Cuantificación mediantela técnica de PCR en tiempo real

Usos y aplicaciones

Paula Fernández

Instituto de Biotecnología. CICVyA. INTA-Castelar

PCR Standard vs. PCR Tiempo Real

Análisis de punto final

Detección del producto por Electroforesis en gel

Análisis de la cinética de la reacción

Detección del producto en cada ciclo de la reacción

VENTAJAS DE PCR SOBRE

OTRAS TÉCNICAS

ALTA SENSIBILIDAD

ALTA ESPECIFICIDAD

RAPIDEZ

DESVENTAJA:PROBLEMAS DE CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA templado específico o productos amplificados previamente)

Geles de agarosa….

* Baja precisión* Baja sensibilidad* Baja resolución* No automatizado* Discriminación sólo por tamaño* Resultados cualitativos

mRNA

cDNA (simple cadena)

cDNA (doble cadena)

PCR

RT-PCR

Consiste en dos pasos:

• Transcripción reversa

• PCR

OBJETIVO:

Detección de la expresión de un gen – por presencia de mRNA

• La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador concapacidad de hacer incidir sobre cada muestra un haz deluz de una longitud de onda determinada y de detectar lafluorescencia emitida por el fluorocromo excitado.

PCR en tiempo real

Real Time PCR

Step One Applied Biosystems

• FluoróforoqueseintercalaenelsurcomenordeladoblecadenadeADN

Desventaja:seuneaCUALQUIERADNdedoblecadena(dímerosdeprimersyproductosinespecíficos).

Observación del proceso de amplificación

Se adquieren los datos cuando la amplificación estátodavía en la fase exponencial. Esto estádeterminado por la identificación del número deciclo al cual la intensidad de emisión del fluoróforoaumenta con respecto al ruido de fondo (background)Este número de ciclo se llama ciclo umbral(Ct: threshold cycle). El Ct está determinado en la faseexponencial de la reacción y es más confiable que lasmediciones a punto final convencionales. El Ct esinversamente proporcional al número de copias deltarget templado: a mayor concentración de templado,menor Ct medido.

Concepto de eficiencia

Xn = X0(1 + E)n

Xn = producto de PCR luego del ciclo nX0 = número inicial de copiasE = eficiencia de amplificaciónn = número de copias

Xn

X0

Número de ciclos

Ecuación de la PCR

Las ecuaciones de PCR

• Idealmente, cada ADN “target” en la muestra original se duplica de ciclo en ciclo

• Esto equivale a una eficiencia de transcripción E=2 o de (E-1)x100=100%

• La eficiencia no siempre alcanza el máximo teórico.

La eficiencia de la reacción puede ser calculada por la siguiente ecuación: E=10(-1/slope). La eficiencia de la PCR debería ser de aprox.

90-100% (pendiente ideal = 3.32)

Diversos factores afectan la eficiencia como puede ser: el largo del amplicón, la estructura secundaria y el diseño de primers (entre

otros).

Eficiencia

Efecto de la eficiencia de amplificación

ResultadosUna diferencia de 0.1 en la eficiencia de amplificación resultó en u

número final de copias significativamente menor.

Xn = X0(1+E)nCaso 1: E = 0.9 Caso 2: E = 0.8

Xn = 100 (1+0.9)30 Xn = 100 (1+0.8)30

Xn = 2.3 x 1010 Xn = 4.6 x 109

Las cinco diluciones alcanzan el plateau en el mismo punto aunque cada curva muestra un recorrido diferente. Esto refuerza el hecho de que si las mediciones fueran tomadas a lo largo del plateau los datos no representarían la cantidad inicial del target.

log view

• En la práctica uno no observa los amplicones sino una medida indirecta de su abundancia.

• Lo que se mide es la fluorescencia de la muestra amplificada

• Se supone que la fluorescencia es proporcional al número de amplicones

¿Cómo sería una curva teórica de fluorescencia en función del número de ciclos?

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20Ciclos

0.0

1.1

2.2

3.3

4.4

5.5

6.6

7.7

8.8

9.9

11.0

Fluo

resc

enci

a

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40Ciclo

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

Fluo

resc

enci

a

¿Cómo es una curva de fluorescencia real en función del número de ciclos?

• La mayoría de las curvas de fluorescencia presentan valores erráticos para los ciclos iniciales de la reacción cuyo origen es diverso.

• La curva de fluorescencia no crece indefinidamente.

La cantidad de reactivos limita la reacción.

Como interpretar Rn?

0 10 20 30 40

Cycle number

Rn

CT

Threshold Rn

Sample

No TemplateControl

Rn

Rn

* Rn+ es el valor Rn de una reacción que contiene todos los componentes (muestra de interés, GOI, blanco); Rn- es el valor

Rn detectado in NTC(valor de base)

* Delta Rn es la diferencia entre Rn+ and Rn-. Es además un indicador de la magnitud de señal generada por la PCR

* El gráfico de Delta Rn versus el número de ciclos y muestra las curvas de amplificación para estimar los valores de Ct

Rn

NTC: no template controlGOI: gene of interest

ARTEFACTOS - PRODUCTOS NO ESPECIFICOS:• Unión inespecífica de primers (mispriming): por unión de losprimers a secuencias parcialmente complementarias presentes enel DNA o cDNAs de la muestra• Dímeros: los primers pueden hibridarse entre ellos creandoproductos pequeños

PROBLEMAS

PRODUCTOS NO ESPECÍFICOS (artefactos): que puedenincrementar el valor de fluorescencia obtenida durante lareacción. Esto es mas frecuente cuando se utiliza SYBR-green.

CURVA DE DENATURALIZACIÓN

Muestra el perfil de denaturalización de los productosamplificados.

Si un producto presenta un perfil de denaturalizacióndiferente (valores de Tm diferentes), significa que es otroproducto (no específico) de amplificación, pueden serdímeros.

CURVA DE DENATURALIZACIÓN DE DILUCIONES

(se observan dímeros, de menor temperatura de fusión)

dímeros

DISEÑO EN PLACA

• Relative expression

gen objetivo

referencia

( ( ) ( ))gen objetivo( ( ) ( ))gen referencia

gen

media Cq control media Cq muestra

media Cq control media Cq muestra

ER

E

Pfaffl M.W. Horgan G.W., Dempfle L. (2002) Relative expression software tool (REST©) for group-wise comparison and statistical

analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No. 9 e36

• Simple y rápida (semi-automatizada).• No hay manipulación post-PCR.• Eliminación de contaminación por amplicones.• Cuantificación del DNA o RNA molde inicial.• Muy sensible.• Detección de productos inespecíficos con la opción

“curva de desnaturalización” (Melt-Curve).• Detección de más de un producto específico en una

misma reacción.• Extraordinariamente específico.

Ventajas del PCR en tiempo real

Desventajas del PCR en tiempo real

• Laborioso y dificultoso de poner a punto

• Determinación de genes presuntos constitutivos

• Alta sensibilidad

Determinación del ciclo umbral (Cq) y eficiencias de la reacción de PCR cuantitativa (LinReg PCR)

• Usualmente son genes abundantes y expresados a un nivel celular/tisular constante

• Los más usados son en general los menos confiables

•Usar una combinación de varios genes

Normalización con genes de referencia

40

Valor M: índice de estabilidad de control interno(nivel de expresión de dos genes constitutivos debe ser idéntica)

Media aritmética de los desvíos de los dos genes constitutivos (j y k)

Limitantes:Dependencia de genes analizados

Evalúa media aritmética de los desvíos estándard de a pares de genesSupuesto de estabilidad de todos los genes

CL1: Control leaf 1CL2: Control leaf 2FE1: Flower excision 1FE2: Flower excision2D: Dehydrated1

Búsqueda de genes de referencia

Modelo estadístico

Fernandez y col. 2011

Búsqueda de genes de referencia

Uso de geNorm

Functional Genomics Strategies applied to the study of senescence in sunflower

Leaf sampling at different development stages

Control

Water stress

Bioinformatics data analysis and integration

Biomarkers (genes, transcripts & metabolites) of senescence process in

Physiological approach

• Chlorophyll• Sugars• Nitrogen• Leaf area

Metabolomicapproach

• GC-TOF-MS

Transcriptomic approach

• 4 x 44 Agilent Sunflower Microarray

Moschen 2009

•Imposibilidad de usar un solo gen constitutivo para todas lasespecies (Coker y Davies 2003)

•Tubulina es el más estable en hoja, raíz y flor (más conveniente paraanálisis dentro de clonotecas en tomate) y en Populus pero el menosestable en Arabidopsis.

•DNA-J-like protein más estable en su expresión media (∆Ct) entretodas las clonotecas (tomate).

•Alta abundancia de 18S o 28S RNA frente a mRNA (Kim y col. 2003) (refutado por Solanas y col. 2001).

Normalización de PCR cuantitativa ybúsqueda de genes de referencia

Sunflower Unigene Resource (SUR v.1.0)

Functional annotation and KEGG mapping(Blast2GO software: www.blast2go.org)

38,485 GO terms resulted in 49.6% of total sequences with GO annotation

133,682 EST Genbank (release May 2009)Helianthus annuus L.

VecScreen(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/UniVec.html)

Trimseq EMBOSS(http://emboss.sourceforge.net/)

28,089 singletons and 12,924 contigs = 41,013 unigenes

(CAP3 software: http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php)

Sunflower microarray • 42,386 probes• 74 specific control probes

(10x: 740 controls, previous cDNA chip)

• 1,417 Agilent controls

Fernández y col 2012

Resultados preliminares microarreglo

Hoja 10 CONTROL

T-1 T-3T-2

Hoja 10 stress hídrico

T-1 T-3T-2

Campo

Sólo Control :6280 probes

Sólo Estres: 3781 probes

Invernáculo

Sólo Control :1945 probes

Sólo Estres: 587 probes

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

F401

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

H110

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

T289

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

EF432

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

F550

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

H124

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

F543

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

H354

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

H125

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

H123

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

F549

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

F443

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

H387

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

H302

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

T221

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

F231

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

T234

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

H385

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

F175

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

H111

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

F209

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

H136

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

H304

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

H209

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

F230

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

F137

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

EF502

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

T340

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

H322

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

T253

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

EF624

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

F216

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

H411

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

F210

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

F171

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

T107

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

T111

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

F192

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

T322

C1

C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3

T187

Validación por qPCR de genes diferencialmente expresados

Perfil de expresión para cada uno de los 80 genes candidatos

Estudios de expresión de genes candidatos frente a estreses abióticos

Validación de genes por PCR cuantitativa (PCR en tiempo real)

• De los 15 genes que fueron seleccionados para su validación se evaluaron 12,confirmándose la expresión diferencial de 10 de ellos (Método 2 -∆∆Ct Livak ySchmittgen, 2001).

EST EF502

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

Ciclo

∆R

nFHSHCH

(BU671910) (BU671806) EST T124

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

Ciclo

? ∆R

n

FHSHCH

• Permiten medir la producción de productos de PCR mediante un sistema de sondas marcadas mediante dos fluorocromos.

• Su utilidad radica en que poseen un fluoróforo en su extremo 3' y una molécula en el 5' que bloquea su emisión de fluorescencia (denominada en inglés «quencher»); esta sonda marcada hibrida específicamente en la parte central del producto de PCR a obtener.

• Cuando la polimerasa se topa con la sonda la hidroliza mediante su actividad exonucleasa 5'-3', lo cual provoca la separación del quencher del fluorocromo y, por tanto, se emite fluorescencia.

Métodos de detección por hidrólisis de ADN(Sondas TaqMan)