Blgo. M.Sc Omar Cceres R.

Laboratorio de Biotecnologa y Biologa Molecular

Instituto Nacional de Salud

DIAGNOSTICO DE TUBERCULOSIS

POR PCR Y GENOTIPIFICACION DE

Mycobacterium tuberculosis

Heminested-PCR para deteccion de M. tuberculosis

UTIL EN:

1. Muestras extrapulmonares

liquidas: LCR, aspirado

bronquial, lavado

bronquioalveolar, aspirado

gstrico entre otros)

2. Muestras extrapulmonares

solidas: Biopsias de piel,

pleura, hgado entre otros

3. Cultivo con colonias

atpicas y escasas

Heminested-PCR para deteccion de M. tuberculosis

M 1 2 3 4 5 6 7 8

M.Marcador 100pb1. Paciente 1 Aspirado gstrico2. Control inhibicin paciente 13. Paciente 2 LCR4. Control inhibicin paciente 25. Paciente 3 Liquido ascitico6. Control inhibicin paciente 37. Control Negativo8. Control Positivo H37rv

Heminested-PCR para deteccion de M. tuberculosis

M 1 2 3 4 5 6

M. Marcador 100pb1. M. avium2. M. fortuitum3. M. chelonae4. Humano5. Paciente6. Control Positivo H37rv

Genotipificacion de M. tuberculosis

La discriminacin de cepas patognicas es crucial; desde el punto de vista epidemiolgico, la tipificacin molecular contribuye al conocimiento de la virulencia, transmisibilidad, la efectividad de drogas, etc. (control de las enfermedades)

Identificacin de relaciones no sospechosas entre casos, nuevos casos y casos inusuales de transmisin de la enfermedad

Evaluacin de la transmisin de genotipos entre pacientes con o sin nexo epidemiolgico

Identificacin de reactivacin de TB en pacientes con historia previa de la enfermedad

Estudio de contactos de pacientes y su asociacin con cadenas de transmisin

PORQUE GENOTIPIFICAR MTB?

Genotipos conocidos de M. tuberculosis

HERRAMIENTAS UTILIZADAS EN LA EPIDEMIOLOGA

MOLECULAR

PCR y Variantes RFLP PCR Fingerprinting (RAPD, ERIC,

DRE, AFLP, etc.) PFGE Ribotipificacin Spoligotyping (solo MTB)MIRU-VNTR (solo MTB) Secuenciamiento de ADN

Genoma de Mycobacterium tuberculosis

RFLP IS6110

Spoligotyping

MIRU

SNPs

Genotipificacin:

Tcnica de genotipificacin para MTb descrita por primera vez en 1993

Basada en las variaciones generadas por el elemento de insercin IS6110 (Transposicin)

La variacin de las cepas esta basada en el numero de copias del IS6110 y en la posicin donde se inserta en el ADN bacterial

)

Brote Epidmico Muestras al Azar de pacientes de una regin

Casos sin nexo epidemiolgico

Tcnica de Genotipificacin basada en PCR descrita por primera vez en 1997, identifica y tipifica a MTB en un solo paso

Explota la variacin que existe en el locus DR de MTB (exclusiva de esta bacteria)

El locus DR (Direct Repeat) es una regin cromosmica que consiste de regiones repetidas de 36 nucletidos muy conservados

Cada DR esta separado por secuencias espaciadoras no repetitivas de 34 a 41pb

Las cepas varan en el numero de DRs y en la presencia o ausencia de los espaciadores particulares

La tcnica utiliza 43 diferentes espaciadores para identificar los diferentes genotipos de MTB

Spoligotyping de 35 MTb (aislamientos clnicos) y 5 M. bovis.

Presencia de seal indica la presencia del espaciador

Filas 6, 12 y 37 corresponden a genotipo Beijing

MIRU-VNTR fingerprinting

VNTR (Variable Number Tandem Repeat): Son secuencias

repetitivas en Tndem similares a minisatlites de eucariotas

que han sido identificados dispersos en las regiones

intergenicas del genoma del complejo de Mycobacterium

tuberculosis.

Estos segmentos repetitivos o minisatelites contienen de 46-

100 bp (pares de bases) y difieren entre las cepas en su

nmero de copias.

Se ha demostrado que la tipificacin por VNTR es muy til

para patgenos cuya poblacin es altamente clonal como MTb

MIRU (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units): VNTR

localizadas en el genoma de M. tuberculosis H37Rv, se han

encontrado 41 posiciones (41 locus) de los cuales 15 son

polimrficos en el nmero de repeticiones de una cepa a otra.

Amplificacin por PCR de MIRU en MTb

MIRU 10

DNA

MIRU 4

PCR amplification

Strain 1

3 repeats 2 repeats

MIRU 10

DNA

MIRU 4

PCR amplification

Strain 2

1 repeat2 repeats

Genotipos hallados hasta el momento (N=100)

Comparacin por distancia gentica: 0.17 significa

una tolerancia como mximo de 4 locus de diferencia

para MIRU-VNTR o 7 espaciadores en Spoligotyping.

Resultados con Da 0.17 (S=100%, E=79%)

Haarlem 16%

Beijing 6%

No determinado 78%

Comparacin por agrupamiento en un rbol filogentico:

Haarlem 28% Beijing 8% Dehli/CAS 2% N.D EAI 3% Uganda 2% N.D Canetti 1% LAM 29% LAM/Cameroon 6% Cameroon 2% N.D Cameroon 2% No match (clster nuevo) 17%

Genotipos de MTB-XDR

Genotipos de MTB-XDR

Genotipos de MTB-XDR

Genotipos de MTB-XDR

Frecuencia de genotipos de M.Tb en Latinoamerica (%)

Per

Da FilVenezuela2006 2009

Para-

guayBrazil

Paran RGS

Hondu-

ras

Sudfrica

TB-XDR

Haarlem 16 28 3 5 18.2 17.2 16 16.5 2

LAM 29 74 53 52.3 26.9 54 54.9 7

Beijing 6 8 0.4 0.5 0.5 76

T 13 10 11.8 22 16

S 9.5

No

identificado78 17 9 0

RDRio

38%5

N= 100 873 1298 220 93 50 206 41

Importancia del genotipo Haarlem

Lopez B. et al. Clin Exp Immunol 2003; 133:3037 Ensayos de infeccin de genotipos en ratones Beijing fue el mas virulento Mostro virulencia intermedia en ratones

Elis R Dalla Costa et al. BMC Microbiology 2009; 9:39 Cepas analizadas de Per, Brasil y Argentina n=224 LAM es el mas frecuente (46.4%), Haarlem es el segundo

(10%) en Sudamrica Resistencia a INH es mas frecuente en Haarlem que en LAM

(82.4% n=34) en Per Haarlem ha sido asociado a la emergencia de TB-MDR en

brotes ocurridos en Argentina, Republica Checa y Tnez

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