

O2NOH

OH

O2NOH

OH

OH

OH

O2NO2N

H

O2N

H

O2N

H

O2N

NH 2

O2N

NH 2

O2NO2N

N = 3

OH

O2N

O2NCH3

X

O2N

N = 3

OH

O2N

OH

O2N

OH

O2N

O2NCH3

O2NCH3

O2NO2NCH3

X

O2N

X

O2N

X

O2N

AtaqueoxidativoAtaque

oxidativoAtaque

reductivoAtaque

reductivo

N = 1

OH

OH

O2N

OH

O2N

O2N

Y

N = 1

OH

OH

O2NOH

OH

O2NOH

OH

OH

OH

O2NO2N

OH

O2N

OH

O2N

OH

O2N

O2N

Y

O2N

YYY

Fig.16.2. La susceptibilidad al ataque reductivo aumenta con el nº de gruposnitro (N), dependiendo del resto de sustituyentes. Cuando N = 3, el ataque essiempre reductivo (Y: -NHOH, -CH3, -COO; X: cualquier sustituyente-).


La presencia de grupos nitro estabiliza a los compuestos nitroaromáticos con relación al

ataque electrofílico del O2, el principal agente activo en la degradación de compuestosaromáticos naturales o xenobióticos. Por ello, los seres vivos han desarrollado estrategiasde ataque reductivo, bien sobre el propio anillo (derivados Meisenheimer) o sobre losgrupos –NO2 (derivados aminoaromáticos).

Los microorganismos

llevan a cabo el ataqueoxidativo medianteoxigenasas, queinsertan átomos deoxígeno en el anillo. El

ataque reductivo serealiza por reductasasque transfieren ioneshidruros (H-) bien alanillo nitroaromático oa los grupos nitro. Elataque oxidativosiempre se lleva acabo en aerobiosis,mientras que elreductivo puede tener

lugar en aerobiosis oen anaerobiosis.



Rutas aeróbicas oxidativas del anillo aromático: monooxigenasas y dioxigenasas


N O 2

O H 2 N A D ( P )H + O 2 N O 2- + H 2 O

O H

O H

N O 2

O H

N O 2

O H 2 N A D ( P )H + O 2 N O 2- + H 2 O2 N A D ( P )H + O 2 N O 2- + H 2 O

O H

O H

O H

O H

Figura 16.3. Oxidación del o -nitrofenol a catecol.

O H

N O 2

N A D (P )H + O2

O H

N O 2

O H N O 2-

C O 2 + H 2O

O H

N O 2

O H

N O 2

N A D (P )H + O2

N A D (P )H + O2

O H

N O 2

O H

O H

N O 2

O H

N O 2

O H

N O 2

O H N O 2-

N O 2-

C O 2 + H 2O

Figura 16.4. Oxidación del p -nitrofenol a nitrocatecol y posterior oxidación de éste.

Las monooxigenasas liberan el grupo nitrofenólico como nitrito, o insertan un grupo –OHpreviamente. Las dioxigenasas producen nitrito a partir de nitrotoluenos. El catecol semineraliza a CO2 y H2O mediante ruptura orto o meta y el nitrito se utiliza como fuente denitrógeno mediante su reducción a amonio por la nitrito reductasa asimiladora.

N O 2

C H 3 N A D (P )H + O 2 N O 2-

O H

C H 3

O H

N O 2

C H 3

N O 2

C H 3 N A D (P )H + O 2 N O 2-N A D (P )H + O 2 N O 2-

O H

C H 3

O H

O H

C H 3

O H

C H 3

O H

C H 3

O H

Figura 16.5. Oxidación del o -nitrotolueno a metilcatecol.



Rutas aeróbicas reductivas: nitrorreductasas y transferasas de hidruros


Los sustratos de estas rutas reductivas son normalmente polinitroaromáticos, estables

frente al ataque del O2, pero susceptibles de ataques nucleofílicos por parte de iones H-

tanto al grupo –NO2 como al anillo aromático.

Reducción del grupo nitro: nitrorreductasasEnzimas ampliamente distribuidas (bacterias y eucariotas), que utilizan NAD(P)H como

reductor de un amplio número de compuestos nitroaromáticos y nitroheterocíclicos.

Las nitrorreductasas bacterianas son de dos tipos:

a) Nitrorreductasas de tipo I, insensibles al O2, que reducen el grupo -NO2 en tres etapas

sucesivas de pares de electrones, formándose los intermediarios nitroso e hidroxilamino.

b) Nitrorreductasas de tipo II, sensibles al O2, que catalizan la transferencia de 1 e- al grupo

nitro con producción de un radical libre aniónico, que puede reaccionar con el oxígenoregenerando el Ar-NO2 y formando el radical anión superóxido (O2

.-).

Figura 16.6. Reducción secuencial del grupo –NO2. Ar (Anillo aromático).

Ar-NO2 → Ar-N = O → Ar-HNOH → Ar-NH2

2 e- 2 e- 2 e-

Ar-NO2 → Ar-N = O → Ar-HNOH → Ar-NH2

2 e- 2 e- 2 e-



Reducción del anillo: hidruro transferasas

El anillo aromático polinitrado (TNT, TNP o ácido pícrico, dinitrofenol) puede

degradarse reductivamente por transferencia de iones hidruro (H-) a regiones del

anillo con densidad de carga positiva, especialmente en posiciones orto (2) y para

(4), debido a la capacidad de éste para retirar los e - ππππ del anillo. Por ello, el 2-

nitrofenol y el 4-nitrofenol son más ácidos que el 3-nitrofenol. Rhodococcus (bacteria Gram positiva) mineraliza polinitrofenoles (TNT, ácido pícrico, 2,4-

dinitrofenol) por transferasas de hidruro que forman como intermediarios

derivados no aromáticos reducidos (complejos Meisenheimer).



Rutas aeróbicas reductivas: transferasas de hidruros


En Rhodococcus sp. RB1, la ruta degradativa del 2,4-dinitrofenol tiene dos fases:1.- Transferencia de hidruros y formación de derivados hidruro-Meisenheimer: el grupo –OHno atrae e- del anillo aromático, pero sí los grupos –NO2 y aparecen cargas δδδδ+ en meta (m) 2.- Liberación de NO2

- y degradación del anillo formando 3-nitroadipato como intermediario

Figura 16.11. Transferencia de 2 H- al 2,4-dinitrofenol por parte de NAD(P)H-reductasas y formación de dos derivados HM consecutivos.

OHNO2

NO2H -

OHNO2

NO2H - -O2N

NO2-

OH

H

OHNO2

NO2H -

OHNO2

NO2

OHNO2

NO2H -H -

OHNO2

NO2H -

OHNO2

NO2

OHNO2

NO2H -H - -O2N

NO2-

OH

H-O2N

NO2-

OH

H-O2N

NO2-

OH

NO2-

OH

NO2-

OH

H

HMm

COO-

COO-

O2-N HO2

-N

NO2-

OH

H

COO-

COO-

O

NO2-

O2

NO2-

O2

CO2 + H2O

COO-

COO-

O2-N H

COO-

COO-

O2-N HO2

-N

NO2-

OH

HO2-N

NO2-

OH

O2-N

NO2-

OH

O2-N

NO2-

OH

NO2-

OH

H

COO-

COO-

O

COO-

COO-

COO-

COO-

O

NO2-

O2

NO2-NO2-

O2O2

NO2-

O2

NO2-NO2-

O2O2

CO2 + H2OCO2 + H2O

Figura 16.12. Ataque del O2 y oxidación del 3-nitroadipato (centro). Una posibilidad

alternativa es la producción de dinitrohexanoato -OOC-CH2-CH2-CHNO2-CH2-CH2NO2

como intermediario.



Rutas anaeróbicas: cometabolismo del 2,4-dinitrofenol en Rhodobacter Biodegradación de Compuestos Nitroaromáticos

En anaerobiosis, las bacterias metabolizan los nitroaromáticos reduciendo los grupos nitro

a amino mediante nitrorreductasas. Rhodobacter capsulatus es una bacteria fototrófica quefija N2 en luz-anaerobiosis, proceso que consume mucha energía y es muy sensible adesacoplantes como el 2,4-dinitrofenol (DNP). En presencia de DNP, R. capsulatus induceuna nitrorreductasa que reduce el grupo 2-nitro a 2-amino formando 2-amino-4-nitrofenol(ANP), que no es desacoplante pero sí genotóxico. Para evitar daños al DNA, la bacteria

bombea al medio el ANP, y cuando la mayor parte del DNP se ha reducido a ANP reanuda elcrecimiento por fijación del N2. La nitrorreductasa de R capsulatus puede utilizar diferentessustratos, como el ácido pícrico (2,4,6-trinitrofenol), al que reduce a ácido picrámico (2-amino-4,6-dinitrofenol), que posteriormente se degrada con liberación de nitrito

O -

N O2

N O 2

O -

N H2

N O 2

N P R

M P

m e d io

3 N A D P H

O -

N O2

N O 2

O -

N H2

N O 2

N P R

M P

m e d io

3 N A D P H

O -

N O2

N O 2

O -

N H2

N O 2

N P R

M P

m e d io

O -

N O2

N O 2

O -

N O2

N O 2

O -

N H2

N O 2

N P R

O -

N H2

N O 2

O -

N H2

N O 2

N P RN P R

M P

m e d io

M P

m e d io

3 N A D P H

Fig.16.13. Fotorreducción del 2,4-dintrofenol. NPR (nitrorreductasa).

O H

N O 2

N O 2

O 2 N

O H

N H 2

N O 2

O 2 N

N P R

3 N A D P H

O H

N O 2

N O 2

O 2 N

O H

N O 2

N O 2

O 2 N

O H

N H 2

N O 2

O 2 N

O H

N H 2

N O 2

O 2 N

N P R

3 N A D P H

N P RN P R

3 N A D P H3 N A D P H

Fig.16.15. Fotorreducción de ácido pícrico a ácido picrámico. NPR (2-nitrorreductasa).

ó á



Biodegradación del 2,4,6-trinitrotolueno (TNT)


La biodegradación de TNT y otros explosivos como el ácido pícrico puede utilizarse para eldiseño de tecnologías de biorremediación in situ (para paliar la contaminación ambiental) yex situ (para eliminar los excedentes mediante biorreactores).El TNT sólo puede ser objetode ataques reductivos, abióticos o biológicos tanto aeróbicos como anaeróbicos.

Catabolismo aeróbico: Es similar a la mineralización de ácido pícrico y del 2-cloro-4,6-

dinitrofenol en Rhodococcus OHNO2

NO2

O2N

OHO2N

NO2

Cl

H -

NO2-

OH

NO2

O2N

NO2

OHO2N Cl

CO2 + H2O

2 H - 2 NO2-

OHNO2

NO2

Cl-

NO2-

OHNO2

NO2

O2NOH

NO2

NO2

O2N

OHO2N

NO2

Cl

H -

OHO2N

NO2

ClOH

O2N

NO2

Cl

H -H -

NO2-

OH

NO2

O2N NO2-

OH

NO2

O2N NO2-

OH

NO2

O2N

NO2

OHO2N Cl

NO2

OHO2N Cl

NO2

OHO2N Cl

CO2 + H2O

2 H - 2 NO2-

CO2 + H2O

2 H -2 H -2 H - 2 NO2-2 NO2-2 NO2-

OHNO2

NO2

Cl-

NO2-

OHNO2

NO2

OHNO2

NO2

Cl-Cl-Cl-

NO2-NO2-NO2-

Figura 16.16 Mineralización de ácido pícrico y 2-Cl-dinitrofenol vía 2,4-dinitrofenol.

Catabolismo anaeróbico: Nitrorreductasas que producen derivados parcial o totalmentereducidos (triaminotolueno) capaces de sufrir una oxidación posterior con liberación de NH3y ruptura del anillo. Los grupos –NO2 del TNT difieren por su capacidad atrayente deelectrones y la reducción del primer grupo (normalmente en la posición 4) tiene lugar conmucha más facilidad que la del grupo 2-nitro y la del 6-nitro; el primer grupo –NH

2formado

disminuye la densidad de carga positiva del anillo al dejar de atraer ya a los electrones ππππ.



Bi d d ió d C t Nit áti



N O 2

1 - N i t r o n a f t a l e n o

N O 2

1 - N i t r o p i r e n o

N O 2

7 - N i t r o b e n z ( a ) a n t r a c e n o

N O 2

2 - N i t r o f l u o r e n o

N O 2

9 - N i t r o a n t r a c e n o

N O 2

6 - N i t r o c r i s e n o

3 - N i t r o b e n z o ( a ) p i r e n o

N O 2

N O 2


N O 2N O 2N O 2


N O 2


N O 2N O 2N O 2


N O 2

7 - N i t r o b e n z ( a ) a n t r a c e n oN O 2N O 2N O 2

7 - N i t r o b e n z ( a ) a n t r a c e n o

N O 2


N O 2N O 2N O 2


N O 2


N O 2N O 2N O 2


N O 2


N O 2N O 2N O 2



N O 2


N O 2N O 2N O 2

Figura 16.23. Hidrocarburos aromáticos policíclicos nitrados.

Biodegradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH)Biodegradación de Compuestos Nitroaromáticos

Los hidrocarburos policíclicos aromáticos nitrados (Nitro-PAHs) se producen al reaccionarlos hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) con óxidos de nitrógeno y por combustiónparcial de combustibles fósiles

La biodegradación de Nitro-PAH es similar a la de los nitroaromáticos monocíclicos:reducción por nitrorreductasas y oxidación por monooxigenasas, que producen óxidos de

nitroareno y derivados fenólicos, y dioxigenasas, que producen dihidrodioles.Cit P-450

O2

O2N-Ar OO2N-Ar O2N-Ar OH

SO42-

G, GU

Cit P-450

O2

Cit P-450

O2

O2N-ArO2N-ArO2N-Ar OO2N-Ar OO2N-ArO2N-Ar O2N-Ar OHO2N-ArO2N-ArO2N-Ar OHOH

SO42-SO42-

G, GUG, GU

Figura 16.24. Degradación de Nitro-PAH por el hongo Cunninghamella elegans. Ar (anilloaromático); Cit P-450 (citocromo P-450); G (glucosa); GU (glucuronato)

Biotecnologías Asociadas a los Compuestos Nitroaromáticos



Biotecnologías Asociadas a los Compuestos NitroaromáticosBiorremediación de nitroaromáticos

Tratamientos in situ (biodegradación de TNT en suelos) y ex situ (biorreactores paraeliminar TNT y ácido pícrico de aguas de fábricas de explosivos y aguas subterráneas deterrenos contaminados por prácticas militares). La incineración es la forma de eliminar losexcedentes de TNT, pero existen tratamientos biológicos basados en el compostaje, labiodegradación aeróbica (rutas ligninolíticas de hongos, muy limitadas por el límite detoxicidad, < 100 µµµµM) y tecnologías de fangos activados. La biomineralización del TNT sepuede plantear mediante lavado del suelo y tratamiento secuencial anaerobio/aerobio, biensobre TNT eliminado del suelo por lavado o sobre una suspensión de suelo contaminado.Estas tecnologías no evitan dos problemas: la formación aerobia de derivados azoxi y lafijación del triaminotolueno (TAT) a la fase orgánica del suelo.

a) Biorreactores anaerobios: Pseudomonas putida JLR11 elimina anaeróbicamenteTNT con glucosa como cosustrato (elimina el 99% del TNT en 20 días). También se hanutilizado consorcios de bacterias anaeróbicas para eliminar TNT y otros compuestosnitroaromáticos como el dinoseb (2-sec -butil-4,6-dinitrofenol).

TN T TAT Tolueno + 3 N H 3 o Trihidroxitolueno + 3 N H 3TN T TAT Tolueno + 3 N H 3 o Trihidroxitolueno + 3 N H 3

Figura 16.26. Biodegradación anaerobia de TNT.

b) Biorreactores aerobios: hongos ligninolíticos que utilizan las mismas enzimasextracelulares para degradar contaminantes aromáticos que para la lignina (idóneos paramezclas complejas de xenobióticos). La toxicidad del TNT para los hongos se evitaaumentando la masa micelial del biorreactor, que degrada TNT mediante un proceso

bifásico, rápido al principio (minutos) y lento después (horas). La eliminación de grandescantidades de TNT (hasta 1 g kg-1) requiere de 1 a 3 meses.

Biotecnologías Asociadas a los Compuestos Nitroaromáticos



Biotecnologías Asociadas a los Compuestos NitroaromáticosBiotecnologías terapéuticas antibacterianas y antitumorales

I. Terapias antibacterianas.

La reducción de los grupos nitroaromáticos mediante nitrorreductasas produce derivadoshidroxilamino-aromáticos citotóxicos y mutagénicos. La actividad nitrorreductasa de lasbacterias es 500 veces mayor que la de células eucarióticas, por lo que los nitroderivadosson mucho más tóxicos para las primeras y tienen un alto potencial para el tratamiento deinfecciones parasitarias (nitrofuranos).II. Terapias anticancerosas.En eucariotas, los derivados formados por las nitrorreductasas de la flora intestinal soncancerígenos (acumulación de mutaciones en tejidos susceptibles, como epitelio del colon).Sin embargo, las nitrorreductasas bacterianas se utilizan en terapias antitumorales, como latecnología ADEPT (Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy). La nitrorreductasa se unecovalentemente a un anticuerpo (Ac-TUM) que reconoce un antígeno específico del tumor

(Ag-TUM) y se suministra un nitroaromático inocuo (prodroga) que se sólo forma elderivado hidroxilamino citotóxico en las células tumorales que poseen la nitrorreductasabacteriana. También se puede expresar el gen de la NR en los tumores (GDEPT y VDEPT).

NR

Ac-TUMNR-Ac-TUM

Ag TUM

TUM OR

TUM OR

Ar-NO 2

Ar-NH 2 Tum or destruído

NR

Ac-TUMNR-Ac-TUM

Ag TUM

TUM OR

TUM OR

Ar-NO 2

Ar-NH 2 Tum or destruído

NR

Ac-TUMNR-Ac-TUM

NR

Ac-TUMNR-Ac-TUMNR-Ac-TUM

Ag TUM

TUM OR

Ag TUM

TUM ORTUM OR

TUM OR

Ar-NO 2

Ar-NH 2

TUM ORTUM OR

Ar-NO 2

Ar-NH 2

Ar-NO 2

Ar-NH 2 Tum or destruídoTum or destruído

Figura 16.25. Destrucción selectiva de un tumor mediante tecnología ADEPT.

Prodroga

Derivadocitotóxico

PCR TECNICAS

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