PCR - Diagnostico

8/8/2019 PCR - Diagnostico

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Evaluacin de tres ensayos de diagnostico basados enPCR para la deteccin de infecciones mixtas de

PlasmodiumGonzlez Silvia Deynali Patricia

Olmos Garca Francisco Xavier

Valds Rives Silvia Anahi


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Antecedentes y Descubrimientos


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AntecedentesAntecedentes

Aproximadamente 2 millones depersonas estn expuestas a lamalaria con un estimado de 250

millones de casos clnicos yalrededor de 800.000 muertes alao

Cuatro especies de Plasmodiumse sabe que causan la malariaen humanos: P. falciparum, P.

vivax, P. malariae y P. ovale.


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Muchas regiones endmicascon malaria tienen informe de

infecciones mixtas de estasespecies y la prevalencia deinfecciones mixtas vara segnla regin geogrfica.

Las presentaciones clnicasde la malaria son a

menudo inespecficas y, en

consecuencia muchasenfermedades febriles deetiologa desconocida seatribuyen a la malaria (que

resulta en el diagnstico

presuntivo y tratamiento)


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Los instrumentos existentespara el diagnstico de la

malaria incluyen microscopa,

pruebas de diagnsticorpido (PDR) y herramientasmoleculares

Desde hace ms de un siglo,la microscopa se ha

mantenido como el estndar

para la deteccin de lamalaria y la determinacinde especies en reasendmicas.

Sin embargo, existen varios

desafos en el desempeo deldiagnstico microscpicopara el uso clnico de rutina.


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Las PDR son pruebasinmunocromatogrficas

diseadas para detectar

parsitos en los productosde la sangre humana.

Las PDR se utilizan cada

vez para el diagnstico dela malaria debido a que

son rpidos y fciles deusar sobre todo enentornos de recursos

limitados.


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Debido a que las PDR sonslo pruebas cualitativas, la

densidad de la parasitemiano puede determinarse conprecisin.


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Los mtodos moleculareshan demostrado ser tiles en

la identificacin de especies y

la deteccin precisa de lasinfecciones de especiesmixtas, adems de ladeteccin de infecciones

subclnicas.

Sin embargo, el uso deherramientas moleculares se veobstaculizada por algunos factores,

incluido el costo elevado de lacolocacin del equipamiento inicialy la imposibilidad de obtenerreactivos debido a unainfraestructura en entornos demuchos campos.


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La prueba ms utilizada para eldiagnstico molecular de la malariaes la reaccin en cadena de lapolimerasa (PCR)-basada en la

amplificacin del ADN ribosomal18S (ADNr) y del gen que permitela deteccin de las diferentesespecies de parsitos de la malariahumana, basados en productos dediferentes tamaos de PCR.


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El mtodo de PCR anidadadesarrollada por Snounou hasido ampliamente utilizadoen estudios de laboratorio y

en el diagnstico clnico,incluso en una referencia dediagnstico de laboratorio enlos Estados Unidos.

Sin embargo, este mtodorequiere mucho tiempo, costoso yes laborioso, ya que requiere decinco reacciones de PCR por

separado para detectar P.falciparum, P. vivax, P. ovale y P.malariae.


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El mltiplex de una solaronda utiliza un gnero

Plasmodium primer

especfico inversa con cuatroespecies con inters encebadores especficos.

Padley afirma la sensibilidadde que el ensayo sea de:

0,02 p / l para P. falciparum

P. ovale 0,004 p / l

Y no prueba de sensibilidadde la prueba para P. vivax yP. malariae.


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Adems de los tradicionalesherramientas moleculares

basados en PCR y PCR en

tiempo real han demostradorecientemente ser unaalternativa slida para eldiagnstico de la malaria.

Sin embargo, varios factoresimpiden el uso de estemtodo en las regionesendmicas de malaria,

incluido el costo, la falta deinfraestructura y falta deapoyo tcnico debido aproblemas deinfraestructura.


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Los tres mtodos descritosanteriormente basadas en la PCRson buenas alternativas a lamicroscopa y PDR.

Sin embargo, nadie ha evaluado

que estos mtodos de PCRtradicional es mejor en la deteccinde infecciones mixtas porPlasmodium.

Por lo que se han comparado eneste artculo los dos mtodos conel mtodo multiplex anidadautilizando cantidades conocidasdel laboratorio de ADN derivadosPlasmodium solo y mixtos cctelesque contienen las cuatro especiesde ADN.

Mtodos:

Anidada

Semi-anidada Un slo tubo mltiple


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Mtodos


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Cultivo de Parsitos y extraccin de

ADN

ADN extrado de :

Cultivos P. Falciparum(3D7)

Derivados de monos P.vivax (SV4)

P. malariae (Uganda)

P. ovale (Nigeria)


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Para las cuatro especies:

Frotis delgados

Tinciones

Conteo

Para conteo de glbulos infectados

El # total de glbulos rojospor micro litro se determinopara cada especie usando un

Coulter counter


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ADN aislado:

Un total de 8x106 parsitos porespecia

Suspendido en 200l estril deTE

Se tomaron alcuotas y seguardo a -20c

Diluciones hasta: 0.04genomas/


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Evaluacin de limites dediagnstico:

Detecciones individuales

Deteccin de mltiplesespecies

7 repeticiones

Cocteles mixtos: 2l de cada especieen dif. concentraciones


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Discusiones y Resultados


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Comparacin de tcnicas para el diagnstico de

diferentes especies dePlasmodium

1. Nested PCR2. Semi-nested multiplex

3. One tube multiplex


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1. Nested PCR

Especies de Plasmodium 0.4 p/l


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2. Semi-Nested PCR

P. falciparum y P. Vivax (o.4p/l)

P.Malariae (0.4 p/l)

P. Ovale ( 4 p/l)

Diferencia desensibilidad

especies


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3.Multiplex PCR

Menos especificidad

Al menos detecta 2especiessimultneamente

Detecta correctamenteP. falciparum en una

mezcla, pero no aP. malariae y P. Vivax.


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Confiabilidad: Menos de 50% de las pruebasrealizadas.

Identificacin de P. Ovale si laconcentracin del DNA era

igual o mayor que 10 p/ul.


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Con las pruebas detectaron:

1 p/l. De P. Ovale en mezclas usando: el semi-nested PCR, y el multiplex PCR.

1ro: 22/42

2do: 7/42

de las concentraciones esperadas para P. Vivax

9/42

Valoracin : 7 replicaciones


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Limitaciones


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Costos

Reactivos + plsticosconsumidos (muestra)

Nested PCR $8 dll/m

Semi-nested PCR $5dll/m

Multiplex PCR $4 dll/m


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CONCLUSIONES

Se demostr que El Nested PCR method es lamejor prueba basada en PCR para la deteccin de

diversas especies causantes de la malaria.

Promoviendo la optimizacin de nuevas tcnicasmoleculares puede incrementar el xito en las

pruebas de PCR tradicionales.


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