CLONACIÓN ACELULAR: REACCIÓN EN

CADENA DE LA POLIMERASA, PCR

BIOTECNOLOGÍA MÉDICA

Ing. Cinthia Córdova Barrios

Introducción general a la clonación

Conjunto de elementos genéticamente idénticos entre sí y a su precursor.

Clonación es una amplificación genética

Clonación

CLONACIÓN DE MOLÉCULAS

CELULAR:

Con células, es la amplificación de un inserto, asistida por vectores en células

anfitrionas en cultivo. Tecnología del DNA

recombinante

ACELULAR: Clonación de moléculas sin la

intervención de célula alguna, amplificación in vitro de moléculas de

DNA y RNA mediante la reacción en cadena de la

polimerasa.

PCR

Amplificación directa de un gen

o un fragmento de DNA o

cDNA, presentes en mezclas de

muy diversas fuentes.

Amplificación Detección

Aplicaciones

Clonación acelular de fragmentos de DNA.

Detección de secuencias.

Secuenciación de ácidos nucleicos.

Establecimiento de polimorfismos de secuencia.

Rastreo de mutaciones.

Tipificación de DNA para trasplante.

Diagnóstico de enfermedades genéticas.

Resolución de problemas forenses.

Resolución de problemas arqueológicos.

Estudios evolutivos.

Detección de células tumorales.

Detección de microorganismos infecciosos.

PCR: RequerimientosdN

TPs

y M

g Sustratos para la síntesis de las innumerables copias de DNA y el cofactor(Mg de 1-4 mM)

Cebad

ore

s o p

rim

ers Oligonucleótidos

sintéticos de cadena sencilla de 18 a 30 nt. Sus secuencias son complementarias a los dos extremos 3’ de la región diana. La posición donde hibridan los cebadores define la longitud del fragmento.

DN

A p

olim

era

sa Termoestable y activa a temperaturas relativamente altas (95°C).

Polimerasa taq(Thermus aquaticus)

Termociclador

PCR: Etapas del procesoD

esn

atura

lizac

ión Calentamiento para

la separación de las dos hebras del DNA.

Tiempo: Incubación (30-120 s).

Temperatura: 68-97 °C

Tem

pla

do o

hib

ridac

ión Enfriamiento

rápidos por debajo de Tm. Hibridación de las hebras sencillas del DNA con los cebadores.

Tiempo:10-120 s.

Temperatura: 37-65 °C

Elo

nga

ción Amplificación, DNA

pol elonga los cebadores, empleando como molde ambas hebras originales

Tiempo: Incubación (1-3 min).

Temperatura: 72-75 °C

S e añade una etapa previa y una final al conjunto de todos los ciclos.

Previa antes de la desnaturalización para inactivar proteasas y nucleasas

Última, prolongación de la última elongación, que permita que se

completen todos los fragmentos.

PCR: Etapas del proceso

PCR: Etapas del proceso

PCR: ETAPAS DEL PROCESO

PCR: ETAPAS DEL PROCESO

PCR: Amplificación global

N° de ciclos

realizados

N° total de

copias

N° de copias

largas

N° de copias

dianas

Dianas/total

1 2 2 0 0

2 4 4 0 0

3 8 6 2 25%

4 16 8 8 50%

5 32 10 22 69%

10 1024 20 1004 98%

20 ~ 106 40 ~ 106 99.996%

40 ~ 1012 80 ~ 1012 100%

X 2X 2X 2X- 2X

Características del proceso

Rendim

iento Los productos

de cada ciclo sirven de molde para el siguiente, la acumulación de copias es exponencial.

Dura

ción De cada etapa,

debe optimizarse dependiendo de la secuencia concreta que se quiera amplificar

Esp

eci

fici

dad Elevada,

determinada por la secuencia de los cebadores y las condiciones del templado. C

apac

idad

de d

ete

cció

n Alta, puede detectar una única molécula de DNA

Fid

elid

ad Capacidad de copiar secuencias con precisión, sin introducir mutaciones

N= número de copias.

N0= número de moléculas iniciales.

R= rendimiento de cada ciclo (0.7 o 0.8)

X= número de ciclos

Automatización de la PCR

Se utiliza termocicladores, para programar los cambios de

temperatura según el carácter cíclico del proceso.

Permite la realización de un número elevado de ciclos.

Se aumenta la precisión del proceso.

Variantes del método:

• Supera los límites de la PCR convencional

• Amplifica con fidelidad regiones diana de gran tamaño

• Se añade otra enzima.

PCR “larga” o

L-PCR

• Realizar una segunda reacción de PCR con dos cebadores nuevos que hibridan dentro del fragmento diana amplificado por el primer parPCR “anidada”

• Clonar regiones desconocidas de un DNA, situadas en posición vecinal a secuencias diana conocidas.

• Amplificar la región externa que flanquea a los cebadores.

PCR inversa

Variantes del método: pcr anidada

Variantes del método: PCR inversa

Variantes del método: PCR inversa

Variantes del método:

• Puede amplificarse una región de DNA de secuencia desconocida ligando a sus fragmentos de restricción unos adaptadores.

PCR con adaptadores.

• Se generan copias de hebra sencilla de un DNA.

• Se añaden cantidades muy diferentes de ambos cebadores.

PCR asimétrica

• Amplificación de RNA a través de la síntesis previa de su cDNA, que después se amplifica por PCR.RT-PCR

Variantes del método: PCR con adaptadores

Variantes del método: RT-PCR

Variantes del método: RT-PCR

Variantes del método: PCR real time o qPCR

Amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto.

Requiere de molde de ADN, cebadores, dNTPs, polimerasa termoestable y fluoróforo

Se requiere de un termociclador termociclador con capacidad de hacer incidir sobre cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la fluorescencia emitida por el fluorocromoexcitado.