P C R

ANA PATRICIA FIGUEROA

SUSANA JARQUÍN

ALONZO MEJÍA

NATHALIE MORALES

ALBA VARGAS

WENDY MAYORGA

Reacción en Cadena de la Polimerasa

PCR

Fundamentada en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN.

Obtiene un gran número de copias de un fragmento de ADN particular.

Técnica de Biología Molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis.

Se utiliza para obtener suficiente ADN que permita detectar el número de repeticiones en varios loci.

S T R

Tipos de PCR

PCR anidada

PCR múltiple PCR in situ

PCR con transcriptasa inversa

PCR en tiempo

real

Componentes

dNTPS Tampón de reacción Cebadores

ADN Polimerasa

sMolde

TermocicladorAparato usado en Biología Molecular que permite realizar los ciclos de temperaturas necesarios para la amplificación de diversas hebras de ADN.

Modelo más común es un bloque de resistencia eléctrica que distribuye una temperatura homogénea a través de una placa durante tiempos programables, durante los cuales ocurre la desnaturalización, hibridación y extensión de una molécula de ADN.

Etapas

Desnaturalización• Separación de

las dos cadenas de ADN

Hibridación• Unión del

cebador a la secuencia complementaria en el ADN molde

Extensión• Síntesis de la

cadena complementaria por medio de la ADN polimerasa

Cebadores

Oligonucleótidos complementarios a la secuencia que se desea amplificar.

Se requieren para iniciar la replicación

Se utilizan dos en cada reacción.

Mayor longitud y temperatura

= más específica

Temperatura de Anillado

4(G+C) + 2(A+T)

Diseño de Cebadores

Contenido de C y G debe ser aproximadamente 50%.

Evitar zonas con largas secuencias de una sola

base.

Evitar complementariedad entre los cebadores.

Temperatura de hibridación de los cebadores debe ser

similar.

Secuencia debe ser única.

Formación de dímeros

ADN Polimerasa

Enzimas que intervienen en la replicación del ADN.

Capaces de adicionar dNTPS a partir de la región 3’ de un

cebador y copiar una secuencia molde.

Utilización de diferentes polimerasas en la técnica de PCR.

Método para copiar trozos de ADN.

Ciclos y temperaturas

Desnaturalización (95°C)

Extensión (72°C)

Anillado (55°C-60°C)

Principio Caliente

Métodos que permiten comenzar un PCR sólo cuando la temperatura de

annealing padeció.

Contaminación• Mesas de laboratorio, equipos y pipetas, que pueden estar

contaminados con preparados anteriores de DNA, o con fragmentos de restricción purificados .

• Contaminación cruzada entre muestras �

• Productos de amplificaciones anteriores por PCR

¿Control negativo?Muestra que incluye los componentes de la reacción, excepto el ADN.

Se usa para comprobar que ninguno de los componentes de la reacción está contaminado con ADN de otra procedencia y que no se han producido errores de manejo que hayan provocado la contaminación cruzada entre muestras.

Método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa.

E l e c t r o f o r e s i s

Fue empleado por primera vez por  en el año 1937, pero su importancia vino a incrementarse cuando en los años cincuenta

Se ha convertido en estos últimos años en una metodología aplicada a sustancias de bajo peso molecular

L.Durrum y Arne W.K. Tiselius , impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asigno a la separación de materiales en un campo eléctrico en presencia de algún tipo de soporte; aunque este termino se limito originalmente al análisis de coloides y partículas submicroscopicas

Generalidades Método de separación de moléculas según la

movilidad de éstas en un campo eléctrico.

Puede ser:

• Sobre la superficie hidratada de un soporte sólido

• A través de una matriz prosa

• En disolución

Es frecuentemente utilizado para analizar fragmentos de ADN generados por enzimas de restricción PCR.

FACTORES

Campo Eléctrico•Es generado por la fuente de corriente

• se encarga de asimilar las proteínas cargadas negativamente gracias al SDC desde la parte superior a la inferior del gel, produciendo su separación por tamaño

Muestra

Se colocan en el lugar indicado gracias a la separación que realizan los pocillos

Deben ser preparadas en presencia del tampón de carga

Tampón

Mezcla en concentraciones relativamente elevadas de un ácido débil y su base conjugada.

Tienen la propiedad de mantener estable el pH de una disolución frente a la adición de cantidades relativamente pequeñas de ácidos o bases fuertes.

Componentes habituales

Tris

EDTA

SDS

Glicerol

β-mercaptoetanol

Soporte En el se fijan los cristales superior

y separador para la preparación de la muestra.

Los cristales deben ser situados a una distancia considerable para que se pueda añadir la mezcla.

Gel Agarosa1. Preparación del molde

2. Preparación del gel de agarosa

a) Vaso de 100ml

b) Tampon de electroforesis y agarosa

c) Calentar

d) Enfriar

e) Dejar que se solidifique

Preparación del gel para electroforesis

1. Sacar los topes2. Colocar el gel en la cámara de

electroforesis3. Llenar la cámara4. Sacar el peine que ha formado los

pocillos5. Proceder la siempre del gel y llevar a

cabo la electroforesis

Proceso de Electroforesis

Colocar ADN en los

pocillos

Se aplica corriente eléctrica

DNA agrupado

Se añade Bromuro de Etidio

Características

Electrodo negativo

Electrodo positivo

Velocidad de migración inversamente proporcional al peso de la molécula

Si 2 componentes tienen la misma masa, las separaciones serán incompletas = bandas solapadas

Bandas en diferentes calles pero misma altura tienen similar peso molecular

¿Cómo se comparan las bandas de ADN?

Se investiga si la posición de una de las bandas de cada marcador genético del hijo coincide con una de las bandas del mismo marcador genético del supuesto padre.

Se asignan las bandas de DNA de origen materno del genotipo del

hijo.

Bandas deben coincidir con la mitas de las bandas del DNA del padre

Ventajas del PCR

A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener una cantidad considerable para el estudio que se vaya a realizar.

El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y análisis.

Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o muerto.

Sus aplicaciones son múltiples: medicina forense, diagnósticos, análisis prenatales, etc.

Desventajas del PCR

Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde se conoce por lo menos una mínima secuencia de 20 – 40 pb.

Se necesitan “ primers ” específicos que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar.

La polimerización puede tener errores al sintetizar el ADN.

Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo investigador o de cualquier otro).

Avances en la cienciaGracias a esta técnica se han podido realizar estudios genéticos en cualquier campo de la ciencia.

• Se utiliza diariamente para la identificación de cadáveres.

• En el estudio de escenas del crimen para buscar rastros del culpable.

• También se emplea en la biología, para identificar cadenas genéticas de plantas, animales o, sobre todo, microorganismos.

¡Gracias por su atención!